ES2200808T3

ES2200808T3 - Antagonistas del factor de necrosis tumoral y su uso en el tratamiento de la endometriosis.

Info

Publication number: ES2200808T3
Application number: ES00900306T
Authority: ES
Inventors: Francesco Borrelli; Mauro D'antonio; Fabrizio Martelli
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2020-01-19
Also published as: BR0008182A; SK287313B6; EP1143997B1; EA003927B1; US20040057954A1; KR20060128056A; NO20013577D0; CA2356737A1; WO2000043031A1; PL204713B1; JP2002535284A; JP4601176B2; CN1698894A; CN1212152C; HK1082690A1; HK1043059A1; CZ302866B6; PL350002A1; EP1022027A1; IL144413A0

Abstract

El uso de un antagonista de TNF junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la endometriosis, en el que dicho antagonista de TNF es un antagonista secuestrante o un antagonista de la señalización. 2 El uso de un antagonista de TNF junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable en la preparación de una composición farmacéutica para mejorar la implantación y tasa de fertilidad por medio de la reducción de las lesiones del endometrio, en el que dicho antagonista de TNF es un antagonista secuestrante o un antagonista de la señalización. 3. El uso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho antagonista secuestrante es una molécula de receptor, un derivado o uno de sus fragmentos que se une al TNF. 4. El uso de la reivindicación 3, en el que la molécula de receptor se escoge del grupo que consiste en: TNF-RI y TNF-RII. 5. El uso de la reivindicación 3, en el que la molécula de receptor es el dominio extracelular de TNF-RI 6. El uso de la reivindicación 3, en el que la molécula de receptor es de TNF-RI humano soluble recombinante. 7. El uso de la reivindicación 3, en el que la molécula de receptor es una molécula de receptor de TNF multimérica o una de sus porciones funcionales. 8. El uso de la reivindicación 7, en el que la molécula multimérica de receptor TNF contiene la totalidad o una parte funcional de dos o más dominios extracelulares de los receptores de TNF unidos por medio de uno o más fragmentos enlazadores polipeptídicos. 9. El uso de la reivindicación 3, en el que la molécula de receptor es una molécula de fusión del inmunoreceptor o una de sus porciones funcionales. 10. El uso de la reivindicación 9, en el que la molécula de fusión del inmunoreceptor contiene la totalidad o una porción funcional del receptor de TNF y una cadena de inmunoglobulina. 11. El uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el antagonista secuestrante es un anticuerpo anti-TNF o uno de sus fragmentos.

Description

Antagonistas del factor de necrosis tumoral y su uso en el tratamientos de la endometrosis.

Objeto de la invención

Los antagonistas del factor de necrosación tumoral deben administrarse en dosis terapéuticamente efectivas para tratar y/o prevenir la endometriosis. Los antagonistas de esta invención se seleccionan típicamente entre varias clases de moléculas pero son receptores de TNF solubles preferiblemente. Los antagonistas son útiles para la regresión de las lesiones del endometrio y, para mejorar la implantación y la tasa de fertilidad mediante la reducción de las lesiones del endometrio.

Antecedentes de la invención

La endometriosis es una enfermedad genital femenina caracterizada por la presencia de las glándulas del endometrio y el estroma fuera de la cavidad endometrial y la musculatura uterina. Las partes anatómicas más frecuentemente afectadas son los ovarios, ligamentos uterosacros, el peritoneo pélvico, el septum rectovaginal, la cerviz, la vagina, las trompas de Falopio y la vulva. Generalmente la endometriosis es probable que se infiltre profundamente desde el septum rectovaginal a los tejidos subyacentes y que no sea visible superficialmente. Ocasionalmente, los focos de la endometriosis pueden encontrarse en lugares extraováricos, como en los pulmones, vejiga, piel, pleura y nodos linfáticos. Las lesiones endométricas son progresivas: se ven primeramente como vesículas transparentes, que después se transforman en rojas y progresan a las lesiones fibróticas negras, a lo largo de un periodo de pocos años (MacSween, 1993).

La endometriosis se considera una enfermedad benigna, pero las lesiones del endometrio pueden transformarse ocasionalmente en malignas. Como en otra clase de malignidades, el desarrollo de los neoplasmas derivados de la endometriosis se debe a acontecimientos concurrentes, que envuelven alteraciones de los factores de crecimiento y/o regulación de los oncogenes (Chenng, 1996)

La endometriosis está entre las enfermedades ginecológicas mas corrientes, con prevalencia entre las mujeres de edad reproductiva: esta enfermedad se encuentra en alrededor del 5-10% de las mujeres en edad de reproducir (Barbieri, 1988). El tejido endométrico es dependiente completamente de estrógeno, para su crecimiento continuado también en los lugares ectópicos. Consecuentemente, la endometriosis es rara antes de la menarquia y después de la menopausia, cuando las mujeres son deficientes en estrógeno. La sensibilidad hormonal de la endometriosis es la causa de alguno de los síntomas más comunes, que son el dolor pélvico y la dismenorrea.

La endometriosis se origina a partir de las células del endometrio que se diseminan desde el útero a otras localizaciones, donde las células viables pueden implantarse y crecer. Se han propuesto dos posibles mecanismos para explicar la diseminación inicial de las células. La menstruación retrógrada, un fenómeno común entre las mujeres con el ciclo, hace posible que fragmentos desprendidos del endometrio alcancen, a través del líquido de reflujo menstrual, estructuras cercanas del aparato genital. Alternativamente para explicar la ocurrencia de endometriosis en otros lugares que las estructuras genitales, las células endometriales pueden diseminarse a través de las venas del útero y extenderse a través del sistema linfático (diseminación hematógena o linfática). También la cirugía ginecológica puede contribuir a esta diseminación (Mac Sween, 1993).

