SK287313B6

SK287313B6 - Použitie TNF antagonistu a farmaceutický prostriedok s obsahom TNF antagonistu

Info

Publication number: SK287313B6
Application number: SK1029-2001A
Authority: SK
Inventors: Francesco Borrelli; Mauro D'ANTONIO; Fabrizio Martelli
Original assignee: Laboratoires Serono Sa
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2010-06-07
Also published as: BR0008182A; EP1143997B1; EA003927B1; US20040057954A1; KR20060128056A; NO20013577D0; CA2356737A1; WO2000043031A1; PL204713B1; JP2002535284A; JP4601176B2; CN1698894A; CN1212152C; HK1082690A1; HK1043059A1; CZ302866B6; PL350002A1; EP1022027A1; IL144413A0; CA2356737C

Abstract

Použitie TNF antagonistu na výrobu liečiva na liečenie a/alebo prevenciu endometriózy, kde TNF antagonista je sekvestrovací antagonista alebo signalizačný antagonista. Opísané antagonisty sú vybrané z rôznych tried molekúl, výhodne sú rozpustné TNF receptory, ktoré sú účinné pri regresii endometrických lézií a v kombinácii s inými účinnými látkami aj na zlepšenie súvisiacich porúch, ako napríklad neplodnosti.

Description

Antagonisty nádorového nekrotického faktora sa podávajú v terapeuticky účinných dávkach na liečbu a/alebo prevenciu endometriózy. Antagonisty podľa tohto vynálezu sú typicky vybrané z rôznych tried molekúl, ale výhodne sú rozpustnými TNF receptormi. Antagonisty sú užitočné na regresiu endometrických lézií, a ak sa kombinujú s inými účinnými zložkami, na zlepšenie príbuzných porúch, napríklad neplodnosti.

Doterajší stav techniky

Endometrióza je ženská pohlavná choroba vyznačujúca sa prítomnosťou endometriálnych žliaz a strom mimo endometriálnej dutiny a svaloviny maternice. Najčastejšie poškodenými anatomickými miestami sú vaječníky, uterosakrálne ligamenty, panvové peritoneum, rektovaginálne septum, kŕčok maternice, vagína, fallopianové rúrky a vulva. Vo všeobecnosti endometrióza pravdepodobne infiltruje hlboko z retrovaginálneho septa do podpovrchových tkanív a nie je viditeľná povrchovo. Občas sa miesta endometriózy môžu nachádzať extraovariálne, napríklad v pľúcach, močovom mechúre, pokožke, pleure a lymfatických uzlinách. Endometrické lézie sú progresívne: najprv je ich možné vidieť ako priezračné vezikuly, ktoré potom červenajú a postupne sa z nich stávajú v priebehu niekoľkých rokov čierne fibrotické lézie (MacSween, 1993).

Endometrióza je považovaná za benígne ochorenie, ale endometrické lézie sa občas môžu stať malígnymi. Tak ako iné druhy malignít je vývin neoplaziem odvodených od endometriózy spôsobený paralelnými udalosťami zahŕňajúcimi zmeny v rastových faktoroch a/alebo regulácii onkogénov (Cheung, 1996).

Endometrióza patrí medzi najbežnejšie gynekologické ochorenia, pričom prevláda u žien v produktívnom veku: táto choroba je zistená u približne 5 až 10 % žien v reproduktívnom veku (Barbieri, 1988). Aby kontinuálne rástlo, je endometrické tkanivo úplne závislé od estrogénu, aj v ektopických lokalitách. Z toho vyplýva, že endometrióza je zriedkavá pred menarche a po menopauze, keď sa u ženy nenachádza estrogén. Hormonálna senzitivita endometriózy je príčinou niektorých z bežnejších symptómov, ktorými sú panvová bolesť a dysmenorrhea.

Endometrióza vzniká z endometriálnych buniek rozšírených z maternice do iných lokalít, kde sa môžu životaschopné bunky implantovať a rásť. Na vysvetlenie počiatočného rozšírenia buniek boli navrhnuté dva možné mechanizmy. Retrográdna menštruácia, bežný fenomén u menštruujúcich žien, keď je možné, že oddelené fragmenty endometria dosiahnu prostredníctvom endometriálnej refluxnej tekutiny susedné štruktúry v genitálnom aparáte. Alternatívne, na vysvetlenie výskytu endometriózy v miestach mimo genitálnych štruktúr, môžu sa endometriálne bunky šíriť prostredníctvom maternicových ciev a prostredníctvom lymfatického systému (hematogénne alebo lymfatické šírenie). Aj gynekologický chirurgický zákrok sa môže podieľať na tomto šírení (MacSween, 1993).

Na náchylnosti žien na endometriózu sa môžu okrem rozsevu endometriálnych buniek podieľať aj iné faktory, ako napríklad genetická predispozícia (Malinak a ďalší, 1980), ako aj imunologické zmeny (Ho a ďalší, 1997). Keďže je endometriálne bunky možné často vidieť v peritoneálnej tekutine u všetkých žien v čase menštruácie, mali by mať cicavce mechanizmy, najpravdepodobnejšie príbuzné s imunitným systémom, ktoré zabraňujú nástupu endometriózy. Vo všeobecnosti, endometriálne bunky, ktoré uniknú hostiteľskej imunitnej odpovedi a majú adekvátnu estrogénnu stimuláciu, môžu proliferovať, čím vytvárajú veľké, makroskopický viditeľné lézie. Endometrióza je preto považovaná za dynamický proces, v ktorom sa kontinuálne vytvárajú nové lézie, zatiaľ čo existujúce lézie môžu rásť alebo byť ničené hostiteľskou imunitnou odpoveďou.

Zápalová reakcia, normálne spojená s endometriózou, mení peritoneálne prostredie, pretože sa zvyšuje objem peritoneálnej tekutiny a zvyšuje sa počet aj aktivita peritoneálnych makrofágov. Preto bol monocytový/makrofágový systém navrhnutý ako systém, ktorý má kľúčovú úlohu vo vývoji endometriózy. Zistilo sa, že sekrečné produkty makrofágov zahŕňajúc RANTES (Homung a ďalší, 1997), interleukín-6 (Harada a ďalší, 1997), interleukín-8 (Arici a ďalší, 1996a), nádorový nekrotický faktor alfa (Overton a ďalší, 1996), monocytový chemotaktický proteín-1 (Arici a ďalší, 1997), majú vyššiu koncentráciu v peritoneálnej tekutine žien postihnutých touto chorobou. U žien s endometriózou boli demonštrované imunologické zmeny, ale nebolo demonštrované, či sú tieto udalosti zodpovedné za endometriózu, alebo či sú výsledkom zápalu spôsobeného endometriózou (Rana a ďalší, 1996).

Znalosti o endometrióze a jej vplyve na iné poruchy sú doteraz obmedzené, aj na diagnostickej úrovni. Hoci je endometrióza považovaná za hlavnú príčinu neplodnosti, sú štúdie patofyziológie choroby protichodné a nie sú definitívne. Existuje slabá korelácia medzi stupňom bolesti alebo neplodnosti a závažnosťou choroby, keďže skoré lézie sú metabolický aktívnejšie. Výskyt neplodnosti je vyšší ako v normálnej populácii a štúdie králikov ukázali, že chirurgická indukcia endometriózy vedie k zníženiu fertility o 75 % až 25 % (Hahn a ďalší, 1986). Zistilo sa, že pacientky s bolesťou panvy majú po čase endometriózu v 71 %, zatiaľ čo 84 % pacientiek s bolesťou panvy a neplodnosťou malo diagnostikovanú endometriózu (Koninckx a ďalší,

1991). Vo všeobecnosti sa môže zistiť neplodnosť, keď je endometrióza v takom rozsahu, že poškodzuje normálnu vaginálnu štruktúru, zatiaľ čo podiel tehotnosti je normálny, keď je endometrióza minimálna.

