KR20060128056A

KR20060128056A - 종양 괴사 인자 길항물질 및 이들의 자궁내막염에서 용도

Info

Publication number: KR20060128056A
Application number: KR1020067022801A
Authority: KR
Inventors: 프란체스코 보르렐리; 마우로 드안토니오; 파브리지오 마르텔리
Original assignee: 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이.
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2006-12-13
Also published as: PL350002A1; HUP0105103A3; ZA200105263B; PT1143997E; CA2356737C; PL204713B1; EP1022027A1; EE05543B1; SK287313B6; BG65556B1; DE60003152T2; EP1143997B1; UA78483C2; IL144413A; NO328814B1; IL144413A0; KR20010101397A; AU771964B2; SK10292001A3; AR022251A1

Abstract

종양 괴사 인자 길항물질은 자궁내막염을 치료 및/또는 예방하기 위한 치료요법적 효과량으로 투여한다. 본 발명의 길항물질은 일반적으로, 다양한 종류의 분자에서 선택되는데, 가급적 가용성 TNF 수용체다. 길항물질은 자궁내막염 병소의 퇴행에 이용되고, 다른 활성 성분과 혼합하여 관련된 질환(예, 불임)의 완화에 유용하다.

종양괴사인자 길항물질, 자궁내막염

Description

종양 괴사 인자 길항물질 및 이들의 자궁내막염에서 용도{TUMOR NECROSIS FACTOR ANTAGONISTS AND THEIR USE IN ENDOMETRIOSIS}

배경기술

자궁내막염은 자궁내막 강과 자궁 근육계의 외부에 자궁내막선 및 기질의 존재로 특징지어지는 여성 생식기 질환이다. 가장 피해를 많이 입는 해부학적 부위는 난소, 자궁천골 간막, 골반 복막, 직장질 중격, 자궁경부, 질, 난관, 외음부이다. 일반적으로 자궁내막염은 직장질 중격으로부터 하부조직에 깊숙이 침투하여 표면에서는 보이지 않는다. 가끔, 자궁내막염의 병소는 난소외 부위, 예를 들면 폐, 방광, 피부, 흉막, 림프절에서 발견할 수 있다. 자궁내막염 병소는 점진적이다; 처음에, 이들은 투명한 소포로 보이고, 수년동안 점점 붉어지다가 결국 검은색 의 섬유성 병소로 변한다(MacSween, 1993).

*자궁내막염은 양성 질환이긴 하지만, 자궁내막염 병소가 악성으로 변질될 수도 있다. 다른 악성 질환에서와 같이, 자궁내막염-유래된 신생물의 발생은 성장 인자의 변형 및/또는 종양 유전자 조절과 관련된 병발 현상에 기인한다(Cheung, 1996).

자궁내막염은 주로 가임기(reproductive age) 여성에서 가장 흔한 부인과 질환중의 하나다: 이 질환은 가임기 여성중 5-10%에서 발견된다(Barbieri, 1988). 자궁내막염 조직은 자궁외에서 지속적인 성장을 위해 에스트로젠에 의존한다. 결과적으로, 자궁내막염은 에스트로젠이 결핍되는 초경전 및 폐경후에는 드물다. 자궁내막염 호르몬 감수성은 가장 일반적인 증상중 일부인 골반 통증과 월경곤란의 원인이 된다.

자궁내막염은 자궁에서 다른 위치로 이탈한 자궁내막 세포에 기인하는데, 여기서 생존 세포는 착상하여 성장할 수 있다. 초기 세포 확산을 설명하는데 2가지 가능 기작이 제시되고 있다. 월경주기 여성에게 흔히 발생하는 현상인 역행성 월경은 자궁내막-부착된 단편이 월경 환류액을 통하여 생식기의 주변 구조에 도달하도록 한다. 대안으로, 생식기가 아닌 다른 부위에서 자궁내막염의 발생을 설명하기 위하여, 자궁내막 세포는 자궁정맥을 통하여 확산되고 림프계을 통해 신장(혈액성 또는 림프성 전염)될 수 있다. 부인과 수술 또한, 이런 확산의 원인이 된다(MacSween, 1993).

내피세포 전염과는 별개로, 다른 인자[예, 유전적 소인(Malinak et al., 1980)과 면역학적 변형(Ho et al., 1997)]가 여성의 자궁내막염 감수성을 결정할 수도 있다. 자궁내막 세포가 월경 시점의 모든 여성에서 빈번하게 관찰된다는 점에서, 포유동물은 자궁내막염의 발병을 피하기 위하여 면역계와 관련성이 높은 기전을 보유해야 한다. 일반적으로, 숙주 면역반응을 회피하고 적당한 에스트로젠 자극을 받은 내피 세포는 증식하여 성장하고 현미경에서 관찰할 수 있는 병소를 형성할 수 있다. 따라서, 자궁내막염은 숙주 면역계에 의해 기존 병소가 성장 또는 파괴되는 동안 새로운 병소가 지속적으로 형성되는 동적 과정으로 간주된다.

주로 자궁내막염과 관련된 염증반응은 복막 환경을 변화시키는데, 여기서 복막 액의 양이 증가하고 수와 활성측면에서 복막 대식세포가 증가한다. 따라서, 단핵구/대식세포 시스템은 자궁내막염 발달에 핵심적인 역할을 하는 것으로 제안되었다. RANTES(Hornung et al., 1997), 인터루킨-6(Harada et al., 1997), 인터루킨-8(Arici et al., 1996a), 종양 괴사 인자-알파(Overton et al., 1996), 단핵구 화학주성 단백질-1(Arici et al., 1997)을 비롯한 대식세포의 분비 산물은 이 질병에 걸린 여성의 복막액에서 더 높은 농도로 발견되었다. 자궁내막염 여성에서 면역학적 변화가 나타나긴 하지만, 이들 현상이 자궁내막염의 원인인 지 또는 자궁내막염에 의해 야기된 염증의 결과인 지는 확인되지 않았다(Rana et al., 1996).

