CZ20012656A3

CZ20012656A3 - Pouľití antagonistů faktoru nekrosy nádorů při endometriose

Info

Publication number: CZ20012656A3
Application number: CZ20012656A
Authority: CZ
Inventors: Francesco Borrelli; Mauro D´Antonio; Fabrizio Martelli
Original assignee: Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2002-02-13
Also published as: HUP0105103A2; EE05543B1; SI1143997T1; HUP0105103A3; UA78483C2; AU1997300A; EP1143997B1; NO20013577D0; CN1698894A; PL204713B1; CZ302866B6; NZ512585A; SK10292001A3; EA200100799A1; EP1143997A1; PT1143997E; IL144413A0; EA003927B1; AR022251A1; DE60003152D1

Description

Použití antagonistů faktoru nekrosy nádorů při endometriose

Oblast techniky

Antagonisté faktoru nekrosy nádorů jsou podávány v terapeuticky účinný dávkách pro léčbu a/nebo prevenci endometriosy. Antagonisté podle předkládaného vynálezu jsou obvykle vybrány z různých tříd molekul, ale výhodně se jedná o solubilní TNF receptory. Antagonisté jsou použitelní pro regresi endometriotických lézí a, v kombinaci s jinými aktivními činidly, pro léčbu souvisejících onemocnění, jako je neplodnost.

Dosavadní stav techniky

Endometriosa je onemocnění ženského pohlavního ústrojí charakterizované přítomností endometriálních žlázek a stromatu mimo endometriální dutinu a děložní svalovinu. i^ej častěj i postiženými anatomickými místy jsou ovaria, uterosakrální ligamenta, pánevní peritoneum, rektovaginální septum, cervix, vagína, vejcovody a pochva. Obecně má endometriosa tendenci infiltrovat hlouběji uložené tkáně z rektovaginálního septa a nebývá viditelná na povrchu. Občas se mohou ložiska endometriosy vyskytovat extraovariálně, jako například v plících, močovém měchýři, pleuře a lymfatických uzlinách. Ložiska endometriosy jsou progresivní: nejprve se jedná i čiré váčky, která postupně zarudnou a během několika let vznikají fibrotické léze (MacSween, 1993) .

Endometriosa se považuje za benigní onemocnění, ale někdy se endometriotické léze mohou stát maligními. Stejně jako u jiných malignit je vznik nádorů odvozených z endometriosy způsobem souběžnými ději, včetně alterací růstových faktorů a/nebo regulace onkogenů (Cheung, 1996).

Endometriosa je jedním z nej častějších gynekologických onemocnění, s prevalencí u žen v reprodukčním věku; toto onemocnění se vyskytuje přibližně u 5-10% žen v reprodukčním věku (Barbiery, 1988). Růst endometriotické tkáně je plně závislý na estrogenech, i v ektopických lokalizacích. Proto j endometriosa vzácná před menarché a po menopauze, když jsou u žen nízké hladiny estrogenů. Hormonální sensitivita endometriosy je příčinou některých příznaků, jako je bolest v pánvi a dysmenorhea.

Endometriosa pochází z endometriálních buněk disseminovaných z dělohy do jiných lokalit, kde se životaschopné buňky implantují a rostou. Pro počáteční šíření byly navrženy dva možné mechanismy. Retrográdní menstruace, běžný jev u žen s menstruačními cykly, umožňuje šíření odloučených fragmentů endometria do struktur poblíž genitálií Alternativně, při šíření endometriosy do jiných míst než do genitálu, se mohou endometriální buňky šířit uteriními žílami a lymfatickým systémem (hematogenní nebo lymfogenní disseminace). Také gynekologické zákroky mohou přispívat k tomuto šíření (MacSween, 1993).

Mimo disseminaci endometriálních buněk mohou citlivost žen k endometriose určovat také jiné faktory, jako jsou genetické predispozice (Malinak et al., 1980), stejně jako imunologické alterace (Ho et al., 1997). Protože jsou endometriální buňky často pozorovány v peritoneální kapalině u všech žen v době menses, musí mít savci mechanismus, nejpravděpodobněji imunitní, kterým brání vzniku endometriosy. Obecně, endometriální buňky, které unikly imunitní reakci jedince a mají adekvátní estrogenní stimulaci, mohou proliferovat za • · · 4 4 ··« vzniku makroskopicky viditelných lézi. Endometriosa se proto považuje za dynamický proces, při kterém se kontinuálně tvoři nové léze, zatímco existující léze mohou růst nebo mohou být destruovány imunitním systémem jedince.

Zánětlivá reakce, normálně spojená s endometriosou, mění peritoneální prostředí, protože dojde ke zvýšení objemu peritoneální kapaliny a zvyšuje se také počet a aktivita peritoneálních makrofágů. Proto bylo navrženo, že monocytární/makrofágový systém má klíčovou úlohu při vzniku endometriosy. Sekreční produkty makrofágů, včetně RANTES (Hornung et al., 1997), interleukinu-6 (Harada et al., 1997), interleukinu-8 (Arici et al., 1996a), TNFa (Oevrton et al.,

1996) , monocytárního chemotaktického proteinu-1 (Arici et al.,

1997) , byly zjištěny ve vysokých koncentracích v peritoneální kapalině žen postižených tímto onemocněním. Imunologické změny byly prokázány u žen s endometriosou, ale nebylo zjištěno, zda jsou odpovědné za endometriosu, nebo zda jsou důsledkem zánětu způsobeného endometriosou (Rana et al., 1996).

Znalosti o endometriose a jejím významu pro jiná onemocnění jsou stále omezené, i na diagnostické úrovni. Ačkoliv je endometriosa považována za hlavní příčinu neplodnosti, jsou studie týkající se patofyziologie onemocnění protichůdné a nejsou definitivní. Existuje špatná korelace stupněm bolestí nebo neplodnosti a závažností onemocnění, protože časné léze jsou metabolicky více aktivní. Stupeň neplodnosti je vyšší než u normální populace a studie na králících prokázaly, že chirurgická indukce endometriosy vede ke snížení fertility o 75% až 25% (Hahn et al., 1986). U pacientů s pánevní bolestí byla zjištěna endometriosa v 71%, zatímco 84% pacientů s bolestí v pánvi a infertilitou mělo diagnostikovanou endometriosu (Koninckx et al., 1991). Obecně, neplodnost se

může vyskytovat tehdy, když je endometriosa tak rozšířená, že narušuje normální vaginální strukturu, zatímco počet těhotenství je normální, když je endometriosa minimální.

