DE69835368T2

DE69835368T2 - Verwendung von tgf beta oder activin zur behandlung und diagnose von unfruchtbarkeit

Info

Publication number: DE69835368T2
Application number: DE69835368T
Authority: DE
Inventors: Anne Sarah St. Peters ROBERTSON; Paul Kelton Vale Park TREMELLEN
Original assignee: University of Adelaide
Current assignee: University of Adelaide
Priority date: 1997-03-06
Filing date: 1998-03-06
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2018-03-07
Also published as: US7204978B1; CA2283270A1; AUPO550897A0; US20060177459A1; EP1028743A4; DE69835368D1; ES2268765T3; EP1743649A1; DK1028743T3; EP1028743A1; EP1028743B1; ATE333890T1; WO1998039021A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Diagnoseverfahren eines Zustandes der Unfruchtbarkeit, der zu einer verringerten Fähigkeit Nachkommen zu haben führt, und ein Verfahren zur Behandlung dieses Zustandes.
Hintergrund der Erfindung
Die Unfähigkeit oder die verringerte Fähigkeit Kinder zu haben, kann zu großen persönlichen Problemen führen und führt zu hohen begleitenden Sozialkosten, insbesondere Kosten von medizinischen Eingriffen. Ein großer Anteil von Ehepaaren fällt in diese Kategorie. Es wird z.B. angenommen, dass in den USA 10 bis 15 % der Ehepaare im gebärfähigen Alter nicht in der Lage sind, Kinder zu haben, während es in dem Vereinigten Königreich um 14 % handeln soll. Im Jahr 1995 wurde berechnet, dass 5,1 Millionen Frauen alleine in den USA eine eingeschränkte Fruchtbarkeit aufzeigen, wobei diese sich auf 5,9 Millionen im Jahre 2020 erhöhen soll (56). In den USA liegen die Kosten einer Schwangerschaft durch IVF zwischen 66.000,00 US Dollar für den ersten Zyklus bis 114.000,00 US Dollar im sechsten Zyklus (60).
Im Zusammenhang mit diesem Patent wird als Zustand der Unfruchtbarkeit verstanden, dass sich dieser Ausdruck nicht nur auf die Fähigkeit einer Empfängnis bezieht, sondern auch auf Fehlgeburten, spontanen Aborten oder anderen schwangerschaftsbezogenen Zuständen, wie Präeklampsie, und schließt Subfertilität ein.
Vor kurzem durchgeführte Studien haben aufgezeigt, dass ein Hauptanteil der unfruchtbaren Ehepaare kinderlos sind, weil sie eher eine höhere als normale Rate von frühem Embryoverlust (70 % Fehlgeburt gegenüber 21 % Fehlgeburt in fruchtbaren Kontrollen; 57) haben, als dass sie in der Lage sind, schwanger zu werden. Diese Befunde haben Untersuchungen initiiert, die Gründe für die erhöhte Rate an frühem embryonalem Verlust in unfruchtbaren Paaren zu finden, genauso wie für mögliche Therapien, um diese Verluste zu verhindern.
In den letzten 20 Jahren kam einige Hoffnung auf, diesen unfruchtbaren Paaren durch die Entwicklung von in-vitro-Fertilisationstechniken (IVF) zu helfen. Diese IVF-Techniken sind im Allgemeinen in einer solchen Art, dass die Frau zum Eisprung stimuliert wird, ein in vitro in Kontaktbringen des entnommenen Eis mit Sperma und Zurückführen des befruchteten Eis in die Gebärmutter. Es gibt verschiedene Varianten dieses allgemeinen Verfahrens. Abgesehen von umfangreichen Untersuchungen und technischen Fortschritten in dem Bereich der IVF ist nach wie vor die Rate einer erfolgreichen Schwangerschaft nach IVF-Behandlung sehr gering und liegt im Bereich von 15 bis 25 % pro Zyklus.
Das Durchführen eines IVF-Programms führt häufig zu seelischen Schmerzen, insbesondere, wenn als Ergebnis keine erfolgreiche Schwangerschaft vorliegt. Es wird derzeit angenommen, dass die geringe Erfolgsrate bei der IVF-Behandlung in der sehr hohen Rate eines frühen Embryoverlusts (58, 59) begründet ist, möglicherweise verbunden mit dem eingeschränkten Zustand des Patienten für eine Vermehrung oder dem IVF-Prozess selbst. Die geringe Wirksamkeit der IVF zusammen mit den hohen Kosten und den assoziierten psychologischen Trauma einer wiederholten Fehlbehandlung lässt es wünschenswert erscheinen, nach alternativen Ansätzen zur Lösung des Unfruchtbarkeitsproblems zu suchen. Derzeitige Verfahren zur Erhöhung der Schwangerschaftsrate während der IVF-Behandlung schließen das Einfügen einer Mehrzahl von Embryonen in die Gebärmutterhöhle ein (2 bis 5). Dies ist aber nicht immer effektiv, da angenommen wird, dass die Gebärmutteraufnahmefähigkeit genauso häufig fehlerhaft ist wie die Lebensfähigkeit des Embryos. Die darauf folgenden hohen Raten an Mehrfachschwangerschaften sind assoziiert mit einem erhöhten Risiko der Mutter für eine Präeklampsie, Blutungen und operativen Geburten, und Risiken für den Fötus, einschließlich frühzeitiger Geburt mit begleitenden Möglichkeiten von physischen und mentalen Handicaps.
In ähnlicher Weise ist ein Verlust in der frühen Schwangerschaft eine wesentliche Einschränkung in Programmen der Tierzucht und bei seltenen oder bedrohten Arten. Embryonale Sterblichkeit während der Pre- und Pereinnistphase wird als Hauptgrund für den geringen Erfolg bei einer Schwangerschaft unter Einsatz von Reproduktionstechnologien, wie künstliche Befruchtung, angesehen. Selbst nach natürlicher Empfängnis stellen die Variabilität in der Tragezeit und die Lebensfähigkeit der Nachkommen zusätzliche Limitierungen mit schwerwiegenden ökonomischen Folgen dar.
Die Gründe für die erhöhten Raten eines frühen embryonalen Verlusts nach natürlicher oder unterstützter Empfängnis sind unbekannt. Chromosomale Untersuchungen bei Fehlgeburten von Embryos haben bestätigt, dass mindestens die Hälfte die Embryos genetisch normal sind (61). Normale Embryos werden anscheinend dadurch verloren, dass die Umgebung, die durch den mütterlichen Trakt während der Pre-Implantations-Entwicklung oder zum Zeitpunkt der Implantation (Einnistung) in das Endometrium unzureichend ist, das Wachstum und die Entwicklung des Embryos zu fördern. Die Embryos können ihre Lebensfähigkeit oder ihr Entwicklungspotential verlieren, wenn im Milieu des mütterlichen Trakts unzureichende oder ungeeignete Nährstoffe oder Peptidwachstumsfaktoren enthalten sind. Weiterhin stellt eine wesentlich Determinante der Aufnahmefähigkeit der Gebärmutter die mütterliche Immunantwort gegenüber dem Conceptus dar, die aufgrund der Expression von sowohl mütterlichen als auch väterlichen Antigenen als fremd oder semi-allogen angesehen wird.
Medawar hat ursprünglich überlegt, dass eine mütterliche Anpassung des Immunsystems gegenüber dem semi-allogenen Conceptus durch immunologische Toleranz gegenüber den väterlichen Transplantationsantigenen (Haupthistokompatibilitäts(MHC)antigenen) erleichtert werden kann (70). Diese Hypothese verlor ihre Stützung als gefunden wurde, dass die Schwangerschaft dauerhaft die Kapazität von Mäusen väterliche Hauttransplantate abzustoßen nicht verändert (5, 46). Das Konzept der vorübergehenden Hypoempfindlichkeit gegenüber väterlichen MHC-Antigenen (46) wird nun erneut beachtet, da eine kürzliche Untersuchung durch Tafuri et al. (31) deutliche Beweise dargelegt hat, dass während der Schwangerschaft bei Mäusen die Lymphozyten, die reaktiv gegenüber väterlichen Klasse I MHC sind, anerg werden oder nicht in der Lage sind, das Antigen zu erkennen, aufgrund der Internalisierung von T-Zellrezeptoren. Dieser anerge Zustand verleiht eine „Toleranz" gegenüber väterlichen MHC-Antigen exprimierenden Tumorzellen und war funktionell aktiv vom Beginn der Einnistung (Tag 4 der Schwangerschaft) bis kurz nach Gebären, wenn die Lymphozyten ihre Aktivität wieder erlangen. Die Daten unterstützen die Hypothese, dass eine Toleranz der mütterlichen Immunantwort gegenüber anderen Antigenen, die von dem Embryo exprimiert werden, oder der fötal-Plazenta-Einheit (im Folgenden auch als Conceptus bezeichnet) ähnlich sein kann, aufgrund der Induktion einer toleranten Immunantwort spezifisch gegenüber diesen Antigenen.
Was genau für die Induktion dieser Toleranz gegenüber väterlichen MHC-Antigenen und anderen Conceptus-Antigenen verantwortlich ist, ist bisher unklar. Weiterhin ist die Natur der Toleranz unklar.
Der Ausdruck „Toleranz" im Zusammenhang mit dieser Erfindung soll ein Inhibieren einer möglichen zerstörenden, zellvermittelten Immunantwort gegenüber Antigenen des Conceptus und/oder Inhibierung der Synthese von reaktiven Immunoglobulin-Isotypen, die gegenüber Conceptus-Antigenen Komplement fixieren können (z.B. „Th1"-Kompartment des Immunsystems) bedeuten. Diese Toleranz kann oder kann nicht mit der Induktion der Synthese von nicht-zerstörenden, Conceptus-Antigenreaktiven Immunglobulinen von Isotypen, die Nicht-Komplement fixierten und Unterklassen hiervon, assoziiert sein (z.B. den „Th2"-Kompartment der Immunantwort). Der Ausdruck „Toleranz" soll so verstanden werden, dass er T-Zell-Anergy und andere permanente oder vorübergehende Arten der Hypoempfindlichkeit oder Suppression des mütterlichen Th1-Kompartments umfasst.
