DE60003152T2

DE60003152T2 - Tumor nekrose faktor antagonisten und ihre verwendung gegen endometriose

Info

Publication number: DE60003152T2
Application number: DE60003152T
Authority: DE
Inventors: Francesco Borrelli; Mauro D'antonio; Fabrizio Martelli
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2020-01-20
Also published as: US6663865B1; NO20013577D0; HUP0105103A3; EE05543B1; HU226149B1; IL144413A; KR20060128056A; SI1143997T1; BG105691A; SK287313B6; CZ20012656A3; ES2200808T3; DK1143997T3; PT1143997E; HK1043059B; CN1212152C; DE60003152D1; EA200100799A1; ZA200105263B; CZ302866B6

Description

Gebiet der Erfindung
Tumor Nekrose Faktor-Antagonisten müssen in therapeutisch wirksamen Dosen verabreicht werden, um Endometriose zu behandeln und/oder zu verhüten. Die Antagonisten dieser Erfindung werden üblicherweise aus verschiedenen Klassen von Molekülen, sind jedoch vorzugsweise lösliche TNF-Rezeptoren ausgewählt. Die Antagonisten sind geeignet für die Regression von endometriotischen Läsionen und zur Verbesserung der Implantation und Fertilitätsrate durch das Verringern von endometriotischen Läsionen.
Hintergrund der Erfindung
Bei der Endometriose handelt es sich um eine Erkrankung des weiblichen Genitals, welche durch die Anwesenheit von endometrialen Drüsen und Stroma außerhalb der endometrialen Höhle und der Uterusmuskulatur gekennzeichnet ist. Die anatomischen Strukturen, welche am häufigsten betroffen sind, sind die Ovarien, uterosakralen Ligamente, das pelvische Peritoneum, das rektovaginale Septum, Cervix, Vagina, die Fallopian-Tuben und die Vulva. Allgemein neigt die Endometriose dazu, tief von dem rektovaginalen Septum in die darunterliegenden Gewebe zu infiltrieren und oberflächlich nicht sichtbar zu sein. Gelegentlich können Endometrose-Herde in extraovariellen Strukturen, wie in Lungen, Blase, Haut, Pleura und Lymphknoten auftreten. Endometriotische Läsionen sind progressiv: sie sind zuerst erkennbar als Vesikel, welche dann rot werden und sich über einen Zeitraum von wenigen Jahren weiterentwickeln zu schwarzen, fibrotischen Läsionen (MacSween, 1993).
Endometriose gilt als benigne Erkrankung, endometriotische Läsionen werden jedoch gelegentlich maligne. Wie in anderen Arten von Malignität, ist die Entwicklung von Endometriose-abgeleiteten Neoplasmen zurückzuführen auf gleichlaufende Ereignisse, welche Veränderungen in der Regulation von Wachstumsfaktoren und/oder Onkogenen einschließen (Cheung, 1996).
Endometriose gehört zu den häufigsten gynäkologischen Krankheiten, mit Verbreitung bei Frauen im gebärfähigen Alter: diese Krankheit tritt bei etwa 5–10% der Frauen im gebärfähigen Alter auf (Barbieri, 1988). Endometriotisches Gewebe ist vollkommen abhängig von Östrogen für kontinuierliches Wachstum, auch an ektopischen Stellen. Folglich tritt Endometriose selten vor der Menarche und nach der Menopause auf, wenn Frauen östrogendefizient sind. Endometriose-hormonelle Sensitivität unterliegt einigen der häufigeren Symptome, welche Unterbauchschmerzen und Dysmenorrhö sind.
Endometriose rührt von endometrialen Zellen her, welche vom Uterus zu anderen Stellen disseminieren, wo lebensfähige Zellen implantieren und wachsen können. Zwei mögliche Mechanismen wurden vorgeschlagen, um die initiale Zellstreuung zu erklären. Retrograde Menstruation, ein häufiges Phänomen unter Frauen im Menstruationszyklus, ermöglicht es Fragmenten, welche sich vom Endometrium gelöst haben, durch rückfließende menstruale Flüssigkeit, nahegelegene Strukturen im Genitalapparat zu erreichen. Alternativ, um das Auftreten von Endometriose in anderen Strukturen als genitalen Strukturen zu erklären, könnten endometriale Zellen durch uterine Venen und Ausbreitung durch das lymphatische System gestreut werden (hämatogene oder lymphatische Dissemination). Auch gynäkologisch-chirurgische Eingriffe können zu dieser Streuung beitragen (MacSween, 1993).
Abgesehen von der Dissemination endometrialer Zellen, können andere Faktoren wie z. B. genetische Prädisposition (Malinak et al., 1980), ebenso wie immunologische Veränderungen (Ho et al., 1997) die Anfälligkeit von Frauen für Endometriose bestimmen. Da endometriale Zellen häufig in peritonealer Flüssigkeit bei allen Frauen zum Zeitpunkt der Menses beobachtet werden, sollten Säugetiere über Mechanismen verfügen, höchstwahrscheinlich zusammenhängend mit dem Immunsystem, um den Beginn von Endometriose zu verhindern. Im Allgemeinen können endometrale Zellen, welche der Immunantwort des Wirtes entgehen, und welche eine adäquate östrogene Stimulation erhalten, proliferieren, um große makroskopisch sichtbare Läsionen zu bilden. Endometriose gilt daher als dynamischer Prozess, wobei neue Läsionen kontinuierlich gebil det werden, während bereits existierende Läsionen wachsen können oder durch die Immunantwort des Wirtes zerstört werden können.
Die Entzündungsreaktion, welche normalerweise mit Endometriose assoziiert ist, verändert die peritoneale Umgebung, da es ein erhöhtes Volumen an peritonealer Flüssigkeit und peritonealen Makrophagen, welche sowohl in Zahl und Aktivität erhöht sind, gibt. Daher wurde vorgeschlagen, dass das Monozyten/Makrophagensystem eine Schlüsselrolle in der Entwicklung von Endometriose hat. Sekretorische Produkte van Makrophagen, einschließlich RANTES (Hornung et al., 1997), Interleukin-6 (Harada et al., 1997), Interleukin-8 (Arici et al., 1996a), Tumor Nekrose Faktor-alpha (Overton et al., 1996), Monozyten-chemotaktisches Protein-1 (Arici et al., 1997), wurden in der peritonealen Flüssigkeit von Frauen, welche von dieser Krankheit betroffen sind, in höheren Konzentrationen festgestellt. Immunologische Veränderungen wurden in Frauen mit Endometriose gezeigt; es wurde jedoch nicht gezeigt, ob diese Ereignisse verantwortlich sind für die Endometriose oder ein Ergebnis der Entzündung, welche von der Endometriose verursacht wird, sind (Rana et al., 1996).