Aparte de la diseminación de las células endometriales, otros factores, tales como la predisposición genética (Malinak et al, 1980) así como las alteraciones inmunológicas (Ho et al., 1997) pueden determinar la susceptibilidad de las mujeres a la endometriosis. Puesto que las células endometriales se ven frecuentemente en el fluido peritoneal de todas las mujeres durante el periodo, los mamíferos tendrían que tener mecanismos lo mas probablemente, relacionados con el sistema inmunológico, para evitar el comienzo de la endometriosis. En general las células endometriales que escapan la respuesta inmune del hospedante y tienen estimulación estrogénica adecuada pueden proliferar para formar grandes lesiones macroscópicamente visibles. La endometriosis es considerada por lo tanto como un proceso dinámico donde nuevas lesiones están continuamente formándose mientras que las lesiones existentes pueden crecer o ser destruidas por la respuesta inmune del hospedante.

La reacción inflamatoria, normalmente asociada con la endometriosis, cambia el entorno del peritoneo, ya que hay un aumento del volumen en el de fluido peritoneal y los macrófagos del peritoneo están aumentados en número y actividad. De modo que, el sistema monocito/macrófago ha sido propuesto como protagonista en el desarrollo de la endometriosis. Los productos segregados por los macrófagos, incluyendo RANTES (Homung et al., 1997), Interleucina-6 (Harada et al., 1997), Interleucina-8 (Arici et al., 1996a), El factor de necrosación tumoral-alfa (Overton et al., 1996), la Proteina-1 quimiotactica linfocítica (Arici et al., 1997), se encontraron en altas concentraciones en el fluido peritoneal de mujeres afectadas por esta enfermedad. Cambios inmunológicos han sido demostrados en mujeres con endometriosis pero no ha sido demostrado si estos eventos son responsables de la endometriosis o son el resultado de la inflamación causada por la endometriosis (Rana et al., 1996).

El conocimiento de la endometriosis, y su relevancia para otras enfermedades, es hasta ahora limitado, aun a nivel diagnostico. Aunque la endometriosis es considerada como una causa mayor de infertilidad, los estudios sobre la patofisiologia de la enfermedad son contradictorios y no son definitivos. Hay una correlación pobre entre el grado de dolor o la infertilidad y la severidad de la enfermedad, ya que las lesiones tempranas son más activas metabólicamente. La tasa de infertilidad es mas alto que la población normal y los estudios en conejos han mostrado que la inducción quirúrgica de la endometriosis conduce a una disminución de la fertilidad desde un 75% al 25% (Hahn et al., 1986). Se encontró que los pacientes con dolor pélvico tenían endometriosis en un 71% de las veces, mientras que el 84% de los pacientes con dolor pélvico e infertilidad tenían endometriosis diagnosticada (Koninckx et al., 1991). En general, la infertilidad puede encontrarse en el caso de que la endometriosis este tan extendida que distorsione la estructura vaginal normal, mientras que los índices de embarazo son normales cuando la endometriosis es mínima.

La endometriosis puede afectar la fertilidad también en forma diferente. Los mensajeros de las células blancas, como la interleucina-6, el interferón y el factor de necrosación tumoral, están todos aumentados, afectando adversamente la interacción oocito-esperma. Se encontró que las muestras de suero obtenidas de mujeres con endometriosis eran embriotóxicas en los modelos en embrión de ratón e inhibían la movilidad del esperma in vitro (Halme, 1991), aumentando el efecto cuando se añadió el factor de necrosación tumoral-alfa recombinante (Eisermann et al., 1989). Estos estudios, sin embargo, no se enfrentan con el problema de como las citoquinas afectan la progresión de la endometriosis sino que sólo mostraron el efecto de tales moléculas en la viabilidad de las células germinales y embriónicas.

La terapia hormonal y la cirugía son las dos modalidades de terapia actualmente usadas para tratar la endometriosis. La terapia actual farmacológica para la endometriosis requiere la supresión hormonal de la producción de estrógenos, de modo que la condición hormonal pobre bloquee el crecimiento del tejido ectópico. Con relación al tratamiento de la infertilidad relacionada con pacientes con la endometriosis, la terapia hormonal en pacientes con mínimos signos de la enfermedad no tiene beneficios probados, mientras que otros estudios mostraron un aumento de los índices de embarazo (Arici et al, 1996b).

Las terapias hormonales han incluido altas dosis de progestógenos, combinaciones de estrógeno y progesterona (usando altas dosis de píldoras contraceptivas orales, o OCPs, en un régimen de "Pseudoembarazo", Danazol (un derivado andrógenico de etisterona) y más recientemente agonistas de GnRH. Estas terapias hormonales son efectivas en el dolor pélvico e inducen una regresión objetiva de las lesiones pero tienen varios inconvenientes. El estrógeno puede estimular y causar proliferación del tejido del endometrio ya que puede impedir la respuesta a la progesterona, aun a altas dosis así que los OCPs pueden ofrecer un alivio parcial a un limitado número de pacientes (Dawood, 1993). Los agentes de progestación pueden provocar hemorragias irregulares (50%) conjuntamente con depresión, ganancia de peso, y retención de fluidos. Danazol suprime la endometriosis provocando respuestas varias, que incluye la reducción del factor soluble de necrosación-tumoral-alfa, interleucina-1 beta y niveles de CD8 en suero (Matalliotakis et al., 1997; Mori et al., 1990), la inhibición de las esteroidogénesis de novo y el desplazamiento de estradiol de su receptor. Danazol puede mejorar los síntomas en aproximadamente 66-100% de los casos de los pacientes que sufren dolor, pero los índices de recurrencia brutos después de cuatro años son aproximadamente del 40%-50%. Otros inconvenientes de la terapia con Danazol son ganancia de peso y efectos andrógenos secundarios, los cuales pueden causar hasta el 80% del abandono de pacientes de esta terapia (Barbieri, 1988).Los análogos de GnRH son más potentes y de más larga duración que la GnRH. nativa, que actúa eliminando el estimulo estrogénico del crecimiento de todos los tejidos sensibles a estrógenos. Los efectos secundarios de los análogos a GNRH son principalmente secundarios a la profunda hipoestrogénemia, como la disminución de la densidad ósea y el índice de recurrencia es de hasta 50% después de 5 años (Waller y Shaw, 1993).