Tafuri et al. (31) haben gezeigt, dass eine spezifische Toleranz gegenüber väterlichen Antigenen bei Fortschreiten der Blastocysteneinnistung am Tag 4 der Schwangerschaft bei Mäusen aktiv ist. Der Embryo ist vor Einnistung nur ein sehr schwacher Antigenstimulus, da er üblicherweise weniger als 100 Zellen umfasst und er sich in einer Schutzumhüllung (zona pelluicida) bis kurz vor dem Einnisten entwickelt. Sperma ist allerdings voll von väterlichen Antigenen, die auf oder in den Spermien, somatischen Zellen und der Samenflüssigkeit selbst vorhanden sind und beinhalten ein wirksames Inokulum zum Primen für viele väterliche Antigene (5), von denen bekannt ist, dass sie im Conceptus ebenfalls vorkommen. Bisher wurde angenommen, dass die Samenflüssigkeit im Wesentlichen als Transport- und Überlebensmedium für die Spermatozoen bei Durchqueren des weiblichen Reproduktionstrakts sind (21). Kürzliche Untersuchungen der Erfinder, die hierin beschrieben werden, haben eine bisher nicht gewürdigte Rolle dieser Flüssigkeit hervorgehoben, dass sie mit mütterlichen Zellen interagieren, um eine Kaskade von zellulären und molekularen Ereignissen zu induzieren, die schließlich zu einer mütterlichen Immuntoleranz gegenüber väterlichen Antigenen, die im Sperma vorhanden sind und vom Conceptus geteilt werden, führen, dies führt zu einem Aufheben der Immunabstoßung während des Einnistens.
Die Ejakulation während des Koitus führt zu einer Leukozyteninfiltration an der Stelle, an der das Sperma abgelagert wird, dies wird als „Leukozytenzellreaktion" bei einer Vielzahl von Säugetierarten einschließlich Menschen bezeichnet (1). In Mäusen ähnelt die hervorgerufene Kaskade an zellulären und molekularen Änderungen durch das Einführen von Sperma in die Gebärmutter in vielen Aspekten einer klassischen Entzündungsantwort.
Innerhalb von Stunden nach Empfängnis findet ein deutliches Einwandern und Aktivieren von Makrophagen, Neutrophilen und Eosinophilen in dem endometrialen Stroma statt (2–4) in Verbindung mit einer heraufgeregelten Expression des Haupthistokompabilitätskomplexes (MHC) Klasse II und von CD86-Antigenen durch dendritische Zellen des Endometriums, gefolgt von einer Vergrößerung der abführenden Lymphknoten (5, 6). Diese Entzündungsantwort ist vorübergehend und verschwindet vollständig zum Zeitpunkt der Embryoneneinnistung vier Tage nach Schwangerschaft (2–4), wenn Leukozyten, die sich in dem Endometrium aufhalten, vorwiegend Makrophagen mit einem immunsuppressiven Phänotyp sind (7).
Die zeitlichen Änderungen im Wanderungsverhalten und dem phänotypischen Verhalten der endometrialen Leukozyten während des Zeitraums zwischen Empfängnis und Einnistung sind wahrscheinlich grundsätzlich begleitet von Cytokinen, die von Steroidhormon regulierten Epithelzellen, die die endometriale Oberfläche auskleiden und die endometriale Drüsen umfassen, stammen (8). Von besonderer Wichtigkeit ist der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierende Faktor (GM-CSF) und Interleukin (IL)-6, die Synthese dieser sind mindestens um das 20 bzw. 200fache in Östrogen geprimten Epithelzellen nach Induktion durch spezifische proteinhaltige Faktoren in der Samenflüssigkeit (8, 9), von denen bekannt ist, dass sie aus den Sekreten der Bläschendrüsen stammen (10), erhöht. Vorherige Studien haben in dem plötzlichen Anstieg in der epithelialen GM-CSF-Freisetzung den Schlüsselmediator in der Entzündungsantwort nach Empfängnis impliziert, da die Injektion von rekombinanten GM-CSF in die Estrus-Gebärmutter ausreichend ist, zelluläre Änderungen hervorzurufen, die denen ähneln, die nach natürlicher Empfängnis folgen (11). Die Erfinder haben festgestellt, dass unter Verwendung von GM-CSF-defizienten Mäusen die chemotaktische Aktivität von GM-CSF wahrscheinlich kompensiert oder erhöht wird durch ein Array von Chemokinen, deren Expression nach Empfängnis vorübergehend heraufreguliert ist (12) und Cytokinen, die von aktivierten endometrialen Makrophagen synthetisiert werden, einschließlich IL-1 und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) (4).
Die Autoren haben die Natur der Faktoren des Spermas, die stimulierend auf die GM-CSF-Freisetzung aus dem Gebärmutterepithel wirken, untersucht. Vorherige Experimente haben gezeigt, dass die Zunahme an GM-CSF-Gehalt in der Gebärmutter weder das Ergebnis des Einbringens von im Ejakulat enthaltenden GM-CSF noch eine Konsequenz einer neuroendokrinen Antwort gegenüber einer Gebärmutterhalsstimulation ist und unabhängig ist von sowohl dem Vorhandensein von Spermien im Ejakulat als auch einer MHC-Verschiedenheit zwischen Männchen und Weibchen (8). Ein Mechanismus der die Induktion der GM-CSF mRNA-Synthese in Epithelzellen durch proteinöse Faktoren, die aus den Bläschendrüsen stammen, involviert, wurde vorgeschlagen, aufgrund von Experimenten die zeigen, dass Bläschendrüsen defiziente (SV-) Männer keine GM-CSF-Freisetzung oder eine postempfängliche, entzündungsartige Antwort in Weibchen hervorrufen und dass Trypsin-sensitives, hochmolekulargewichtiges Material extrahiert aus den Bläschendrüsen die GM-CSF-Freisetzung aus den Epithelzellen der Gebärmutter in vitro herauf regulieren kann (10).
Es ist allerdings aus den bisher veröffentlichten Arbeiten nicht klar, dass diese Entzündungsantwort im Zusammenhang mit der Induktion einer Toleranz der Mutter gegenüber dem Conceptus steht oder alternativ, ob die Entzündungsantwort eine Rolle bei der Verstärkung des Immunsystems zur Bekämpfung fremder Gegenstände, wie möglichen pathogenen Bakterien, spielt. Es gibt weiterhin keinen Hinweis darauf, was der Auslöser für die Induktion der Toleranz ist oder ob tatsächlich die Toleranz durch das Sperma vermittelt wird.
Ein bekanntes, relevantes Stand der Technik Dokument ist das US-Patent 5395825 von Feinberg. Die Beschreibung offenbart einen Befund, der suggeriert, dass erhöhtes TGF-β in dem weiblichen Reproduktionstrakt die Produktion von Fibronektin erleichtert, ein Protein, von dem angenommen wird, dass es das Einnisten durch Adhäsion des Embryos an die endometriale Oberfläche fördert. Die Halbwertszeit von TGF-β ist nur einige Minuten und sein Effekt auf Fibronektin ist daher nur sehr kurzfristig. Daher kann ein Verabreichen von TGF-β in dem obigen Verfahren nur zur Unterstützung der Einnistung erwähnt werden, wenn es zeitgenau verabreicht wird, wenn der noch nicht eingenistete Embryo in der Gebärmutterhöhle eintrifft. Die vorliegende Erfindung erfordert nicht eine solche zeitliche Präzision in der TGF-β-Zufuhr, sie gibt auch nicht vor, dass die Wirkung von TGF-β durch Fibronektin vermittelt wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfinder haben TGF-β als ein grundlegendes immunregulierendes Molekül im Samenflüssigkeit identifiziert. TGF-β, das in der Bläschendrüse in seiner latenten Form hergestellt wird, wird in dem weiblichen Reproduktionstrakt aktiviert, dort wirkt es auf die GM-CSF Synthese in den Epithelzellen der Gebärmutter induzierend und initiiert somit die postkoitale Entzündungsantwort.
Weiterhin haben die Erfinder gezeigt das TGF-β eine Toleranz gegenüber männlichen Antigenen einschließlich den MHC Klasse I Antigenen hervorrufen kann, wenn es zu dem weiblichen Reproduktionstrakt zusammen mit Spermien oder Sperma hinzugefügt wird. Dieser Zustand der Toleranz wird aufgezeigt durch Hemmung der Th1-artigen Immunantworten gegenüber väterlichen Antigenen einschließlich einer delayed-type-hypersensitivity (DTH) Antwort, gefördert durch eine vorherige Injektion von Sperma, Herstellung von Komplement fixierenden Isotypen von Immunglobulinen spezifisch für Spermien und zellvermittelter Immunabstoßung von Tumorzellen, die die gleichen MHC Klasse 1 Antigene tragen, wie sie in dem initiierenden (priming) Sperma-Inoculum enthalten sind. Es wird vorgeschlagen, dass diese Toleranz erreicht werden kann durch Aussetzen der Frau gegenüber TGF-β entweder mit oder ohne männliche Antigenen. Die Signifikanz hiervon ist, dass es sehr wahrscheinlich ist, dass bestimmte Zustände der Unfruchtbarkeit mit der Unfähigkeit verbunden sind, Toleranz gegenüber Antigenen des Mannes und/oder ein geeignetes Cytokinumfeld zum Wachstum und Entwicklung der Pre-Implantation des Embryos auszubilden als Ergebnis von entweder das Fehlen von TGF-β in der Samenflüssigkeit des Mannes, der Unfähigkeit der Frau TGF-β aus der inaktiven in die aktive Form zu verarbeiten oder aufgrund der Abwesenheit oder geringeren Niveaus an väterlichen Antigenen in dem Ejakulat. In einigen Fällen mag die Unfruchtbarkeit begründet sein, in der Unfähigkeit der Frau auf TGF-β zu antworten, in diesem Fall kann die direkte Verabreichung durch von TGF-β induzierten Molekülen, wie GM-CSF, begleitet sein.