Endometrióza môže ovplyvňovať fertilitu aj iným spôsobom. Koncentrácie látok prenášajúcich správy bielych krviniek, ako interleukínu-6, interferónu a nádorového nekrotického faktora, sú zvýšené, čo negatívne ovplyvňuje interakciu oocytu a spermie. Zistilo sa, že vzorky získané od žien z endometriózou sú embryotoxické v modeloch s myšacím embryom a inhibujú mobilitu spermií in vitro (Halme, 1991), pričom účinok je zosilnený, keď sa pridá rekombinantný nádorový nekrotický faktor alfa (Eisermann, 1989). Ale tieto štúdie sa nezaoberali problémom ako cytokíny ovplyvňujú progresiu endometriózy, ale len ukázali účinky takýchto molekúl na životaschopnosť spermatických a embryotických buniek.

Hormonálna terapia a chirurgický zákrok sú dve terapeutické možnosti, ktoré sa v súčasnosti používajú na liečbu endometriózy. Súčasná farmakologická terapia endometriózy vyžaduje hormonálnu supresiu produkcie estrogénu, aby čisté hormonálne prostredie blokovalo rast ektopického tkaniva. Čo sa týka liečby neplodnosti súvisiacej s endometriózou, nepotvrdil sa účinok hormonálnej terapie u pacientiek s minimálnou chorobou, zatiaľ čo iné štúdie ukázali zvýšenie podielu tehotností (Arici a ďalší, 1996b).

Hormonálne terapie zahŕňajú vysoké dávky progestogénov, kombinácie estrogénu a progesterónu (používanie vysokých dávok orálnych antikoncepčných tabletiek, alebo OCPs, v „pseudograviditnom“ režime), Danazol (androgénny derivát etisterónu) a najnovšie GnRH agonistov. Tieto hormonálne terapie sú účinné na panvovú bolesť a indukujú objektívnu regresiu lézií, ale majú niekoľko negatív. Estrogén môže stimulovať a spôsobiť proliferáciu endometriotického tkaniva, keďže môže byť neschopný odpovedať na progesterón aj vo vysokých dávkach, takže OCPs môžu poskytnúť čiastočnú úľavu obmedzenému počtu pacientiek (Dawood, 1993). Progestačné činidlá môžu provokovať nepravidelné krvácanie (50 %) spolu s depresiou, naberaním hmotnosti a zadržiavaním tekutiny. Danazol suprimuje endometriózu, pričom evokuje rôzne odpovede vrátane zníženia hladín rozpustného nádorového nekrotického faktora alfa, interleukínu-1 beta a CD8 v sére (Matalliotakis, 1997; Mori, 1990), inhibície de novo steroidogenézy a premiestňovania estradiolu z jeho receptora. Danazol môže zlepšiť symptómy u približne 66 až 100 % pacientiek trpiacich bolesťou, ale hrubý podiel opätovného výskytu po až 4 rokoch je približne 40 % až 50 %. Inými negatívnymi dôsledkami Danazolovej terapie sú zvýšenie hmotnosti a androgénne vedľajšie účinky, ktoré môžu spôsobiť, že až 80 % pacientiek upustí od tejto liečby (Barbieri, 1988). GnRH analógy sú účinnejšie a dlhšie pôsobia ako prirodzený GnRH, ktorý pracuje prostredníctvom odstraňovania estrogénneho stimulu na rast všetkých estrogénne senzitívnych tkanív. Vedľajšie účinky GnRH analógov sú najmä sekundárne vo vzťahu k vážnej hypoestrogenémii, ako napríklad znížená hustota kostí a podiel opätovného výskytu do 50 % po 5 rokoch (Waller a Shaw, 1993).

V závislosti od stupňa ochorenia môže byť chirurgická intervencia konzervatívna, ak je želateľná fertilita, alebo môže viesť k odstráneniu maternice, vajíčkovodov a vaječníkov v prípade vážneho ochorenia. V každom prípade aj obmedzená chirurgická liečba vedie k významnému poklesu fertility. Podiel tehotnosti po chirurgickom zákroku je vo všeobecnosti v rozsahu medzi 35 % a 65 %, takže pacientky potrebujú indukciu ovulácie a intrauterinnú insemináciu, aby dosiahli normálnu fekunditu (Koninckx a Martin, 1994). Klinické správy ukazujú, že po laparotómii a resekcii endometriózy do 40 % pacientiek vyžaduje opätovnú operáciu do 5 rokov. Aj po agresívnom chirurgickom zákroku ostáva opätovný výskyt bolesti z endometriózy významným problémom. Niektoré dôvody zlyhania chirurgickej terapie môžu zahŕňať nekompletnú resekciu lézií, ktoré buď neboli rozoznané, alebo boli úplne stratené. Mnohé lézie sú mikroskopické a nebolo by možné ich vizualizovať, iba ak laparoskopom vybaveným zväčšovacím zariadením. Preto sa nedá očakávať, že len samotný chirurgický zákrok vylieči toto ochorenie (Revelli a ďalší, 1995).

Keďže tak veľa pacientiek s endometriózou trpí na nežiaduce účinky tradičných terapií (vrátane následkov hormonálnej nerovnováhy, vysokého podielu opätovného výskytu a neplodnosti), je záujem poskytnúť alternatívne liečby endometriózy. Možný terapeutický prístup môže byť reprezentovaný použitím imunomodulačných molekúl, ktoré by mohli byť schopné zlepšiť, tak endometrické lézie, ako aj imunologickú situáciu. Takýto prístup môže byť považovaný za vhodný na liečbu všeobecných symptómov (Rana a ďalší, 1996), ale neexistujú žiadne experimentálne dôkazy poukazujúce na to, ktorý cytokín z cytokínov so zmenenými hladinami expresie po endometrióze by mohol byť výhodným cieľom terapeutickej intervencie.

Ako bolo uvedené, jedným z niekoľkých makrofágových sekrečných produktov podieľajúcich sa na endometrickej zápalovej reakcii je nádorový nekrotický faktor (odtiaľto nižšie sa uvádza skratka TNF). TNF, definovaný aj ako Kachektín, je pleiotropný cytokín vylučovaný aktívnymi T bunkami a makrofágmi. TNF je členom interferónovej, interleukínovej a kolóniovej stimulačnej faktorovej cytokínovej siete, ktorá má kľúčovú úlohu v signalizačnom systéme podieľajúcom sa na patogenéze mnohých infekčných a zápalových ochorení prostredníctvom indukcie množstva prozápalových zmien vrátane produkcie iných cytokínov a adhéznych molekúl (Fiers, 1991).

Kvôli prehľadnosti bude výraz TNF v celom texte predloženej prihlášky kolektívne znamenať tak nádorový nekrotický faktor alfa, ako aj beta, zo zvierat alebo z ľudí, spolu s ich prirodzene sa vyskytujúcimi alelami TNF-alfa (Pennica a ďalší, 1984). TNF-beta, označovaný aj ako lymfotoxín, má podobnú aktivitu, ale je produkovaný odlišnými typmi buniek (lymfocytmi a prirodzenými zabíjačskými bunkami) ako odpoveď na antigénny alebo mitogénny stimul (Gray a ďalší, 1984).