Endometriosa může ovlivňovat fertilitu také jiným způsobem. Signální molekuly leukocytů, jako je interleukin-6, interferon a faktor nekrosy nádorů, jsou zvýšeny a negativně ovlivňují interakci spermie-oocyt. Bylo zjištěno, že vzorky séra od žen s endometriosou jsou embryotoxické v modelu myších embryí a že inhibují mobilitu spermií in vitro (Halme, 1991), kde tento efekt je zesílen, když se přidá faktor nekrosy nádorů a (Eisermann, 1989) . Tyto studie, nicméně, neřeší problém toho, jak cytokiny ovlivňují progresi endometriosy, ale pouze ukazují efekt takových molekul na životaschopnost zárodečných a embryonálních buněk.

Hormonální a chirurgická terapie jsou dvě terapeutické modality v současnosti používané pro léčbu endometriosy. Současná farmakoterapie endometriosy vyžaduje hormonální supresi produkce estrogenů tak, aby nízké koncentrace hormonů blokovaly růst ektopické tkáně. Při léčbě neplodnosti související s endometriosou nemá hormonální terapie u pacientů s minimálním onemocněním žádný přínos, zatímco jiné studie prokázaly zvýšení počtu těhotenství (Arici et al., 1996b).

Hormonální terapie zahrnuje vysoké dávky progestagenů, kombinace estrogenů a progesteronu (za použití vysokých dávek orálních kontraceptiv, nebo OCP, v pseudotěhotenském režimu), Danazol (androgenní derivát ethisteronu) a nověji GnRH agonisty. Tyto hormonální terapie jsou účinné v léčbě pánevní bolesti a indukují objektivní regresi lézí, ale mají několik nedostatků. Estrogen může stimulovat a způsobit proliferaci endometriotické tkáně, protože ta nemusí být schopna reagovat na progesteron, i při vysokých dávkách, takže OCP může způsobit částečnou úlevu u omezeného počtu pacientů (Dawood, 1993). Progestačni činidla mohou vyvolat nepravidelné krvácení (50%) spolu s depresí, nárůstem hmotnosti a retencí tekutin. Danazol potlačuje endometriosu různými reakcemi, včetně snížení solubilního faktoru nekrosy nádorů a, interleukinu β a CD8 v séru (Matalliotakis, 1997; Moři, 1990), inhibice de novo steroidogenese a vytěsnění estradiolu z jeho receptoru.

Danazol může zlepšit příznaky u přibližně 66-100% pacientů trpících bolestí, ale procento recidiv do 4 let je přibližně 40%-50%. Dalšími nevýhodami terapie Danazolem jsou nárůst hmotnosti a androgenní vedlejší účinky, které způsobují to, že až 80% pacientů vysadí tuto terapii (Barbiery, 1988). GnRH analogy jsou účinnější a dlouhodoběji působící než přirozené GnRH a působí prostřednictvím odstranění estrogenního podnětu pro růst pro všechny tkáně citlivé na estrogeny.Vedlejší účinky GnRH analogů souvisí zejména s hlubokou hypoestrogenemií a patří mezi ně snížená densita kostí, a k recidivám dochází až u 50% pacientů během 5 let (Waller and Shaw, 1993) .

Podle pokročilosti onemocnění může být chirurgická intervence konzervativní, pokud je žádoucí zachování fertility, nebo může být provedeno odstranění dělohy, vejcovodů a vaječníků, pokud je onemocnění závažnější.

Procento těhotenství po chirurgickém zákroku je obecně mezi 35% a 65% a proto pacientky potřebují pro dosažení těhotenství indukci ovulace a intrauterinní insemínaci (Koninckx and Martin, 1994). Klinické práce ukazují, že po laparotomii a resekci endometriosy vyžaduje až 40% pacientek reoperaci během 5 let. I po agresivní chirurgické intervenci je recidiva bolesti způsobené endometriosou významným problémem. Mezi důvody selhání chirurgické terapie patří inkompletní resekce » w w w W « · · • · · · 9 9 99 ··· • 9·· 9 9 99 • • 9 9 9 9 9···

9 9 9 9 9 99 •9 99 999 99 9 99 9 lézí, které buď nebyly rozpoznány, nebo byly ponechány. Mnoho lézi je mikroskopických a nemohou být vizualizovány, i přes zvětšení dosažené laparoskopem. Proto nelze předpokládat, že by chirurgická intervence samo o sobě vyléčila toto onemocnění (Revelli et al., 1995).

Mnoho pacientek s endometriosou tedy trpí nevýhodami tradiční terapie (včetně následků hormonální nerovnováhy, vysokého počtu recidiv a neplodnosti). Je proto důležité poskytnout alternativní léčbu endometriosy. Možným terapeutickým přístupem může být použití imunomodulačních molekul, které mohou zlepšit jak endometriotické léze, tak imunologickou situaci. Takový přístup se považuje za vhodný pro léčbu celkových příznaků (Rana et al., 1996), ale neexistují experimentální důkazy o tom, které cytokiny (z cytokinů s alterovanou expresí při endometriose), by mohly být cílem terapeutické intervence.

Jak již bylo řečeno, jedním z několika sekrečních produktů makrofágů účastnících se endometriotické zánětlivé reakce je faktor nekrosy nádorů (TNF). TNF, též označovaný jako kachektin, je pleiotropní cytokin uvolňovaný aktivovanými Tlymfocyty a makrofágy. TNF je členem cytokinové sítě interferonů, interleukinů a faktorů stimulujících kolonie, která má klíčovou úlohu v signalizaci při mnoha zánětlivých a infekčních onemocněních tím, že indukuje mnoho prozánětlivých změn, včetně produkce dalších cytokinů a adhesních molekul (Fiers, 1991).

Termín TNF, jak je zde použit, označuje jak faktor nekrosy nádorů a, tak β, od člověka nebo zvířete, společně s přirozenými alelami TNF-α (Pennica et al., 1984). TNF- β, též označovaný jako lymfotoxin, má podobnou aktivitu, ale je

Ί

produkován jinými typy buněk (lymfocyty a přirozenými zabiječi) v reakci na antigenní nebo mitogenní podněty (Gray et al., 1984).

TNF je exprimován jako zralý 17 kDa protein, který je aktivní jako trimer. Tento komplex vykazuje svou biologickou aktivitu prostřednictvím agregace receptorů na povrchu buněk, což zprostředkuje specifické účinky v různých orgánech a tkáních. V endometriu je exprese TNF závislá na místě a na menstruačním cyklu (Hunt et al., 1992) a indukuje apoptosu v endometriu pokusných zvířat (Shalaby et al., 1989).

Adherence endometriálních stromálních buněk na mesotelové buňky byla statisticky významně zvýšena tehdy, když byly mesotelové buňky předem ošetřeny TNF (Zhang et al., 1993), což podporuje myšlenku, že TNF může přispívat k iniciaci a/nebo vývoji endometriosy.