Dependiendo del grado de la enfermedad, la intervención quirúrgica puede ser conservadora, si se desea la fertilidad, o puede conducir a la eliminación del útero, trompas y ovarios en caso de enfermedad severa. En cualquier caso, incluso la intervención quirúrgica limitada conduce a una disminución de la fertilidad significativa. Los índices de embarazo que siguen al tratamiento quirúrgico van de entre el 35% al 65%, de modo que los pacientes necesitan la inducción de la ovulación y la inseminación intrauterina para alcanzar las tasas de fecundidad normal (Koninckx y Martin, 1994). Los informes clínicos mostraron que, después de la laparotomía y la reserción de la endometriosis, hasta un 40% de los pacientes requieres volver a ser operados dentro de los 5 años posteriores. Aun después de una intervención quirúrgica agresiva la recurrencia del dolor de la endometriosis continúa siendo un problema significativo. Algunas de las razones para el fracaso de la terapia de intervención quirúrgica pueden incluir la reserción incompleta con lesiones que o no se reconocen o se desconocen completamente. Muchas lesiones son microscópicas y no podrían ser vistas a pesar de la magnificación proporcionada por la laparoscopia. Por lo tanto, la cirugía sola no se puede esperar que cure esta enfermedad (Revelli et al., 1995).

Muchos pacientes con endometriosis sufren los inconvenientes de las terapias tradicionales (que incluyen las consecuencias del desequilibrio hormonal, altos índices de recurrencia e infertilidad). Es por tanto de interés proporcionar tratamientos alternativos para la endometriosis. Una aproximación terapéutica posible puede representarse por el uso de inmunomoduladores que podrían mejorar ambas, las lesiones endométricas y la situación inmunológica. Tales aproximaciones han sido consideradas posibles para el tratamiento de los síntomas generales (Rana et al., 1996) pero no hay ninguna evidencia experimental que señale qué citoquinas, entre las de niveles de expresión alterados que siguen a la endometriosis, podrían ser una diana preferida para la intervención terapéutica.

Como se dijo previamente, uno de los varios productos de secreción de los macrófagos envueltos en la reacción inflamatoria del endometrio es el factor de necrosación tumoral (abreviado, desde ahora en adelante, como TNF), también definido como Caquectina, es una citoquina pleiotrópica liberada por las células T activadas y los macrófagos. El TNF es un componente de la red del interferón, la interleucina y de la citoquina del factor de estimulación de colonia, que tiene un papel clave en el sistema de señalización relacionado con la patogénesis de muchas enfermedades infecciosas e inflamatorias mediante la inducción de un número de cambios proinflamatorios, que incluyen la producción de otra citoquina y de la molécula de adhesión (Fiers, 1991).

Por acuerdo, el término TNF colectivamente significará, en todo el texto de la presente solicitud, ambos factor alfa y beta de necrosación tumoral de animales y humanos, junto por tanto con los alelos de ocurrencia natural del TNF-alfa (Penica et al., 1984). El TNF-beta, también conocido como linfotoxina, tiene una actividad similar pero es producida por tipos diferentes de células (linfocitos y células naturales asesinas) en respuestas a los estímulos antigénicos o mitogénicos (Gray et al., 1984).

El TNF se expresa como una proteína madura de 17kDa que es activa como un trímero. Este complejo ejerce su actividad biológica mediante la agregación a sus receptores en la superficie de la célula, que median efectos específicos en diferentes órganos y tejidos. En el endometrio, la expresión de TNF es dependiente del lugar y el ciclo menstrual (Hunt et al, 1992), e induce apoptosis en el endometrio de los animales de experimentación (Shalaby et al., 1989). La adherencia de las células del estroma endometrial a las células del mesotelio estuvo significativamente aumentada por el pretratamiento de las células del mesotelio con TNF (Zhang et al., 1993), apoyando así la idea de que el TNF podría contribuir a la iniciación y/o desarrollo de la endometriosis.

El TNF ejerce su actividad, requerida para el normal desarrollo y función del sistema inmune mediante la unión a una familia de moléculas de receptor que están unidos a la membrana que incluyen el receptor 1 p55 TNF, definido en la literatura también como TNF-R1, y el receptor p75 TNF, definido también en la literatura como TNF-RII (Bazzoni y Beutler, 1996). La dominancia de TNF-RI en la trasducción de la señal de TNF es sugerida por la habilidad de los anticuerpos agonistas específicos para este receptor para mimetizar la mayoría de las respuestas inducidas por TNF (Shalaby et al., 1990). Mediante la unión a sus receptores ligados a la membrana, el TNF dispara el camino de señalización a través de los mediadores citoplasmáticos como TRADD y TRAP-1 (para TNF-RI) o TRAP-1 y TRAF-2 (para TNF-RII), conduciendo a una respuesta distinta de la célula, como la proliferación de células T, la lisis de células tumorales in vitro, la necrosis dérmica, la resistencia a la insulina, la apoptosis. Las porciones extracelulares de ambos receptores de TNF pueden ser liberadas y esos receptores solubles retienen la habilidad para unirse al TNF, inactivando la actividad del TNF por medio de la formación de los complejos de alta afinidad, reduciendo por tanto la unión de TNF a los receptores de membrana de las células diana (Nophar et al.,1990).

En el endometrio, los niveles de los receptores de TNF unidos la membrana son afectados por la administración de estradiol y/o progesterona, lo que resulta en una expresión temporal y especifica para el tipo de célula de TNF-RI en el ratón (Roby el al., 1996). Sin embargo este estudio, como muchos otros estudios realizados en varios modelos relacionados con la endometriosis, no proporcionó ninguna sugerencia sobre el efecto real in vivo de TNF y TNF-RI, soluble o unido a la membrana, en el desarrollo de focos de endometriosis sino solo una descripción de las anormalidades inmunológicas asociadas con la endometriosis.

Resumen de la invención

La presente aplicación de patente esta basada en la asunción de que un antagonista de TNF puede, mediante el secuestro del TNF circulante, bloquear la progresión de las lesiones endometrióticas. Esta asunción se confirma por el descubrimiento descrito en el ejemplo, que muestra que un antagonista de TNF reduce significativamente el tamaño de los focos de tipo endometriótico en un modelo experimental de rata. Como un resultado del descubrimiento del aplicante, el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de antagonistas de TNF en donde el antagonista de TNF mencionado es un antagonista secuestrante de señalización se proporciona aquí para la fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir la endometriosis en un individuo.