자궁내막염에 관한 지식 및 다른 질환에 대한 이의 관련성은 여전히 진단수준에 머물고 있다. 자궁내막염이 불임의 주원인으로 인식되고 있긴 하지만, 이 질환의 이상생리학에 대한 연구결과는 상충되고 분명하지 않다. 초기 병소가 좀더 대사적 활성을 보이기 때문에, 통증이나 불임의 정도 및 이 질환의 중증도간에는 상관관계가 부족하다. 불임율은 정상 개체군보다 높은데, 토끼에서 실시한 연구결과는 자궁내막염의 외과적 유도가 출산율을 75% 내지 25% 감소시킨다는 것을 보여준다(Hahn et al., 1986). 골반 통증 환자중 71%에서 자궁내막염이 발견되었고, 골반통증과 불임 환자중 84%가 자궁내막염으로 진단받았다(Koninckx et al., 1991). 일반적으로, 불임은 자궁내막염이 정상 질구조를 교란시킬 만큼 확장될 때 발견되는데, 자궁내막염이 최소일 때는 임신율이 정상적이다.

자궁내막염은 상이한 방식으로 출산율에 영향을 줄 수 있다. 인터루킨-6, 인터페론, 종양 괴사 인자와 같은 백혈구 메신저가 모두 증가하여, 난자-정자 상호작용에 악영향을 준다. 자궁내막염 여성에서 구한 혈청 샘플은 생쥐 배아 모델에서 배아독성을 보이고 시험관에서 정액 유동성을 저해하는 것으로 밝혀졌는데(Halme, 1991), 이런 효과는 재조합 종양 괴사 인자-알파를 첨가하는 경우 확대된다(Eisermann, 1989). 하지만, 이들 연구결과는 사이토킨이 자궁내막염의 진행에 어떤 영향을 주는 지에 대한 문제를 해결하지 못하고, 단지 생식세포와 배아세포의 생존율에 대한 이런 분자의 효과만을 보여준다.

현재 자궁내막염을 치료하는데 사용되는 2가지 치료요법적 양식은 호르몬요법과 수술요법이다. 자궁내막염에 대한 현재의 약리학적 요법은 에스트르젠 생산의 호르몬 억제를 필요로 하는데, 그 이유는 상기 호르몬이 결핍되면 자궁 조직의 성장이 차단되기 때문이다. 자궁내막염-관련된 불임의 치료 측면에서, 호르몬요법은 최소 질환 환자에서 효능이 입증되지 않은 반면, 다른 연구결과는 임신율의 증 가를 보여준다(Arici et al., 1996b).

호르몬요법에는 높은 용량의 프로게스토겐[에스트로젠과 프로제스테론의 혼합물("가임신" 섭생에서 높은 용량의 경구 피임제 또는 OCP 사용)], 다나졸(에티스테론의 남성호르몬 유도체), 좀더 최근의 GnRH 길항제가 포함된다. 이들 호르몬 요법은 골반통증에 효과적이고 병소의 실질적인 퇴행을 유도하지만, 몇몇은 사용 정지된 상태다. 에스트로젠은 자궁내막 조직을 자극하여 이의 증식을 유발하는데, 그 이유는 이것이 높은 용량의 프로제스테론에 반응하지 않고, 따라서 OCP가 한정된 수의 환자에게 부분적인 경감을 제공할 수 있기 때문이다(Dawood, 1993). 프로제스테론성 약물은 우울증, 체중증가, 체액유지와 함께 부정기적인 출혈(50%)을 유발할 수 있다. 다나졸은 가용성 혈청에서 종양 괴사 인자 알파, 인터루킨-1 베타, CD8 수준의 감소(Matalliotakis, 1997; Mori, 1990), 스테로이드형성, 에스트라디올의 수용체로부터 이탈을 비롯한 다양한 반응을 유발하는 자궁내막염을 억제한다. 다나졸은 통증을 겪고 있는 환자중 66-100%에서 증상을 개선시킬 수 있지만, 4년후 재발율이 최대 40%-50%에 이른다. 다나졸의 다른 단점은 체중증가와 남성호르몬 부작용인데, 이로 인해 환자중 최대 80%가 이 요법을 포기하고 있다(Barbieri, 1988). GnRH 유사체는 고유 GnRH보다 좀더 강력하고 좀더 오랜 기간동안 효과를 보이는데, 상기 GnRH는 에스트로젠 자극을 제거하여 모든 에스트로젠 감수성 조직의 성장에 효과를 나타낸다. GnRH 유사체의 부작용은 감소된 뼈 밀도와 같이, 심한 저에스트로젠혈증에 대하여 부차적이고, 재발율은 5년후 최대 50%에 이른다(Waller and Shaw, 1993).

질병의 정도에 따라, 임신을 원하는 경우 외과적 수술은 보존적 요법으로 실시하고, 심각한 경우에는 자궁, 난소, 난관을 제거할 수 있다. 임의의 경우에, 아주 제한적인 외과적 치료도 심각한 임신의 감소를 초래할 수 있다. 외과적 수술후 임신율은 35% 내지 65%로, 환자들이 정상적인 생식력을 달성하기 위해서는 배란 유도 및 자궁강내 인공수정을 필요로 한다(Koninckx and Martin, 1994). 임상 보고서는 자궁내막염의 개복술과 절제후, 환자중 최대 40%가 5년이내에 재수술을 필요로 한다는 것을 보여준다. 적극적인 외과적 개입 후에도, 자궁내막염으로부터 통증은 상당한 문제가 된다. 수술요법의 실패이유에는 인식되지 않은 또는 잘못 인식된 병소의 불완전 절제가 포함된다. 많은 병소는 극히 미세하여 복강경 최대 배율에서도 관찰되지 않는다. 따라서, 수술요법만으로는 이 질환을 치료할 수 없다(Revelli et al., 1995).