TNF zprostředkuje svou aktivitu, která je nutná pro normální vývoj a funkci imunitního systému, vazbou na rodinu membránových receptorových molekul, včetně p55 TNF receptoru I, uváděného v literatuře též jako TNF-RI, a p75 TNF receptoru, uváděného v literatuře též jako TNF-RII (Bazzoni and Beutler, 1996). Dominance TNF-RI v přenosu signálu TNF je naznačena schopností agonistických protilátek specifických pro tento receptor napodobovat většinu účinků TNF (Shalaby et al., 1990). Vazbou na své membránové receptory spouští TNF signalizační kaskádu prostřednictvím cytoplasmatických mediátorů, jako je TRADD a TRAP-1 (pro TNF-RI) nebo TRAF-1 a TRAF-2 (pro TNF-RII), což vede k různých odpovědím buněk, jako je proliferace T-lymfocytů, lýza nádorových buněk in vitro, kožní nekrosa, resistence na inzulín, apoptosa. Extracelulární části obou TNF receptorů mohou být odštěpeny a tyto solubilní receptory si zachovávají schopnost vazby na TNF a inaktivace • · ·· tttt • · * • · tttt • tttt • · · • tt tttt aktivity TNF tvorbou vysoce afinitních komplexů, což redukuje vazbu TNF na membránové receptory cílových buněk (Nophar et al., 1990).

V endometriu jsou koncentrace membránových TNF receptorů ovlivněny podáním estradiolu a/nebo progesteronu, což vede k dočasné expresi TNF-RI u myší, která je specifická pro určité typy buněk (Roby et al., 1996). Nicméně, tato studie, stejně jako mnoho jiných studií provedených na různých modelech týkajících se endometriosy, nevyřešila reálnou úlohu TNF a TNF-RI, membránových nebo solubilních, in vivo ve vývoji endometriotických ložisek, ale pouze popisuje imunologické abnormality související s endometriosou.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález je založen na předpokladu, že antagonista TNF je schopen, díky sekvestraci cirkulujícího TNF, blokovat progresi ložisek endometriosy. Tento předpoklad je potvrzen zjištěními popsanými v příkladu, která ukazují, že antagonista TNF statisticky významně redukuje velikost ložisek podobných endometriose v krysím pokusném modelu. V důsledku objevu přihlašovatelů je zde poskytnut způsob pro léčbu a/nebo prevenci endometriosy u jedince, který zahrnuje podání terapeuticky účinného množství antagonisty TNF.

V jiném provedení se vynález týká způsobu pro léčbu a/nebo prevenci neplodnosti související s endometriosou u jedince, který zahrnuje podání terapeuticky účinného množství antagonisty TNF v kombinaci s jinými léky.

Ještě jiným předmětem vynálezu je použití antagonisty TNF společně s farmaceuticky přijatelným nosičem pro přípravu • 9 9 9 • 9 99 • 9 9 9 • 9 9 9

99 farmaceutických prostředků pro léčbu endometriosy.

V předkládaném vynálezu může být podání antagonisty TNF provedeno v parenterálním nebo jiném vhodném prostředku. Vhodný je jakýkoliv způsob podání, včetně intravenosního, intramuskulárního a podkožního. Kromě farmaceuticky přijatelného nosiče může prostředek podle předkládaného vynálezu také obsahovat malá množství pomocných činidel, jako jsou stabilizační činidla, přísady, pufry a konzervační činidla.

Mezi TNF antagonisty použitelné v předkládaném vynálezu patří solubilní TNF receptory, anti-TNF protilátky a sloučeniny, které brání a/nebo inhibují signalizaci TNF receptoru. Je možno použít antagonistu TNF samostatně nebo v kombinaci s jiným antagonistou TNF. Možná je také kombinace s jedním nebo více farmaceuticky aktivními produkty, zejména při léčbě pacientů s neplodností související s endometriosou.

Popis vynálezu

Předkládaný vynález jasně ukazuje neočekávaný výsledek, že sekvestrace TNF (který je pouze jedním z několika cytokinů, jejichž exprese je zvýšena v peritoneální kapalině při endometriose), způsobená antagonistou TNF, redukuje endometriotická ložiska v krysím modelu. Tento model také demonstruje, že tento efekt je dosažen bez významného narušení hormonální rovnováhy a aktivity přirozených zabiječů. Redukce endometriotických lézí pomocí antagonistu TNF může také zlepšit plodnost, protože normalizace genitální struktury má pozitivní efekt na implantaci.

Proto je hlavním předmětem předkládaného vynálezu způsob • · ·· · · ·· · * fe * * ·♦ ·♦ 9 9 99 ·· 99 9 fe fefefe • fefefe· fe fefefe· fe *·♦· · · fefefe ·· ·· ··· ··· fefe fefefe pro léčbu a/nebo prevenci endometriosy u jedince, který zahrnuje podáni terapeuticky účinného množství antagonisty TNF.

Ve druhém provedení se vynález týká způsobu pro léčby neplodnosti související s endometriosou u jedince, který zahrnuje podání terapeuticky účinného množství antagonisty TNF v kombinaci s jinými léky.

Ještě dalším předmětem vynálezu je použití antagonisty TNF společně s farmaceuticky přijatelným nosičem pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčbu a/nebo prevenci endometriosy. Farmaceutický prostředek připravený tímto způsobem je také dalším předmětem předkládaného vynálezu.

Aktivní složky v prostředcích podle předkládaného vynálezu jsou antagonisté TNF. Antagonisté TNF podle předkládaného vynálezu vykazují svou aktivitu dvěma způsoby. Za prvé, antagonista se může vázat na molekulu TNF s dostatečnou afinitou a specificitou pro významnou neutralizaci epitopu TNF odpovědného za vazbu na receptor pro TNF (ty jsou zde označovány jako sekvestrační antagonisté) . Alternativně může antagonista TNF inhibovat TNF signalizační dráhu aktivovanou povrchovým buněčným receptorem po vazbě TNF (ty jsou zde označovány jako signalizační antagonisté) . V terapii endometriosy podle předkládaného vynálezu jsou použitelné obě skupiny antagonistů, samostatně nebo společně.

Antagonisté TNF se snadno identifikují rutinním skríningem kandidátů na jejich efekt na aktivitu přirozeného TNF na citlivých buněčných liniích in vitro, například na lidských Blymfocytech, ve kterých způsobuje TNF proliferaci a sekreci Ig. Testy obsahují přípravek TNF a testovaného antagonistů *4 *» 4 • · « · 4« φ « 4 44 4 • 4 4 4 4 4 • 44* * ·· 44 ··· ₄ v různých koncentracích, například od 0,1 do 100-násobného molárního množství TNF použitého v testu, a kontroly bez TNF nebo pouze s antagonistou (Tucci et al., 1992).