TNF sa exprimuje ako zrelý 17 kDa proteín, ktorý je aktívny ako trimér. Tento komplex vykonáva svoju biologickú aktivitu agregovaním svojich povrchových bunkových receptorov, ktoré sprostredkúvajú špecifické účinky v rozličných orgánoch a tkanivách. V endometriu je expresia TNF závislá od miesta a menštruačného cyklu (Hunt a ďalší, 1992) a indukuje apoptózu v endometriu experimentálnych zvierat (Shalaby a ďalší, 1989). Adherencia endometriálnych stromálnych buniek na mezoteliálne bunky sa významne zvýšilo predošetrením mezoteliálnych buniek s TNF (Zhang a ďalší, 1993), čím sa podporila myšlienka, že TNF sa môže podieľať na iniciácii a/alebo vývoji endometriózy.

TNF vykonáva svoju aktivitu, ktorá je potrebná pre normálny vývin a funkciu imunitného systému, prostredníctvom viazania rodiny na membránu naviazaných receptorových molekúl vrátane p55 TNF receptora I, ktorý je v literatúre definovaný aj ako TNF-RI, a p75 TNF receptora, ktorý je v literatúre definovaný aj ako TNF-RII (Bazzoni a Beutler, 1996). Dominancia TNF-RI pri transdukcii TNF signálu je navrhnutá prostredníctvom schopnosti agonistických protilátok špecifických pre tento receptor napodobovať väčšinu TNF indukovaných odpovedí (Shalaby a ďalší, 1990). Viazaním na svoje membránovo viazané receptory spúšťa TNF signalizačnú dráhu prostredníctvom cytoplazmatických mediátorov ako TRADD a TRAP-1 (pre TNF-RI) alebo TRAF-1 a TRAF-2 (pre TNF-RII), čo vedie k odlišnej bunkovej odpovedi, ako T bunkovej proliferácii, in vitro lýze nádorových buniek, dermálnej nekróze, inzulínovej rezistencii, apoptóze. Extraceluláme časti oboch TNF receptorov sa môžu oddeliť a tieto rozpustné receptory si zachovávajú schopnosť viazať TNF, inaktivovať TNF aktivitu vytvorením vysokoafinitných komplexov, a tým redukovaním viazania sa TNF na cieľové bunkové membránové receptory (Nophar a ďalší, 1990).

V endometriu sú hladiny membránovo viazaných TNF receptorov ovplyvnené podávaním estradiolu a/alebo progesterónu, čo vedie k dočasnej expresii TNF-RI špecifickej pre určitý typ buniek v myši (Roby a ďalší, 1996). Ale táto štúdia, podobne ako mnohé iné štúdie uskutočňované na rôznych modeloch týkajúce sa endometriózy, nedala žiadne podnety na skutočný in vivo účinok TNF a TNF-RI, či už naviazaných na membránu, alebo rozpustných, vo vývoji endometrických lokalít, ale poskytla len opis imunologických abnormalít asociovaných s endometriózou.

Podstata vynálezu

Predložená prihláška vynálezu je založená na predpoklade, že TNF antagonista je schopný, sekvestrovaním cirkulujúceho TNF, blokovať progresiu endometrických lézií. Tento predpoklad je potvrdený zistením opísaným v príklade, ktoré ukazuje, že TNF antagonista významne redukuje veľkosť lokalít podobných endometrickému tkanivu v potkaňom experimentálnom modeli.

Podstatou vynálezu je preto použitie TNF antagonistu na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu endometriózy u jedinca.

V druhom uskutočnení sa vynález týka použitia TNF antagonistu v kombinácii s inými liečivami na liečenie a/alebo prevenciu stavov neplodnosti vzťahujúcim sa na endometriózu u jedinca.

Ďalším predmetom predloženého vynálezu je použitie TNF antagonistu spolu s farmaceutický prijateľným nosičom na prípravu farmaceutických prostriedkov na liečbu endometriózy.

V predloženom vynáleze môže byť podávanie TNF antagonistu parenterálne alebo v iných účinných formuláciách. Vhodný môže byť akýkoľvek spôsob parenterálneho podávania vrátane intravenózneho, intramuskulámeho a subkutánneho. Okrem farmaceutický prijateľného nosiča môže prostriedok podľa vynálezu obsahovať aj minoritné množstvá aditív, ako napríklad stabilizátorov, excipientov, tlmivých roztokov a konzervačných látok.

TNF antagonisty užitočné v spôsobe podľa predloženého vynálezu zahŕňajú rozpustné TNF receptorové molekuly, anti-TNF protilátky a zlúčeniny, ktoré zabraňujú a/alebo inhibujú TNF recpetorovú signalizáciu. Je možné použiť TNF antagonistu samostatne alebo v kombinácii s inými TNF antagonistami. Možná je aj kombinácia s jedným alebo viacerými farmaceutický aktívnymi produktmi, najmä na odstránenie stavov pacientiek trpiacich neplodnosťou súvisiacou s endometriózou.

Tu opísaný vynález jasne ukazuje neočakávaný výsledok, kedy sekvestrovanie TNF (ktorý je len jedným z niekoľkých cytokínov, ktorých úroveň expresie sa zvyšuje v peritoneálnej tekutine po endometrióze) prostredníctvom TNF antagonistu redukuje v potkaňom experimentálnom modeli miesta podobné endometrickému tkanivu. Tento model demonštruje aj to, že takýto účinok sa získava bez významného ovplyvnenia hormonálnej rovnováhy a aktivity prirodzených zabíjačských buniek. Redukcia endometrických lézií použitím TNF antagonistov môže zlepšiť aj podiel fertility, keďže normalizácia genitálnej štruktúry má pozitívny účinok na implantačný pomer.

Preto je hlavným predmetom predloženého vynálezu poskytnúť spôsob liečby a/alebo prevencie endometriózy u jedinca, ktorý zahŕňa podávanie terapeuticky účinného množstva TNF antagonistu.

V druhom uskutočnení sa vynález týka spôsobu liečby stavov neplodnosti súvisiacich s endometriózou u jedinca, ktorú zahŕňa podávanie terapeuticky účinného množstva TNF antagonista v kombinácii s inými liečivami.

Ešte ďalším predmetom predloženého vynálezu je použitie TNF antagonista spolu s farmaceutický prijateľným nosičom na prípravu farmaceutických prostriedkov na liečbu a/alebo prevenciu endometriózy. Ďalším predmetom predloženého vynálezu sú aj farmaceutické prostriedky pripravené týmto spôsobom.

Účinnými zložkami ta nárokovaných prostriedkov sú TNF antagonisty. Nárokované TNF antagonisty vykonávajú svoju aktivita jedným z dvoch spôsobov. Po prvé, antagonisty sa môžu viazať na alebo môžu byť sekvestrované TNF molekulou samotne s dostatočnou afinitou a špecificitou, aby v podstate neutralizovali TNF epitop zodpovedný za TNF receptorové viazanie (ta sú označované ako „sekvestrovacie antagonisty“). Alternatívne, TNF antagonisty môžu inhibovať TNF signalizačnú dráhu aktivovanú bukovým povrchovým receptorom po TNF naviazaní (ta označované ako „signalizačné antagonisty“). Obe skupiny antagonistov sú užitočné, buď samostatne, alebo spolu, na liečbu endometriózy podľa predloženého vynálezu.