Un objeto posterior de la presente invención es el uso de un antagonista de TNF donde dicho antagonista es un secuestrador o antagonista de señalización junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable en la preparación de las composiciónes farmacéuticas para el tratamiento de la endometriosis.

En la invención presente, la administración del mencionado antagonista de TNF puede ser parenteral u cualquier otra formulación efectiva. Cualquier forma de administración parenteral puede ser apropiada incluyendo la intravenosa, intramuscular y subcutánea. Además de los vehículos farmacéuticamente aceptables, la composición de la invención puede también incluir cantidades menores de aditivos, tales como estabilizadores, excipientes, tampones y preservantes.

Los antagonistas de TNF útiles en el uso de la presente invención incluyen moléculas del receptor de TNF solubles, anticuerpos anti-TNF y compuestos que previenen y/o inhiben la señalización del receptor de TNF. Es posible el uso de los antagonistas de TNF solos o en combinación con otros antagonistas de TNF. La combinación con uno o más productos farmaceúticamente activos es también posible, en particular, para mejorar la condición de los pacientes que sufren de infertilidad relacionada con la endometriosis.

Descripción de la invención

La invención descrita aquí muestra claramente los resultados inesperados que el secuestrar al TNF (que es sólo una de las varias citoquinas cuyo nivel de expresión aumenta en el fluido peritoneal en la endometriosis), por medio de un antagonista de TNF, reduce los focos de tipo endometriótico en el modelo experimental en rata. Este modelo demuestra también que tal efecto se obtiene sin afectar significativamente el equilibrio hormonal y la actividad de las células Naturales Asesinas. La reducción de las lesiones endométricas por medio del uso de los antagonistas de TNF puede también mejorar las tasas de fertilidad, ya que la normalización de la estructura genital tiene un efecto positivo en la tasa de implantación.

Por lo tanto, el principal objeto de la presente invención es proporcionar el uso de una cantidad terpeúticamente efectiva de antagonista de TNF donde dicho antagonista de TNF es un secuestrador o un antagonista de señalización para la producción de un medicamento para tratar y/o prevenir la endometriosis en un individuo incluyendo su administración.

En una segunda versión la invención se refiere a que dicho antagonista de TNF es un secuestrador o un antagonista de la señalización para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la infertilidad relacionada con la endometriosis en un individuo en combinación con otros fármacos.

Aún otro objeto de la presente invención es el uso de los mencionados antagonistas de TNF junto con un vehículo aceptable farmacéuticamente en la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento y/o la prevención de la endometriosis.

Los ingredientes activos de las composiciones reivindicadas aquí son antagonistas de TNF. Los antagonistas de TNF reivindicados ejercen su actividad en una de estas dos formas. Primeramente, los antagonistas pueden unirse o secuestrar la molécula misma de TNF con afinidad y especificidad suficiente para substancialmente neutralizar el epitopo de TNF responsable de la unión con el receptor de TNF (en lo sucesivo denominado "antagonistas secuestrantes"). Alternativamente, los antagonistas de TNF pueden inhibir el camino de señalización de TNF activado por el receptor de la superficie de la célula posterior a la unión del TNF (denominados en lo sucesivo "antagonistas de señalización"). Ambos grupos de antagonistas son útiles, bien solos o juntos, en la terapia de la endometriosis, según la invención presente.

Los antagonistas de TNF son fácilmente identificables y valorables en las cribas rutinarias de candidatos por su efecto sobre la actividad del TNF nativo en línea de células susceptibles in vitro, por ejemplo células humanas B, en las cuales el TNF causa la proliferación y secreción de Ig. Los ensayos que contienen formulación de TNF a varias diluciones del antagonista candidato, por ejemplo de 0,1 a 100 veces la cantidad molar de TNF empleado en el ensayo, y los controles con nada de TNF o sólo el antagonista (Tucci et al., 1992).

Los antagonistas secuestrantes son los antagonistas preferidos de TNF según la presente invención. Entre los antagonistas secuestrantes, aquellos polipéptidos que se unen a TNF con alta afinidad y poseen baja inmunogenicidad son preferidos. Las moléculas del receptor soluble de TNF y los anticuerpos neutralizantes de TNF son particularmente preferidos. Por ejemplo TNF-RI y TNF-RII son útiles en la invención presente. Formas truncadas de estos receptores, que comprenden los dominios extracelulares de los receptores o porciones funcionales de los mismos, son antagonistas particularmente más preferidos. De acuerdo con la presente invención formas truncadas de los receptores de TNF son solubles y han sido detectados en orina y suero como proteínas de 30kDa y 40 kDa inhibidoras de la unión de TNF, las cuales fueron originalmente denominadas respectivamente TBPI y TBPII (Engelmann et al., 1990).Derivados, fragmentos, regiones y porciones biológicamente activas de las moléculas del receptor que funcionalmente se asemejan a las moléculas del receptor, que pueden ser usadas en la invención presente. Tal equivalente biológicamente activo o derivado de las moléculas del receptor se refiere a la porción del mencionado polipéptido, o a la secuencia que codifica la molécula del receptor que es de suficiente tamaño y capaz de unirse al TNF con tal afinidad que la interacción con el receptor de TNF unido a la membrana es inhibida o bloqueada. En una versión preferida, el TNF-RI soluble humano es el antagonista de TNF que se administra a pacientes. Las moléculas del receptor de TNF soluble recombinante y el natural y los métodos de su producción han sido descritos en el documento European Patent Applications EP 308.378, EP 398.327 y EP 433.900.