Sekvestrující antagonisté jsou výhodnými antagonisty TNF podle předkládaného vynálezu. Ze sekvestrujících antagonistů jsou výhodné ty polypeptidy, které se váží na TNF s vysokou afinitou a mají nízkou imunogenicitu. Solubilní TNF receptory a neutralizační protilátky k TNF jsou zejména výhodné. Například, TNF-RI a TNF-RII jsou použitelné v předkládaném vynálezu. Zkrácené formy těchto receptorů, obsahující extracelulární domény receptorů nebo jejich funkční části, jsou ještě výhodnějšími antagonisty podle předkládaného vynálezu. Zkrácené formy TNF receptorů jsou solubilní a byly identifikovány v moči a v séru jako 30 kDa a 40 kDa TNFinhibiční vazebné proteiny, které byly původně označovány jako TBPI a TBPII, v příslušném pořadí (Engelmann et al., 1990) . Deriváty, fragmenty, regiony a biologicky aktivní části receptorových molekul funkčně napodobující receptorové molekuly mohou být použity v předkládaném vynálezu. Takové biologicky aktivní ekvivalenty nebo deriváty receptorové molekuly jsou odvozeny od části uvedeného polypeptidu nebo sekvence kódující molekulu receptorů, která má dostatečnou velikost a je schopna vazby na TNF s takovou afinitou, že dojde k inhibici nebo blokování TNF receptorů navázaného na membránu. Ve výhodném provedení je lidský TNF-RI antagonistou TNF, který je podán pacientovi. Přirozený a rekombinantní solubilní TNF receptor a způsoby jeho produkce jsou popsány v Evropských patentových přihláškách EP 308378, EP 398327 a EP 433900.

Multimerní molekuly TNF receptorů a TNF imunoreceptorové fúzní molekuly a jejich deriváty nebo části jsou další

9* *«

9 9 9 99 9

9 99 9 • 9 9 9 9 9

9 9 9 · ·· 99 999 999

9« *

9 99

9 9

9 99 9 příklady receptorových molekul použitelných v předkládaném vynálezu. Multimerní molekuly TNF receptorů podle předkládaného vynálezu obsahují celou nebo funkční část extracelulární domény dvou nebo více TNF receptorů spojenou jednou nebo více polypeptidovými spojovacími skupinami. Multimerní molekuly mohou dále obsahovat signální peptid secernovaného proteinu pro řízení exprese multimerní molekuly. Tyto multimerní molekuly a způsoby jejich přípravy jsou popsány v Evropské patentové přihlášce EP 526905.

TNF imunoreceptorové fůzní molekuly použitelné ve způsobech podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň jednu část jednoho nebo více imunoglobulinů a celou nebo část jednoho nebo více TNF receptorů. Tyto imunoreceptorové fůzní molekuly mohou být sestaveny jako monomery nebo hetero- nebo homomultimery. Imunoreceptorové fůzní molekuly mohou být také monovalentní nebo multivalentní. TNF imunoreceptorové fůzní molekuly a způsoby pro jejich přípravu jsou popsány v Evropské patentové přihlášce EP 620739.

Jinou třídu sekvestrujících antagonistů použitelných ve způsobech podle předkládaného vynálezu představují anti-TNF protilátky, včetně monoklonálních, chimérických humanizovaných a rekombinantních protilátek a jejich fragmentů, které jsou charakterizovány vysoce afinitní vazbou na TNF in vivo a nízkou toxicitou. Protilátky, které mohou být použity v předkládaném vynálezu, jsou charakterizovány svou schopností umožňující jejich aplikaci pacientům po dobu dostatečnou pro dosažení dobré až vynikající regrese endometriotických lézí, zmírnění příznaků a nízkou toxicitou. Neutralizační protilátky jsou snadno získány od zvířat, jako jsou králíci nebo myši, imunizací TNF. Imunizované myši jsou zejména vhodné jako zdroj B-lymfocytů pro přípravu hybridomů, které jsou potom «4 • · · ·

4 4« • · · 4 • 4 4 ·

4«

	4 • 4 • • 4	4» • 4 • 4 • 4 4 • 4	44
• 4	• 44	44	4 4

kultivovány za produkce velkých množství anti-TNF monoklonálních protilátek. Chimérické protilátky jsou imunoglobulinové molekuly charakterizované dvěma nebo více segmenty nebo částmi odvozenými od jiných živočišných druhů. Obecně, variabilní region chimérické protilátky je odvozen od savce jiného než je člověk, jako například z myší monoklonální protilátky, a konstantní region imunoglobulinu je odvozen od molekuly lidského imunoglobulinu. Výhodně mají oba regiony a jejich kombinace nízkou imunogenicitu, jak je možno rutině stanovit (Elliot et al., 1994). Humanizované protilátky jsou imunoglobulinové molekuly vytvořené technikami genové inženýrství, ve kterých jsou myší konstantní regiony nahrazeny lidskými konstantními regiony za zachování myších vazebných regionů pro antigen. Vzniklá myší-lidská chimérická protilátka by měla mít sníženou imunogenicitu a zlepšenou farmakokinetiku u člověka (Knight et al., 1993). Výhodné příklady vysoce afinitních monoklonálních protilátek á jejich chimérických derivátů, které jsou použitelné ve způsobech podle předkládaného vynálezu, jsou popsány v Evropské patentové přihlášce 186833 a PCT patentové přihlášce WO 92/16553.

Antagonista TNF může být podán jedinci různými způsoby. Mezi vhodné způsoby patří intradermální, transdermální (například v prostředku s pomalým uvolňováním), intramuskulární, intraperitoneální, intravenosní, podkožní, orální, epidurální, lokální a intranasální. Může být použit také jakýkoliv jiný terapeuticky účinný způsob podání, například absorpce přes epitelovou nebo endotelovou tkáň nebo genová terapie, při které je pacientovi podána DNA molekula kódující antagonistu TNF (například ve vektoru), což způsobí expresi a sekreci antagonisty TNF in vivo. Dále, antagonista TNF může být podán společně s dalšími biologicky aktivními činidly, jako jsou farmaceuticky přijatelné surfaktanty, • · přísady, ředidla nebo jiné nosiče.

Výraz farmaceuticky přijatelný označuje jakýkoliv nosič, který neinterferuje s biologickou aktivitou aktivní složky a který je netoxický pro hostitele, kterému je podán. Například, při parenterálním podání může být antagonista TNF připraven ve formě dávkové jednotky pro injekce ve vehikulu jako je salinický roztok, roztok dextrosy, sérový albumin a Ringerův roztok.

Pro parenterální (například intravenosní, podkožní, intramuskulární) podání může být antagonista TNF připraven ve formě roztoku, suspenze, emulze nebo lyofilizovaného prášku v kombinaci s farmaceuticky přijatelným vehikulem (například vodou, salinickým roztokem, roztokem dextrosy) a přísadami, které udržují izotonicitu (jako je například manitol) nebo chemickou stabilitu (jako jsou konzervační činidla a pufry). Prostředek je sterilizován běžnými technikami.