너무나 많은 자궁내막염 환자들이 통상적인 요법의 부작용(호르몬 불평형 결과, 높은 재발율, 불임)으로 고통받고 있기 때문에, 자궁내막염에 대한 대안적 치료법을 제공하는 것이 바람직하다. 가능한 치료요법적 방법은 자궁내막염 병소와 면역학적 상태를 완화시킬 수 있는 면역조절 분자를 활용하는 것이다. 이런 방식은 일반적 증상의 치료에도 사용가능할 것으로 생각되긴 하지만(Rana et al., 1996), 자궁내막염이후 발현수준이 변형된 사이토킨중에서 어떤 사이토킨이 치료요법적 개입을 위한 바람직한 표적인 지를 설시하는 실험적 증거는 없다.

전술한 바와 같이, 자궁내막 염증 반응에 관여하는 몇몇 대식세포 분비 산물중의 하나는 종양 괴사 인자(이후, TNF)이다. 카켁틴(cachectin)으로 불리는 TNF 는 활성화된 T 세포와 대식세포에 의해 방출되는 다면발현성 사이토킨이다. TNF는 인터페론, 인터루킨, 콜로니 자극 인자 사이토킨 네트워크의 한 구성원으로, 이것은 다른 사이토킨 및 접착분자의 생산을 비롯한 다수의 친염증성 변화를 유도함으로써 다양한 전염성 염증 질환의 발병에 관한 시그널링 시스템에서 중요한 역학을 한다(Fiers, 1991).

본원에서 동물 또는 사람에서 구한 TNF는 종양 괴사 인자-알파나 베타 및 TNF-알파의 자연발생 대립유전자를 의미한다(Pennica et al., 1994). 림포톡신이라 칭하는 TNF-베타는 유사한 활성을 보유하지만, 항원성 또는 유사분열성 자극에 반응하여 상이한 세포형(림프구와 고유 킬러 세포)에 의해 생산된다(Gray et al.,1984).

TNF는 삼중복합체(trimer)로 활성을 나타내는 17kDa 단백질로 발현된다. 이 복합체는 상이한 기관과 조직에서 특이적인 효과를 매개하는 세포 표면 수용체를 응집시켜 생물학적 활성을 발휘한다. 자궁내막에서, TNF 발현은 부위- 및 월경주기-의존성으로(Hunt et al., 1992), 실험 동물의 자궁내막에서 아팝토시스를 유도한다(Shalaby et al., 1989). TNF로 중피 세포를 사전처리하면 자궁내막 간질 세포의 중피세포에 대한 고착이 상당히 증가하는데(Zhang et al., 1993), 이것은 TNF가 자궁내막염의 개시 및/또는 발생의 원인이라는 것을 뒷받침한다. TNF는 기존 문헌에서 TNF-RI로 정의된 p55 TNF 수용체 및 TNF-RⅡ로 정의된 p75 TNF를 비롯한 일군의 막결합 수용체 분자와 결합하여, 면역계의 정상적인 발달과 기능에 필요한 활성을 발휘한다(Bazzoni and Beutler, 1996). TNF 변환 시그널에서 TNF-RI의 우 위는 이런 수용체에 특이적인 작용항체가 TNF 유도된 반응 대부분을 모방하는 능력에서 알 수 있다(Shalaby et al., 1990). 막결합 수용체와 결합한 TNF는 TRADD, TRAP-1(TNF-RI에 대한 조절물질)이나 TRAF-1, TRAF-2(TNF-RⅡ에 대한 조절물질)와 같은 세포질 조절물질을 통하여 시그널링 경로를 개시시켜, T 세포 증식, 시험관에서 종양-세포 용해, 피부 괴사, 인슐린 저항성, 아팝토시스와 같은 상이한 세포반응을 야기한다. 양 TNF 수용체의 세포외 영역은 제거될 수 있는데, 이들 가용성 수용체는 TNF와 결합하고 고 친화성 복합체를 형성하여 TNF 활성을 불활성화시키고, 따라서 TNF의 표적세포 막 수용체에 대한 결합을 감소시킨다(Nophar et al., 1990).

자궁내막에서 막-결합된 TNF 수용체 수준은 여성호르몬(oestradiol) 및/또는 프로제스테론 투여의 영향을 받고, 따라서 생쥐에서 TNF-RI은 일시적이고 세포-특이적으로 발현된다(Roby et al., 1996). 하지만, 자궁내막염과 관련된 관련된 다양한 모델에서 실행된 다른 연구에서와 같이, 이번 연구는 자궁내막염 병소의 발달에서 막-결합성 또는 가용성의 TNF 및 TNF-RI의 실질적인 생체내 효과에 대해서는 전혀 언급하지 않고, 다만 자궁내막염-관련된 면역학적 비정상만을 설명하였다.

본원은 TNF 길항물질이 순환 TNF를 격리시켜 자궁내막염 병소의 진행을 차단할 수 있다는 가설에 기초한다. 이런 가설은 실시예에서 밝힌 조사결과에 의해 입증되었는데, 이들 조사결과는 TNF 길항물질이 쥐 실험모델에서 자궁내막염-유사 병소의 크기를 현저하게 감소시킨다는 것을 보여준다. 출원인의 발견으로, 개체에서 자궁내막염을 치료 및/또는 예방하는 방법을 이 글에서 제공하는데, 상기 방법은 TNF 길항물질의 치료요법적 효과량을 투여하는 것으로 구성된다.