Der TGF-β₁ Gehalt in Sekreten der Bläschendrüsen bei Mäusen, wie auch in der Samenflüssigkeit bei Menschen (22), wurde als außergewöhnlich hoch festgestellt und nur geringer als der für Plättchendestillat beschriebene (23). In Säugetierarten umfasst die TGF-β-Familie mindestens drei eng-verwandte Polypeptide, TGF-ß_1,2,3 (24), diese weisen ein 70 bis 80%ige Sequenzhomologie auf und teilen sich viele biologische Wirkungen. TGF-ß₁ ist der dominante TGF-β Isotyp verantwortlich für das Erhöhen des Austoßes von GM-CSF in der Gebärmutter bei der Maus, da jetzt gefunden wurde, dass TGF-β₁ spezifische, neutralisierende Antikörper die Fähigkeit besitzen 85 % der GM-CSF-stimulierenden Aktivität in den Bläschendrüsen zu blockieren (2). Andere Mitglieder der TGF-β Superfamilie, wie TGF-β₂ und Aktivin wurden ebenfalls als Moleküle, die in der Lage sind, den Ausstoß von GM-CSF in der Gebärmutter zu erhöhen, identifiziert (4). Diese weiteren Mitglieder der TGF-β-Familie, die mit anderen Trägerproteinen komplexiert sind, wie das 250–300 kDa bindende Protein Betaglycan (25), können für die Aktivität durch höher molekulargewichtige Verbindungen, die in dem Sekret der Bläschendrüse von Mäusen und der Samenflüssigkeit von Menschen vorhanden sind, beitragen (22).
Es wird angenommen, dass die Synthese von TGF-β als latenten Komplex eine stabilisierende Wirkung besitzt (26) und dadurch dessen Aktivität auf den Zielbereich durch Bindung an extrazelluläre Matrix fokussiert (27). Beweise für einen Mechanismus in der Gebärmutter zu Aktivierung von latenten TGF-β wurde durch die vorliegenden Befunde gezeigt, nämlich das im Gegensatz zu der Aktivität in den Bläschendrüsen die Mehrheit an TGF-ß₁, dass in der Luminalflüssigkeit der Gebärmutter nach Empfängnis gefunden werden kann, in der aktiven Form vorliegt (5). Plasmin oder andere protolytische Enzyme, die von Gebärmutterzellen oder aus den männlichen Nebenhoden stammen (28, 29, 47), können zu der Aktivierung des TGF-β nach Ejakulation beitragen.
Der Vorschlag, dass die Komponenten des Ejakulats indirekt zu dem Erfolg der Schwangerschaft beitragen, wird durch Experimente mit Nebenhoden defizienten Mäusen gestützt (36, 37) und dem Befund, dass ein geringer Schwangerschaftserfolg und fehlregulierter fetaler und/oder plazentaler Wachstum nach Embryotransfer oder während der ersten Schwangerschaftsphase in verschiedenen Vieharten (38–40) teilweise durch vorheriges Aussetzen gegenüber Sperma (41, 42) verbessert werden kann. Entsprechende Studien in Menschen haben nun dargelegt, dass ein Mangel eines Aussetzens gegenüber Spermien aufgrund begrenzter sexueller Erfahrung, der Verwendung von Barriereverfahren zur Empfängnisverhütung oder bei IVF-Schwangerschaften mit erhöhtem Risiko des Misslingens der Einnistung, spontanen Fehlgeburt und Präeklampsie (43, 45).
Allgemein richtet sich die Erfindung auf die Verwendung von TGF-β oder einer Modifikation davon, das wirksam ist, eine effektive, vorübergehend tolerante Immunreaktion hervorzurufen, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustandes der Unfruchtbarkeit bei einer angehenden menschlichen oder Säugetiermutter, wobei das Medikament angepasst ist, um vor der versuchten Empfängnis verabreicht zu werden, dadurch gekennzeichnet, dass der Zustand der Unfruchtbarkeit ein Mangel an Immuntoleranz gegenüber väterlichen Antigenen beinhaltet und ausgewählt ist aus wiederholten Fehlgeburten, Präeklampsie oder intra-uterinären Wachstumsbeschränkungen (Inter-uterine growth restriction (IUGR).
Bevorzugt wird eine mukosale Oberfläche der angehenden Mutter dem Antigen ausgesetzt und weiter bevorzugt ist die mukosale Oberfläche eine genitale mukosale Oberfläche, es ist aber auch unmöglich, dass ein Aussetzen anderer mukosaler Oberflächen zu einer transienten Toleranz gegenüber väterlichen Antigenen führen kann. Es gibt zwei wesentliche Gründe, dass dies der Fall sein kann. Erstens ist es bekannt, dass Toleranz gegenüber externen Antigenen auf den mukosalen Oberflächen erzielt werden kann, d.h. es ist bekannt, dass Frauen, die Samenflüssigkeit oral ausgesetzt waren, Beweise für verringerte Präeklampsie- Effekte gegenüber MHC Antigenen der männlichen Partner aufzeigen (48). Das Aussetzen kann daher oral, respiratorisch, gastrointestinal oder genital erfolgen.
Das Oberflächenantigen und TGF-β kann z.B. als ein Mund- oder Nasenspray vorliegen, als ein rektales oder vaginales Gel. Solch ein Gel kann z.B. ein Gel sein, wie es als Vaginalgel unter dem Handelsnamen PROSTIN vertrieben wird (Upjohn Pty Ltd.). Alternativ kann es wünschenswert sein, TGF-β und das Oberflächenantigen in einer Form aufzunehmen, dass ein Aussetzen im Dünn- und Dickdarm erfolgt; sie können z.B. in Gelatinekapseln enthalten sein.
Während ein mukosales Aussetzen bevorzugt sein kann, da es wahrscheinlich zu einer transienten Toleranz der Immunreaktion führt, kann es angebracht sein, einen anderen Weg des Aussetzens bereitzustellen. Das Oberflächenantigen und TGF-β können z.B. für einen systemischen Kontakt injiziert werden.
Es kann wünschenswert sein, TGF-β und das Antigen zusammen zuzuführen, z.B. wo diese beiden in einem Gel oder Spray kombiniert sind, alternativ kann es wünschenswert sein, eine Quelle für TGF-β an der relevanten mukosalen Oberfläche bereitzustellen, bei dem es sich um den Genitalbereich handeln kann und das Antigen anschließend auf der mukosalen Oberfläche aufgebracht wird. Es ist weiterhin noch unklar, ob das TGF-β gleichzeitig mit dem Antigen vorhanden sein muss, obwohl angenommen wird, dass es bevorzugt ist. Es wird vorgeschlagen, dass es möglich ist, eine Verschiebung zwischen dem Zuführen von TGF-β und dem Oberflächenantigen zu haben. D.h. eine Alternative würde das Aufbringen des Antigens z.B. als ein Ejakulat zuerst und anschließend das Zuführen des TGF-β als ein Pessar nach dem Geschlechtsverkehr.
Die Art der relevanten Oberflächenantigene ist nicht vollständig klar, sollten aber jene sein, die besonders antigen wirken und entweder auf dem Sperma oder auf dem Conceptus prominent vorliegen. Die wahrscheinlichsten Kandidaten sind MHC-Antigene und bevorzugt MHC Klasse I. Die wirksamste Weise diese Antigen zu präsentieren ist in der Form, dass sie natürlich auf einer geeigneten Zelle des vorgesehenen männlichen Elternteils vorhanden, dass diese exprimiert sind, und solche Zellen schließen Spermazellen ein und können Leukozyten einschließen. Die Antigene können auch in biologischen Flüssigkeiten, wie Samenflüssigkeit vorhanden sein, diese ist bekannt dafür, dass es bestimmte männliche Antigene enthält (49). Die Verwendung von anderen als Spermazellen sind einschlägig, wo die Zahl an Spermien des zukünftigen Vaters zu gering ist. Die Verwendung dieser anderen als Spermazellen können bevorzugt sein, wenn ein nicht genitaler Weg genutzt wird. Alternativ können die Antigene in gereinigter oder halbaufgereinigter Form vorliegen, diese können auf inerten oder adjuvanzen Trägern präsentiert werden, d.h. sie können z.B. in als ISCOMS bekannte Träger präsentiert werden. Dieser letztere Ansatz ist aber wahrscheinlich technisch umfangreicher und teurer. Es ist weiterhin möglich, dass diese Antigene in Form von mRNA (oder anderer Nukleinsäure) in der Spermazelle kodiert sind und dass diese mRNA dann durch Zellen des weiblichen Genitaltrakts exprimiert werden. Es mag sein, dass TGF-β hierbei eine Rolle spielt, um diese Ereignisse, die zur Präsentation von väterlichen Antigenen gegenüber mütterlichen Lymphocyten durch Aktivieren der Antigen-präsentierenden Zellen im Genitaltrakt Spermien mRNA aufzunehmen und zu translatieren, zu fördern.
Das Niveau an TGF-β kann variiert werden und variiert in Abhängigkeit der zu behandelnden Art. Bei Menschen ist das Niveau an TGF-β bevorzugt größer als 50 ng/ml mit einer Gesamtdosis von 150 ng und bevorzugter mit einer Konzentration von zwischen 100 und 400 ng/ml mit einer Gesamtdosis von zwischen 100 bis 2000 ng. Das TGF-β-Niveau im normalen männlichen Samen ist im Bereich von 200 ng/ml. Dieses Niveau kann empirisch bestimmt werden und es wird angenommen, dass für Pferde oder Vieh der bevorzugte Bereich bei 100 ng/ml liegt. Diese Niveaus können variieren, wenn das TGF-β in einer Form eines langsam freisetzenden Depots bereitgestellt wird, z.B. als Patch oder als Gel oder als latenter TGF-β-Komplex.