Biologická dostupnost antagonisty TNF může být také zlepšena pomocí konjugačních postupů, které zvyšují poločas molekuly v lidském těle, například vazbou molekuly na polyethylenglykol, jak je popsáno v PCT patentové přihlášce WO 92/13095.

Terapeuticky účinné množství antagonisty bude záviset na mnoha proměnných, včetně typu antagonisty, afinity antagonisty pro TNF, jakékoliv residuální cytotoxické aktivity antagonisty, způsobu podání, klinického stavu pacienta (včetně požadavku udržení netoxických koncentrací aktivity přirozeného TNF), přítomnosti více míst pro TNF v sekvestračním činidle, například na protilátkách.

Termín terapeuticky účinné množství označuje takové množství antagonisty TNF, které po podání vede k inhibici biologické aktivity TNF. Dávka podaná jedinci, v jedné nebo ve více dávkách, závisí také na různých faktorech, včetně farmakokinetiky antagonisty TNF, způsobu podání, stavu a charakteristikách pacienta (pohlaví, věk, tělesná hmotnost, zdravotní stav, velikost), rozsahu příznaků, současné medikace, frekvence podávání léčby a požadovaného efektu.

Úprava dávek je dobře známá odborníkům v oboru, stejně jako in vitro a in vivo metody pro stanovení inhibice TNF u jedince.

Protože maximální tolerovaná dávka TNF v klinických studiích na lidech je v rozsahu do přibližně 25 pg/m tělesného povrchu/24 hodin, nepřesahuje dávka antagonisty obvykle dávku, která je vypočtena pro neutralizaci tohoto množství TNF.

V souladu s tím je molární dávka antagonisty od přibližně 0,001-násobku do 10-násobku maximální tolerované molární dávky TNF, ačkoliv, jak bylo uvedeno výše, je dávka předmětem terapeutické úvahy.

Dále, data získaná v klinických studiích, kde bylo různými protokoly demonstrováno zvýšení koncentrace TNF v peritoneální kapalině u žen s endometriosou (Eisermann et al., 1988; Halme, 1991; Overton et al., 1996), mohou být také užitečné při stanovení účinné dávky antagonisty TNF.

Obvykle je denní dávka aktivní složky od přibližně 0,01 do 100 mg na kg tělesné hmotnosti. Pro získání požadovaných výsledků se obvykle podává 1 až 40 mg/kg/den rozděleně do několika dávek nebo v prostředku se zpomaleným uvolňováním. Druhá nebo další aplikace může být provedena za použití stejné, nižší nebo vyšší dávky, než byla iniciální dávka podaná jedinci. Druhá nebo další aplikace může být provedena rr-^τι s-;sťsa.-«arwtBa

během nebo před relapsem endometriosy nebo souvisejících příznaků. Termín relaps nebo recidiva označují objevení se jednoho nebo více příznaků endometriosy.

Antagonista TNF může být aplikován profylakticky nebo terapeuticky jedinci před, současně s nebo sekvenčně s jinými terapeutickými režimy nebo činidly (například v režimech obsahujících více léčiv), v terapeuticky účinném množství, zejména při léčbě neplodnosti. Antagonisté TNF, které jsou podány simultánně s jinými terapeutickými činidly, mohou být podány ve stejném nebo v jiném prostředku. Konkrétně, když je léčeným onemocnění neplodnost spojená s endometriosou, tak mohou být podány biologicky aktivní lidský choriový gonadotropin (hCG), luteinizační hormon (LH) nebo hormon stimulující folikuly (FSH), buď přirozená vysoce přečištěné, nebo rekombinantní. Takové molekuly a způsoby jejich přípravy jsou popsány v Evropských patentových přihláškách PE 160699, EP 211894 a EP 322438.

Předkládaný vynález bude nyní dokreslen následujícím příkladem, který nijak neomezuje rozsah vynálezu, a připojenými výkresy.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 ukazuje efekty Antide (2 mg/kg, podkožně každé 3 dny), rekombinantního solubilního TNF (10 mg/kg, s.c., aplikace ve dvou denních dávkách po dobu 1 týdně), na velikost ložisek u krys s experimentální endometriosou 2 dny a 9 dní po poslední léčbě. Tato data, která byla získána za použití 6 zvířat na skupinu pro první dobu utracení zvířat a 5 zvířat na skupinu pro druhou dobu utracení zvířat, představují průměrné procento inhibice ± SEM.

• «

Obr. 2 ukazuje efekty rekombinantního solubilního TNF (10 mg/kg, s.c., aplikace ve dvou denních dávkách po dobu 1 týdně) a Antide (2 mg/kg, podkožně každé 3 dny), na NK aktivitu krysích buněk sleziny proti YAC buňkám (uvolňování ⁵¹Cr) 2 dny (panel A) a 9 dnů po poslední léčbě (panel B) . Data představují průměrné procento lýzy ± SEM.

Obr. 3 ukazuje efekty rekombinantního solubilního TNF (10 mg/kg, s.c., aplikace ve dvou denních dávkách po dobu 1 týdně) ve srovnání s kontrolou a Antide (2 mg/kg, podkožně každé 3 dny) , na sérovou koncentraci estradiolu 17β u krys s experimentální endometriosou. Data představují průměrné koncentrace estradiolu-17P ± SEM.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Zvířata: Samice Sprague-Dawley krys (250-275 g) byly zakoupeny od Charles River Italia (Calco, Lecco, Italy). Zvířata byla chována za následujících experimentálních podmínek: teplota 22+2 °C, relativní vlhkost 55+10%, ventilace 15±3 výměn vzduchu za hodinu s filtrací na HEPA 99,997% filtrech a osvětlením s 12 hodinovým cyklem (7,00-19,00).

Před pokusem se zvířata nechala aklimatizovat za těchto podmínek po dobu alespoň jednoho týdne. Zvířata byla krmena ad libitum standardními peletami.

Testované léky: Antide byl připraven a dodán Bachem (California, USA). Lidský rekombinantní solubilní TNFRI použitý v příkladu měl sekvenci odpovídající segmentu 20-180 lidského TNF-RI (Nophar et al., 1990) a byl připraven v CHO • ·

• · · · • · ·· : :: :

• · · · buňkách a byl získán od Interpharm Laboratory Ltd. (Izrael) pod jménem r-h TBP-1.

Materiály: Materiál pro buněčnou kulturu byl zakoupen od Gibco BRL, Life Technologies )Paisley, UK). Estradiol 17-β RIA kit byl zakoupen od DPC (Los Angeles, CA, USA). Inoketam byla zakoupen od Virbac (Carros, FR) . [⁵¹Cr) -chroman sodný byl zakoupen od NEN Dupont (Boston, MA, USA). Rompun byl zakoupen od Bayer AG (Leverkusen, DE). Hedvábné stehy 7,0 byly Zakoupeny od Ethicon (Pomezia, IT).