두 번째 구체예에서, 본 발명은 개체에서 자궁내막염-관련된 불임질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 다른 약물과 병용하여 TNF 길항물질의 치료요법적 효과량을 투여하는 것으로 구성된다.

본 발명의 또 다른 목적은 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께, 자궁내막염의 치료를 위한 제약학적 조성물의 제조에 TNF 길항물질을 이용하는 것이다.

본 발명에서, TNF 길항물질은 장관외 또는 다른 제형으로 효과적으로 투여할 수 있다. 정맥내, 근육내, 피하를 비롯한 임의의 장관외 경로로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한, 소량의 첨가제(예, 안정제, 부형제, 완충제, 방부제)를 함유할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 TNF 길항물질에는 가용성 TNF 수용체 분자, 안티-TNF 항체, TNF 수용체 시그널링을 예방 및/또는 저해하는 화합물이 포함된다. TNF 길항물질은 단독으로 또는 다른 TNF 길항물질과 병용하여 사용할 수 있다. 또한, 자궁내막염-관련된 불임 환자의 질환을 완화시키기 위하여, 하나 또는 복수의 제약학적 활성 산물을 병용할 수 있다.

이 글에서 밝힌 본 발명은 TNF 길항물질로 TNF(자궁내막염이후 복강액에서 발현 수준이 증가되는 몇몇 사이토킨중 하나)를 격리시키면 쥐 실험모델에서 자궁내막염-유사 병소가 감소한다는 예상치못한 결과를 명료하게 보여준다. 상기 모델 은 또한, 이런 효과가 호르몬 균형과 자연 킬러 세포 활성에 별다른 영향을 주지않고 달성된다는 것을 입증한다. 또한, 생식기 구조의 정상화가 착상율에 긍정적인 영향을 준다는 점에서 TNF 길항물질을 이용한 자궁내막염 병소의 감소는 임신율을 향상시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 주목적은 개체에서 자궁내막염을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하는 것인데, 상기 방법은 TNF 길항물질의 치료요법적 효과량을 투여하는 것으로 구성된다.

본 발명의 다른 목적은 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께, 자궁내막염의 치료를 위한 제약학적 조성물의 제조에 TNF 길항물질을 이용하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 이런 방식으로 제조된 제약학적 조성물에 관한다.

본원에서 청구한 활성성분은 TNF 길항물질이다. 청구된 TNF 길항물질은 2가지중 한가지 방식으로 활성을 발휘한다. 먼저, 길항물질은 TNF 수용체 결합을 담당하는 TNF 에피토프를 실제적으로 중화시킬 수 있을 만큼 충분한 친화성과 특이성을 갖고 TNF 분자와 결합하거나 또는 이를 격리시킬 수 있다(이후, "격리 길항물질"). 대안으로, TNF 길항물질은 TNF 결합후 세포 표면 수용체에 의해 활성화되는 TNF 시그널링 경로를 저해할 수 있다(이후, "시그널링 길항물질"). 양 길항물질은 본 발명에 따른 자궁내막염 요법에서 단독으로 또는 동시 에 사용된다.

TNF 길항물질은 시험관에서 감수성 세포주, 예를 들면 TNF가 증식과 Ig 분비를 유발하는 사람 B 세포에서 고유 TNF의 활성에 대한 후보들의 효과를 스크리닝하여 확인하고 평가한다. 상기 분석은 예로써, 분석에 사용되는 TNF 몰량의 0.1 내지 100배로 다양하게 희석된 후보 길항물질의 TNF 제형 및 TNF를 함유하지 않거나 길항물질만 함유한 대조군을 포함한다(Tucci et al., 1992).

바람직한 격리 길항물질은 본 발명에 따른 TNF 길항물질이다. 격리 길항물질중에서, 고친화성으로 TNF와 결합하고 낮은 면역원성을 보이는 폴리펩티드가 바람직하다. 가용성 TNF 분자 및 TNF에 대한 중화 항체가 특히 바람직하다. 가령, TNF-RI와 TNF-RⅡ가 본 발명에 유용하다. 본 발명에 따른 좀더 바람직한 길항물질은 수용체의 세포외 도메인 또는 이들의 기능영역으로 구성되는 이들 수용체의 절두형이다. TNF 수용체의 절두형은 가용성으로, 자궁과 혈청에서 30kDa와 40kDa TNF 저해 결합 단백질로 탐지되는데, 이들은 초기에 TBPI와 TBPⅡ로 불렸었다(Engelmann et al., 1990). 수용체 분자의 유도체, 단편, 영역, 생물학적 활성 부분은 본 발명에 사용할 수 있는 수용체 분자와 기능적으로 유사하다. 수용체의 이런 생물학적 활성 등가물 또는 유도체는 막-결합된 TNF 수용체와의 상호작용을 저해 또는 차단시킬 만큼의 친화도로, TNF와 결합할 수 있는 충분한 크기의 상기 폴리펩티드 일부분 또는 수용체 분자를 인코드하는 서열 일부분을 지칭한다. 적절한 구체예에서, 사람 가용성 TNF-RI는 환자에게 투여되는 TNF 길항물질이다. 자연과 재조합 가용성 TNF 수용체 분자 및 이들의 생산방법은 유럽 특허 출원 EP 308,378, EP 398,327, EP 433,900에서 제시한다.

TNF 수용체 복합 분자와 TNF 면역수용체 융합 분자, 이들의 유도체 또는 일부분은 본 발명의 방법에 유용한 수용체 분자의 추가적인 실례다. 본 발명에 유용한 TNF 수용체 복합분자는 하나 또는 복수의 폴리펩티드 링커를 통해, 2개이상 TNF 수용체의 세포외 도메인 전체부분 또는 일부분으로 구성된다. 복합분자는 복합분자의 직접 발현으로 분비된 단백질의 단일 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 이들 복합분자 및 이들의 생산 방법은 유럽 특허 출원 EP 526,905에서 제시한다.