Das Maß des Aussetzens gegenüber Oberflächenantigenen kann variieren; in einer bevorzugten Form findet ein Aussetzen gegenüber dem Genitaltrakt der zukünftigen Mutter in Form des Ejakulats des zukünftigen Vaters statt und dass das Niveau des Aussetzens wird durch Zellzahl und Antigendichte auf der Oberfläche dieser Zellen bestimmt. Wenn andere Zellen als die oben genannten verabreicht werden, kann eine ähnliche Zahl von Zellen verwendet werden, die wirksamste Weise kann empirisch bestimmt werden. Es wird angenommen, dass ein Aussetzen gegenüber Leukozyten in einer Menge von 10⁷ bis 10⁹-Zellen ein geeignetes Niveau eines Aussetzens gegenüber einer mukosalen Oberfläche ist.
Die Spezifität des TGF-β, das mit den männlichen Antigenen co-verabreicht wird, ist zurzeit nicht vollständig klar und da angenommen wird, dass TGF-β1 verantwortlich ist, während TGF-β2,3 weniger wichtig sind, ist es wahrscheinlicher, dass TGF-β1 verwendet wird. Es ist aber klar, dass verschiedene Modifikationen des TGF-β1 oder TGF-β2 oder TGF-β3 möglich sind, die effektiv sind, eine wirksame transiente Toleranz bei der Immunreaktion hervorzurufen, entweder getrennt oder in Kombination mit einem anderen Mittel. Solche modifizierten TGFβs können Substitutions- Deletions-, oder Additionsmutanten einschließen und können Peptidfragmente einschließen, die gegebenenfalls in ein anderes Protein eingebracht werden können, um ein rekombinantes Protein herzustellen. Alternativ können andere Mitglieder der TGF-β-Superfamilie verwendet werden oder als Ausgangspunkt für die Entwicklung eines Analogs mit TGF-β-Aktivität verwendet werden, ein solches Mitglied ist als Activin bekannt.
Wenn nicht-modifiziertes TGF-β verwendet wird, wird es bevorzugt als TGF-β1 verabreicht. Das TGF-β1 kann in seiner aktiven Form verabreicht werden; wenn aber die angehende Mutter in der Lage ist, TGF-β zu aktivieren, kann es in seiner Vorläuferform verabreicht werden. Eine Alternative „Zufuhr"-Option ist natürliches TGF-β, z.B. in Form von Plättchen. D.h. anstelle von aufgereinigtem TGF-β kann eine Preparation von Plättchen oder eine andere Quelle, die reich an natürlichem TGF-β ist, wie Milch oder Kolostrum verwendet werden.
Das Aussetzen ist bevorzugt ein mehrfaches Aussetzen. Das mehrfache Aussetzen wird bevorzugt über einen Zeitraum von mindestens drei Monaten durchgeführt, wobei die mukosale Oberfläche während jedem Aussetzen gegenüber den Antigenen des zukünftigen Vaters TGF-β ausgesetzt wird. Dieser Zeitraum kann allerdings in gewisser Weise reduziert werden, und es kann möglich sein, eine Verbesserung mit einem Aussetzen zu erzielen. Als Minimum wird aber angenommen, dass ein Aussetzen mindestens eine Woche vor Empfängnis versucht werden soll. Es ist weiterhin bevorzugt, dass nicht versperrende Verhütungsmittel vor der geplanten Empfängnis verwendet werden, wobei die Antigene mit den Spermazellen assoziiert sind und diese in den genitalen Trakt verabreicht werden, so dass eine gewisse Sicherheit eines Zeitraums des Aussetzens gegenüber den Antigenen des vorgesehenen Vaters vor Empfängnis vorliegt. Dies ist insbesondere der Fall, wenn der Zustand der Zeugungsfähigkeit von der Art ist, bei dem die Empfängnis stattfindet, aber entweder eine Fehlgeburt, spontaner Abort oder Präeklampsie nach Empfängnis auftritt.
Es ist vorgesehen, dass die Verabreichung von TGF-β in Anwesenheit oder Abwesenheit mindestens eines Oberflächenantigens über einen Zeitraum über die Empfängnis hinaus durchgeführt werden muss, z.B. für die ersten zwölf Wochen der Schwangerschaft.
Es ist klar, dass diese Erfindung nicht auf Menschen begrenzt ist, sondern auch auf die Behandlung von anderen Säugetieren einschließlich Vieharten ausgedehnt werden kann.
Einige spezielle Erkrankungen oder Verfahren werden im Folgenden unter Berücksichtigung der Vorteile der vorliegenden Erfindung in einem gewissen Umfang diskutiert.
Wiederholte Fehlgeburt
Es ist bekannt, dass circa 2 bis 5 % der Ehepaare aufgrund wiederholter Fehlgeburten unfreiwillig kinderlos sind. Die Etiologie der wiederholten Fehlgeburt ist komplex aber in den meisten Fällen können keine chromosomalen, hormonellen oder anatomischen Defekte gefunden werden und eine immunologische Läsion wird impliziert. Eine Vielzahl von Therapien, die versuchen, die Immunantwort der Mutter zu dem semi-allogenen Conceptus zu modifizieren, wurden mit unterschiedlichem Erfolg untersucht. Der vorherrschende therapeutische Ansatz in den letzten 20 Jahren war den Frauen väterliche Leukozyten zu injizieren mit der Hoffnung, eine Toleranz gegenüber väterlichen Antigenen zu erreichen. Diese Therapie hatte begrenzten Erfolg. Die Metaanalyse von 15 Untersuchungen führte zum Ergebnis, dass väterliche Leukozytenimmunisierung die Schwangerschaftsrate um 8 bis 10 % erhöhen kann (51).
Coulam & Stern (52) haben Samenflüssigkeit von einer gepoolten Spenderquelle in den Genitaltrakt von Frauen mit wiederholten Fehlgeburten verabreicht und waren in der Lage eine statistisch nicht signifikante Erhöhung der Lebendgeburtsrate zu erzielen (60 % gegenüber 48 %, p = 0.29 n = 86). Diese Behandlung unterscheidet sich deutlich von den bevorzugten Behandlungsformen dahingehend, dass die Samenflüssigkeit in Abwesenheit von väterlichen Antigenen verabreicht wurde. Es ist nicht überraschend, dass der Erfolg dieser Therapie begrenzt war, da kein väterliches Antigen verabreicht wurde.
Die Daten, die die vorliegende Erfindung unterstützen, stellen bestärkende Ergebnisse bereit, die darlegen, dass TGF-β eine vorteilhafte Behandlung bei wiederholter Fehlgeburt aufgrund seiner potenten immunmodulierenden Fähigkeit darstellt. Es wird angenommen, dass die Verabreichung von Sperma in Kombination mit TGF-β hilft, eine Toleranz oder „unterstützende (nurturing)" Immunantwort gegenüber dem zukünftigen Conceptus, dass einige der gleichen MHC-Klasse I oder andere Antigene teilt, bereitzustellen.
Präeklampsie und IUGR-Prophylaxe. Präeklampsie und einige Formen der interuterinären Wachstumsbeschränkung (IUGR) werden als immunologische Fehlfunktionen angenommen aufgrund einer „oberflächigen (shallow)" Plazentabildung begründet in einem schädigenden Th1-artigen Immunangriff auf die invasiven Trophoblasten. Es gibt epidemiologische Beweise, die zeigen, dass wiederholtes Aussetzen einer Frau gegenüber den Antigenen des Partners durch Geschlechtsverkehr in Abwesenheit von Verhütungsmitteln, die eine Barriere aufbauen, die Chancen einer Präeklampsieentwicklung in einer anschließenden Schwangerschaft mit diesem Partner verringern (54, 55). Dies kann in der Ausbildung von mütterlicher „Toleranz" gegenüber den väterlichen Antigenen als eine Konsequenz des wiederholten Aussetzens bei Geschlechtsverkehr begründet sein, dies erleichtert das Wachstum der Plazenta und die Invasion der mütterlichen Dezidua. Einige Frauen haben die Neigung, jedes Mal wenn sie schwanger werden, Präeklampsie auszubilden oder an Einschränkungen des fötalen Wachstums zu leiden. Dies mag an einem unzureichenden TGF-β-Gehalt im Sperma des Partners begründet sein oder der Unfähigkeit latentes TGF-β in die biologisch aktive Form zu verarbeiten.
Ein anfängliches Aussetzen gegenüber den Antigenen des Partners in Kombination mit dem TGF-β vor Empfängnis und eventuell bis drei Monate der Schwangerschaft, bis zu diesem Zeitraum ist das plazentale Einwachsen vollständig, kann helfen, die Entwicklung von Präeklampsie und IUGR in diesen Risiko-Frauen zu verhindern.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 Sepharyl S-400 Größenausschlusschromatographie von (A) GM-CSF stimulierender Aktivität und (B) TGF-Immunaktivität im Sekret der Bläschendrüse der Maus. In A, Epithelzellen der Gebärmutter von Östrus-Mäusen wurden für 16 Stunden mit unbehandelten (o = aktives TGF-β) oder säureaktivierten (• = aktives und latentes TGF-β) Fraktionen vom Sekret der Bläschendrüsen inkubiert. Nach einer weiteren 24 stündigen Kultur wurde der GM-CSF-Gehalt in den Überständen mit einem FD 5/12 Bioassay bestimmt. Die Werte sind als Durchschnitt von Dreifachkulturen angegeben und die horizontale gestrichelte Linie ist GM-FSC-Produktion von Epithelzellen kultiviert mit DMEM-FCS alleine. In B wurde der Gehalt an immunaktivem TGF-β1 (•) in Fraktionen des Sekrets von Bläschendrüsen mittels ELISA bestimmt. TGF-β-Bioaktivität wurde bestimmt mit einem Mv-1-Lu-Zellbioassay. Die im schraffierten Bereich dargestellten Fraktionen enthalten mehr als 300 pg/ml und die anderen Fraktionen enthalten < 50 pg/ml. Die Daten sind repräsentativ für ähnliche Ergebnisse erhalten aus drei wiederholtenden Experimenten.