TNF antagonisty je možné jednoducho identifikovať a zhodnotiť rutinným skríningom kandidátov z hľadiska ich účinku na aktivita prirodzeného TNF na vnímavých bunkových líniách in vitro, napríklad na ľudských B bunkách, v ktorých TNF spôsobuje proliferáciu a sekréciu Ig. Test obsahuje TNF formuláciu s rôznymi riedeniami kandidátskeho antagonista, napr. od 0,1 do 100 násobku molámeho množstva TNF použitého v teste, a kontroly bez TNF alebo len s antagonistom (Tucci a ďalší, 1992).

Sekvestrovacie antagonisty sú výhodné TNF antagonisty podľa predloženého vynálezu. Spomedzi sekvestrovacích antagonistov sú výhodné tie polypeptidy, ktoré viažu TNF s vysokou afinitou a majú nízku imunogénnosť. Výhodné sú najmä rozpustné TNF receptorové molekuly a neutralizačné protilátky proti TNF. Užitočné podľa predloženého vynálezu sú napríklad TNF-RI a TNF-RII. Výhodnejšími antagonistmi podľa predloženého vynálezu sú skrátené formy týchto receptorov, obsahujúce extraceluláme domény receptorov alebo ich funkčné časti. Skrátené formy TNF receptorov sú rozpustné a boli detegované v moči a sére ako 30kDa a 40kDa TNF inhibičné viažuce proteíny, ktoré boli pôvodne označené TBPI a TBPII (Engelmann a ďalší, 1990). Deriváty, fragmenty, oblasti a biologicky aktívne časti receptorových molekúl funkčne napodobujú receptorové molekuly, ktoré môžu byť použité v predloženom vynáleze. Takýto biologicky aktívny ekvivalent alebo derivát receptorovej molekuly znamená časť uvedeného polypeptidu alebo sekvencie kódujúcej receptorovú molekulu, ktorá je dostatočne veľká a schopná viazať TNF s takou afinitou, že interakcia na membránu naviazaného TNF receptora je inhibovaná alebo blokovaná. Vo výhodnom uskutočnení je TNF antagonistom, ktorý sa má podávať pacientkám, rozpustný TNF-RI. Prirodzené a rekombinantné rozpustné TNF receptorové molekuly a spôsoby ich produkcie boli opísané v európskych prihláškach vynálezu EP308378, EP398327 a EP433900.

TNF receptorové multiméme molekuly a TNF imunoreceptorové fúzované molekuly a ich deriváty alebo časti sú ďalšími príkladmi receptorových molekúl užitočných v spôsoboch podľa predloženého vynálezu. TNF receptorové multiméme molekuly užitočné v predloženom vynáleze obsahujú celú alebo funkčnú časť extracelulámej domény dvoch alebo viacerých TNF receptorov spojených prostredníctvom jedného alebo viacerých polypeptidových spojovníkov. Multiméme molekuly môžu ďalej obsahovať signálny peptid sekretovaného proteínu na priamu expresiu multimémej molekuly. Tieto multiméme molekuly a spôsoby ich produkcie boli opísané v európskej prihláške vynálezu EP526905.

TNF imunoreceptorové fúzované molekuly užitočné v spôsoboch podľa predloženého vynálezu obsahujú najmenej časť jednej alebo viacerých imunoglobulínových molekúl a celý alebo funkčnú časť jedného alebo viacerých TNF receptorov. Tieto imunoreceptorové fúzované molekuly môžu byť zostavené ako monoméry alebo ako hetero- alebo homomultiméry. Imunoreceptorové fúzované molekuly môžu byť aj monovalentné alebo multivalentné. TNF imunoreceptorové fúzované molekuly a spôsoby ich produkcie boli opísané v európskej prihláške vynálezu EP620739, zodpovedajúcej PCT prihláške vynálezu WO94/06476.

Iná trieda sekvestrujúcich antagonistov užitočných v spôsobe podľa predloženého vynálezu je reprezentovaná anti-TNF protilátkami vrátane monoklonálnych, chimémych humanizovaných a rekombinantných protilátok a ich fragmentov, ktoré sa vyznačujú vysokoafinitným viazaním sa na TNF in vivo a nízkou toxicitou. Protilátky, ktoré môžu byť použité vo vynáleze, sa vyznačujú ich schopnosťou liečiť pacientky tak dlho, že je to dostatočné na dobrú až vynikajúcu regresiu endometrických lézií, odstránením symptómov a nízkou toxicitou. Neutralizačné protilátky je možné jednoducho vyvolať u zvierat, ako napríklad králikov alebo myší, imunizáciou s TNF. Na poskytnutie zdrojov B buniek na výrobu hybridómov, ktoré sa ďalej kultivujú na produkciu veľkých množstiev anti-TNF monoklonálnych protilátok, sú užitočné najmä imunizované myši. Chimérne protilátky sú imunoglobulínové molekuly vyznačujúce sa dvomi alebo viacerými segmentmi alebo časťami odvodenými od odlišných živočíšnych druhov. Vo všeobecnosti je variabilná oblasť chimérnej protilátky odvodená od inej ako humánnej cicavčej protilátky, ako napríklad od hlodavčej monoklonálnej protilátky, a imunoglobulínová konštantná oblasť je odvodená od humánnej imunoglobulínovej molekuly. Výhodne majú obe oblasti a kombinácia nízku imunogénnosť, ako sa rutinne stanovuje (Elliott a ďalší, 1994). Humanizované protilátky sú imunoglobulínové molekuly vytvorené technikami genetického inžinierstva, v ktorých sú hlodavčie konštantné oblasti nahradené humánnymi náprotivkami, zatiaľ čo si zachovávajú hlodavčie antigén viažuce oblasti. Výsledná myšia-humánna chiméma protilátka by mala mať zníženú imunogénnosť a zlepšené farmakokinetiky u ľudí (Knight a ďalší, 1993). Výhodné príklady vysokoafínitných monoklonálnych protilátok a ich chimémych derivátov, užitočné v spôsoboch podľa predloženého vynálezu, sú opísané v európskej prihláške vynálezu EP186833 a PCT prihláške vynálezu WO92/16553.

TNF antagonista môže byť podávaný jedincovi rôznymi spôsobmi. Spôsoby podávania zahŕňajú intradermálny, transdermálny (napr. vo formuláciách s pomalým uvoľňovaním), intramuskulámy, intraperitoneálny, intravenózny, subkutánny, orálny, epidurálny, topický a intranazálny spôsob. Použité môžu byť akékoľvek iné terapeuticky účinné spôsoby podávania, napríklad absorpcia cez epiteliálne alebo endoteliálne tkanivá alebo génová terapia, pri ktorej sa pacientke podáva DNA molekula kódujúca TNF antagonistu (napr. prostredníctvom vektora), čo spôsobuje, že TNF antagonista sa exprimuje a vylučuje in vivo. Okrem toho môže byť TNF antagonista podávaný spolu s inými zložkami biologicky účinných činidiel, ako napríklad s farmaceutický prijateľnými povrchovo aktívnymi látkami, excipientmi, riedidlami a akýmkoľvek iným nosičom.

Definícia „farmaceutický prijateľný“ je mienená tak, že zahŕňa akýkoľvek nosič, ktorý neinterferuje s účinnosťou biologickej aktivity účinnej zložky, a ktorý nie je toxický voči hostiteľovi, ktorému sa podáva. Napríklad, na parenterálne podanie môže byť TNF antagonista formulovaný v jednotkovej dávkovej forme na injekciu vo vehikule, ako napríklad fyziologickom roztoku, dextrózovom roztoku, sérovom albumíne a Ringerovom roztoku.