본 발명에 유용한 TNF 면역수용체 융합분자는 하나 또는 복수 면역글로불린 분자의 적어도 일부분 및 하나 또는 복수 TNF 수용체의 기능적 일부분으로 구성된다. 이들 면역수용체 융합분자는 단량체, 이종-다량체 또는 동종-다량체로 만들 수 있다. 또한, 면역수용체 융합분자는 일가(monovalent) 또는 다가(multivalent)로 만들 수 있다. TNF 면역수용체 융합분자 및 이들의 생산방법은 유럽 특허 출원 EP 620,739와 이에 상응하는 PCT 특허 출원 WO 94/06476에서 제시한다.

본 발명의 방법에 유용한 다른 격리 길항물질 종류는 생체내에서 TNF에 대한 고친화성 결합과 낮은 독성으로 특징지어지는 단클론 항체, 키메라 인화(humanized)항체, 재조합 항체, 이들의 단편을 비롯한 안티-TNF 항체로 대변된다. 본 발명에 사용할 수 있는 항체는 자궁내막염 병소의 효과적 퇴행, 증상의 완화, 낮은 독성을 보일 만큼 충분한 기간동안 환자를 치료할 수 있는 능력으로 특징지어진다. 중화항체는 토끼나 생쥐같은 동물에서 TNF 면역으로 용이하게 만들 수 있다. 면역된 생쥐는 하이브리도마 제조를 위한 B 세포의 공급원을 제공하는데 특 히 유용하고, 상기 하이브리도마는 배양하여 대량의 안티-TNF 단클론 항체를 생산한다. 키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래된 2개이상 분절 또는 일부분으로 특징지어지는 면역글로불린 분자다. 일반적으로, 키메라 항체의 가변영역은 비-사람 포유동물 항체(예, 뮤린 단클론항체)로부터 유래되고, 면역글로불린 불변영역은 사람 면역글로불린 영역으로부터 유래된다. 바람직하게는, 양 영역 및 이들의 조합체는 일상적으로 낮은 면역원성을 갖는다(Elliott et al., 1994). 뮤린 항원 결합 영역을 계속 유지하면서 뮤린 불변 영역이 사람 불변 영역으로 치환된 인화 항체는 유전자 조작 기술로 만든 면역글로불린 분자다. 생성된 생쥐-사람 키메라 항체는 사람에서 감소된 면역원성과 향상된 약동학을 갖는다(Knight et al., 1993). 본 발명의 방법에 사용되는 고친화성 단클론 항체 및 이들의 키메라 유도체의 바람직한 실례는 유럽 특허 출원 EP 186,833과 PCT 특허 출원 WO 92/16553에서 제시한다.

TNF 길항물질은 다양한 방식으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 경로에는 피내, 경피(예, 서방 제형에서), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구, 경막, 국부, 비강내 경로가 포함된다. 다른 치료요법적으로 효과적인 투여경로, 예를 들면 상피나 내피조직을 통한 흡수 또는 유전자 요법[여기서, TNF 길항물질을 인코드하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(벡터를 통해), 이후 생체내에서 TNF 길항물질을 발현시키고 분비한다]을 활용할 수 있다. 또한, TNF 길항물질은 생물학적 활성약물의 다른 성분, 예를 들면 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 희석제 또는 임의의 다른 담체와 함께 투여할 수 있다.

quot;제약학적으로 수용가능한"에는 활성 성분의 생물학적 활성 효과를 간섭하지 않고 투여된 숙주에 유해하지 않은 임의의 담체가 포함된다. 가령, 장관외 투여의 경우 TNF 길항물질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 담체에 녹여 주사용 단위 약형으로 제조할 수 있다.

장관외(예, 정맥내, 피하, 근육내) 투여용 TNF 길항물질은 제약학적으로 수용가능한 장관외 담체(예, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(예, 만니톨)이나 화학적 안정성(예, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 공동으로, 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결분말로 제조할 수 있다. 제형은 통상적으로 사용되는 기술로 멸균한다.

TNF 길항물질의 생체이용효율은 사람 체내에서 분자의 반감기를 증가시키는 공액 과정, 예를 들면 PCT 특허 출원 WO 92/13095에서 제시한 바와 같이 분자를 폴리에틸렌 글리콜에 결합시켜 향상시킬 수 있다.

TNF 길항물질의 치료요법적 효과량은 길항물질의 유형, TNF에 대한 길항물질의 친화도, 길항물질이 보이는 임의의 잔류 세포독성, 투여 경로, 환자의 임상적 상태(내인성 TNF 활성을 비-독성수준으로 유지시키는 소요정도 포함), 격리제(예, 항체)에서 다중 TNF 결합부위의 존재를 비롯한 다양한 변수로 구성되는 함수다.

quot;치료요법적 효과량"은 TNF 길항물질 투여로, TNF의 생물활성을 저해시키는 양이다. 개체에 단일 또는 복수 투여되는 용량은 TNF 길항물질의 약동학적 특성, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건장, 크기), 증상의 정도, 병행 치료, 치료빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다. 개 체에서 TNF의 저해를 측정하는 시험관내와 생체내 방법을 비롯하여, 기존 용량범위의 조정과 조작은 당업자의 통상적 능력에 속한다.

사람 임상 실험에서 TNF의 최대 허용량이 최대 25㎍/체표면㎡ /24시간이기 때문에, 투여되는 길항물질의 양은 일반적으로 TNF의 양을 중화시키는 계산된 분량을 초과하지 않는다. 따라서, TNF 길항물질의 분량은 전술한 바와 같이 치료요법적으로 임의 선택할 수 있는데, 최대로 허용되는 TNF 몰용량의 0.001 내지 10배 범위에서 변화된다.