Las moléculas multiméricas del receptor de TNF y las moléculas de fusión del inmunoreceptor de TNF, y los derivados o porciones de los mismos, son ejemplos adicionales de moléculas del receptor útiles en los métodos de la invención presente. Las moléculas multiméricas del receptor de TNF útiles de la invención presente comprende la totalidad o una porción funcional del dominio extracelular de dos o más receptores de TNF unidos vía uno o más fragmentos enlazadores polipeptídicos. Las moléculas multiméricas pueden además comprender un péptido de señalización de una proteína segregada para dirigir la expresión de la molécula multimérica. Estas moléculas multiméricas y los métodos de su fabricación han sido descritas en la European Patent Aplication EP 526.905.

Las moléculas de fusión del immunoreceptor de TNF útiles en los métodos de la invención presente comprenden al menos una porción de una o más moléculas de inmunoglobulina y la totalidad o una porción funcional de uno o más receptores de TNF. Estas moléculas de fusión del inmunoreceptor pueden unirse como monómeros, o hetero o homo multímeros. Las moléculas de fusión del inmunoreceptor pueden ser también monovalentes o multivalentes. Las moléculas de fusión del inmunoreceptor TNF y los métodos para su producción ha sido descrito en el documento European Patent Application EP 620.739, que corresponde al documento ACT Patent Application Wo 94/06476.

Otra clase de antagonistas secuestrantes útiles en el método de la invención presente, está representada por los anticuerpos anti-TNF, que incluye los monoclonales, los quiméricos humanizados, y los anticuerpos recombinantes y los fragmentos de los mismos que están caracterizados por la unión de alta afinidad a TNF in vivo y la baja toxicidad. Los anticuerpos que pueden usarse en la invención están caracterizados por su habilidad para tratar pacientes por un periodo suficiente para tener de buena a excelente regresión de las lesiones endométricas, alivio de los síntomas y baja toxicidad. Los anticuerpos neutralizantes se elevan rápidamente en animales tales como conejos o ratones mediante la inmunización con TNF. Los ratones inmunizados son particularmente útiles para proporcionar fuentes de células B para la producción de hibridomas, que a su vez se cultivan para producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales anti-TNF. Los anticuerpos quiméricos son moléculas de inmunoglobulina caracterizados por dos o más segmentos o porciones derivadas de especies animales diferentes. Generalmente, la región variable del anticuerpo quimérico se deriva de un anticuerpo de mamífero no humano, tal como un anticuerpo monoclonal murino, y la región constante de la inmunoglobulina se deriva de una molécula de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, ambas regiones y la combinación tienen baja inmunogenicidad como se determina rutinariamente (Elliott et al., 1994). Los anticuerpos humanizados son moléculas de inmunoglobulina creadas por técnicas de ingeniería genética en las cuales las regiones constantes murinas son reemplazadas con las correspondientes humanas mientras que retienen las regiones de unión del antígeno murino. El anticuerpo quimérico humano-murino resultante debería tener la inmunogenicidad reducida y la farmacocinética mejorada en humanos (Knight et al., 1993). Los ejemplos preferidos de anticuerpos monoclonales de alta afinidad y derivados quiméricos de los mismos, útiles en los métodos de la invención presente, se describen en el documento patente European Application EP 186.833 y PCT Patent Application WO 92/16553.

Los antagonistas de TNF pueden administrarse a un individuo de varias maneras. Las rutas de administración incluyen intradérmica, transdérmica (por ejemplo en formulaciones de liberación retardada), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, oral, epidural, tópica y rutas intranasales. Pueden usarse cualquier otra ruta de administración terapéuticamente eficaz por ejemplo la absorción a través de tejidos epiteliales o endoteliales o por terapia génica en donde una molécula de ADN que codifica el antagonista de TNF es administrada al paciente (por ej. vía un vector) el cual origina que el antagonista de TNF sea expresado y segregado in vivo. En adición, el antagonista de TNF puede administrarse junto a otros componentes de agentes biológicamente activos tales como surfactantes aceptables farmacéuticamente, excipientes, diluyentes o cualquier otro vehículo.

La definición de "farmacéuticamente aceptable" significa incluir cualquier excipiente, el cual no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo y no es tóxico para el hospedante al cual se administra. Por ejemplo, por administración parenteral. Los antagonistas de TNF pueden formularse en forma de dosis unitarias para inyección en vehículos tales como solución salina, solución de dextrosa, albúmina del suero y solución de Ringer.

Para administración parenteral (o sea intravenosa, subcutánea, intramuscular), los antagonistas de TNF pueden formularse como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado asociado con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable (por ejemplo agua, solución salina, solución de dextrosa) y aditivos que mantengan la isotonicidad (por ejemplo manitol) o estabilidad química (por ejemplo preservantes y tampones). La formulación se esteriliza por medio de técnicas usadas corrientemente.

La biodisponibilidad de los antagonistas de TNF puede también mejorarse utilizando procedimientos de conjugación que aumentan la semi vida de la molécula en un cuerpo humano, por ejemplo uniendo la molécula a polietilenglicol, como se describe en la Aplicación de Patente WO 92/13095.

Las cantidades terapéuticamente efectivas de los antagonistas de TNF serán una función de muchas variables, incluyendo el tipo de antagonista, la afinidad del antagonista por el TNF ,la actividad citotóxica residual mostrada por los antagonistas, la forma de administración, la condición clínica del paciente (incluyendo la conveniencia de mantener un nivel no tóxico de actividad endógena de TNF), la presencia de centros múltiples de combinación con TNF en los agentes secuestrantes, por ejemplo anticuerpos.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es la que cuando es administrada, origina que el antagonista de TNF reproduzca la inhibición de la actividad biológica del TNF. La dosis administrada en dosis únicas o múltiples a un individuo variará dependiendo de una variedad de factores incluyendo las propiedades farcocinéticas del antagonista de TNF, la forma de administración, la condición del paciente y sus características (sexo, edad, peso corporal, estado de salud, tamaño), alcance de los síntomas, tratamientos concomitantes, frecuencia del tratamiento y efecto deseado. El ajuste y la manipulación de los intervalos de dosis establecidos deben ser establecidos por la habilidad de los expertos, así como los métodos in vivo e in vitro para determinar la inhibición de TNF en un individuo.