Na parenterálne podanie (napr. intravenózne, subkutánne, intramuskuláme) môžu byť TNF antagonisty formulované ako roztok, suspenzia, emulzia alebo lyofilizovaný prášok v spojení s farmakologicky prijateľným parenterálnym vehikulom (napr. vodou, fyziologickým roztokom, dextrózovým roztokom) a aditívami, ktoré udržiavajú izotonicitu (napr. manitolom) alebo chemickú stabilitu (napr. konzervačné látky a tlmivé roztoky). Formulácia sa sterilizuje bežne používanými technikami.

Biologická dostupnosť TNF antagonistu sa môže zlepšiť aj použitím konjugačných procedúr, ktoré predlžujú polčas rozpadu molekuly v ľudskom tele, napríklad spojením molekuly s polyetylénglykolom, ako je opísané v PCT prihláške vynálezu WO 92/13095.

Terapeuticky účinné množstvá TNF antagonistu budú funkciou mnohých premenných vrátane typu antagonistu, afinity antagonistu proti TNF, akejkoľvek zvyškovej cytotoxickej aktivite vykazovanej antagonistmi, spôsobu podania, klinického stavu pacientky (vrátane požiadavky udržať netoxickú úroveň aktivity endogénneho TNF), prítomnosti viacerých TNF kombinačných miest v sekvestračných činidlách, napr. protilátkach.

„Terapeuticky účinné množstvo“ je také, že keď sa podáva, TNF antagonista vedie k inhibícii biologickej aktivity TNF. Dávka, podávaná ako jednotková alebo ako viacero dávok, jedincovi sa bude meniť v závislosti od rôznych faktorov vrátane TNF antagonistových farmakokinetických vlastností, spôsobu podania, stavov pacientky a charakteristík pacientky (pohlavie, vek, telesná hmotnosť, zdravotný stav, veľkosť), rozsahu symptómov, paralelných terapií, frekvencie liečby a požadovaného účinku. Nastavenie a manipulácia v stanovenom rozsahu dávok, ako aj in vitro a in vivo spôsoby stanovenia inhibicie TNF v jednotlivcovi, patria do schopností priemerného odborníka v oblasti.

Keďže maximálna tolerovaná dávka TNF v humánnych klinických pokusoch bola v rozsahu do približne 25 mikrogramov/m² telesného povrchu za 24 hodín, podávané množstvo antagonistu vo všeobecnosti nesmie prekročiť dávku, ktorá je vypočítaná na neutralizáciu tohto množstva TNF. Z toho vyplýva, že moláma dávka TNF antagonistu bude varírovať od približne 0,001 do 10 násobku maximálnej tolerovanej molámej dávky TNF, hoci ako bolo poznamenané, táto dávka bude z veľkej časti predmetom voľného terapeutického posúdenia.

Okrem toho môžu byť pri určovaní TNF antagonistovej účinnej dávky, ktorá sa má podať, užitočné aj údaje získané z klinických štúdií, v ktorých sa demonštrovala zvýšená koncentrácia TNF v peritoneálnej tekutine u žien s endometriózou použitím rôznych protokolov (Eisermann a ďalší, 1988; Halme, 1991; Overton a ďalší, 1996).

Zvyčajne môže byť denná dávka účinnej zložky približne 0,01 až 100 miligramov na kilogram telesnej hmotnosti. Bežne je 1 až 40 miligramov na kilogram na deň podávané v rozdelených dávkach alebo vo forme s neprerušovaným vylučovaním účinné na získanie požadovaných výsledkov. Druhé alebo následné podania sa môžu uskutočňovať v dávke, ktorá je rovnaká, nižšia alebo vyššia ako počiatočná alebo predchádzajúca dávka podaná jedincovi. Druhé alebo nasledujúce podania sa môžu podávať počas alebo pred recidívou endometriózy alebo príbuzných symptómov. Výrazy „recidíva“ alebo „opätovný výskyt“ sú definované tak, že zahŕňajú objavenie sa jedného alebo viacerých symptómov endometriózy.

TNF antagonista sa môže podávať profylaktický alebo terapeuticky jedincovi pred, simultánne alebo postupne s inými terapeutickými režimami alebo činidlami (napr. režimy s viacerými liečivami), v terapeuticky účinnom množstve, najmä na liečbu neplodnosti. TNF antagonisty, ktoré sa podávajú simultánne s inými terapeutickými činidlami sa môžu podávať v rovnakých alebo v odlišných prostriedkoch. Najmä ak je cieľom liečiť neplodnosť asociovanú s endometrickou poruchou, môže byť podávaný biologicky aktívny ľudský choriový gonádotropín (hCG), luteinizačný hormón (LH) alebo folikuly stimulujúci hormón (FSH), a to buď v prirodzenej vysoko purifikovanej forme, alebo v rekombinantnej forme. Takéto molekuly a spôsoby ich produkcie boli opísané v európskych prihláškach vynálezu EP 160699, EP211894 a EP322438.

Predložený vynález bude teraz ilustrovaný príkladom, ktorý v žiadnom smere nie je mienený ako obmedzujúci, a odvoláva sa na nasledujúce obrázky.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje účinky Antidu (2 mg/kg, subkutánne podávaný každé 3 dni), rekombinantného rozpustného TNF-RI (10 mg/kg, podávané s.c. v dvoch denných dávkach počas týždňa) na veľkosť štepov u potkanov s experimentálnou endometriózou 2 dni a 9 dní po poslednom ošetrení. Tieto údaje, ktoré boli získané použitím 6 zvierat v jednej skupine pre prvý usmrcovací časový bod a 5 zvierat v jednej skupine pre druhý usmrcovací časový bod, predstavujú priemerné percento inhibície ±SEM.

Obrázok 2 znázorňuje účinky rekombinantného rozpustného TNF-RI (10 mg/kg, podávaný s.c. v dvoch denných dávkach počas 1 týždňa) a Antidu (2 mg/kg, podávaný s.c. každé 3 dni) na NK aktivitu potkaních slezinových buniek proti YAC bunkám (⁵¹Cr vylučovanie) 2 dni (panel A) a 9 dní (panel B) po poslednom ošetrení. Údaje predstavujú priemerné percento lýzy ±SEM.

Obrázok 3 znázorňuje účinky rekombinantného rozpustného TNF-RI (10 mg/kg, podávaný s.c. v dvoch denných dávkach počas 1 týždňa) v porovnaní s kontrolou a Antidom (2 mg/kg, podávaný s.c. každé 3 dni) na hladiny estradiolu-17p v sére experimentálnych endometrických potkanov. Údaje predstavujú priemernú koncentráciu estradiolu-17p ±SEM.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Materiál a Metódy

Zvieratá. Samičky Sprague-Dawley potkanov (250 až 275 g) sa kúpili od Charles River Italia (Calco, Lecco, Taliansko). Zvieratá sa ubytovali v nasledujúcich podmienkach okolia: teplota 22 ± 2 °C, relatívna vlhkosť 55 ± 10 %, ventilácia 15 ± 3 výmeny vzduchu za hodinu, filtrované na HEPA 99,997 % filtroch a umelé osvetlenie s cirkadickým cyklom 12 hodín svetla (7:00-19:00). Pred experimentmi sa zvieratá nechali aklimatizovať na tieto podmienky najmenej jeden týždeň. Zvieratá sa kŕmili ad libitum štandardnou peletnou stravou.

Študované liečivá. Antid bol pripravený a poskytnutý firmou Bachem (Califomia, USA). Ľudská rekombinantná rozpustná TNF-RI molekula používaná v príklade mala sekvenciu zodpovedajúcu segmentu 20-180 ľudského TNF-RI (Nophar a ďalší, 1990) a bola pripravená v CHO bunkách a dodaná firmou Interpharm Laboratories Ltd. (Izrael) pod označením r-hTBP-1.