게다가, 다양한 프로토콜을 이용하여 자궁내막염 여성의 복막액에서 TNF 농도의 증가를 입증한 임상 연구(Eisermann et al., 1988; Halme, 1991; Overton et al., 1996)에서 수득된 데이터 또한, 투여되는 TNF 길항물질의 효과량 결정에 유용하다.

일반적으로, 활성 성분의 일일 용량은 0.01 내지 100 mg/체중kg이다. 통상, 분할 복용 또는 지속 방출형으로 제공되는 1 내지 40mg/kg/day가 소요의 결과를 달성하는데 효과적이다. 이차 또는 이후의 투여는 개체에 대한 일차 또는 이전 투여량과 동일한, 이보다 적은 또는 이보다 많은 용량으로 실시할 수 있다. 이차 또는 이후 투여는 자궁내막염 또는 관련 증상의 재발동안, 재발이전 또는 재발이후에 실시할 수 있다. "재발"에는 자궁내막염의 하나 또는 복수 증상의 출현이 포함된다.

TNF 길항물질은 특히 불임의 치료를 위해 다른 치료요법적 섭생 또는 약물이전에, 이들과 동시에 또는 순차적으로, 치료요법적 효과량을 개체에 예방적 또는 치료요법적으로 투여할 수 있다. 다른 치료요법적 약물과 동시에 투여되는 TNF 길항물질은 동일 또는 상이한 조성물로 투여할 수 있다. 특히, 치료할 자궁내막염-관련 질환이 불임인 경우, 고도 정제된 원형 또는 재조합 형태로 생물학적 활성 인융모막 성선자극호르몬(hCG), 황체형성 호르몬(LH) 또는 뇌하수체 성선자극 호르몬(FSH)을 투여할 수 있다. 이런 분자 및 이들의 생산방법은 유럽 특허 출원 EP 160,699, EP 211,894, EP 322,438에서 제시한다.

본 발명은 실시예로 설명하는데, 이들 실시예는 본 발명을 제한하지 않고, 또한 다음의 도면을 참고로 한다.

도면의 간단한 설명

도1은 마지막 치료 2일과 9일후, 실험적 자궁내막염 생쥐에서 생착 크기에 대한 안티드(매 3일마다 2㎎/㎏ 피하 투여) 및 재조합 가용성 TNF-RI(1주일동안 일일 2번씩 10㎎/㎏, s.c.투여)의 효과를 보여준다. 첫 번째 희생 시점에서 6마리 동물/군 및 두 번째 희생 시점에서 5마리 동물/군을 이용하여 수득한 이들 데이터는 저해 ±SEM의 평균 퍼센트를 나타낸다.

도2는 마지막 치료 2일후(패널 A)와 9일후(패널 B), YAC 세포(⁵¹Cr 방출)에 대항하는 쥐 비장세포의 쥐 NK 활성에 대한 안티드(매 3일마다 2㎎/㎏ 피하 투여) 및 재조합 가용성 TNF-RI(1주일동안 일일 2번씩 10㎎/㎏, s.c.투여)의 효과를 보여준다. 데이터는 세포용해 ±SEM의 평균 퍼센트를 나타낸다.

도3은 쥐의 실험적 자궁내막염에서 에스트라디올-17β혈청 수준에 대한 안티 드(매 3일마다 2㎎/㎏ 피하 투여) 및 재조합 가용성 TNF-RI(1주일동안 일일 2번씩 10㎎/㎏, s.c.투여)의 효과를 대조군과 비교하여 보여준다. 데이터는 에스트라디올-17β±SEM의 평균 농도를 나타낸다.

실시예

재료와 방법

동물. 웅성 백서(Sprague-Dawley) 쥐(250-275g)는 Charles River Italia(Calco, Lecco, Italy)에서 구매하였다. 동물은 다음의 실험 환경에서 둔다: 온도 22 ±2℃, 상대습도 55 ±10%, 환풍 15 ±3 공기 교환/시간, HEPA 99.99% 필터에서 여과, 12시간(7:00-19:00) 생물학적 주기의 인공 조명. 실험전에, 동물은 1주일이상동안 이들 조건에 적응시킨다. 동물은 표준 펠렛 식단에 따라 임으로 사료를 먹인다.

조사 약물. 안티드는 Bachem(California, USA)에서 제조하여 제공하였다. 실시예에 사용되는 사람 재조합 가용성 TNF-RI 분자는 사람 TNF-RI의 20-180 분절에 상응하는 서열을 갖는데(Nophar et al., 1990), Interpharm Laboratories Ltd(Israel)가 CHO에 제조하여 상품명 r-hTBP-1로 제공하였다.

재료. 일반적인 세포배양 재료는 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, UK)에서 구매하였다. 에스트라디올-17βRIA 키트는 DPC(Los Angeles, CA, USA)에서 구매하였다. 이노케탐(Inoketam)은 Virbac(Carros, FR)에서 구매하였다. [⁵¹Cr]-크롬산나트륨은 NEN Dupont(Boston, MA, USA)에서 구매하였다. 럼 푼(Rompun)은 Bayer AG(Leverkusen, DE)에서 구매하였다. 실크 봉합사 7.0은 Ethicon(Pomezia, IT)에서 구매하였다.

자궁내막염의 쥐 실험모델. 자궁내막염에서 재조합 가용성 TNF-RI의 효과를 탐구하기 위하여, 전술한 실험모델(Jones, 1987)을 약간 변형하여 사용하였다. 이노케탐/럼푼 전신마취하에, 오른쪽 자궁각으로부터 자궁내막염 조직의 자가 단편(1㎝ 길이)을 절제하고, 37℃ PBS에 넣는다. 자궁 분절은 종적 절개로 개봉하고, 자궁근을 제거하지 않은 5 x 5㎜ 조각은 네군데 가장자리에 비-흡수성 실크 봉합사를 이용하여 복벽 내부면에 이식한다.