Experimentální model endometriosy u krys. Pro výzkum efektu rekombinantního solubilního TNF-RI u endometriosy se použil dříve popsaný model s drobnými modifikacemi (Jones, 1987). V anestesii Inoketamen/Rompunem se autologní fragment endometriální tkáně (délky 1 cm) resekoval z pravého děložního rohu a vložil se do PBS o teplotě 37 °C. Uterinní segment se otevřel longitudinální incisí a 5x5 mm řez se transplantoval, bez odstranění myometria, na vnitřní povrch stěny břišní pomocí neabsorbovatelných hedvábných stehů na čtyřech rozích.

Výzkum efektů studovaných léků v experimentálních modelech endometriosy. Experimentální endometriosa byla chirurgicky indukována u anestezovaných krys způsobem popsaným výše. Dále, jiné skupině krys byl odstraněn podobný fragment jednoho děložního rohu, ale byl u nich transplantován 5x5 mm čtvereček tuku obklopujícího dělohu (falešně operovaná skupina). Další skupina krys, u které nebyl proveden žádný chirurgický zákrok, byla normální kontrolní skupinou. Tři týdny pro indukci endometriosy se u zvířat provedla druhá laparotomie (laparotomie před léčbou) pro určení velikosti a životaschopnosti ektopické endometriální tkáně. Povrchová r^yrfíffltwřaffť

plocha (délka x šířka) se měřila pomocí kaliperu a zaznamenala se. Zvířata s životaschopnými transplantáty se přidělila do daných léčebných skupin, jak je popsáno v tabulce 1, tak, že na konci pokusu bylo použito šest zvířat na skupinu v době prvního utracení a pět zvířat na skupinu v době druhého utracení. Léčba byla zahájena po 1 týdnu pro zotavení. Kontrolním skupinám byl podán pouze salinický roztok; jiné skupině byly podávány tři podkožní injekce Antidu (2 mg/kg) každé 3 dny v režimu, o kterém bylo dokázáno, že potlačuje ovariální a hypothalamickou aktivitu (Sharpe et al., 1990). Další skupině bylo podáváno 10 mg/kg rekombinantního solubilního TNF-RI, ve dvou denních dávkách, po dobu 1 týdne.

Transplantace endometria	Léčba	Dny léčby¹	Dny utracen i¹
Ne	salinický roztok	28 až 34	36, 43
falešně operované	salinický roztok	28 až 34	36, 43
Ano	salinický roztok	28 až 34	36, 43
Ano	Antide (2 mg/kg)	28 až 34	36, 43
Ano	Rekombinantní solubilní TNF-RI (10 mg/kg ve dvou denních dávkách)	28 až 34	36, 43

od dne chirurgické transplantace (den 1)

V uvedenou dobu utracení (2 a 9 dnů po poslední terapii, t.j. 36 a 43 dnů po chirurgické transplantaci) se zvířata uvedla do anestesie, z břišní aorty se odebraly vzorky krve, sérum se separovalo a uskladnilo se při -20 °C do analýzy na koncentraci 17-3~estradiolu. Sleziny se odebraly pro měření aktivity přirozených žabíječů (NK buněk). Plocha endometriotických ložisek se měřila v každé době utracení a pro normalizaci dat se procentuální variace vůči hodnotě při laparotomii před léčbou vypočítala podle následujícího vzorce:

(X-Xo)

------x 100

Xo kde Xo je velikost v době laparotomie před léčbou a X je velikost v době utracení. Potom se vypočetla průměrná hodnota procentuální variace v každé skupině.

Určení aktivity NK buněk. Aktivita NK buněk se určila za použití testu uvolňování ⁵¹Cr. Myší lymfomové YAC-1 buňky se získaly během fáze exponenciálního růstu a promyly se jedenkrát mediem (RPMI 1640 obsahující penicílin/streptomycin, L-glutamin a 10% teplem inaktivované fetální telecí sérum). Buněčná peleta se inkubovala s 100 gCi [⁵¹Cr]-chromanu sodného při teplotě 37 °C, 5% CO2 po dobu 2 hodin. Buňky se potom promyly 3-krát 10 ml testovacího media, resuspendovaly se v požadované koncentraci a přidaly se na testovací plotnu ke krysím splenocytům. Ty se resuspendovaly v testovacím mediu v požadované koncentraci (2xl0⁶/ml) a provedla se sériová ředění v testovacím mediu ve trojím provedení v jamkách s U-dnem na 96-jamkové plotně a potom se přidaly cílové buňky značené ⁵¹Cr. Cílové buňky značené ⁵¹Cr (5xl0³) se přidaly do každé jamky testovací plotny a pro každý vzorek se testovaly tři poměry efektorových ku cílovým buňkám (200:1, 100:1 a 50:1). Plotna obsahující směs efektorových a cílových buněk se odstředila při 200 x g po dobu 4 minut a potom se inkubovala při 37 °C, 5% CO2 po dobu 4 hodin. Po dalším odstředění plotny při 200 x g po dobu 4 minut se 20 μΐ supernatantu z každé jamky přeneslo na filtr ze skleného vlákna a β-kamerou se hodnotila asociovaná radioaktivita.

Procento lýzy se vypočítalo následujícím způsobem:

cpmvzor ku^- Cpmspont.

----------------X 100

Cpmcel kem” cpmspont.

kde cpmvzorku = průměrné uvolnění ⁵¹Cr za přítomnosti efektorových buněk;

cpm_Spont. = průměrné uvolnění ⁵¹Cr z cílových buněk za přítomnosti kultivačního media;

cpmceikem = průměrné uvolnění ⁵¹Cr z cílových buněk za přítomnosti 1% Triton-XlOO.

Stanovení 17-B-estradiolu. Sérové koncentrace 17-B-estradiolu byly určeny za použití komerčně dostupného kitu pro kvantifikaci estradiolu v séru bez kroku extrakce (DPC, Los Angeles, CA, USA). Stručně, estradiol značený I soutěží s estradiolem ve vzorku séra o protilátky. Po inkubaci se separace navázaného a volné estradiolu provede dekantováním. Zkumavka se potom odečítá v gamma-čítači (LKB-Pharmacia Wallak) a hodnoty jsou nepřímo úměrné množství estradiolu ve vzorku séra. Kvantita estradiolu ve vzorcích se určí srovnáním hodnot s kalibrační křivkou. Antisérum je vysoce specifické pro estradiol, s relativně nízkou zkříženou reaktivitou s jinými přirozenými steroidy. Vzorky z jednoho pokusu se analyzují v jednom imunotestu.