Materiál. Všeobecný bunkový kultivačný materiál bol kúpený od Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, UK). Estradiol-173 RIA kit bol kúpený od DPC (Los Angeles, CA, USA). Inoketam bol kúpený od Virbac (Carros, FR). Chróman [⁵¹Cr]-sodný bol kúpený od NEN Dupont (Boston, MA, USA). Rompun bol kúpený od Bayer AG (Leverkusen, DE). Silikónové šitie 7.0 bolo kúpené od Ethicon (Pomezia, IT).

Experimentálny model endometriózy na potkanoch. Na skúmanie účinkov rekombinantného rozpustného TNF-RI na endometriózu bol použitý predtým opísaný experimentálny model (Jones, 1987) s minimálnymi modifikáciami. V Inoketam/Rompun anestézii sa vyrezal autológny fragment endometrického tkaniva (dlhý 1 cm) z pravého rohu maternice a umiestnil sa do PBS na 37 °C. Longitudálnym rezom sa otvoril maternicový segment a transplantoval sa rez s veľkosťou 5x5 mm bez toho, aby sa odstránilo myometrium, na vnútorný povrch brušnej steny použitím neabsorbovateľného silikónového šitia v štyroch rohoch.

Skúmanie účinkov študovaných liečiv v experimentálnom modeli endometriózy. V anestetizovaných potkanoch sa indukovala experimentálna endometrióza, ako bolo opísané. Okrem toho sa v inej skupine potkanov podobne odstránil fragment rohu maternice, ale transplantoval sa štvorec tuku obklopujúceho maternicu s veľkosťou 5x5 mm (zdanlivo manipulované). Jedna ďalšia skupina potkanov, ktorá sa nepodrobila chirurgickej procedúre, sa udržiavala ako normálna kontrolná skupina. Tri týždne po indukcii endometriózy sa zvieratá podrobili sekundárnej laparotómii (predošetrujúca laparotómia), aby sa zhodnotila veľkosť a životaschopnosť ektopického endometrického tkaniva. Použitím posuvného meradla sa zmerala povrchová oblasť (dĺžka x šírka) a zaznamenala sa. Zvieratá vykazujúce životaschopné štepy sa určili do vybraných liečených skupín, ako je uvedené v tabuľke I tak, aby sa na konci experimentu získalo šesť zvierat v skupine pre prvý usmrcovací časový bod a päť zvierat v skupine pre druhý usmrcovací časový bod. Liečby začali po týždňovej zotavovacej perióde. Kontrolné skupiny dostali len fyziologický roztok; iná skupina dostala tri subkutánne injekcie 2 mg/kg Antidu každé 3 dni v režime, o ktorom sa predtým ukázalo, že suprimuje vaječníkovú a hypotalamovú aktivitu (Sharpe a ďalší, 1990). Ďalšia skupina dostala 10 mg/kg rekombinantného rozpustného TNF-RI rozdeleného na dve denné dávky počas 1 týždňa.

Tabuľka I

Transplantácia endometria	Ošetrenie	Počet dní ošetrovania^ )	Dni usmrtenia*¹¹
nie	fyziologický roztok	28 až 34	36, 43
zdanlivo manipulované	fyziologický roztok	28 až 34	36, 43
áno	fyziologický roztok	28 až 34	36, 43
áno	Antid (2 mg/kg)	28,31,34	36, 43
áno	rekomb., rozpusť TNF-RI (10 mg/kg v dvoch denných dávkach)	28 až 34	36, 43

(1) Odo dňa chirurgického prenesenia štepu (deň 1)

V určených usmrcovacích časových bodoch (2 a 9 dní po poslednom ošetrení, tzn. 36 a 43 dní po chirurgickom prenesení štepu) sa zvieratá anestetikovali; z abdominálnej aorty sa odobrali krvné vzorky, séra sa oddelili a uskladnili pri -20 °C, až kým sa neanalyzovali na určenie hladiny estradiolu-17p. Vybrali sa sleziny, aby sa merala aktivita prirodzených zabíjačov (NK). V každom usmrcovacom časovom bode sa merala povrchová oblasť miest podobných endometrickému tkanivu. Aby sa normalizovali údaje, vypočítalo sa percento variácie versus predošetrovacia laparotomická hodnota podľa vzorca:

(X-X_o)

------------x 100, Xo kde X_o je veľkosť v čase predošetrovacej laparotómie a X je veľkosť v čase usmrtenia. Potom sa vypočítala priemerná hodnota percentuálnej variácie v každej skupine.

Determinácia NK aktivity. Rozsah NK aktivity sa stanovil použitím ⁵ *Cr-vylučovacieho testu. Hlodavčie lymfómové YAC-1 bunky sa zozbierali počas exponenciálnej rastovej fázy a raz sa premyli s médiom (RPMI 1640 obsahujúcom penicilín/streptomycín, L-glutamin a 10 % teplom inaktivované fetálne hovädzie sérum). Bunkový pelet sa inkuboval so 100 pCi chrómanu [⁵¹Cr]-sodného pri 37 °C, 5 % CO2 2 hodiny. Bunky sa potom 3-krát premývali s 10 ml testovacieho média, resuspendovali sa v požadovanej koncentrácii a pridali sa na testovacie platne v prítomnosti potkaních splenocytov. Resuspendovali sa v testovacom médiu v požadovanej koncentrácii (2xl0⁶/ml) a uskutočnili sa sériové riedenia v testovacom médiu trojmo v jamkách 96-jamkovej platne s dnom v tvare U pred pridaním ⁵¹Cr-značených cieľových buniek. ⁵¹Cr-značené cieľové bunky (5x10³) sa pridali do každej jamky testovacej platne a pre každú vzorku sa testovali tri pomery efektor : cieľ (200 : 1, 100 : 1 a 50 : 1). Platne obsahujúce zmes efektor:cieľová bunka sa centrifugovali s rýchlosťou 200 ot./min. 4 min. a potom sa inkubovali pri 37 °C, 5 % CO2 4 hodiny. Po ďalšej centrifugácii platne s rýchlosťou 200 ot./min. 4 min. sa 20 μΐ supematanty z každej jamky prenieslo do filtra so sklenenými vláknami a asociovaná rádioaktivita sa zhodnocovala β-snímačom.

Percento lýzy sa vypočítalo nasledovne:

Cpm_vzorka ^P^spont.

_______________________________ x 100,

Cpíľlceíkové ~ ΟρΠ^ρθη^ kde cpm_vzorka = priemerné uvoľňovanie ⁵¹Cr v prítomnosti efektorových buniek cpmspont = priemerné uvoľňovanie ⁵¹Cr cieľovými bunkami v prítomnosti kultivačného média cpmce|_kovč = priemerné uvoľňovanie ⁵¹Cr cieľovými bunkami v prítomnosti 1 % Triton-X100

Stanovenie estradiolu-17β. Sérové koncentrácie estradiolu-17β sa stanovovali použitím komerčne dostupného kitu na kvantifikáciu estradiolu v sére bez extrakčného kroku (DPC, Los Angeles, C A, USA). Stručne, ¹²⁵I-značený estradiol súťaží s estradiolom vo vzorke séra pri naväzovaní na protilátkové miesta. Po inkubovaní sa oddelenie naviazaného estradiolu od voľného estradiolu dosiahlo dekantovaním. Skúmavka sa potom odčítala v gama snímači (LKB-Pharmacia Wallak), impulzy boli v inverznom vzťahu k množstvu estradiolu prítomnému vo vzorke séra. Množstvo estradiolu vo vzorkách sa stanovilo porovnaním impulzov s kalibračnou krivkou. Antisérum je vysoko špecifické pre estradiol s relatívne nízkou krížovou reaktivitou proti iným prirodzene sa vyskytujúcim steroidom. Vzorky z rovnakej experimentálnej várky sa analyzovali v jednom imunologickom teste.