자궁내막염의 실험모델에서 조사 약물 효과의 탐구. 실험적 자궁내막염은 전술한 바와 같이 마취된 쥐에서 외과적으로 도입한다. 또한, 다른 쥐 군도 유사하게 자궁각 단편을 떼어내고, 자궁을 둘러싸는 5 x 5 ㎜ 지방조직을 이식한다(sham-operated 군). 외과적 수술을 받지 않은 또 다른 쥐 군은 정상적인 대조군으로 유지한다. 자궁내막염 유도 3주후에, 동물은 2차 개복술을 실시하여, 자궁외 자궁내막염 조직의 크기와 생존율을 평가한다. 표면(길이 X 폭)은 캘리퍼를 이용하여 측정하고 기록한다. 생존 착생을 보이는 동물은 표1에 도시한 바와 같이 처리군으로 지정하고, 실험 종결시점에서 첫 번째 희생 시점의 6마리 동물/군 및 두 번째 희생 시점의 5마리 동물/군을 수득한다. 1주일 회복기간후에 치료를 시작한다. 대조군에는 식염수만 공급한다. 다른 군에는 난소와 시상하부 활성을 억제하는 것으로 밝혀진 섭생(Sharpe et al., 1990)으로, 2㎎/㎏ 안티드를 매 3일마다 피하 주사한다. 또 다른 군에는 1주일동안 일일 2회에 걸쳐 10㎎/㎏ 재조합 가용성 TNF-RI을 제공한다.

표1

자궁내막염 착상	치료	치료 일자	희생 일자
No	식염수	28-34	36, 43
Sham-operated	식염수	28-34	36, 43
Yes	식염수	28-34	36, 43
Yes	안티드(2mg/kg)	28, 31, 34	36, 43
Yes	재조합 가용성 TNF-RI(일일 2회 10mg/kg)	28-34	36, 43

정해진 희생 시점(마지막 치료 2일후와 9일후, 즉 외과적 생착 36일후와 43일후)에서, 동물은 마취시킨다; 복부대동맥으로부터 혈액 샘플을 수거하고, 혈청은 분리하고 에스트라디올-17β수준 측정분석 때까지 -20℃로 보관한다. 비장은 고유 살해능(NK) 측정을 위해 절개한다. 각 희생 시점에서 자궁내막염-유사 병소의 표면 영역을 측정한다. 데이터를 표준화시키기 위하여, 변이 백분율 대 치료전 개복술 수치는 다음의 공식으로 계산한다:

여기서, X_o은 치료전 개복시점에서 크기이고, X는 희생시점에서 크기이다. 이후, 각 군에서 변이 백분율의 평균값을 계산한다.

NK 활성 측정. NK 활성의 정도는 ⁵¹Cr-방출 분석을 이용하여 측정한다. 뮤린 림프종 YAC-1 세포는 지수성장기동안 수거하고, 배지(페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 10% 열-불활화된 우태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640)로 한번 세척한 다. 세포 펠렛은 2시간동안 37℃, 5% CO₂에서 100μCi [⁵¹Cr]-크롬산나트륨과 함께 배양한다. 이후 세포는 10㎖ 분석 배지로 3회 세척하고, 원하는 농도로 재부유시키고 쥐 비세포 존재하의 분석 평판에 첨가한다. 이들은 원하는 농도(2 x 10⁶/㎖)로 분석 배지에서 재부유시키고, ⁵¹Cr-표지된 표적 세포의 첨가이전에 U-바닥 96-웰 평판의 3중 웰 분석 배지에서 연속희석을 실시한다. ⁵¹Cr-표지된 표적 세포(5 x 10³)는 분석 평판의 각 웰에 첨가하고, 각 샘플에 대하여 3가지 주효체-대-표적 비율(100:1, 100:1, 50:1)을 분석한다. 주효체-대-표적세포 혼합물을 함유하는 평판은 4분동안 200xg로 원심분리하고, 이후 4시간동안 37℃, 5% CO₂에서 배양한다. 평판은 4분동안 200xg로 추가 원심분리한 후, 각 웰로부터 20㎕ 상층액은 유리 섬유 필터로 이전하고, 관련된 방사능은 β-카운터로 계산한다.

세포용해의 퍼센트는 다음과 같이 계산한다:

여기서,

cpm_sample = 주효체 세포 존재하에 평균 ⁵¹Cr 방출

cpm_spont = 배양 배지 존재하에 표적 세포의 평균 ⁵¹Cr 방출

cpm_total = 1% 트리톤-X100 존재하에 표적 세포의 평균 ⁵¹Cr 방출.

에스트라디올-17β측정. 추출 단계없이 혈청에서 에스트라디올을 정량할 수 있는 상업적으로 입수가능한 키트(DPC, Los Angeles, CA, USA)를 이용하여 혈청 에스트라디올-17β농도를 측정하였다. 간단히 말하면, ¹²⁵I-표지된 에스트라디올은 항체 부위에 대하여 혈청 샘플내 에스트라디올과 경합한다. 배양후, 자유 에스트라디올 및 결합된 에스트라디올의 분리는 디캔팅(decanting)으로 달성한다. 이후, 튜브는 감마 카운터(LKB-Pharmacia Wallak)에서 계수하는데, 이의 수치는 혈청 샘플에 존재하는 에스트라디올의 양과 역비례한다. 샘플에서 에스트라디올의 양은 수치와 검량선(calibration curve)을 비교하여 측정한다. 항혈청은 에스트라디올에 대하여 특이적이고, 다른 자연 발생 스테로이드에 대해서는 상대적으로 낮은 교차-반응성을 보인다. 동일 실험중인 샘플은 단일 면역분석으로 분석한다.