Das Wissen über Endometriose und seine Relevanz für weitere Krankheiten ist noch limitiert, sogar auf diagnostischer Ebene. Obwohl Endometriose als eine Hauptursache von Infertilität gilt, sind Studien über die Pathophysiologie der Krankheit widersprüchlich und nicht definitiv. Es gibt eine schwache Korrelation zwischen dem Grad der Schmerzen oder Infertilität und der Schwere der Krankheit, da frühe Läsionen metabolisch aktiver sind. Die Infertilitätsrate ist höher als in der normalen Population und Studien in Kaninchen haben gezeigt, dass chirurgische Induktion von Endometriose zu einem Rückgang in der Fertilität von 75% auf 25% führt (Hahn et al., 1986). Von Patienten mit Unterbauchschmerzen wurde festgestellt, dass sie in 71% der Fälle Endometriose haben, während bei 84% der Patienten mit Unterbauchschmerzen und Infertilität Endometriose diagnostiziert wurde (Koninckx et al., 1991). Im Allgemeinen kann Infertilität festgestellt werden, wenn die Endometriose so ausgeprägt ist, dass sie normale vaginale Strukturen stört, während Schwangerschaftsraten normal sind, wenn Endometriose minimal ausgeprägt ist.
Endometriose kann die Fertilität auch auf eine andere Art beeinflussen. Signalstoffe von weißen Blutzellen, wie Interleukin-6, Interferon und Tumor Nekrose Faktor, sind alle er höht, was die Oozyten-Spermainteraktion nachteilig beeinflusst. Von Serumproben, welche von Frauen mit Endometriose erhalten wurden, wurde festgestellt, dass sie embryotoxisch in Mausembryomodellen wirken und die Spermamobilität in vitro inhibieren (Halme, 1991), ein Effekt, welcher verstärkt wird, wenn rekombinanter Tumor Nekrose Faktor-alpha dazugegeben wird (Eisermann et al., 1989). Diese Studien jedoch haben sich nicht dem Problem gewidmet, wie Cytokine die Progression von Endometriose beeinflussen, sondern haben lediglich die Effekte solcher Moleküle auf die Lebensfähigkeit von Keimzellen und embryonale Zellen gezeigt.
Hormontherapie und Chirurgie sind die beiden therapeutischen Modalitäten, welche gegenwärtig zur Behandlung von Endometriose verwendet werden. Die gegenwärtige pharmakologische Therapie für Endometriose erfordert die hormonelle Unterdrückung der Östrogenproduktion, so dass das schwache hormonelle Umfeld das Wachstum von ektopischem Gewebe blockiert. Was die Behandlung von Endometriose abhängiger Infertilität betrifft, so ist die Hormontherapie in Patienten mit minimaler Krankheit nicht von nachgewiesenem Vorteil, während andere Studien einen Anstieg in den Schwangerschaftsraten zeigten (Arici et al., 1996b).
Hormonelle Therapien enthielten hohe Dosen von Progestagenen, Kombinationen von Östrogen und Progesteron (unter Verwendung hoch dosierter oraler kontrazeptiver Pillen, oral contraceptive pills oder OCPs, in einem "Scheinschwangerschafts"-Behandlungsschema), Danazol (ein androgenisches Derivat von Ethisteron) und in letzterer Zeit GnRH-Agonisten. Diese hormonellen Therapien sind effektiv gegen Unterbauchschmerzen und induzieren eine objektive Regression der Läsionen, weisen jedoch mehrere Vorbehalte auf. Östrogen könnte das endometriotische Gewebe stimulieren und dessen Proliferation verursachen, da es unfähig sein kann, auf Progesteron zu antworten, sogar in hohen Dosen, so dass OCPs einer limitierten Zahl von Patienten teilweise Erleichterung schalten könnten (Dawood, 1993). Progestationale Mittel können unregelmäßige Blutung (50%), begleitet von Depression, Gewichtszunahme und Retention von Flüssigkeit hervorrufen. Danazol unterdrückt Endometriose durch Hervorrufen verschiedener Antworten, einschließlich der Verringerung von löslichem Tumor Nekrose Faktor alpha, Interleukin-1 beta und CD8-Level im Serum (Matalliotakis et al., 1997; Mori et al., 1990), die Inhibition von de novo Steroidbildung und das Ablösen von Estradiol von seinem Rezeptor. Danazol kann die Symptome in etwa 66–100% der Patienten, welche an Schmerzen leiden, verbessern, die Rückfallquote nach bis zu 4 Jahren beträgt jedoch etwa 40%–50%. Weitere Nachteile der Danazol-Therapie sind Gewichtszunahme und androgenische Nebenwirkungen, welche bis zu 80% der Patienten dazu veranlassen, diese Therapie zu beenden (Barbieri, 1988). GnRH-Analoga sind stärker und länger wirksam als natives GnRH, welche durch Entfernen des östrogenischen Stimulus für das Wachstum von allen östrogensensitiven Geweben wirken. Nebenwirkungen von GnRH-Analoga sind hauptsächlich sekundär bedingt durch die Schwere Hypoöstrogenämie, wie z. B. veränderte Knochendichte, und die Rückfallquote beträgt bis zu 50% nach 5 Jahren (Waller und Shaw, 1993).
Abhängig von der Ausprägung der Krankheit, kann die chirurgische Intervention konservativ sein, wenn Fertilität gewünscht wird, oder sie kann zu der Entfernung des Uterus, der Tuben und der Ovarien in Fällen von schwerer Krankheit führen. In jedem Fall führt selbst die limitierte chirurgische Behandlung zu einer signifikanten Abnahme in der Fertilität. Schwangerschaftsraten nach chirurgischen Eingriffen liegen im Allgemeinen zwischen 35% und 65%, so dass Patienten Ovulationsinduktion und intrauterine Insemination benötigen, um normale Fekundität zu erreichen (Koninckx und Martin, 1994). Klinische Berichten zeigen, dass nach Laparotomie und Resektion der Endometriose bis zu 40% der Patienten eine erneute Operation innerhalb von 5 Jahren brauchten. Sogar nach einem radikalen chirurgischen Eingriff bleibt das Wiederauftreten von Schmerzen durch Endometriose ein signifikantes Problem. Einige der Gründe für das Versagen der chirurgischen Therapie könnte eine unvollständige Resektion einschließen, mit Läsionen welche entweder nicht erkannt oder vollständig übersehen werden. Viele Läsionen sind mikroskopisch und könnten trotz der durch das Laparoskop erreichten Vergrößerung nicht visualisiert werden. Daher kann von der Chirurgie alleine nicht erwartet werden, dass sie diese Krankheit heilt (Reveli et al., 1995).
Viele Patienten mit Endametriose leiden an den Nachteilen der traditionellen Therapien (einschließlich der Konsequenzen von hormonellem Disäquilibrium, hohen Rückfallquoten und Infertilität). Es ist daher von Interesse, alternative Behandlungsformen für Endometriose zur Verfügung zu stellen. Ein möglicher therapeutischer Ansatz könnte in der Verwendung von immunomodulatorischen Molekülen liegen, welche fähig sein könnten, sowohl die endometriotischen Läsionen als auch die immunologische Situation zu verbessern. Ein solcher Ansatz wurde als geeignet für die Behandlung von allgemeinen Symptomen betrachtet (Rana et al., 1996), es sind jedoch keine experimentellen Erkenntnisse vorhanden, welche darauf deuten, welches Cytokin unter denjenigen, welche veränderte Expressionslevel nach dem Auftritt von Endometriose aufweisen, ein bevorzugtes Ziel für die therapeutische Intervention sein könnte.