Puesto que la dosis máxima tolerada de TNF en ensayos clínicos humanos ha estado en el intervalo de hasta alrededor de 25 microgramos/m^{2} de superficie corporal/24 horas, la cantidad de antagonista administrado generalmente no necesita ser mayor de la dosis que se calcula para neutralizar esta cantidad de TNF. Así la dosis molar del antagonista de TNF variará desde alrededor de 0,001 a 10 veces la dosis molar máxima tolerada de TNF, aunque como se ha mencionado antes esto está sujeto a gran discreción terapéutica.

Adicionalmente los datos obtenidos en estudios clínicos, en los que el aumento de la concentración de TNF en el fluido peritoneal de las mujeres con endometriosis se demostró usando varios protocolos (Eisermann et al., 1988; Halme, 1991; Overton et al., 1996), pueden ser también útiles en la determinación de la dosis efectiva del antagonista de TNF que debe administrarse.

Normalmente una dosis diaria de un ingrediente activo puede ser de alrededor de 0,01 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Normalmente de 1 a 40 miligramos por kilogramo día en dosis divididas o en forma de liberación retardada es efectivo para obtener los resultados deseados. La segunda o siguientes administraciones pueden hacerse a una dosis que es la misma, menor que o mayor que la dosis inicial o la dosis previa administrada al individuo. Una segunda o sucesivas administraciones pueden administrarse durante o antes de una recaída de la endometriosis o síntomas relacionados. El término "recaída" o "recurrencia" se definen incluyendo la aparición de uno o más síntomas de la endometriosis.

El antagonista de TNF puede administrarse profilácticamente o terapéuticamente a un individuo antes de, simultáneamente o secuencialmente con otros regímenes o agentes terapéuticos (por ejemplo regímenes de varios fármacos en una cantidad terapéuticamente efectiva, en particular para el tratamiento de la infertilidad). Los antagonistas de TNF que se administran simultáneamente con otros agentes terapéuticos pueden administrarse en las mismas composiciones o diferentes. En particular, cuando la infertilidad es el desorden que se pretende curar asociado con la endometriosos, pueden administrarse la gonadotropina coriónica humana biológicamente activa (Hcg), la hormona luteinizante, (LH) o la hormona estimuladora del folículo (FSH), en forma natural altamente purificada o en forma recombinante. Dichas moléculas y los métodos para su producción se describen en el documento European Patent Applications EP 160.699, EP 211.894 y EP 322.438.

La presente invención se ilustrará ahora con un ejemplo, que no intenta ser limitante en ninguna forma y en el que se hace referencia a las siguientes figuras.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra los efectos de Antide (2 mg/kg, subcutáneo, administrado cada 3 días),y TNF-RI soluble recombinante (10 mg/kg, subcutáneo, administrado en dos doses diarias durante un período de 1 semana) en el tamaño de injertos en ratas con endometriosis experimental 2 días y 9 días después del último tratamiento. Estos datos, que se obtuvieron usando 6 animales/grupo para el tiempo primero del sacrificio y 5 animales/grupo para el tiempo segundo del sacrificio, representan el porcentaje medio de inhibición \Box SEM (error estandar de la medida).

La Figura 2 muestra los efectos del TNF-RI soluble recombinante (10 mg/kg, subcutáneo, administrado en dos dosis diarias durante un período de 1 semana) y de Antide (2 mg/kg, subcutáneo, administrado cada 3 días), en la actividad NK de las células del bazo de la rata frente a células de YAC (liberación de ^{51}Cr) 2 días (panel A) y 9 días (panel B) después del último tratamiento. Los datos representan el porcentaje medio de lisis \pm SEM.

La Figura 3 muestra los efectos del TNF-RI soluble recombinante (10 mg/kg, subcutáneo, administrado en dos dosis diarias durante un período de 1 semana) comparado con el control y Antide (2 mg/kg, subcutáneo, administrado cada 3 días), en las concentraciones séricas de 17\beta-estradiol en endometriosis experimental en ratas. Los datos representan las concentraciones medias de 17\beta-estradiol \pm SEM.

Ejemplo Métodos y materiales Animales

Ratas hembras Sprague-Dawley (250-275 g) se compraron en Charles River Italia (Calco, Lecco, Italia). Los animales se mantuvieron en las condiciones medioambientales siguientes: temperatura 22\pm2ºC, humedad relativa 55\pm10%, ventilación 15\pm3 cambios de aire por hora fitrado en filtros de HEPA 99,997% y luz artificial con un ciclo circadiano de 12 horas de luz (7:00 - 19:00). Antes de los experimentos se permitió a los animales aclimatarse a estas condiciones durante un período de al menos una semana. A los animales se les alimentó ad libitum con una dieta estandar de pelets.

Fármacos del estudio

Antide se preparó y proporcionó en Bachem (California, USA).El TNF-RI soluble recombinante humano usado en el ejemplo tiene una secuencia que corresponde al segmento 20-180 del TNF-RI humano (Nophar et al., 1990) y se preparó en células CHO y se obtuvo de Interpham Laboratories Ltd. (Israel) con el nombre r-hTBP-1.

Material. El material ordinario para cultivo de células se obtuvo de Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, UK). El kit de RIA del 17\beta-estradiol se obtuvo de DPC (Los Angeles, CA, USA). Inoketam se obtuvo de Virbac(Carro, FR). (^{51}Cr)-cromato sódico se obtuvo de NEN Dupont (Boston, MA USA). Rompun® se obtuvo de Bayer AG (Leverkusen, DE). Hilo de seda 7,0 se obtuvo de Ethicon (Pomezia, IT).

Modelo experimental de endometriosis en la rata

Para explorar los efectos del TNF-RI soluble recombinante en endometriosis, se usó un modelo experimental previamente descrito (Jones, 1987) con pequeñas modificaciones. Bajo anestesia Inoketam/ Rompun®, se cortó un fragmento autólogo de tejido endometrial (1 cm de longitud) del cuerno derecho del útero y se colocó en PBS a 37ºC. El segmento del útero se abrió con una incisión longitudinal, y una sección de 5x5 mm se transplantó, sin quitar el miometrio, sobre la superficie interna de la pared abdominal usando sutura de seda no absorbible en las cuatro esquinas.