2 Die Wirkung der neutralisierenden Antikörper spezifisch für TGF-β_1,2,3 und TGF-β₁ auf die GM-CSF-stimulierende Wirkung im Sekret der Bläschendrüse der Maus. Epithelzellen aus der Gebärmutter von Östrus-Mäusen wurden für 16 Stunden mit 2 % rohem Sekret der Bläschendrüsen oder DMEM-FCS alleine inkubiert in Anwesenheit oder Abwesenheit von Maus-Anti-Rind TGF-β_1,2,3 (20 μg/ml) oder Huhn-Anti-Rind TGF-β₁ (10 μg/ml). Nach weiterer 24-stündiger Kultur wurde der GM-CSF-Gehalt in Überständen mit einem FD 5/12-Bioassay bestimmt. Die Werte sind Durchschnittswerte ± Standardabweichung von Dreifachkulturen. Die Daten sind repräsentativ für ähnliche Ergebnisse erhalten von drei wiederholenden Experimenten.
3 Die Wirkung von TGF-β₁ auf die GM-CSF-Produktion von Epithelzellen der Gebärmutter in vitro. Epithelzellen der Gebärmutter von Östrus-Mäusen wurden für 16 Stunden mit 0,08 bis 80 ng/ml rekombinantem humanen TGF-β₁ inkubiert. Nach weiterer 24 stündiger Kultur wurde der GM-CSF-Gehalt der Überstände mittels FD 5/12 Bioassay bestimmt. Der Durchschnitt ± Standardabweichung der Dreifachansatzkulturen ist dargestellt. Die Daten sind repräsentativ für ähnliche Ergebnisse erhalten in drei Wiederholungsexperimenten.
4 Die Wirkung von TGF-β₂, Activin und Inhibin auf die GM-CSF-Produktion von Epithelzellen der Gebärmutter in vitro. Epithelzellen der Gebärmutter von Östrus-Mäusen wurden für 16 Stunden mit 0,05 bis 50 ng/ml rekombinantem humanen TGF-β₁, TGF-β₂ vom Schwein oder humanen rekombinantem Activin und Inhibin inkubiert. Nach weiterer 24 stündiger Kultur wurde der GM-CSF-Gehalt der Überstände mittels FD 5/12 Bioassay bestimmt. Der Durchschnitt ± Standardabweichung der Dreifachansätze ist gezeigt. Die Daten sind repräsentativ für ähnliche Ergebnisse erhalten von zwei Wiederholungsexperimenten.
5 Die Wirkung der Spermazusammensetzung auf den TGF-β₁-Gehalt in der Lumenflüssigkeit der Gebärmutter nach Empfängnis. TGF-β₁-Immunaktivität wurde mittels ELISA in unbehandelten (o = aktives TGF-β) oder säurebehandelten (• = aktives und latentes TGF-β) Lumenflüssigkeiten der Gebärmutter von Östrus-Mäusen oder von Mäusen, eine Stunde nach Paarung von gesunden, vasektomierten (vas) oder Bläschendrüsen defizienten (SV-) Männchen, bestimmt. Die Symbole stellen Daten für die einzelnen Mäuse dar, die Durchschnittswerte für die Behandlungsgruppen sind dargestellt. Die Daten wurden mit Kruskal-Wallis Ein-Weg-ANOVA und Mann Whitney Rangsummentest verglichen. Die Daten selbst wurden auf der X-Achse mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben gekennzeichnet, um die statistische Signifikanz zwischen den Behandlungsgruppen anzuzeigen (p < 0.01)
6 Die Wirkung von intra uterinärem TGF-β₁ auf dem GM-CSF-Gehalt der Lumenflüssigkeit der Gebärmutter. Die Flüssigkeiten wurden 16 Stunden nach natürlicher Paarung mit gesunden Männchen oder nach Verabreichung von 0,4 bis 40 ng rekombinantem humanem TGF-β₁ in 50 μl PBS/1 % BSA, oder nur dem Vehikel zu der luminalen Gebärmutterhöhle von Östrus-Mäusen, gesammelt. Die Symbole stellen die Daten für die einzelnen Mäuse dar und die Durchschnittswerte für die Behandlungsgruppen sind gescort. Die Daten wurden mit Kruskal-Wallis Ein-Weg-ANOVA und Mann Whitney Rangsummentest verglichen. Die Daten selbst wurden auf der X-Achse mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben gekennzeichnet, um die statistische Signifikanz zwischen den Behandlungsgruppen anzuzeigen (p < 0.01)
7 Die Wirkung von rTGF-β₁ und Sperma auf den GM-CSF-Ausstoß von humanen Epithelzellen aus dem Reproduktionstrakt. Der GM-CSF-Gehalt der Kulturüberstände gesammelt von (A) cervikalen Keratinozyten und (B) Endometriumzellkulturen wurden mittels kommerziellem ELISA 12 Stunden nach Zugabe von verdünntem Gesamtsamen (10 % vol/vol) oder 10 ng/ml rTGF-β₁ bestimmt.
8 Die Wirkung von intra uterinärem Priming mit Spermien und TGF-β auf die Induktion einer Th1-artigen Immunität. Weibliche Balb/c F1 Mäuse wurden durch intra uterinäre Infusion mit CBA-Sperma in Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 ng rTGF-β₁ immunisiert. Weitere Gruppen von uterin-ligierten Mäusen wurden mit gesunden CBA-Männchen gepaart oder ihnen wurde sub-kutane Immunisierungen mit Sperma in kompletten Freunds-Adjuvants verabreicht. 10 Tage wurden die Mäuse auf eine DTH-Antwort gegenüber Sperma Antigene oder auf den Serumgehalt an IgG₁₃₂-Immunglobulinen untersucht. Die Werte wurden mit Hilfe des Kruskal Wallis Ein-Weg-ANOVA und den Mann Whitney Rangsummentest verglichen mit verschiedenen Kleinbuchstaben, die signifikante Unterschiede anzeigen (p < 0,05).
9 Wirkung einer vorherigen Immunisierung mit Sperma und TGF-β auf das fetale und plazentale Gewicht während der anschließenden Schwangerschaft bei Mäusen. Weibliche Balb/cF1 Mäuse wurden mit intra uterinärer Infusion mit CBA-Sperma in Anwesenheit (± r TGF-β₁) immunisiert und wurden anschließend natürlich mit CBA-Mäusen zwei Wochen später gepaart. Die Weibchen wurden am Tag 17 der Schwangerschaft getötet und das fetale (A) und das Plazentagewicht (B) wurden bestimmt. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden in Bezug auf Zahl der lebenden Fetus-Plazenta-Einheiten pro Gebärmutter bestimmt mit Hilfe des Kruskal Wallis Ein-Weg-ANOVA, gefolgt von Mann Whitney Rangsummentest (p < 0,05).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Material und Methoden
Zelllinien, Medien, Zytokine und Antikörper
RPMI-1640 und Dulbeccos modified Eagle-Medium (DMEM, GIBCO) mit wenig Glukose wurden mit 10⁶ fötalem Kälberserum (CSL), 20 mM HEPES pH 7,2, 5 × 10^–5 M β-mercaptoethanol, 2 mL L-Glutamin und Antibiotika versetzt (RPMI-FCS und DMEM-FCS). FD 5/12-Zellen (14), 3T3 Fibroblasten und JR-5-Balb/c-Fibrosarkomazellen wurden in RPMI-FCS kultiviert und die Mink-Lungenzellen (Mv-1-Lu, CCL-64) und die Epithelialzellen der Gebärmutter wurden in DMEM-FCS kultiviert. Humane ektocervikale Zellen wurden in 70 % DMEM, 20 Hams F-12 (Gibco), 9 % FCS, 1 % Neutridoma-SP (Boehringer Mannheim), und 0,4 μg/ml Hydrokortison (Upjohn, Rydalmere, NSW) (ECM-FCS) und die humanen endometrialen Zellen wurden in DMEM-FCS kultiviert.
Rekombinantes humanes (rh) TGF-β1 stammt von R & D Systems, rekombinantes murines GM-CSF wurde von N. Nicola, The Walter and Eliza Hall Institute for Cancer Research zur Verfügung gestellt und rekombinantes humanes Activin und Inhibin wurden von J. Findlay, Prince Henry's Institut for Medical Research zur Verfügung gestellt. Die monoklonalen Antikörper (mAb), die zur Immhistochemie verwendet wurden, waren anti-CD45 (TIB 122), anti-Mac-1 (CD11b, TIB 128) und anti-MHC-Klasse II (Ia Antigen, TIB 120, alle von ATCC), F4/80 (15) und RB6-6C5 (16). Maus-anti-Rind-TGF-β_1,2,3 mAb (der alle drei Säugetier TGF-β-Isoformen neutralisiert) stammte von Genzyme (Cambridge, MA) und Huhn-anti-Rind-TGF-β₁ monoklonale Antikörper (neutralisiertes TGF-β₁, < 2 % Kreuzreaktivität mit TGF-β₂ und TGF-β₃) stammte von R & D Systems.