Wie bereits erwähnt, handelt es sich bei einem der verschiedenen sekretorischen Produkte von Makrophagen, welche in die endometriotische Entzündungsreaktion involviert sind, um Tumor Nekrose Faktor (abgekürzt von hier an als TNF). TNF, auch definiert als Cachectin, ist ein pleiotropes Cytokin, welches von aktivierten T-Zellen und Makrophagen freigesetzt wird. TNF ist ein Mitglied des Interferon, Interleukin und Colony Stimulating Factor (Kolonie-stimulierender Faktor) Cytokin-Netzwerkes, welches eine Schlüsselrolle im Signalsystem in Bezug auf die Pathogenese von vielen infektiösen und inflammatorischen Krankheiten durch die Induzierung einer Zahl von proinflammatorischen Veränderungen, einschließlich der Produktion von weiteren Cytokinen und Adhäsionsmolekülen, spielt (Fiers, 1991).
Der Einfachheit halber soll der Begriff TNF in den gesamten Text der vorliegenden Anmeldung sowohl Tumor Nekrose Faktor-alpha oder -beta von Tieren oder Menschen kollektiv bezeichnen, gemeinsam mit natürlich vorkommenden Allelen davon. TNF-alpha (Pennica et al., 1984). TNF-beta, auch als Lymphotoxin bezeichnet, hat eine ähnliche Aktivität, wird jedoch von anderen Zelltypen (Lymphozyten und natürlichen Killerzellen) in Antwort auf antigenische oder mitogenische Stimuli produziert (Gray et al., 1984).
TNF wird als ein reifes 17 kDa-Protein exprimiert, welches als Trimer aktiv ist. Dieser Komplex übt seine biologische Aktivität durch Aggregierung seiner Zelloberflächenrezeptoren aus, welche spezifische Effekte in verschiedenen Organen und Geweben vermitteln. Im Endometrium ist die TNF-Expression ortsabhängig und abhängig vom Menstruationszyklus (Hunt et al., 1992) und induziert Apoptose im Endometrium von Versuchstieren (Shalaby et al., 1989). Die Adhärenz von endometrialen Stromazellen an mesothelialen Zellen war signifikant erhöht durch Vorbehandlung der mesothelialen Zellen mit TNF (Zhang et al., 1993), was die Idee unterstützt, dass TNF zu der Initiation und/oder der Entwicklung der Endometriose beitragen könnte.
TNF übt seine Aktivität, welche für die normale Entwicklung und Funktion des Immunsystems erforderlich ist, aus durch Bindung an eine Familie von Membran-gebundenen Rezeptormolekülen einschließlich p55 TNF-Rezeptor I, in der Literatur auch als TNF-RI bezeichnet und p75 TNF-Rezeptor, in der Literatur auch als TNF-RII bezeichnet (Bazzoni und Beutler, 1996). Die Dominanz von TNF-RI in der Transduktion des TNF-Signals wird nahegelegt durch die Fähigkeit von agonistischen Antikörpern, welche spezifisch für diesen Rezeptor sind, die Mehrzahl von TNF-induzierten Antworten nachzuahmen (Shalaby et al., 1990). Durch Binden an seine Membran-gebundenen Rezeptoren triggert TNF den Signaltransduktionsweg durch cytoplasmatische Mediatoren wie TRADD und TRAP-1 (für TNF-RI) oder TRAP-1 TRAF-2 (für TNF-RII), was zu verschiedenen Zellantworten, wie T-Zellproliferation, Tumorzelllyse in vitro, dermale Nekrose, Insulinresistenz und Apoptose führt. Die extrazellulären Abschnitte beider TNF-Rezeptoren können abgeworfen werden, und diese löslichen Rezeptoren behalten ihre Fähigkeit TNF zu binden, die TNF-Aktivität durch die Bildung von hochaffine Komplexen zu inaktivieren und dadurch die Bindung von TNF an Ziel-Zellmembranrezeptoren zu reduzieren (Nophar et al., 1990).
Im Endometrium werden die Level der Membran-gebundenen TNF-Rezeptoren durch die Verabreichung von Östradiol und/oder Progesteron beeinflusst, was in einer zeitlichen und Zelltyp-spezifischen Expression von TNF-RI in der Maus resultiert (Roby et al., 1996). Diese Studie jedoch, wie viele andere Studien, welche in verschiedenen mit Endometriose zusammenhängenden Modellen durchgeführt wurden, gab keinerlei Hinweise auf den tatsächlichen in vivo-Effekt von TNF und TNF-RI, entweder Mmembrangebunden oder löslich, in der Entwicklung von endometriotischen Herden, sondern lediglich eine Beschreibung der Endometriose-assoziierten immunologischen Anomalitäten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Patentanmeldung basiert auf der Annahme, dass ein TNF-Antagonist fähig ist, durch Sequestrieren des zirkulierenden TNFs die Progression von endometriotischen Läsionen aufzuhalten. Diese Annahme wird bestätigt durch die Entdeckung, welche in dem Beispiel beschrieben wird, und welche zeigt, dass ein TNF-Antagonist die Größe von endometriotisch ähnlichen Herden in einem experimentellen Rattenmodell signifikant reduziert. Als ein Ergebnis der Entdeckung des Anmelders wird die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines TNF-Antagonisten, wobei der genannte TNF-Antagonist ein sequestrierender oder signalisierender Antagonist ist, hierin zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung und/oder Verhütung von Endometriose in einem Individuum zur Verfügung gestellt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines TNF-Antagonisten, wobei der genannte TNF-Antagonist ein sequestrierender oder signalisierender Antagonist ist, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger in der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Endometriose.
In der vorliegenden Erfindung kann die Verabreichung des genannten TNF-Antagonisten parenteral oder durch andere wirksame Formulierungen erfolgen. Jede Art der parenteralen Verabreichung kann geeignet sein, einschließlich der intravenösen, intramuskulären und subkutanen Verabreichung. Neben dem pharmazeutisch annehmbaren Träger kann die Zusammensetzung gemäß der Erfindung außerdem geringe Mengen von Zusätzen, wie z. B. Stabilisatoren, Arzneiträgern, Puffern und Konservierungsmitteln umfassen.
TNF-Antagonisten, welche geeignet in der Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung sind, schließen lösliche TNF-Rezeptormoleküle, Anti-TNF-Antikörper und Verbindungen, welche das TNF-Rezeptor-Signaling verhindern und/oder inhibieren, ein. Es ist möglich, den TNF-Antagonisten allein oder in Kombination mit weiteren TNF-Antagonisten zu verwenden. Die Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch aktiven Produkten ist ebenfalls möglich, insbesondere um das Befinden der Patienten, welche von Endometriose-abhängiger Infertilität leiden, zu verbessern.