Statistická analýza. Statistická významnost rozdílů pozorovaných mezi léčebnými skupinami se hodnotila za použití ANOVA z Statgraphíc Plus® softwaru {verze 1.4). Provedl se Tukeyův test (p<0,05).

i

• · ·· ·· i

Výsledky

Efekty rekombinantního solubilního TNF-RI při experimentální endometriose

Úspěšný růst a vývoj chirurgicky transplantované endometriální tkáně u krys je pokusným modelem, který byl použit pro výzkum některých aspektů endometriosy, které nemohou být úspěšně studovány u člověka (Dudley et al., 1992). Dřívější studie provedené na pokusné endometriose u krys ukázaly, že Antide účinkuje správně jako pozitivní kontrola (Sharpe et al., 1990) . V popsaném příkladu byl efekt Antide srovnáván, z hlediska rozměru transplantátu před a po léčbě, s efektem rekombinantního solubilního TNF-RI, jak je uvedeno v tabulce II.

Léčba	Dávka (mg/kg)	Doba hodnocení po poslední léčbě (dny)	Průměr ± SEM pro hodnoty	Průměr ± SEM pro hodnoty po léčbě (cm²)
před (cm²)	léčbou
Salinický roztok		2	1,45	± 0,41	1,18 ± 0,15
Solubilní TNF-RI	10	2	1, 43	± 0,38	0,77 ± 0,09
Antide	2	2	1, 43	± 0,34	0,08 ± 0,02
Salinický roztok		9	1,28	± 0,24	0,97 ± 0,11
Solubilní TNF-RI	10	9	1,42	± 0,38	0,54 ± 0,19
Antide	2	9	1,41	± 0,32	0,19 ± 0,09

Výsledky jsou uvedeny na obr. 1 jako průměrná procentuální inhibice transplantovaných fragmentů endometria (jak bylo vypočteno způsobem uvedeným výše).

Antide byl účinný v redukci velikosti endometriotických ložisek (obr. 1), včetně téměř kompletních (94% a 88% ve srovnání s původními rozměry) a statisticky signifikantních (p<0,05, ANOVA a Tukeyův test) remisí v obou sledovaných dobách po přerušení terapie. 1-týdenní léčba lidským rekombinantním solubilním TNF-RI (10 mg/kg, ve dvou denních dávkách) vedla k statisticky významnému zmenšení velikosti (33% a 64% ve srovnání s původními rozměry, v příslušném pořadí) endometriotických ložisek v obou sledovaných dobách, ale statisticky významné (p<0,05, ANOVA a Tukeyův test) bylo toto zmenšení pouze ve dnu 9. Ložiska nebyla pozorována u falešně operovaných zvířat v žádnou dobu.

Hodnocení aktivity NK buněk

Aktivita NK buněk byla hodnocena in vitro testem provedeným s buňkami sleziny proti YAC buňkám a neukázala žádný rozdíl mezi skupinami (obr. 2), což je v souladu s pozorováním na paviánech, kde nebyl pozorován rozdíl v antiendometriální cytotoxicitě a aktivitě NK buněk u zvířat s a bez endometriosy (D'Hooghe et al., 1995). Toto pozorování je v protikladu s pozorováním u člověka, kde byla popsána snížená aktivita NK buněk u pacientů s endometriosou, s významnou korelací mezi sníženou aktivitou peritoneálních NK buněk a závažností endometriosy (Oosterlynck et al., 192).

Hodnocení sérového 17-P-estradiolu

Sérové koncentrace 17-p-estradiolu byly měřeny radioimunotestem v obou testovaných dobách. Statisticky významný rozdíl byl zjištěn ve skupině léčené Antidem ve • 9

9 srovnání s neléčenými kontrolami v den 9. Žádný statisticky významný rozdíl nebyl pozorován pro rekombinantní solubilní TNF-RI při srovnání s kontrolami (obr. 3; p<0,05, ANOVA a Tukey test) .

Závěr

V krysím pokusném modelu endometriosy poprvé podání antagonisty TNF, solubilní formy TNF-RI, jasně dokazuje potenciální účinnost této cytokinové, nehormonální terapie tohoto patologického stavu. Proto představují antagonisté TNF alternativu k existujícím způsobům léčby ve smyslu snížení nežádoucích účinků. Tyto výsledky ukazují na možné použití antagonistů TNF v léčbě neplodnosti asociované s endometriosou.

Odborníkům v oboru budou jasné mnohé varianty specifických provedení předkládaného vynálezu, které zde byly popsány. Tyto a všechny další varianty spadají do rozsahu připojených patentových nároků.

Odkazy

Από, A, Tazuke, S.L, Artar, E., Klímán, H.J., and Olivě, Di., 1996a, MolHumReprod. 2, 40-45.

And, A-, Oral, E., Bukulmez, O., Duleba, A, Olivě, DJL, and Jones, E.E., 1996b, FemLSteríL 65, 603-607.

Απά, A., Oral, E., Artar, E., Tazuke, S.L, and Olivě, DJL, 1997, FertiLSteriL 67,1065-1072. Barbieri, RL, 1988, N.Engl.JMed. 318,512-514.

Bazzoni, F. and Beuder, B., 1996, N.EnglJJMed. 334,1717-1725.

Cheung, AN., 1996, Curr.Opin.ObstetGynecoL 8,46-51.

DTíooghe, TM, Scheerlinck, Ji*., Koninckx, PJL, ΡΕΠ, JA., and Bambra, CS., 1995, HumReprod. 10,558-562.

Dawood, M.Y., 1993, Int.J.Gynaecol.Obste£. 40 (Suppl.), S29-42.

Dudley, DJ, Hatasaka, HJEi, Branch, D.W., Hammond, E., and Mítchell, MD^ 1992, AmJ.Obstet.GynecoL 167,1774-1780.

Eísennann, J., Gast, M. J., Pineda, J., Ódem, R R, and Ccffins J. L , 1988, FerhLSteriL 50,573579.

Eísennann, J., Register, K. B., Stridder, R C, and Coflins J. L, 1989, JAndroL 10,270-274.

Elliott, M.J., Maini, RN., Feldmann, M., Long-Fox, Charles, P., Byl, H, and Woody, JN, 1994, Lancet 344,1125-1127.

Engelmann, EL, Novici, D., and Wallach, D., 1990, J-BioLChem. 265,1531-1536.

Kers, W^ 1991, FEBS Lett. 285,199-212.

Gray, P.W., Aggarwaí, B.B., Benton, C.V., Bringman, TR, Henzel, W.J., Jarrett, J.A, Leung, D.W., Moffar, B., Ng, and Svedershy, LP., 1984, Narure 312,721-724.

Hahn, D.W., Carraher, RP., Foldesy, RG., and McGuire, JL., 1986, Am.J.Obstet.GynecoL 155,1109-1113.

Halme, J., 1991, AnnN.YAcad.Sci. 622,266-274.

Harada, T., Yoshioka, H., Yoshida, S., Iwabe, T., Onohara, Y., Tanikawa, M., and Terakawa, N, 1997, Am.J.Obstet.Gynecol. 176,593-597.

Ho, KN., Wu, M.Y., and Yang, Y.S., 1997, AmJReprodJmmunol. 38,400-412.