Mäuse und chirurgische Verfahren. Erwachsene weibliche Mäuse (8 bis 12 Wochen) von [Balb/c X C57B1]F1, Balb/c oder Balb/k-Stämmen und erwachsene männliche Mäuse von [CBA X C57B1]F1, CBA oder Balb/c-Stämmen wurden von der Universität of Adelaide, Zentrales Tierhaus, erhalten und gehalten in einer Einrichtung mit minimalen Sicherheitsbestimmungen in einem 12 Stunden Licht/12 Stunden Dunkelheit-Zyklus mit Wasser und Nahrung ad libitum. Die Weibchen wurden unter Anwendung des Whitten-Effekts (17) in ihrem Zyklus synchronisiert und der Zyklus-Zustand wurde durch Analyse von Abstrichen aus der Vagina bestimmt. Zur natürlichen Paarung wurden die Weibchen (2 pro Käfig) mit einzelnen Männchen zusammengebracht und der Tag, an dem der vaginale Tropfen sichtbar wurde, wurde als Tag 1 der Schwangerschaft bestimmt. Die Männchen, die zur Sammlung der Nebendrüsensekrete verwendet wurden, wurden alle auf Fruchtbarkeit bestimmt und wurden eine Woche vor Verwendung ruhig gestellt.
Für die intra-uterinären Injektionen wurden die Gebärmutterhörner von Estrus-Weibchen nach außen verlagert durch einen dorsale Mittellinienschnitt und mit 0,2 bis 40 ng rhTGF-β₁ in 50 ml RPMI/0,1 BSA oder dem Vehikel alleine injiziert, bevor die Mäuse 16 Stunden später getötet wurden, um den luminalen Zytokin-Gehalt zu bestimmen oder Gebärmuttergewebe für die Immunhistochemie zu sammeln. Eine nicht-chirurgische Verabreichung von Sperma/TGF-β₁ zu dem Gebärmutterlumen wurde erreicht durch Einbringen eines 3 French Gauge Tom Cat^Tm-Katheters (Sherwood Medical, St. Louis, MO) in das Gebärmutterlumen (proximal zu dem Verzweigungspunkt) der zurückgehaltenen Weibchen, nach Visualisierung des Cervix mit Hilfe eines Auriscopes (Heine, Germany) und manueller Dilation des Cervix mit einem feinen Draht. Jeder Gebärmutterkatheter wurde mit 50 μl Sperma/TGF-β₁ beladen, dieses wurde in die Gebärmutterhöhle mit Hilfe einer Mundpipette verbracht.
Vasectomierte Mäuse wurden durch bilaterale Ligation des Samenleiters durch einen transversen Einschnitt in den Unterleib erhalten (Hogan et al., 1986) und bläschendrüsenvectomierte Mäuse wurden durch Entfernen der Bläschendrüse über einen transversalen Schnitt in den Unterleib hergestellt, gefolgt von einem Verbinden und Trennen des proximalen Leiters an der Basis der Drüse. Das Gewebe und die Haut wurden genäht, und die Maus konnte sich für mindestens 2 Wochen vor der Paarung erholen.
Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter Narkose unter Verwendung von Avertin (1 mg/l Tribromoethylalkohol in tertiärem Amylalkohol (Sigma) verdünnt auf 2,5 % v/v in Kochsalzlösung; 15 μl/g Körpergewicht injiziert i.p.) durchgeführt.
Sammeln der Flüssigkeiten aus dem Fortpflanzungstrakt. Sekretion aus den Bläschendrüsen wurden aus den intakten Drüsen extrudiert und in 6 M Guanidin HCl (1:4 v/v) solubilisiert, anschließend in DMEM mit Hilfe einer 5 ml Sephadex G-25-Entsalzungssäule (Pharmacia) entsalzt vor Verwendung in den Epithelialzellkulturen. Prostata- und Nebendrüsensekretionen wurden durch Homogenisieren der intakten Drüsen in 0,5 ml PBS/1 % BSA extrahiert, gefolgt von einer Sedimentation des Debris bei 5000 g. Luminale Flüssigkeit der Gebärmutter wurde 16 Stunden nach Paarung oder Instillation von rhTGF-β₁ in den Uterus durch Spülen jedes Horns mit 500 μl RPMI-FCS gesammelt. Debris wurde bei 2000 g sedimentiert und der Überstand bei –80 °C gelagert, bevor der Zytokin-Assay durchgeführt wurde. In den Experimenten, wo TGF-β₁ der Gebärmutter gemessen wurden, wurde ein Spülen des rechten Horns mit 6 M Guanidin HCl/0,1 % BSA durchgeführt, und dieses wurde vor dem Zytokin-Assay in PBS/0,1 % BSA entsalzt. Für die Paare mit gesunden und Bläschendrüsen defizienten Männern wurde das linke Horn mit DMEM gespült, um sicherzustellen, dass eine adäquate Besamung stattgefunden hat (> 1 × 10⁶ Spermien/ml).
Chromotographie. Ca. 1 ml Sekret der Bläschendrüsen und 6 M Guanidin HCl wurden auf eine Sepharyl S-400-Säule (40 cm × 16 mm, Pharmacia), die mit 6 M Guanidin HCl/0,05 M Hepes pH 7,4 equilibriert war, aufgebracht. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt, in DMEM entsalzt und auf GM-CSF-stimulierende Aktivität untersucht. Bevor diese zu der Gebärmutterkultur oder zu dem TGF-β-Assay gegeben wurden, wurde die Hälfte der Fraktion mit Säure behandelt, wie vorbeschrieben in (18).
Epithelzellkulturen der Gebärmutter aus der Maus. Epithelzellen der Gebärmutter wurden, wie beschrieben, hergestellt (19) und in 1 ml Kulturwells (Nunc) mit 1–2 × 10⁵ Zellen/ml in 500 μl DMEM-FCS ausplattiert. Nach 4-stündiger Inkubation bei 37 °C in 5 % CO₂, damit die Zellen anhaften können, wurden weitere 500 μl entsalztes Sekret der Bläschendrüsen DMEM-FCS, Zytokine in DMEM-FCS oder DMEM-FCS alleine hinzugefügt. Kulturüberstände wurden gesammelt und durch frisches Medium nach 16 Stunden ersetzt, dann wieder nach 24 Stunden gesammelt. Zu diesem Zeitpunkt wurden auch die adherenten Zellen quantifiziert, wie vorbeschrieben (19). Alle Behandlungen wurden im zweifachen oder dreifachen Ansatz durchgeführt.
Humane Endometriumkulturen. Humane Endometrialzellkulturen wurden unter sterilen Bedingungen unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens, wie in Bentin-Ley beschrieben (64), durchgeführt. In kurz, Stromazellen wurden in eine Kollagenmatrix eingebettet, abgedeckt durch eine dünne Schicht von Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). Diese wurde wiederum von einer Schicht mit Epithelzellen der Gebärmutter überschichtet. Überstände der Epithelzellen der Gebärmutter wurden 12 Stunden (basal) gesammelt, mit 400 μl Medium enthaltend entweder rTGF-β₁, Sperma oder frischem Kulturmedium ersetzt, und der Überstand wurde 12 Stunden später gesammelt. Der GM-CSF-Gehalt des 24-stündigen Überstandes wurden auf den GM-CSF-Gehalt der entsprechenden 12 Stunden (basal) Überstände normalisiert.
Humane cervikale Keratinozyten. Humane cervikale Keratinozyten wurden unter Verwendung einer modifizierten Technik, wie sie von Rheinwald und Green (65) beschrieben werden, kultiviert. Cervikale Biopsien wurden von Frauen, die einer Hysterektomie aufgrund von nicht-malignen gynäkologischen Indikationen unterworfen wurden und die zugestimmt haben, erhalten. Alle Frauen waren premenopausal, es wurde aber keine Unterscheidung gemacht in Bezug auf den Status des Menstruationszyklus zum Zeitpunkt der Operation. Die cervikalen Biopsien wurden in eiskaltem HBSS für den Transport in das Labor gelagert, zweimal mit Antibiotika haltigem Medium gewaschen und über Nacht bei 4 °C in DMEM enthaltend 5 U-Dispase (Boehringer Mannheim) inkubiert. Große Schichten von Keratinozyten wurden mechanisch von der Biopsie unter Verwendung von sterilen Pinzetten nach einer anschließenden einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur abgezogen. Die Disintegration in einzelne Zellen wurde gefördert durch Inkubation in DMEM/0,25 % Trypsin/0,05 % Kollagenase für 30 Minuten bei 37 °C und wiederholtes Aufziehen einer Nadel und Spritze. Die Keratinozyten wurden in ECM-FCS kultiviert mit einer Dichte von 1–2 × 10⁵-Zellen/ml über einschichtige Schichten von murinen 3T3-Fibroblasten, die mitogen-inaktiv durch Aussetzen gegenüber 4 Mitomycin C (Sigma) gemacht wurden. Die Keratinozyten wurden für 5 bis 7 Tage inkubiert, um ein Anheften und Ersetzen der 3T3-Fibroblasten zu erlauben, dann wurde das Medium mit frischem ECM-FCS ersetzt. Die Überstände wurden 12 Stunden später (basal) gesammelt und mit 500 μl ECM-FCS enthaltend 10 ng rTGF-β1, 10 % Sperma oder alleine Kulturmedium (Kontrolle) ersetzt. Diese wurden wieder 12 Stunden später gesammelt. Der GM-CSF-Gehalt des 24-stündigen Überstandes wurde auf den GM-CSF-Gehalt der entsprechenden 12 Stunden (basal) Überstand normalisiert.