Beschreibung der Erfindung
Die hierin beschriebene Erfindung zeigt deutlich das unerwartete Ergebnis, dass Sequestrieren von TNF (welches das einzige von mehreren Cytokinen ist, dessen Expressionslevel in der peritonealen Flüssigkeit nach Auftreten von Endometriose erhöht ist), mittels eines TNF-Antagonisten, die endometriotisch ähnlichen Herde in einem experi mentellen Rattenmodell reduziert. Dieses Modell zeigt auch, dass ein solcher Effekt erreicht wird, ohne das hormonelle Äquilibrium und die Aktivität von natürlichen Killerzellen signifikant zu beeinflussen. Die Reduzierung von endometriotischen Läsionen durch Verwendung von TNF-Antagonisten kann auch die Fertilitätsrate verbessern, da die Normalisierung von genitalen Strukturen einen positiven Effekt auf die Implantationsrate hat.
Daher ist das Hauptziel der vorliegenden Erfindung, die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines TNF-Antagonisten zur Verfügung zu stellen, wobei der genannte TNF-Antagonist ein sequestrierender oder signalisierender Antagonist ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Verhütung von Endometriose in einem Individuum, umfassend die Verabreichung.
In einer zweiten Ausführungsform betrifft die Erfindung den genannten TNF-Antagonisten, welcher ein sequestrierender oder signalisierender Antagonist ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Endometriose-abhängigen Infertilitätsbeschwerden in einem Individuum, in Kombination mit weiteren Arzneimitteln.
Ein noch weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des TNF-Antagonisten zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger in der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung und/oder Verhütung von Endometriose.
Die aktiven Inhaltsstoffe der hierin beanspruchten Zusammensetzungen sind TNF-Antagonisten. Die beanspruchten TNF-Antagonisten üben ihre Aktivität in einem von zwei Wegen aus. In dem ersten können die Antagonisten an das TNF-Molekül selbst binden oder es sequestrieren mit ausreichender Affinität und Spezifität, um das TNF-Epitop, welches verantwortlich ist für die TNF-Rezeptorbindung, zu neutralisieren (im weiteren "sequestrierende Antagonisten" genannt). Alternativ können die TNF-Antagonisten den TNF-Signaltransduktionsweg inhibieren, welcher durch den Zelloberflächenrezeptor nach TNF-Bindung aktiviert wird (im weiteren "signalisierende Antagonisten") genannt. Beide Gruppen von Antagonisten sind, allein oder zusammen, in der Therapie von Endometriose gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich.
TNF-Antagonisten werden einfach identifiziert und eingeordnet durch Routinescreening von Kandidaten auf ihren Effekt auf die Aktivität von nativem TNF auf empfindliche Zelllinien in vitro, z. B. humane B-Zellen, in welchen TNF die Proliferation und Ig-Sekretion verursacht. Das Assay enthält TNF-Formulierungen mit variierenden Verdünnungen von Kandidaten-Antagonisten, z. B. von 0,1 bis 100 mal die molare Menge von TNF, welche in dem Assay verwendet wird sowie Kontrollen mit keinem TNF oder nur den Antagonisten (Tucci et al., 1992).
Sequestrierende Antagonisten sind die bevorzugten TNF-Antagonisten gemäß der vorliegenden Erfindung. Unter den sequestrierenden Antagonisten sind solche Polypeptide bevorzugt, welche TNF mit hoher Affinität binden und welche geringe Immunogenizität aufweisen. Lösliche TNF-Rezeptormoleküle und neutralisierende Antikörper gegen TNF sind besonders bevorzugt. Zum Beispiel sind TNF-RI und TNF-RII nützlich in der vorliegenden Erfindung. Trunkierte Formen dieser Rezeptoren, welche die extrazellulären Domänen der Rezeptoren oder funktionelle Abschnitte davon umfassen, sind mehr besonders bevorzugte Antagonisten gemäß der vorliegenden Erfindung. Trunkierte Formen der TNF-Rezeptoren sind löslich und wurden im Urin und Serum als 30 kDa und 40 kDa TNF-inhibitorische Bindungsproteine detektiert, welche ursprünglich TBPI bzw. TBPII (TNF inhibitory binding proteins) genannt wurden (Engelmann et al., 1990). Derivate (Abkömmlinge), Fragmente, Regionen, und biologisch aktive Abschnitte der Rezeptormoleküle ähneln den Rezeptormolekülen funktionell, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Solch ein biologisch aktives Äquivalent oder Derivat des Rezeptormoleküls bezieht sich auf den Abschnitt des genannten Polypeptids oder auf die Sequenz, welche das Rezeptormolekül kodiert, das eine ausreichende Größe aufweist und fähig ist, TNF mit einer solchen Affinität zu binden, dass die Interaktion mit dem Membran-gebunden TNF-Rezeptor inhibiert oder blockiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem TNF-Antagonisten, welcher dem Patienten verabreicht werden soll, um humanen löslichen TNF-RI. Die natürlichen und rekombinanten löslichen TNF-Rezeptormoleküle und Verfahren zu ihrer Herstellung wurden in den europäischen Patentanmeldungen EP 308,378 , EP 398,327 und EP 433,900 beschrieben.
TNF-Rezeptor multimerische Moleküle und TNF-Immunrezeptor-Fusionsmoleküle und Derivate oder Abschnitte davon sind weitere Beispiele von Rezeptormolekülen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind. TNF-Rezeptor multimerische Moleküle, welche in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen die gesamte oder einen funktionellen Abschnitt der extrazellulären Domäne von zwei oder mehr TNF-Rezeptoren, welche verbunden sind durch einen oder mehrere Polypeptidlinker. Die multimerischen Moleküle können weiterhin ein Signalpeptid eines sezernierten Proteins umfassen, um die Expression des multimerischen Moleküls gerichtet zu machen. Diese multimerischen Moleküle und Verfahren zu ihrer Herstellung wurden in der europäischen Patentanmeldung EP 526,905 beschrieben.
TNF-Immunrezeptor-Fusionsmoleküle, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen wenigstens einen Abschnitt von einem oder mehreren Immunglobulinmolekülen und alles oder einen funktionellen Abschnitt von einem oder mehreren TNF-Rezeptoren. Diese Immunrezeptor-Fusionsmoleküle können als Monomere oder Hetero- oder Homo-Multimere zusammengesetzt sein. Die Immunrezeptor-Fusionsmoleküle können auch monovalent oder multivalent sein. TNF-Immunrezeptor-Fusionsmoleküle und Verfahren zu ihrer Herstellung wurde in der europäischen Patentanmeldungen EP 620,739 , korrespondierend zu PCT-Patentanmeldung WO 94/06476, beschrieben.