Homung, D., Ryan, LP-, Chao, V A., Vígne, JL, Schnock, ED., and Taylor, RN, 1997, J.CHikEndocrinoLMetab. 82,1621-1628.

Hunt, JR., Chen, HL, Hu, XL., and Tabibzadeh, S, 1992, BioLReprod. 47,141-147.

Jones, RC, 1987, Acta Endocrinol.(CopenL) 114,379-382.

Knight, ϋλί, Trinh, EL, Le, J, Siegel, S, Sheaíy, D, MčDonough, M, Scallon, B, Moore, MA-, V2cek, J, and Daddona, P, 1993, MoLImmunoL 30,1443-1453.

Koninckx, PR_, Meuleman, C, Demeyere, S, Lesaffre, E, and ComiHie, F.J, 1991, FerúLSteril. 55,759-765.

Knn incky, PR. and Mardn, D., 1994, Curr.Opin.Obstet.GynecoL 6,231-241.

MacSween, RNM, 1993, Muir’s Textbook of pathology, 13th ed. (Whaley K.; ISBN 0-34055145-3), 1024-1025.

Malinak, LR, Buttram, V.C.J, Elias, S, and Simpson, JJL, 1980, AmJ.Obstet-Gynecol. 137, 332-337.

MataHínrakic, L, Neonaki, M, Zolindaki, A, Hassan, E, Georgoulias, V, and Kouma ntakis, E, 1997, IntJJFerriLWomensLíed. 42,211-214.

·· 44 • 4 4 4

J · ♦♦ • · 4 4 • 4 4 4

44

4

4 4

Moii, EL, Nakagawa, ML, Itoh, N., Wada, K., and Tamaya, T., 1990, AmJJReprocLImniunoL 24,45-50.

Nophar, Y-, Kemper, O., Brakebusch, C, Englemann, Hl·, Zwang, R,, Aderia, Ď, Hofrmann, H, and WaBach, D_n 1990, EMBO J. 9,3269-3278.

Oosteiiynck, D.J^ Menleman, C, Waer, ML, Vandeputte, Ní, and Koninckx, P.R, 1992, FeruLSteriL 58,290-295.

Overton, CL, Femandez-Shaw, S., Hicks, B., Barlow, D., and Staikey, P., 1996, HumRcprod. 11,380-386.

Pennica, D-, Nedwin, G.E., Hayfiick, J.S., Seeburg, PH., Derynck, R, PaDadino, ΜΛ Kohr, WJ^Aggarwal,BJB^aiid GoeddeljD.V., 1984, Nature 312,724-729.

Rana, N., Braun, DT., House, R, Gebel, HL, Rotman, CL, and Dmowski, WP., 1996, FertiLSteiiL 65,925-930.

Revelli, A., Modotti, M., Ansaldi, G, and Massobiio, M., 1995, Obsret-GynecoLSurv. 50,747754.

Roby, KLF., Laham, N., and Hunt, J.S., 1996, JReprodTertfl. 106,285-290.

Shalaby, MLR., Laegreid, W.W., Ammann, A.J., and Liggitt, HD., 1989, Lab.Invest. 61, 564570.

Shalaby, MLR, Sundán, A-, Loetscher, H, Brockhaus, Ní, Lesslauer, W., and Espevik, T, 1990, J.ExpMed. 172,1517-1520.

Shaipe, KTBertero, MLCL, and Vemon, M.W., 1990, Prog.Clin.BioLRes. 323,449-58

Tucci, A., James, H., Chicheporache, R, Bonnefoy, J.Y., Dayer, JÍM., and Zubler, RHL, 1992, J.IrnmunoL 148,2778-2784.

Waller, K.G. and Shaw, R.W, 1993, FemLSteriL 59,511-515.

Zhang, RJ., WHd, RA-, and Ojago,JLML, 1993, FerdlSteriL 59,1196-1201.

Claims

1. Použití antagonisty TNF společně s farmaceuticky přijatelným nosičem pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčbu a/nebo prevenci endometriosy.

2. Použití podle nároku 1, kde antagonistou TNF je polypeptid, který je schopný vazby na specifický epitop TNF tak, že TNF se nadále nemůže vázat na membránový receptor pro TNF.

3. Použití podle nároku 2, kde antagonistou TNF je molekula receptorů, její derivát nebo fragment, který se váže na TNF.

4. Použití podle nároku 3, kde molekula receptorů je vybrána ze skupiny zahrnující TNF-RI a TNF-RII.

5. Použití podle nároku 3, kde molekulou receptorů je extracelulární doména TNF-RI.

6. Použití podle nároku 3, kde molekulou receptorů je lidský solubilní rekombinantni TNF-RI.

7. Použití podle nároku 3, kde molekulou receptorů je multimerní molekula TNF receptorů nebo její funkční část.

8. Použití podle nároku 7, kde multimerní molekula TNF obsahuje celé nebo funkční části dvou nebo více extracelulárních domén TNF receptorů navázané prostřednictvím jednoho nebo více spojovacích polypeptidů.

9. Použití podle nároku 3, kde molekulou receptorů je imunoreceptorová fúzní molekula nebo její funkční část.

♦ 4 ·

4 4 ·

4 4 4 ·· · ·· • 4 • 4

4 4

10. Použití podle nároku 9, kde imunoreceptorová fúzní molekula obsahuje celou nebo funkční část TNF receptoru a imunoglobulinový řetězec.

11. Použití podle nároku 1, kde antagonistou TNF je anti-TNF protilátka nebo její fragment.

12. Použití podle nároku 11, kde monoklonální protilátka je vybrána ze skupiny zahrnující chimérickou monoklonální protilátku, humanizovanou monoklonální protilátku nebo její fragment.

13. Použití podle nároku 1, kde antagonista TNF brání nebo inhibuje signalizaci TNF receptoru.

14. Použití antagonisty TNF společně s farmaceuticky přijatelným nosičem pro přípravu farmaceutického prostředku pro zlepšení implantace a plodnosti prostřednictvím redukce endometriotických lézí.

15. Způsob léčby a/nebo prevence endometriosy vyznačující se tím, že zahrnuje podání terapeuticky účinné dávky antagonisty TNF pacientovi.

16. Farmaceutický prostředek pro léčbu a/nebo prevenci endometriosy vyznačující se tím, že obsahuje antagonistu TNF a farmaceuticky přijatelný nosič.

17. Farmaceutický prostředek pro zlepšení implantace a plodnosti prostřednictvím redukce endometriotických lézí vyznačující se tím, že obsahuje antagonistu TNF a farmaceuticky přijatelný nosič.

• ·

18. Farmaceutický vyznačuj i podle jakéhokoliv • · * ♦ * 4 ··

29 · 5 · 5 ·· ·· prostředek podle nároků 16 nebo 17 c i se t i m, že obsahuje antagonistu TNF z nároků 1 až 13.