La exploración de los efectos de los fármacos del estudio en el modelo experimental de endometriosis experimental se indujo quirúrgicamente en ratas como se ha descrito anteriormente. Adicionalmente, a otro grupo de ratas se les quitó de forma similar un fragmento de uno de los cuernos del útero, pero se les transplantó un cuadrado de 5x5 mm cuadrados del tejido adiposo que rodea el útero (grupo operado testigo). Un grupo adicional de ratas que no sufrió ningún procedimiento quirúrgico se mantuvo como un grupo normal de control. Tres semanas después de la inducción de la endometriosis los animales sufrieron una segunda laparotomía (laparotomía de pre-tratamiento) para evaluar el tamaño y viabilidad del tejido ectópico del endometrio. Se midió y se registró la superficie (longitud x anchura) utilizando un calibrador. Se asignaron los animales que mostraron injertos viables a los grupos de tratamiento como se anota en la Tabla 1, de manera que al final del experimento, se obtuvieron seis animales/grupo para el primer tiempo de sacrificio y cinco animales/grupo para el segundo. Los tratamientos se iniciaron después de un período de recuperación de una semana. El grupo de control recibió sólo solución salina; otro grupo recibió tres inyecciones subcutáneas de 2 mg/kg de Antide cada tres días con un régimen que se había previamente demostrado que suprime la actividad ovárica e hipotalámica (Sharpe et al., 1990). Otro grupo recibió 10 mg/kg de TNF-RI soluble recombinante dividido en dos dosis diarias a lo largo de un período de una semana.

TABLA 1

Transplante del	Tratamiento	Días de	Días de
Endometrio		Tratamiento (1)	Sacrificio (1)
No	Solución salina	28 a 34	36, 43
Testigo de operación	Solución salina	28 a 34	36, 43
Sí	Solución salina	28 a 34	36, 43
Sí	Antide (2 mg/kg)	28, 31, 34	36, 43
Sí	TNF-RI (10mg/kg) soluble	28 a 34	36, 43
	recombinante en dos dosis
	diarias
(1) Desde el día del implante del injerto quirúrgico (día 1)

En los tiempos de sacrificio designados (2 y 9 días después del último tratamiento, o sea 36 y 43 días después de los injertos quirúrgicos), se anastesió a los animales; se tomaron muestras de sangre de la aorta abdominal, se separó el suero y se almacenó a -20ºC hasta que se analizó para determinar las concentraciones de 17\beta-estradiol. Los bazos se cortaron para medir la actividad de las células naturales asesinas (NK). Se midió la superficie de cada uno de los focos de la endometriosis en cada uno de los tiempos de sacrificio, para normalizar los datos se calculó el porcentaje de variación frente al valor de la laparotomía del pre-tratamiento por medio de la fórmula:

\frac{(X-X_{0})}{X_{0}} \ x \ 100

En el que X_{0} es el tamaño en la laparatomía de pre-tratamiento y X es el tamaño en el momento del sacrificio. Se calculó así el valor medio del porcentaje de variación de cada grupo.

Determinación de la actividad NK

Se determinó la extensión de la actividad NK por medio del ensayo de liberación de ^{51}Cr. Se recogieron células de linfoma murino YAC-1 durante la fase de crecimiento exponencial y se lavaron una vez con el medio (RPMI 1640 que contiene penicilina/estreptomicina, L-glutamina y 10% de suero fetal de ternera inactivado por el calor). Se incubó la pelet celular con 100 \muCi de (^{51}Cr)-cromato sódico a 37ºC, 5% CO_{2} durante 2 horas. Las células se lavaron a continuación tres veces con 10 ml del medio del ensayo, se resuspendieron a la concentración deseada y se añadió a la placa de ensayo en presencia de esplenocitos de rata. Se resuspendió en el medio de ensayo a la concentración deseada (2 x 10^{6}/ml) y se hicieron diluciones seriadas en el medio de ensayo por triplicado en los pocillos de una placa en forma de U de 96 pocillos antes de la adición de las células diana marcadas con ^{51}Cr (5 x 10^{-3}) y se analizaron tres fracciones de efector-a-diana (200:1, 100:1, y 50:1) para cada muestra. La placa que contenía la mezcla de célula efector-a-diana se centrifugó a 200g durante 4 min y se incubó a 37ºC, 5% CO_{2} durante 4 horas. Después de una centrifugación adicional de la placa a 200xg durante 4 min, 20 \mul del sobrenadante de cada pocillo se transfirió a un filtro de fibra de vidrio y la radioactividad asociada se evaluó con un contador \beta.

El porcentaje de lisis se calculó como a continuación:

\frac{Cpm_{muestra}-cpm_{base}}{cpm_{total}-cpm_{base}} \ x\ 100

en el que:

cpm_{muestra} = media de la liberación de ^{51}Cr en presencia de las células efectoras

cpm_{base} = media de la liberación de ^{51}Cr de las células diana en presencia del medio de cultivo

cpm_{total} = media de la liberación de _{51}Cr en presencia de 1% Tritón-X100.

Determinación de 17\beta-estradiol

Se determinaron las concentraciones séricas de 17\beta-estradiol por medio de un kit comercial para la cuantificación de estradiol en suero sin etapa de extracción (DPC, Los Aneles, CA, USA). Brevemente, el estradiol marcado con ^{125}I compite con el estradiol de la muestra sérica por los lugares del anticuerpo. Después de la incubación, se realiza la separación del estradiol unido y libre por decantación. Se realiza el contaje del tubo entonces en un contador gamma (LKB-Pharmacia Wallak), las cuentas estan inversamente relacionadas con la cantidad de estradiol presente en la muestra sérica. Se determinó la cantidad de estradiol en las muestras comparando las cuentas en una curva de calibración. El antisuero es altamente específico para estradiol, con una reactividad cruzada para otros esteroides naturales relativamente baja. Las muestras de la misma sesión experimental se analizaron en el mismo inmunoensayo.

Análisis estadístico

La significancia estadística de las diferencias observadas entre los grupos de tratamiento se evaluó usando el ANOVA (análisis de varianza) presente en el software de Statgraphics Plus® (Versión 1,4). Se realizó el test de intervalo múltiple de Tukey (P<0,05).