Eine weitere Klasse von sequestrierenden Antagonisten, welche nützlich sind in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wird gebildet von Anti-TNF-Antikörpern, einschließlich monoklonalen, chimären humanisierten und rekombinanten Antikörpern und Fragmenten davon, welche gekennzeichnet sind durch eine hohe Bindungsaffinität zu TNF in vivo sowie durch geringe Toxizität. Die Antikörper, welche in der Erfindung verwendet werden können, sind gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit, Patienten für eine Zeitspanne zu behandeln, welche ausreichend ist, um gute bis exzellente Regression der endometriotischen Läsionen zu erhalten, eine Linderung der Symptome und geringe Toxizität. Neutralisierende Antikörper können einfach generiert werden in Tieren wie z. B. Kaninchen oder Mäusen durch Immunisierung mit TNF. Immunisierte Mäuse sind besonders nützlich, um Quellen für B-Zellen zur Herstellung von Hybridomen zur Verfügung zu stellen, welche wiederum kultiviert werden, um große Mengen an Anti-TNF-monoklonalen Antikörpern herzustellen. Chimäe Antikörper sind Immunglobulinmoleküle, welche durch zwei oder mehr Segmente oder Abschnitte, abgeleitet von verschiedenen Tierarten, gekennzeichnet sind. Im Allgemeinen stammt die variable Region des chimären Antikörpers von einem nicht humanen Antikörper eines Säugetiers, wie z. B. von einem murinen monoklonalen Antikörper, und die Immunglobulin konstante Region stammt von einem humanen Immunglobulinmolekül. Vorzugsweise weisen beide Regionen und die Kombination geringe Immunogenizität auf, wie sie routinemäßig bestimmt werden kann (Elliott et al., 1994). Humanisierte Antikörper sind Immunglobulinmoleküle, welche durch gentechnische Methoden geschaffen werden, in welchen die murinen konstanten Regionen ersetzt werden durch humane Gegenstücke, während gleichzeitig die murinen antigenen Bindungsstellen beibehalten werden. Der daraus resultierende Maus-humane chimäre Antikörper sollte eine reduzierte Immunogenizität und verbesserte Pharmakokinetiken in Menschen aufweisen (Knight et al., 1993). Bevorzugte Beispiele für hochaffine monoklonale Antikörper und chimäre Derivate davon, welche in den Verfahren gemäß der Erfindung nützlich sind, werden in der europäischen Patentanmeldung EP 186,833 und in der PCT-Patentanmeldung WO 92/16553 beschrieben.
Der TNF-Antagonist kann einem Individuum auf verschiedene Arten verabreicht werden. Die Verabreichungswege schließen intradermale, transdermale (z. B. in Depotform (slow release formulations)), intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, orale, epidurale, topische und intranasale Wege ein. Jeder andere therapeutisch wirksame Weg der Verabreichung kann verwendet werden, z. B. die Absorption durch epitheliale oder endotheliale Gewebe oder durch Gentherapie, wobei ein DNA-Molekül, welches den TNF-Antagonisten kodiert, den Patienten verabreicht wird (z. B. durch einen Vektor), was dafür sorgt, dass der TNF-Antagonist in vivo exprimiert und sezerniert wird. Zusätzlich kann der TNF-Antagonist zusammen mit weiteren Komponenten von biologisch aktiven Mitteln wie z. B. pharmazeutisch annehmbaren Surfactans, Arzneistoffträgern, Verdünnungsmitteln oder jeden weiteren Träger verabreicht werden.
Die Definition von "pharmazeutisch annehmbar" bedeutet, dass jeder Träger, welcher nicht mit der Effektivität der biologischen Aktivität des aktiven Inhaltsstoffes interferiert, und welcher nicht toxisch ist für den Wirt, welchem er verabreicht wird, eingeschlossen ist. Zum Beispiel kann der TNF-Antagonist zur parenteralen Verabreichung formuliert sein in einer Dosierungseinheit (unit dosage form) zur Injektion in Trägerstoffen wie Saline, Dextroselösung, Serumalbumin und Ringer-Lösung.
Zur parenteralen (z. B. intravenösen, subkutanen, intramuskulären) Verabreichung, können die TNF-Antagonisten formuliert sein als Lösung, Suspension, Emulsion oder lyophilisierter Puder in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren parenteralen Trägerstoff (z. B. Wasser, Saline, Dextroselösung) und Zusatzstoffen, welche die Isotonizität aufrechterhalten (z. B. Mannitol) oder die chemische Stabilität (z. B. Konservierungsmittel und Puffer). Die Formulierung wird durch allgemein verwendete Methoden sterilisiert.
Die Bioverfügbarkeit des TNF-Antagonisten kann auch verbessert werden durch Verwendung von Konjugationstechniken, welche die Halbwertszeit des Moleküls im menschlichen Körper erhöht, z. B. durch Verbinden des Moleküls mit Polyethylenglycol, wie in der PCT-Patentanmeldung WO 92/13095 beschrieben.
Die therapeutisch wirksamen Mengen an TNF-Antagonist ist eine Funktion von zahlreichen Variablen, einschließlich der Art des Antagonisten, der Affinität des Antagonisten für TNF, jeder restcytotoxischen Aktvität, welche die Antagonisten aufweisen, des Weges der Verabreichung, des klinische Zustandes des Patienten (was die Wünschbarkeit verursacht, ein nicht-toxisches Level an endogener TNF-Aktivität aufrechtzuerhalten), der Präsenz von multiplen TNF-Kombinierungsstellen in sequestrierenden Mitteln, z. B. Antikörpern.
Eine "therapeutisch wirksame Menge" ist solcherart, dass, wenn sie verabreicht wird, der TNF-Antagonist in der Inhibition der biologischen Aktivität von TNF resultiert. Die verabreichte Dosis, welche als Einzeldosis oder Mehrfachdosis einem Individuum verabreicht wird, ist abhängig von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich der pharmakokinetischen Eigenschaften des TNF-Antagonisten, dem Weg der Verabreichung, dem Zustand des Patienten sowie seinen Eigenschaften (Geschlecht, Alter, Körpergewicht, Gesundheit, Größe), dem Ausmaß der Symptome, gleichzeitigen Behandlungen, der Häufigkeit der Behandlung und dem gewünschten Effekt. Anpassung und Veränderung der etablierten Dosisbereiche liegen innerhalb der Fähigkeit der Fachleute, genauso wie in vitro- und in vivo-Verfahren zur Bestimmung der Inhibition von TNF in einem Individuum.
Da die maximale tolerierte Dosis von TNF in klinischen Studien im Menschen bei bis zu etwa 25 Mikrogramm/m² Körperoberfläche/24 Stunden lag, braucht die Menge an verab reichtem Antagonisten im Allgemeinen eine Dosis nicht zu überschreiten, welche als diese Menge an TNF neutralisierend berechnet wird. Entsprechend variiert die molare Dosis an TNF-Antagonist zwischen etwa 0,001 und 10-fach dem Maximum der tolerierten molaren Dosis an TNF, obwohl dies, wie oben angemerkt, zu einem großen Ausmaß dem therapeutischen Ermessen unterliegt.