Zytokine und Zytokin Assays. GM-CSF wurde unter Verwendung der GM-CSF-abhängigen Zelllinie FD5/12 untersucht, im Wesentlichen beschrieben in (19). Die Zellproliferation wurde durch Zugabe von Alamar Blue (Alamar Biosciences) für die letzten 24 Stunden des Assays oder durch Pulsen mit 1 μCi [³H]-Thymidin pro Well für die letzten 6 Stunden des Assays bestimmt. Die minimal nachweisbare Menge an GM-CSF war 1 U/ml (50 U/ml definiert als Menge, die eine halb-maximale Proliferation der FD 5/12 erlaubt). TGF-β-Bioaktivität wurde gemessen mit Hilfe der Mv-1-Lu-Zellen, wie vorbeschrieben (71), mit Ausnahme, dass die Zellzahlen durch Zugabe von Alamar Blue für die letzten 24 Stunden des Assays quantifiziert wurden. Die minimal nachweisbare Menge an TGF-β in diesem Assay war 15 pg/ml. Zytokin-Bioassays wurden gegen rekombinante Zytokine standardisiert, und die Spezifität des Assays wurde bestätigt durch Verwendung von Zytokin-spezifischen neutralisierenden Antikörpern. TGF-β1-Immunreaktivität wurde in einem spezifischen ELISA (R & D Systems) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
Immunhistochemie. Das Gebärmuttergewebe wurde in OCT-Tissue Tek (Miles Scientific) eingebettet und in durch flüssiges N₂ gekühltes Isopropanol gefroren und anschließend bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. 6 μm halb-serielle Schnitte wurden von den Gebärmuttern erhalten um 14:00 Uhr am Tag des Estrus oder am Tag 1 der Schwangerschaft oder von Mäusen, denen rhTGF-β injiziert wurde, angefertigt, diese Schnitte wurden in 96 % Ethanol fixiert (4 °C/10 min). Zum Färben mit den monoklonalen Antikörpern wurden die Schnitte mit den monoklonalen Antikörpern (reiner Hybridomüberstand, enthaltend 10 % normales Mausserum [NMS]) und Ziege-Anti-Ratte-Meerrettich-Peroxidase (HRP; Dako, 1:20 in PBS enthaltend 10 % NMS) wie vorbeschrieben (19) inkubiert. Um HRP oder endogene Peroxidase (zum Nachweis von Eosinophilen) nachzuweisen, wurden Schnitte in Diaminobenzidin (Sigma) (5 mg/ml in 0,05 M Tris-HCl pH 7,2) plus 0,02 Wasserstoffperoxid für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Gegenfärbung mit Haematoxylin wurden die Schnitte mit Hilfe eines Videobildanalysepakets (Video Pro, Faulding Imaging, Adelaide) analysiert, dabei wurde die Fläche an positiver Färbung in dem Endometrialstroma als Prozent der Gesamtzellfärbung ausgedrückt.
Anti-Spermien-Antikörper ELISA: Eine Fest-Phasen-ELISA-Technik, die ausgehend vom Protokoll von Okada (66) modifiziert wurde, wurde zur Quantifizierung des Serumgehalts an Spermien spezifischen Immunoglobulinen mit Unterscheidung des Isotyps verwendet. Das Antigen wurde hergestellt durch Zerstören von frisch isolierten CBA-Sperma (5 × 10⁶-Spermien/ml in PBS) mit Hilfe eines Branson Sonikators. 50 μl Spermienantigensuspension wurden in Polystyrol 96 Well-Flachboden-ELISA-Platten (Maxisorb^TM, Nunc) gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden mit PBS/3 % BSA für eine Stunde blockiert und bei –20 °C bis zur Verwendung gelagert. Das Serum wurde 1:4 in PBS verdünnt, dann wurden serielle 1:2 Verdünnungen bis zu einer letztlichen Verdünnung von 1:128 gemacht vor einer 2-stündigen Inkubation in den aufgetauten mit Spermien Antigen-beschichteten Platten. Gebundenes Immunoglobulin wurde mit einem Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper (Mouse Typer^TM, BioRad; 1 Stunde) gefolgt von einem biotiniliertem Affen-Anti-Kaninchen-Antikörper (Amersham, UK; 1:2000 in PBS/1 % BSA, 1 Stunde) und Streptavidin-HRP (Amersham; 1:4000 in PBS, 30 min) nachgewiesen. Die HRP wurde durch Zugabe von Tetramethylbenzidin (TMB, Sigma; 20 min) gefolgt von einem Ansäuern des Produkts mit 1 M H₂SO₄ visualisiert. Die Quantifizierung von jedem Immunoglobulin-Isotyp (IgG₁, IgG_2a, IgG_2b) wurde zweifach durchgeführt und alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Antikörper-Titer von jedem Serum wurde durch Auftragen von A₄₅₀ gegenüber der Titration bestimmt.
Spermien-Antigen-verzögerte Hypersensitivität (DTH)-Antwort: Ein Assay mit dem Anschwellen der Fußballen (69) wurde verwendet um die DTH-Antwort gegenüber Spermien-Antigenen zu bestimmen. Balb/c F1-Mäuse wurden bei zwei Gelegenheiten, die einen Monat auseinander waren, durch intra-uterinäre Inokulation mit Spermien-Antigen in Anwesen- oder Abwesenheit von TGF-β geprimt und 10 Tage später wurde die Dicke der Fußballen unter Verwendung eines Mikrometergeräts (0,01 mm Zunahme) (Mitutoyo, Tokyo, Japan) gemessen vor und 24 Stunden nach Injektion in den hinteren Fussballen von 25 μl Spermiensuspension (1 × 10⁸ Spermien/ml in HBSS). Antigen-spezifisches Anschwellen wurde berechnet durch Abziehen der Dicke des kontralateralen Fußballens, in denen HBSS injiziert wurde.
Humane Leukozyten Chemotaxis-Assay: Leukozyten Populationen wurden aus peripherem Blut mit Hilfe des Ficoll-Paque^TM Dichte-Gradienten-Zentrifugation erhalten gemäß dem Verfahren beschrieben von Boyum (68). Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC: Lymphozyten und Monozyten) wurden in HBSS enthaltend 10 % ECM-FCS mit 5 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert. Der Chemotaxis-Assay war eine Modifikation eines Boyden-Kammer-Protokolls beschrieben von Bignold (69). Cervikale Keratinozytenkulturüberstände (verdünnt 1:1 mit HBSS/10 % ECM-FCS), HBSS/10 % ECM-FCS oder N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin (FMLP, Sigma) wurden zu dem unteren Bereich der Kammern gegeben und von den PBMCs mit einer 3 μm Polycarbonat angebracht neben einer 8 μm Polycarbonatfilter mit wenig Poren (Nuclepore) getrennt. Nach einer 45 bis 60 minütigen Inkubation bei 37 °C während dessen PBMCs durch den 8 μm Sparse-Pore-Filter migrieren konnten und auf der Oberfläche des darunter liegenden 3 μm Filter gefangen wurden, wurden die Zellen durch Zugabe von 1 ml 10 % Formalin fixiert und durch manuelles Zählen nach Färbung mit Mayers Haematoxylin quantifiziert. Die durchschnittlichen Zellzahlen (± Standardabweichung) von Dreifachmessungen wurden für jede Testprobe durchgeführt.
Beispiel 1
Sperma TGF-β initiiert die Entzündungsantwort in Mäusen und Menschen nach der Paarung.
Das Zytokin GM-CSF, das nach Kontakt mit Sekret von Bläschendrüsen durch das Epithel in der Gebärmutter hergestellt wird, wird angenommen als entscheidend zur Ausbildung der mütterlichen Toleranz, die im Wesentlichen verantwortlich ist für das Initiieren des Leukozyteneinströmens in den weiblichen Reproduktionstrakt nach Paarung und für die Erhöhung der Antigen-präsentierenden Kapazität dieser Zellen.
Das Sekret der Bläschendrüsen wurde mit Hilfe einer Größenausschlusschromatographie fraktioniert, um die GM-CSF stimulierende Aktivität zu identifizieren. Zwei Fraktionen wurden identifziert; ein hochmolekulargewichtiger proteinöser Anteil (650 kDa) und ein mittlerer molekulargewichtiger mehr heterogener Anteil, der zwischen 150 bis 440 kDA eluiert (10,62). Der letztere Anteil wurde als TGF-β₁ identifiziert aufgrund des Befundes, das dessen GM-CSF stimulierende Aktivität durch Säurebehandlung verstärkt war, dass TGF-β1 Immunaktivität und Bioaktiviät in der gleichen Fraktion co-eluierte und dass anti-TGF-β₁ neutralisierende Antikörper die GM-CSF stimulierende Aktivität dieser Fraktion blockieren kann (1, 2). Das Molekulargewicht der GM-CSF stimulierenden Aktivität in dem Sekret der Bläschendrüsen (150–440 kDA) stimmt mit der latenten Form von TGF-β₁ überein, ein Komplex von 230 bis 290 kDA, der das reife TGF-β-Dimer (25 kDA) umfasst, das nicht kovalent assoziiert ist mit einem 75 bis 80 kDA Latenz-assoziierten Protein und einem 130 bis 190 kDA Bindungsprotein (23).
Der TGF-β₁-Gehalt der murinen Bläschendrüsensekretion, wie der der humanen Samenflüssigkeit (22) wurde als extrem hoch festgestellt, nur für Plättchendestillate wurde er höher beschrieben (23). Weiterhin stellte sich heraus, dass die Bläschendrüsensekretionen mit über 90 % zu dem Gesamt-TGF-β₁-Gehalt im Ejakulat beitragen, während die Prostata und koagulierenden Drüsensekretionen nur geringe Mengen an TGF-β₁ enthalten. Die Zugabe von rTGF-β₁ zu Epithelzellen der Gebärmutter in Kultur und in vivo bestätigten die Zunahme des uterinären Epithel-GM-CSF-Ausstoßes in einer Dosis abhängigen Art (3). Die Verabreichung von rTGF-β₁ zu dem Gebärmutterlumen von Östrus-Mäusen führte nicht nur zu einer Erhöhung der GM-CSF-Produktion in der Gebärmutter, sondern initiierte weiterhin das Einströmen und Aktivieren von Entzündungszellen ähnlich wie nach einem Paaren (Tabelle 1 und 6). Diese Ergebnisse unterstützen weiterhin die Ansicht, dass TGF-β die Entzündungsantwort, induziert in der natürlichen Situation durch die Samenflüssigkeit, vollkommen nachbilden kann.