Resultados Exploración de los efectos de TNF-RI recombinante soluble en endometriosis experimental

El crecimiento y desarrollo con éxito del transplante quirúrgico de tejido endometrial en la rata ha ofrecido un modelo de investigación que se ha usado para estudiar algunos de los aspectos de la endometriosis que no pueden ser estudiados adecuadamente en humanos (Dudley et al., 1992). Estudios anteriores sobre la endometriosis experimental en la rata indican que Amide es apropiado como control positivo (Sharpe et al., 1990). En el ejemplo actual, el efecto de Amide se comparó, en términos del tamaño del injerto antes y después del tratamiento, con el observado usando TNF-RI soluble recombinante como se resume en la Tabla II.

TABLA II

Tratamiento	Dosis (mg/Kg)	Tiempo de obervación	Media\pmSEM	Media\pmSEM
		después del último	Valores de	Valores de
		tratamiento (día)	Pre-tratamiento (cm^{2})	Post-tratamiento (cm^{2})
Solución salina	-	2	1,45\pm0,41	1,18\pm0,15
TNF-RI soluble	10	2	1,43\pm0,38	0,77\pm0,09
Antide	2	2	1,43\pm0,34	0,08\pm0,02
Solución salina	-	9	1,28\pm0,24	0,97\pm0,11
TNF-RI soluble	10	9	1,42\pm0,38	0,54\pm0,19
Antide	2	9	1,41\pm0,32	0,19\pm0,09

Los resultados se expresan en la Figura 1 como el porcentaje medio de inhibición de fragmentos de endometrio injertados (calculado como se ha descrito anteriormente).

El antide fue efectivo en la reducción del tamaño de los focos tipo endometrio (Figura 1), induciendo una remisión casi completa (94% y 88% comparado con la dimensión original, respectivamente) y estadísticamente significativa (p<0,05, ANOVA y prueba de Tukey), en ambos tiempos de observación después de discontinuar el tratamiento. El tratamiento de 1 semana con TNF-RI (10 mg/kg en dos dosis diarias) resultó en reducciones del tamaño significativas (33% y 64% comparado con la dimensión original, respectivamente) de los focos tipo endometriotico sólo en el día 9. No se observaron crecimientos (Engraftments) en los animales operados testigo en ningún momento.

Evaluación de las actividades de células NK

La actividad de las células NK se evaluó por medio de los experimentos in vitro en células de bazo frente a células YAC y no se observó ninguna diferencia entre los grupos (Figura 2), similarmente a lo que se había observado en monos baboon, en los que no se observó ninguna diferencia en citotoxicidad antiendometrial y actividad de células NK en animales con o sin endometriosis (D`Hooghe et al., 1995). Este resultado contrasta con datos en seres humanos en los que se ha publicado menor actividad NK en pacientes con endometriosis con una correlación significativa entre actividad NK peritoneal reducida y severidad de la endometriosis (Oosterynck et al., 1992).

Evaluación del 17\beta-estradiol en el suero

Las concentraciones séricas de 17\beta-estradiol se midieron por radioinmunoensayo en ambos tiempos de observación.

Se observó una diferencia significativa en los grupos tratados con Antide comparados con los controles no tratados en el segundo tiempo de observación. No se observaron diferencias estadísticamente significativas para el TNF-RI cuando se compararon con los controles (Fig. 3; p<0,05, ANOVA y prueba de Tukey)

Conclusiones

En el modelo experimental de endometriosis en la rata, la administración de un antagonista de TNF, la forma soluble de TNF-RI, proporciona evidencia clara por primera vez de la efectividad potencial del tratamiento de esta condición patológica basado en citoquinas, no relacionado con hormonas. Así los antagonistas de TNF representan una alternativa a los tratamientos médicos existentes en términos de efectos secundarios reducidos. Estos resultados evalúan el uso de antagonistas de TNF en el tratamiento de la infertilidad relacionada con la endometriosis.

Los versados en el arte conocerán, o serán capaces de encontrar usando sólo experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las versiones específicas de las invenciones aquí descritas. Se entiende que éstos y todos los demás equivalentes están incluidos en las reivindicaciones siguientes.

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Claims

1. El uso de un antagonista de TNF junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la endometriosis, en el que dicho antagonista de TNF es un antagonista secuestrante o un antagonista de la señalización.

2. El uso de un antagonista de TNF junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable en la preparación de una composición farmacéutica para mejorar la implantación y tasa de fertilidad por medio de la reducción de las lesiones del endometrio, en el que dicho antagonista de TNF es un antagonista secuestrante o un antagonista de la señalización.

3. El uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho antagonista secuestrante es una molécula de receptor, un derivado o uno de sus fragmentos que se une al TNF.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que la molécula de receptor se escoge del grupo que consiste en: TNF-RI y TNF-RII.

5. El uso de la reivindicación 3, en el que la molécula de receptor es el dominio extracelular de TNF-RI.

6. El uso de la reivindicación 3, en el que la molécula de receptor es de TNF-RI humano soluble recombinante.

7. El uso de la reivindicación 3, en el que la molécula de receptor es una molécula de receptor de TNF multimérica o una de sus porciones funcionales.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que la molécula multimérica de receptor TNF contiene la totalidad o una parte funcional de dos o más dominios extracelulares de los receptores de TNF unidos por medio de uno o más fragmentos enlazadores polipeptídicos.

9. El uso de la reivindicación 3, en el que la molécula de receptor es una molécula de fusión del inmunoreceptor o una de sus porciones funcionales.

10. El uso de la reivindicación 9, en el que la molécula de fusión del inmunoreceptor contiene la totalidad o una porción funcional del receptor de TNF y una cadena de inmunoglobulina.

11. El uso de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el antagonista secuestrante es un anticuerpo anti-TNF o uno de sus fragmentos.

12. El uso de la reivindicación 11, en el que el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en: un anticuerpo monoclonal quimérico, un anticuerpo monoclonal humanizado o uno de sus fragmentos.