Darüber hinaus können die Daten, welche in klinischen Studien erhalten wurden, in denen die Zunahme der Konzentration von TNF in Peritonealflüssigkeit von Frauen mit Endometriose gezeigt wurde unter Verwendung verschiedener Protokolle (Eisermann et al., 1988; Halme, 1991; Overton et al., 1996) ebenfalls nützlich sein in der Bestimmung der wirksamen Dosis an TNF-Antagonist, welche verabreicht werden soll.
Gewöhnlich kann eine tägliche Dosis von aktivem Inhaltsstoff etwa 0,01 bis 100 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht betragen. Gewöhnlich sind 1 bis 40 Milligramm pro Kilogramm pro Tag, verabreicht in getrennten Dosen oder anhaltender Abgabeform (Depotform), wirksam, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Zweite oder folgende Verabreichungen können durchgeführt werden mit einer Dosis, welche die gleiche ist, geringer oder größer als die ursprüngliche oder vorige Dosis ist, welche dem Individuum verabreicht wurde. Eine zweite oder folgende Verabreichung kann während oder vor dem Rezidiv der Endometriose oder damit verbundenen Symptomen verabreicht werden. Die Begriffe "Rezidiv" oder "Wiederauftreten" sind so definiert, dass sie das Auftreten von einem oder mehreren Symtomen von Endometriose umfassen.
Der TNF-Antagonist kann einem Individuum prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht werden, vor, simultan oder sequentiell mit anderen therapeutischen Schemata oder Mitteln (z. B. Mehrtachmedikationsschemata), in einer therapeutisch wirksamen Menge, insbesondere zur Behandlung von Infertilität. TNF-Antagonisten, welche gleichzeitig mit anderen therapeutischen Mitteln verabreicht werden, können in der gleichen oder in anderen Zusammensetzungen verabreicht werden. Insbesondere, wenn es sich bei der mit Endometriose assoziierten Störung um Infertilität handelt, welche geheilt werden soll, können biologisch aktives humanes Choriongonadotropin (hCG), luteinisierendes Hormon (LH) oder Follikel stimulierendes Hormon (FSH), entweder in einer natürlichen hoch gereinigten oder in einer rekombinanten Form verabreicht werden. Solche Moleküle und Verfahren zu ihrer Herstellung wurden in den europäischen Patentanmeldungen EP 160,699 , EP 211,894 und EP 322,438 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden illustriert durch das Beispiel, welches nicht in irgendeinem Weg limitierend gemeint ist, und bezieht sich auf die folgenden Figuren.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt den Effekt von Antide (2 mg/kg, subkutan alle 3 Tage verabreicht), rekombinantem löslichem TNF-RI (10 mg/kg, subkutan gegeben in zwei täglichen Dosen über einen Zeitraum von 1 Woche) auf die Größe von Verpflanzungen in Ratten mit experimenteller Endometriose, 2 Tage und 9 Tage nach der letzten Behandlung. Diese Daten, welche unter Verwendung von 6 Tieren/Gruppe für den ersten Tötungszeitpunkt und 5 Tieren/Gruppe für den zweiten Tötungszeitpunkt erhalten wurden, stellen den mittleren Prozentsatz der Inhibition ± SEM (standard error of mesument, Standardabweichung) dar.
2 zeigt die Effekte von rekombinantem löslichem TNF-RI (10 mg/kg subkutan gegeben in zwei täglichen Dosen über einen Zeitraum von 1 Woche) und Antide (2 mg/kg subkutan gegeben alle 3 Tage) auf die NK-Zellaktivität von Milzzellen in Ratten gegen YAC-Zellen (⁵¹Cr-Freisetzung) 2 Tage (A) und 9 Tage nach der letzten Behandlung (B). Die Daten stellen den mittleren Prozentsatz der Lyse ± SEM dar.
3 zeigt die Effekte von rekombinantem löslichem TNF-RI (10 mg/kg, subkutan in zwei täglichen Dosen über einen Zeitraum von 1 Woche gegeben) im Vergleich zur Kontrolle und Antide (2 mg/kg, subkutan alle 3 Tage gegeben) auf den Östradiol-17β-Level in Serum in experimentieller Endometriose in Ratten. Die Daten stellen die mittlere Konzentration von Östradiol-17β ± SEM dar.
Beispiel
Material und Methoden
Tiere. Weibliche Sprague-Dawley-Ratten (250–275 g) wurden von Charles River Italien (Calco, Lecco, Italien) erworben. Die Tiere wurden unter den folgenden Umweltbedingungen gehalten: Temperatur 22 ± 2°C, relative Feuchtigkeit 55 ± 10%, Belüftung 15 ± 3 Luftaustausche pro Stunde, gefiltert durch HEPA 99,997% Filter und künstliche Beleuchtung mit einem zirkadiären Zyklus von 12 Stunden Licht (7:00–19:00). Vor den Experimenten wurde es den Tieren erlaubt, sich für einen Zeitraum von wenigstens einer Woche unter diesen Bedingungen zu akklimatisieren. Die Tiere wurden ad libitum mit einem Standardpellet-Futter gefüttert.
In der Studie verwendete Arzneimittel. Antide wurde hergestellt und zur Verfügung gestellt durch Bachem, (Kalifornien, USA). Das humane rekombinante lösliche TNF-RI-Molekül, welches in dem Beispiel verwendet wurde, hat eine Sequenz, welche korrespondierend ist zu dem Segment 20–180 von humanen TNF-RI (Nophar et al., 1990) und wurde in CHO-Zellen hergestellt und zur Verfügung gestellt durch Interpharm Laboratories Ltd. (Israel) unter dem Namen r-hTBP-1.
Material. Allgemeines Zellkulturmaterial wurde von Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, UK) erworben. Der Östradiol-17β RIA-Kit wurde erworben von DPC (Los Angeles, CA, USA). Inoketan wurde erworben von Virbac (Carros, FR). [⁵¹Cr]-Natriumchromat wurde erworben von NEN Dupont (Boston, MA, USA). Rompun^TM wurde erworben von Bayer AG (Leverkusen, DE). Seiden-Nahtmaterial (silk suture 7.0) wurde erworben von Ethicon (Pomezia, IT).
Experimentelles Modell von Endometriose in der Ratte. Um die Effekte von rekombinanten löslichen TNF-RI in Endometriose zu untersuchen, wurde ein zuvor beschriebenes experimentelles Modell (Jones, 1987) mit geringen Modifikationen verwendet. Unter Inoketam/Rompun^TM-Anästhesie wurde ein autologes Fragment von endometrialem Gewebe (mit einer Länge von 1 cm) von dem rechten Uterushom resiziert und in PBS platziert bei 37°C. Das uterine Segment wurde durch einen longitudinalen Einschnitt geöffnet und ein 5 × 5 mm Gewebsblock wurde transplantiert, ohne das Myometrium zu entfernen, auf die innere Oberfläche der abdominalen Wand unter Verwendung von nicht-resorbierbaren Seiden-Nahtmaterial an vier Ecken.