Štatistická analýza. Štatistická významnosť rozdielov pozorovaných medzi ošetrovanými skupinami sa stanovila použitím ANOVA nachádzajúcom sa v Statgraphics Plus® softwari (Verzia 1.4). Uskutočnil sa Tukeyov viacnásobný hraničný test (P<0,05).

Výsledky

Skúmanie účinkov rekombinantného rozpustného TNF-RI pri experimentálnej endometrióze

Úspešný rast a vývoj chirurgicky transplantovaného endometrického tkaniva u potkanov ponúkol výskumný model, ktorý bol použitý na štúdium niektorých aspektov endometriózy, ktoré nie je možné adekvátne študovať u ľudí (Dudley a ďalší, 1992). Predchádzajúce štúdie potkanej experimentálnej endometriózy indikujú, že Antid dobre funguje ako pozitívna kontrola (Sharpe a ďalší, 1990). V predloženom príklade bol účinok Antidu porovnávaný, čo sa týka rozmerov štepu pred ošetrením a po ošetrení, s účinkom získaným použitím rekombinantného rozpustného TNF-RI, ako je zhrnuté v tabuľke II.

Tabuľka II

Ošetrenie	Dávka (mg/kg)	Pozorovanie po poslednom ošetrení (dni)	Priemer±SEM predošetrovacie hodnoty (cm²)	Priemer±SEM postošetrovacie hodnoty (cm²)
Fyziol. roztok	-	2	1,45 ±0,41	1,18 ±0,15
Rozp. TNF-RI	10	2	1,43 ±0,38	0,77 ± 0,09
Antid	2	2	1,43 ±0,34	0,08 ± 0,02
Fyziol. roztok	-	9	1,28 ±0,24	0,97 ±0,11
Rozp. TNF-RI	10	9	1,42 ± 0,38	0,54 ±0,19
Antid	2	9	1,41 ±0,32	0,19 ±0,09

Výsledky sú vyjadrené na obrázku 1 ako priemerné percento inhibície zaštepených endometrických fragmentov (vypočítané, ako bolo opísané).

Antid účinne redukoval veľkosť miest podobných endometrickému tkanivu (obrázok 1), indukoval takmer úplnú (94 %, respektíve 88 % v porovnaní s pôvodnými rozmermi) a štatisticky významnú (p<0,05, ANOVA a Tukey test) remisiu v oboch pozorovacích časových bodoch po prerušení liečby. Výsledkom 1týždňového ošetrovania s ľudským rekombinantným rozpustným TNF-RI (10 mg/kg, dve denné dávky) boli významné redukcie veľkosti (33 %, respektíve 64 % v porovnaní s pôvodnými rozmermi) miest podobných endometrickému tkanivu v oboch pozorovacích časových bodoch, ale štatisticky významná redukcia (p<0,05, ANOVA a Tukey test) nastala len na deň 9. Štepy neboli vôbec pozorované v zdanlivo spracovaných zvieratách.

Stanovenie NK bunkových aktivít

NK bunková aktivita stanovovaná in vitro testami so slezinovými bunkami oproti YAC bunkám nevykazovala žiadny rozdiel medzi skupinami (obrázok 2), podobne ako to bolo pozorované u paviánov, kde sa nezistil žiadny rozdiel v antiendometrickej cytotoxicite a NK bunkovej aktivite u zvierat s endometriózou alebo bez endometriózy (D’Hooghe a ďalší, 1995). Toto zistenie je v rozpore s humánnymi údajmi, kde bola publikovaná znížená NK aktivita u pacientiek s endometriózou s významnou koreláciou medzi zníženou peritoneálnou NK aktivitou a vážnosťou endometriózy (Oosterlynck a ďalší, 1992).

Zhodnotenie sérového estradiolu-17P

Koncentrácie sérového estradiolu-17β boli merané rádioimunologickým testom v oboch pozorovacích časových bodoch. Významný rozdiel bol pozorovaný v Antidom liečených skupinách v porovnaní s neošetrenými kontrolami v druhom pozorovacom časovom bode. Žiadne významné rozdiely neboli pozorované pre rekombinantný rozpustný TNF-RI, keď sa porovnával s kontrolami (obrázok 3; p<0,05, ANOVA a Tukey test).

Závery

V potkaňom experimentálnom modeli endometriózy poskytuje podávanie TNF antagonistu, rozpustnej formy TNF-RI, po prvý krát zrejmý dôkaz potenciálnej účinnosti liečby tohto patologického stavu založenej na cytokine bez vzťahu k hormónom. Takže TNF antagonisty predstavujú alternatívu k existujúcim medicínskym liečbam, pričom majú redukované vedľajšie účinky. Tieto výsledky určujú použitie TNF antagonistov na liečbu neplodnosti vyplývajúcej z endometriózy.

Priemerný odborník v oblasti bude poznať, alebo bude schopný určiť použitím nie zložitejších ako rutinných experimentov, mnohé ekvivalenty tu opísaných konkrétnych uskutočnení vynálezu. Tieto a všetky iné ekvivalenty sú mienené ako patriace do rozsahu nasledujúcich nárokov.

Zoznam literatúry

Arici, A., Tazuke, S. L., Attar, E., Kliman, H. J., and Olive, D. L., 1996a, Mol. Hum. Reprod. 2, 40-45.

Arici, A., Oral, E., Bukulmez, O., Duleba, A., Olive, D. L., and Jones, E. E., 1996b, Feml. Steril. 65, 603-607.

Arici, A., Oral, E., Attar, E., Tazuke, S. I., and Olive, D. L., 1997, Feml. Steril. 67, 1065-1072.

Barbieri, R. L., 1988, N. Engl. J. Med. 318,512-514.

Bazzoni, F. and Beutler, B., 1996, N. Engl. J. Med. 334, 1717-1725.

Cheung, A. N., 1996, Curr. Opin. Obstet.Gynecol. 8, 46-51.

D'Hooghe, T. M., Scheerlinck, J. P., Koninckx, P. R., Hill, J. A., and Bambra, CS., 1995, Hum. Reprod. 10, 558-562.

Dawood, M. Y., 1993, Int. J. Gynaecol. Obstet. 40 (Suppl.), S29-42.

Dudley, D. J., Hatasaka, H. H., Branch, D.W., Hammond, E., and Mitchell, M.D., 1992, Am. J. Obstet. Gynecol. 167, 1774-1780.

Eisermann, J., Gast, M. J., Pineda, J., Odem, R. R., and Collins J. L., 1988, Fertil. Steril. 50,573-579. Eisermann, J., Register, K. B., Strickler, R. C, and Collins J. L., 1989, J. Androl. 10, 270-274.

Elliott, M. J., Maini, R. N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, FL, and Woody, J. N., 1994, Lancet344, 1125-1127.

Engelmann, H., Novick, D., and Wallach, D., 1990, J. Biol. Chem. 265, 1531-1536. Fiers, W., 1991, FEBS Lett. 285,199-212.