통계 분석. 치료군간에 관찰되는 차이의 통계학적 유의성은 Statgraphics Plussoftware의 ANOVA(1.4 버전)를 이용하여 평가한다. 튜키 다중 범위 테스트(P<0.05)를 실시한다.

결과

실험적 자궁내막염에서 재조합 가용성 TNF-RI 효과의 탐구

쥐에서 외과적으로 이식된 자궁내막염 조직의 성공적인 성장과 발달은 사람에서는 조사할 수 없는 자궁내막염의 일부 특징을 연구하는데 사용할 수 있는 연구 모델을 제공하였다(Dudley et al., 1992). 쥐의 실험적 자궁내막염에서 이전 연구는 안티드가 긍정적인 대조군으로 적절히 기능한다는 것을 시사한다(Sharpe et al., 1990). 이 실시예에서, 안티드의 효과는 치료 전후 착생 크기의 수치 측면에서, 재조합 가용성 TNF-RI을 이용하여 수득된 수치와 비교한다(표2에 요약).

표2

치료	약량(mg/kg)	마지막 치료후관찰(일)	평균 ±SEM처리전 수치(㎠)	평균 ±SEM처리후 수치(㎠)
식염수	-	2	1.45 ±0.41	1.18 ±0.15
가용성TNF-RI	10	2	1.43 ±0.38	0.77 ±0.09
안티드	2	2	1.43 ±0.34	0.08 ±0.02
식염수	-	9	1.28 ±0.24	0.97 ±0.11
가용성TNF-RI	10	9	1.42 ±0.38	0.54 ±0.19
안티드	2	9	1.41 ±0.32	0.19 ±0.09

결과는 도1에서 착생된 자궁내막 단편의 평균 저해 백분율(전술한 바와 같이 계산됨)로 나타낸다.

안티드는 자궁내막염-유사 병소의 크기를 감소시키고(도1), 치료 중단후 양 관찰 시점에서 거의 완전한(각각 원 수치에 비하여 94%와 88%) 완화 및 통계학적으로 유의성있는(p<0.05, ANOVA와 튜키 테스트) 완화를 유도하는데 효과적이다. 사람 재조합 가용성 TNF-RI(10㎎/㎏, 일일 2회)을 이용한 1주 치료에서, 자궁내막염-유사 병소는 양 관찰시점에서 현저한 크기 감소(각각 원 수치에 비하여 33%와 64%)를 보인 반면, 통계학적으로 유의성있는 완화(p<0.05, ANOVA와 튜키 테스트)는 9일에만 관찰된다. 착생은 sham-operated 동물에서는 전혀 관찰되지 않는다.

시험관내 비장 세포 검사로 평가한 YAC 세포에 대한 NK 세포 활성은 비비에 서 관찰되는 것과 유사하게 군간에 별다른 차이를 보이지 않는데(도2), 여기서 자궁내막염에 걸린 또는 걸리지 않은 동물에서 안티자궁내막염 세포독성 및 NK 세포 활성의 차이는 발견되지 않는다(D'Hooghe et al., 1995). 이런 조사결과는 자궁내막염 환자에서 감소된 NK 활성이 감소된 복막 NK 활성 및 중증도의 자궁내막염과 상당한 상관관계를 갖는 것으로 보고되었던 인간 데이터와는 대조적이다(Oosterlynck et al., 1992).

혈청 에스트라디올-17β평가

혈청 에스트라디올-17β농도는 양 관찰시점에서 방사면역분석으로 측정한다. 제 2 관찰시점에서 치료받지 않은 대조군과 안티드-치료받은 군간에는 현저한 차이가 관찰된다. 대조군과 재조합 가용성 TNF-RI에서 통계학적으로 유의성있는 차이는 관찰되지 않는다(도3; p<0.05, ANOVA와 튜키 테스트).

결론

자궁내막염의 쥐 실험모델에서, TNF 길항물질인 가용성 TNF-RI의 투여는 처음으로, 전술한 병리학적 이상의 사이토킨-기초한 비-호르몬 치료에서 강력한 효능의 증거를 보여준다. 따라서, TNF 길항물질은 감소된 부작용의 측면에서 기존의 의학적 치료법의 대안을 제공한다. 이들 결과는 자궁내막염-관련된 불임의 치료에서 TNF 길항물질을 이용할 수 있다는 것을 시사한다.

당업자는 본원에서 밝힌 본 발명에 따른 특정 구체예의 다수 등가물을 과도한 실험없이 용이하게 인지할 수 있을 것이다. 이들 등가물은 하기 청구항의 범위에 포함된다.

Claims

자궁내막염 병소를 감소시켜 이식과 임신율을 향상시키기 위한 제약학적 조성물 제조에 이용되는 TNF 길항물질.
자궁내막염을 치료 및/또는 예방하는 방법에 있어서, 환자에게 TNF 길항물질의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
활성성분으로 TNF 길항물질을 포함하고 약학적으로 수용가능한 담체로 구성된 자궁내막염의 치료 및/또는 예방용 약학 조성물.
활성성분으로 TNF 길항물질을 포함하고 약학적으로 수용가능한 담체로 구성된자궁내막염 병소를 감소시켜 이식과 임신율 향상 목적의 약학 조성물.
제 3 항 또는 4 항에 있어서, TNF 길항물질은 TNF의 특정 에피토프와 결합하여 TNF가 더 이상 막-결합된 TNF 수용체와 결합할 수 없도록 하는 폴리펩티드인 약학 조성물.