Untersuchung der Effekte der in der Studie verwendeten Arzneimittel in dem experimentellen Endometriosemodell. Experimentelle Endometriose wurde in anästhetisierten Ratten wie oben beschrieben chirurgisch induziert. Zusätzlich wurde bei einer weiteren Gruppe von Ratten in ähnlicher Weise ein Fragment von einem Uterushom entfernt, es wurde jedoch ein 5 × 5 mm Block von Fett, welches den Uterus umgibt, transplantiert (scheinoperierte Gruppe). Eine weitere Gruppe von Ratten, welche keinem chirurgischen Eingriff unterzogen wurde, wurde als normale Kontrollgruppe gehalten. Drei Wochen nach der Induktion der Endometriose durchliefen die Tiere eine zweite Laparotomie (Laparotomie vor der Behandlung), um die Größe und die Lebensfähigkeit des ektopischen endometrialen Gewebes zu bestimmen. Die Oberfläche (Länge × Weite) wurde unter Verwendung eines Zirkels gemessen und aufgezeichnet. Die Tiere, welche lebensfähige Verpflanzungen aufwiesen, wurden den zur Behandlung bestimmten Gruppen wie in Tabelle I wiedergegeben zugeordnet, so dass am Ende des Experimentes sechs Tiere pro Gruppe für den ersten Tötungszeitpunkt und fünf Tiere pro Gruppe für den zweiten Tötungszeitpunkt erhalten wurden. Die Behandlungen wurden nach einem 1-wöchigen Erholungszeitraum begonnen. Die Kontrollgruppen erhielten Saline allein; eine weitere Gruppe erhielt drei subkutane Injektionen von 2 mg/kg Antide alle 3 Tage, mit einem Behandlungsschema, welches zuvor die Unterdrückung von ovarieller und hypothalamischer Aktivität zeigte (Sharpe et al., 1990). Eine weitere erhielt 10 mg/kg rekombinanten löslichen TNF-RI, eingeteilt in zwei tägliche Dosen über einen Zeitraum von 1 Woche.
Tabelle I
Zu den bestimmten Tötungszeitpunkten (2 und 9 Tage nach der letzten Behandlung, d. h. 36 und 43 Tage nach der chirurgischen Verpflanzung), wurden die Tiere anästhesiert; Blutproben wurden von der abdominalen Aorta entnommen, Sera wurden abgetrennt und bei –20°C gelagert, bis sie zur Bestimmung des Östradiol-17β Levels analysiert wurden. Die Milzen wurden zur Bestimmung der Aktivität der natürlichen Killer (NK) Zellen entnommen. Die Oberfläche der Endometriose-ähnlichen Herde wurde zu jedem Tötungszeitpunkt vermessen; um die Daten zu normalisieren wurde die prozentuale Abweichung gegenüber dem Wert, welcher in der Laparotomie vor der Behandlung erhalten wurde, mit Hilfe der folgenden Formel berechnet:
wobei X₀ die Größe zum Zeitpunk der Laparotomie vor der Behandlung und X die Größe zu dem Zeitpunkt der Tötung wiedergibt. Der Mittelwert der prozentualen Abweichung in jeder Gruppe wurde anschließend berechnet.
Bestimmung der NK-Aktivität. Das Ausmaß der NK-Aktivität wurde bestimmt unter Verwendung des ⁵¹Cr-Freisetzungsassays (⁵¹Cr-release assay). Murine Lymphom YAC-1-Zellen wurden während der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und einmal mit Medium (RPMI 1640, welches Penicillin/Streptomycin, L-Glutamin und 10% Hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum enthielt) gewaschen. Das Zellpellet wurde mit 100 μCi von [⁵¹Cr]-Natriumchromat bei 37°C und 5% CO₂ für 2 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden anschließend 3 mal mit 10 ml des Assaymediums gewaschen, in der gewünschten Konzentration resuspendiert und zu den Assayplatten in Anwesenheit der Rattensplenozyten gegeben. Sie wurden im Assaymedium in der gewünschten Konzentration (2 × 10⁶/ml) resuspendiert und es wurden Verdünnungsreihen in dem Assaymedium in dreifacher Ausführung in den Vertiefungen einer U-Bottom 96-Wellplatte vor der Zugabe von ⁵¹Cr-markierten Zielzellen (Targetzellen) durchgeführt. ⁵¹Cr-markierte Zielzellen (5 × 10³) wurden in jede der Vertiefungen der Assayplatte dazugegeben und drei Effektor-zu-Targetverhältnisse (200 : 1, 100 : 1 und 50 : 1) wurden für jede Probe untersucht. Die Platte, welche das Effektor-zu-Zielzelle-Gemisch enthielt, wurde bei 200 × g für 4 min zentrifugiert und dann bei 37°C und 5% CO₂ für 4 Stunden inkubiert. Nach einer zusätzlichen Zentrifugation der Platte bei 200 × g für 4 min wurden 20 μl des Über standes von jeder Vertiefung auf einen Glasfaserfilter transferiert und die assoziierte Radioaktivität wurde durch einen β-Zähler (Counter) gemessen.
Der Prozentsatz der Lyse wurde wie folgt berechnet:
wobei:
cpm_Probe = durchschnittliche ⁵¹Cr-Freisetzung in der Anwesenheit von Effektorzellen
cpm_spont. = durchschnittliche ⁵¹Cr-Freisetzung von Zielzellen in der Anwesenheit von Kulturmedium
cpm_total = durchschnittliche ⁵¹Cr-Freisetzung von Zielzellen in der Anwesenheit von 1% Triton-X100.
Bestimmung von Östradiol-17β. Konzentrationen von Östradiol-17β in Serum wurden bestimmt unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits zur Quantifizierung von Östradiol in Serum ohne Extraktionsschritt (DPC, Los Angeles, CA, USA). Kurz beschrieben, kompetitiert ¹²⁵I-markiertes Östradiol mit Östradiol in der Serumprobe um Antikörperbindestellen. Nach der Inkubation wurde eine Trennung von gebundenem Östradiol von freiem Östradiol durch Dekantieren erreicht. Das Reaktionsgefäß wurde anschließend in einen gamma-Counter (LKB-Pharmacia Wallak) gemessen, wobei die Impulse (Counts) sich umgekehrt zu der Menge von in der Serumprobe vorhandenen Östradiol verhält. Die Menge an Östradiol in den Proben wurde durch Vergleichen der Impulse mit einer Kalibrierungskurve bestimmt. Das Antiserum ist hoch spezifisch für Östradiol, mit einer relativ geringen Kreuzreaktivität gegenüber natürlich vorkommenden Steroiden. Proben derselben experimentellen Sitzung wurden in einem einzigen Immunassay analysiert.