Gray, P.W., Aggarwal, B. B., Benton, C. V., Bringman, T. S., Henzel, W. J., Jarrett, J. A, Leung, D. W., Moffat, B., Ng, P., and Svedersky, L. P., 1984, Náture 312,721-724.

Hahn, D. W., Carraher, R. P., Foldesy, R. G., and McGuire, J. L., 1986, Am. J. Obstet. Gynecol. 155, 1109-1113.

Halme, J., 1991, Ann. N. Y. Acad. Sci. 622, 266-274.

Harada, T., Yoshioka, H., Yoshida, S., Iwabe, T., Onohara, Y., Tanikawa, M., and Terakawa, N., 1997, Am. J. Obstet. Gynecol. 176, 593-597.

Ho, H. N., Wu, M. Y., and Yang, Y. S., 1997, Am. J. Reprod. Immunol. 38,400-412.

Homung, D., Ryan, I. P., Chao, V. A, Vigne, J. L., Schriock, E. D., and Taylor, R. N., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 1621-1628.

Hunt, J. S., Chen, H. L., Hu, X. L., and Tabibzadeh, S., 1992, Biol. Reprod. 47,141-147. Jones, R. C, 1987, Acta Endocrinol.(Copenh.) 114, 379-382.

Knight, D. M, Trinh, H., Le, J., Siegel, S., Shealy, D., McDonough, M., Scallon, B., Moore, M. A., Vilcek, J., and Daddona, P., 1993, Mol. Immunol. 30, 1443-1453.

Koninckx, P. R., Meuleman, C., Demeyere, S., Lesaffŕe, E., and Comillie, F.J., 1991, Ferril. Steril. 55,759-765.

Koninckx, P. R. and Martin, D., 1994, Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 6, 231-241.

MacSween, R. N. M., 1993, Muir's Textbook of pathology, 13th ed. (Whaley K.; ISBN 0-340-55145-3), 1024-1025.

Malinak, L. R., Buttram, V.C. J., Elias, S., and Simpson, J. L., 1980, Am. J. Obstet. Gynecol. 137, 332-337. Matalliotakis, L., Neonaki, M., Zolindaki, A., Hassan, E., Georgoulias, V., and Koumantakis, E., 1997, Int. J. Fertil. Womens. Med. 42, 211-214.

Mori, H., Nakagawa, M., Itoh, N., Wada, K., and Tamaya, T., 1990, Am. J. Reprod..Immunol. 24,45-50. Nophar, Y., Kemper, O., Brakebusch, C., Englemann, H., Zwang, R., Aderka, D., Holtmann, H., and Wallach, D., 1990, EMBO J. 9, 3269-3278.

Oosterlynck, D. J., Meuleman, C., Waer, M., Vandeputte, M., and Koninckx, P. R., 1992, Fertil. Steril. 58, 290-295.

Overton, C., Femandez-Shaw, S., Hicks, B., Barlow, D., and Starkey, P., 1996, HumReprod. 11,380-386. Pennica, D., Nedwin, G. E., Hayflick, J. S., Seeburg, P. H., Derynck, R., Palladino, M. A., Kohr, W. J., Aggarwal, B. B., and Goeddel, D. V., 1984, Náture 312, 724-729.

Rana, N., Braun, D. P., House, R., Gebel, H., Rotman, C., and Dmowski, W. P., 1996, Fertil. Steril. 65, 925-930.

Revelli, A., Modotti, M., Ansaldi, C., and Massobrio, M., 1995, Obstet. Gynecol. Surv. 50,747-754.

Roby, K. F., Laham, N., and Hunt, J. S., 1996, J. Reprod. Fertil. 106, 285-290.

Shalaby, M. R., Laegreid, W. W., Ammann, A. J., and Liggitt, H. D., 1989, Lab. Invest. 61, 564-570.

Shalaby, M. R., Sundan, A., Loetscher, H., Brockhaus, M., Lesslauer, W., and Espevik, T., 1990 J. Exp. Med. 172, 1517-1520.

Sharpe, K. L., Bertero, M. C., and Vemon, M. W., 1990, Prog. Clin. Biol. Res. 323,449-58.

Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J. Y., Dayer, J. M., and Zubler, R. H., 1992, J. Immunol. 148, 2778-2784.

Waller, K. G. and Shaw, R. W., 1993, Fertil. Steril. 59, 511-515.

Zhang, R. J., Wild, R. A., and Ojago, J. M., 1993, Fertil. Steril. 59,1196-1201.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Použitie TNF antagonistu spolu s farmaceutický prijateľným nosičom na prípravu farmaceutického prostriedku na liečbu a/alebo prevenciu endometriózy, kde TNF antagonista je sekvestrovací antagonista alebo signalizačný antagonista.

2. Použitie TNF antagonistu spolu s farmaceutický prijateľným nosičom na prípravu farmaceutického prostriedku na zlepšenie implantačného a fertilizačného pomeru redukovaním endometrických lézií, kde TNF antagonista je sekvestrovací antagonista alebo signalizačný antagonista.

3. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 alebo 2, kde sekvestrovací TNF antagonista je polypeptid schopný viazať sa na špecifický epitop TNF takým spôsobom, že TNF viac nie je schopné viazať sa na membránovo viazaný TNF receptor.

4. Použitie podľa nároku 3, kde sekvestrovací TNF antagonista je receptorová molekula, jej derivát alebo fragment, ktorý sa viaže na TNF.

5. Použitie podľa nároku 4, kde receptorová molekula je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z TNF-RI a TNF-RII.

6. Použitie podľa nároku 4, kde receptorová molekula je extraceluláma doména TNF-RI.

7. Použitie podľa nároku 4, kde receptorová molekula je ľudský rozpustný rekombinantný TNF-RI.

8. Použitie podľa nároku 4, kde receptorová molekula je TNF receptorová multiméma molekula alebo jej funkčná časť.

9. Použitie podľa nároku 8, kde TNF receptorová multiméma molekula obsahuje celé alebo funkčné časti dvoch alebo viacerých extracelulámych domén TNF receptorov spojených prostredníctvom jedného alebo viacerých polypeptidových spojovníkov.

10. Použitie podľa nároku 4, kde receptorová molekula je imunoreceptorová fuzovaná molekula alebo jej funkčná časť.

11. Použitie podľa nároku 10, kde imunoreceptorová fuzovaná molekula obsahuje celú alebo funkčnú časť TNF receptora a imunoglobulínový reťazec.

12. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde sekvestrovací TNF antagonista je anti-TNF protilátka alebo jej fragment.

13. Použitie podľa nároku 12, kde protilátka je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z: chimémej monoklonálnej protilátky, humanizovanej monoklonálnej protilátky alebo ich fragmentu.

14. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 alebo 2, kde TNF antagonista predchádza TNF receptorovej signalizácii alebo inhibuje TNF receptorovú signalizáciu.

15. Farmaceutický prostriedok na použitie pri liečbe a/alebo prevencii endometriózy, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje TNF antagonistu spolu s farmaceutický prijateľným nosičom, pričom TNF antagonista je sekvestrovací antagonista alebo signalizačný antagonista.

16. Farmaceutický prostriedok na použitie na zlepšenie implantačného a fertilizačného pomeru redukovaním endometrických lézií, vyznačujúci sa tým, že obsahuje TNF antagonistu spolu s farmaceutický prijateľným nosičom, pričom TNF antagonista je sekvestrovací antagonista alebo signalizačný antagonista.

17. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 15 alebo 16, vyznačujúci sa tým, že TNF antagonista má znaky uvedené v ktoromkoľvek z nárokov 3 až 14.