Statistische Analyse. Die statistische Signifikanz der Unterschiede, welche innerhalb der Behandlungsgruppen beobachtet wurden, wurde unter Verwendung der ANOVA, welche in der Statgraphics Plus^® Software (Version 1.4) vorhanden ist, gemessen. Der Tukey's multiple range-Test (P < 0,05) wurde durchgeführt.
Ergebnisse
Untersuchung von Effekten von rekombinantem löslichen TNF-RI in experimenteller Endometriose
Erfolgreiches Wachstum und Entwicklung von chirurgisch transplantiertem endometrialem Gewebe in der Ratte stellte ein Forschungsmodell zur Verfügung, welches zum Studium einiger der Aspekte von Endometriose verwendet wurde, welche nicht adäquat in Menschen untersucht werden können (Dudley et al., 1992). Frühere Studien der experimentellen Endometriose in Ratten zeigten, dass Antide gut als positive Kontrolle funktionierte (Sharpe et al., 1990). In dem vorliegenden Beispiel wurde der Effekt von Antide in Bezug auf die Dimensionen des verpflanzten Gewebes vor und nach der Behandlung mit denen verglichen, welche unter Verwendung von rekombinantem löslichem TNF-RI erhalten wurde, wie in Tabelle II zusammengefasst.
Tabelle II
Die Ergebnisse werden in 1 als mittlere prozentuale Inhibition des verpflanzten Endometrium-Fragments (wie oben beschrieben berechnet) wiedergegeben.
Antide war wirksam bei der Reduzierung der Größe der Endometriose-ähnlichen Herde (1), es induzierte eine fast vollständige (94% bzw. 88% im Vergleich zu den ursprünglichen Dimensionen) und statistisch signifikante (p < 0,05, ANOVA und Turkey's Test) Remission zu beiden Beobachtungszeitpunkten nach Abbruch der Behandlung. Die 1-wöchige Behandlung mit humanem rekombinantem löslichem TNF-RI (10 mg/kg, zwei tägliche Dosen) resultierte in einer signifikanten Reduktion der Größe (33% bzw. 64% im Vergleich mit den ursprünglichen Dimensionen) der Endometriose-ähnlichen Herde zu beiden Beobachtungszeitpunkten, jedoch statistisch signifikant (p < 0,05, ANOVA und Tukey's Test) nur am Tag 9. Die verpflanzten Gewebe wurden in den scheinoperierten Tieren zu keinem Zeitpunkt beobachtet.
Auswertung der NK-Zellaktivitäten
Die NK-Zellaktivität, welche durch in vitro Tests mit Milzzellen gegen YAC-Zellen gemessen wurde, zeigte keine Unterschiede unter den Gruppen (2), ähnlich dem, was in Pavianen beobachtet wurde, wo kein Unterschied in der antiendometrialen Cytotoxizität und NK-Zellaktivität in Tieren mit und ohne Endometriose festgestellt wurde (D'Hooghe et al., 1995). Diese. Beobachtung steht im Gegensatz mit humanen Daten, nach denen eine unterdrückte NK-Aktivität in Patienten mit Endometriose berichtet wurde mit einer signifikanten Korrelation zwischen reduzierter peritonealer NK-Aktivität und dem Schweregrad der Endometriose (Oosterlynck et al., 1992).
Auswertung des Östradiol-17β in Serum
Die Konzentrationen von Östradiol-17β in Serum wurden durch ein Radioimmunassay zu beiden Beobachtungszeitpunkten gemessen. Es wurde zu dem zweiten Beobachtungszeitpunkt ein signifikanter Unterschied beobachtet in den Antide-behandelten Gruppen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen. Keine statistisch signifikanten Unterschiede wurden für rekombinanten löslichen TNF-RI beobachtet, im Vergleich zu den Kontrollen (3; p < 0,05, ANOVA und Tukey's Test).
Schlussfolgerungen
In dem experimentellen Endometriosemodell in der Ratte stellt die Verabreichung eines TNF-Antagonisten, der löslichen Form von TNF-RI, zum ersten Mal einen klaren Beweis für die potenzielle Wirksamkeit einer Cytokin-basierten, nicht hormonabhängigen Behandlung dieser pathogenen Beschwerden zur Verfügung. Folglich stellen TNF-Antagonisten eine Alternative zu den existierenden medizinischen Behandlungsmetho den in Bezug auf reduzierte Nebeneffekte dar. Diese Ergebnisse bewerten die Verwendung von TNF-Antagonisten in der Behandlung von Endometriose-abhängiger Infertilität.
Die Fachleute auf dem Gebiet werden viele Äquivalente der spezifischen Ausführungsform der hierin beschriebenen Erfindungen kennen oder sind fähig diese zu ermitteln, ohne mehr als Routineversuche zu unternehmen. Diese und alle weiteren Äquivalente sollen in den folgenden Ansprüchen miteingeschlossen sein.
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Claims

Verwendung eines TNF-Antagonisten zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung und/oder Verhütung von Endometriose, worin dieser TNF-Antagonist ein sequestrierender Antagonist oder ein signalisierender Antagonist ist.
Verwendung eines TNF-Antagonisten zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, um die Implantations- und Fruchtbarkeitsrate durch Verringerung von endometriotischen Läsionen zu verbessern, worin dieser TNF-Antagonist ein sequestrierender Antagonist oder ein signalisierender Antagonist ist.
Verwendung des Anspruchs 1 oder 2, worin der sequestrierende Antagonist ein Rezeptormolekül, dessen Abkömmling oder Fragment ist, das an TNF bindet.
Verwendung des Anspruchs 3, worin das Rezeptormolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus TNF-RI und TNF-RII besteht.
Verwendung des Anspruchs 3, worin das Rezeptormolekül der extrazelluläre Bereich von TNF-RI ist.
Verwendung des Anspruchs 3, worin das Rezeptormolekül löslicher menschlicher rekombinanter TNF-RI ist.
Verwendung des Anspruchs 3, worin das Rezeptormolekül ein multimeres TNF-Rezeptormolekül oder ein funktioneller Abschnitt davon ist.
Verwendung des Anspruchs 7, worin das multimere TNF-Rezeptormolekül die Gesamtheit oder einen funktionellen Abschnitt von zwei oder mehr extrazellulären Bereichen von TNF-Rezeptoren umfasst, die über ein oder mehrere Polypeptid-Linker verbunden sind.
Verwendung des Anspruchs 3, worin das Rezeptormolekül ein Immunrezeptor-Fusionsmolekül oder ein funktioneller Abschnitt davon ist.
Verwendung des Anspruchs 9, worin das Immunrezeptor-Fusionsmolekül die Gesamtheit oder einen funktionellen Abschnitt des TNF-Rezeptors und eine Immunglobulinkette umfasst.
Verwendung der Ansprüche 1 oder 2, worin der sequestrierende Antagonist ein Anti-TNF-Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Verwendung des Anspruchs 11, worin der monoklonale Antikörper aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem monoklonalen chimären Antikörper, einem monoklonalen humanisierten Antikörper oder einem Fragment davon besteht.