In vitro Experimente mit humanen, cervikalen Keratinozyten und endometrialem Gewebe zeigte, dass sowohl Sperma als auch rTGF-β₁ eine Erhöhung der GM-CSF-Produktion bei Geweben des Reproduktionstrakts in Frauen hervorrufen können (7). Weiterhin war der Gehalt an Leukozyten chemotaktischer Aktivität im Überständen von Keratinozytenkulturen durch Behandlung entweder mit Sperma oder rTGF-β₁ verstärkt (8), dies stützt weiter eine prinzipielle Rolle für Sperma-TGF-β in der Entzündungskaskade bei Frauen nach der Paarung (63).
Tabelle 1. Die Wirkung von intra-uterinärer Injektionen mit TGF-β1 auf endometriale Leukozyten-Parameter
Die Gewebe wurden 16 Stunden nach natürlicher Paarung mit gesunden Männchen oder nach Verabreichung von 20 ng rhTGF-β₁ in 50 μl PBS/1 % BSA oder nur dem Vehikel zu der luminalen Höhle der Gebärmutter von Östrus-Mäusen gegeben. Die Reaktivität des endometrialen Gewebes gegenüber monoklonalen Antikörpern spezifisch für alle Leukozyten (anti-LCA), Makrophagen (F4/80 und anti-Mac-1), Neutrophile (anti-Mac-1 und RB6-8C5), und aktivierten Makrophagen/dendritischen Zellen (Ia) wurden mit Hilfe der Immunhistochemie und Videobildanalyse bestimmt. Die Eosinophilen wurden durch Färben auf endogene Peroxidaseaktivität (Peroxidase) nachgewiesen. Die Reaktivität der Antikörper ist dargestellt als durchschnittliche (Bereich) Positivität in Prozent. Die Zahl an Mäusen in jeder Experimentiergruppe ist n. Die Daten wurden mittels Kruskal-Wallis Ein-Weg-ANOVA und Mann Whitney Rangsummentest bestimmt. Die Datensätze wurden mit verschiedenen Kleinbuchstaben innerhalb der Spalten gekennzeichnet, um statistische Signifikanz zwischen den Behandlungsgruppen (p < 0,01) zu kennzeichnen.
Beispiel 2
Sekret der Bläschendrüse moduliert die mütterliche Reproduktionsleistung und die mütterliche Immunantwort gegenüber väterlichen Antigenen.
Es wurde früher festgestellt, dass ein Aussetzen gegenüber Sperma bei der Paarung eine intensive aber vorübergehende Entzündungsantwort auslöst und Faktoren in der Samenflüssigkeit aus den Bläschendrüsen in dieser Antwort involviert sind. In Studien in Mäusen haben die Erfinder Sekrete der Bläschendrüsen als eine entscheidende Determinante bei der optimalen Embryoentwicklung und Einnistung identifiziert. Weiterhin wurde gezeigt, dass ein Aussetzen gegenüber Sperma bei der Paarung eine wichtige Rolle bei der Induktion der mütterlichen Toleranz vor der Einnistung spielt und Faktoren in der Samenflüssigkeit wurden identifiziert, die notwendig sind, um diesen Zustand zu induzieren; dies legt eine vorteilhafte Wirkung der Samenflüssigkeit bei dem Ausgang der Schwangerschaft mindestens zum Teil aufgrund der immunabweichenden Wirkungen dieser Flüssigkeit nahe.
Um die Wichtigkeit des Aussetzens gegenüber Sekret aus der Bläschendrüse für den Erfolg der Schwangerschaft zu testen, wurden Balb/c F1 Weibchen mit CBA Männchen, bei denen die Bläschendrüsen chirurgisch entfernt wurden (SV-Männchen), gepaart. Keine Einnistungsbereiche waren in der Gebärmutter am Tag 17 der Schwangerschaft vorhanden (n = 12 Weibchen). Diese totale Unfruchtbarkeit lag nicht an der Befruchtung, sondern war mit einem Mangel bei der Einnistung oder einer frühen Resorption assoziiert. Dies kann eine unzureichende mütterliche Toleranz des semi-allogenen Embryos aufgrund des Fehlens eines Aussetzens von TGF-β aus dem Sperma bei der Paarung reflektieren.
Tabelle 2. Wirkung der Samenflüssigkeit auf die Embryoentwicklung bei Mäusen
Balb/c F1 Mäuse, die natürlich mit gesunden oder Bläschendrüsen defizienten (SV-) CBA Mäusen gepaart wurden, wurden um 16:00 Uhr am 3. Tag getötet, um die Embryoentwicklung zu untersuchen oder am Tag 17, um die Zahl der Einnistungsstellen zu bestimmen.
Um die Wichtigkeit des Spermas, insbesondere des Sekrets der Bläschendrüsen auf die Induktion einer Th1-Immunantwort gegenüber väterlichen MHC-Antigenen zu untersuchen, wurden weibliche Balb/k (H-2^k) Mäuse mit gesunden Balb/k oder verwandten Balb/c (H-2^d) zeugungsfähigen Männchen oder Balb/c SV-Männchen gepaart. Um Pseudoschwangerschaften zu erzielen, wurden die Gebärmuttern von Balb/k Weibchen zwei Wochen vor dem Paaren an der oviduktalen Verbindung ligiert. Die Immunantwort gegenüber MHC Klasse I (H-2^d) Antigen wurde untersucht durch Messen des Wachstums von Tumorzellen, die am vierten Tag der Schwangerschaft oder Pseudoschwangerschaft injiziert wurden. Die Tumorzellen wurden in den meisten Balb/k-Weibchen, die mit Balb/k Männchen gepaart wurden, abgestoßen, wuchsen aber in schwangeren oder pseudoschwangeren Balb/k Weibchen, die mit Balb/c Männchen gepaart wurden. Im Gegensatz dazu wuchs normalerweise kein Tumor in Balb/k Mäusen, die mit SV-Balb/c Mäusen gepaart wurden. Diese Daten zeigen, dass ein Aussetzen gegenüber Sperma ausreichend ist, um spezifische Toleranz gegenüber väterlichen MHC Klasse I Antigenen zu induzieren, selbst in Abwesenheit einer sich anschließenden Schwangerschaft und zeigt, dass die Toleranz abhängig ist von Faktoren, die von den Bläschendrüsen stammen (Tabelle 3).
Tabelle 3. Wirkung der Schwangerschaft und Pseudoschwangerschaft auf das Abstoßen von Balb/c JR-5 Fibrosarkomazellen in Balb/k Mäusen
Weibliche Balb/c (H-2d) oder Balb/k (H-2k) Mäuse wurden mit Balb/c oder C58BIk × CBA F1 (H-2b/k) Männchen gepaart. In einigen Gruppen wurden die Gebärmutter der weiblichen Balb/k an der oviduktalen Verbindung 2 Wochen vor der Paarung ligiert (ut lig). Die anderen Gruppen an gesunden Balb/k Mäusen wurden mit vasektomisierten Balb/c Männchen (vas) oder Balb/c Männchen, bei denen die Bläschendrüsen zwei Wochen vor dem Paaren entfernt wurden (SV-), gepaart. Der Tag, an dem ein Vaginalpropfen festgestellt wurde, wurde als Tag 1 der Schwangerschaft oder Pseudoschwangerschaft bestimmt. Balb/c-Tumorzellen (JR-5-Fibrosarkomzellen, 10⁵) wurden s.c. am Tag 4 injiziert und das Tumorwachstum (Durchmesser in zwei Dimensionen) wurde am Tag 17 der Schwangerschaft oder Pseudoschwangerschaft bestimmt (++++=> 8 mm; +++=> 5 mm; + = 1–3 mm).
Beispiel 3
Sperma-TGF-β ist ein immunabweichendes Mittel
Um die Wirkung von TGF-β auf die Induktion von Th1 und Th2 Immunantworten gegenüber CBA-Spermien-Antigenen zu bewerten, wurden weibliche Balb/c F1 Mäuse durch intra-uterinäre Infusion mit CBA-Sperma immunisiert in Anwesenheit oder Abwesenheit von rTGF-β zu zwei Zeitpunkten, die vier Wochen voneinander getrennt lagen. Die Entwicklung einer Th1-Anti-Spermien-Immunität wurde zwei Wochen nach Messen der DTH-Antwort gegenüber einer subkutanen Spermien-Antigenreizung gemessen und durch Messen des Serumgehaltes an Anti-Spermienreaktiven Immunglobulinen der IgG2b-Subklasse. Während Sperma, das alleine oder in Anwesenheit von kompletten Freunds-Adjuvanz eine starke DTH-Antwort und eine moderate IgG2b-Antikörper hervorriefen, verminderte eine Immunisierung in Anwesenheit von TGF-β beide Parameter wesentlich und war vergleichbar mit der Antwort, die bei einem natürlichen Paaren hervorgerufen wird (8). Im Gegensatz dazu trat die Synthese von Spermien-reaktiven-Immunglobulinen des IgG1-Isotyps (Anzeichen einer Th2-Antwort) in einem ähnlichen Ausmaß in allen Behandlungsgruppen auf, egal ob TGF-β in dem immunisierenden Inokulum vorhanden war.
In einem weiteren Experiment wurde die Wirkung von TGF-β auf die Induktion von „Toleranz" gegenüber väterlichen MHC-Antigenen, die mit dem Sperma assoziiert waren, untersucht. Weibliche Balb/k (H-2k) Mäuse, denen intra-uterinäre Infusionen von Sperma aus Balb/c (H-2d) Männchen zusammen mit rTGF-β1 gegeben wurden, waren nicht in der Lage, väterliche MHC-Antigen tragende Tumorzellen, die 4 Tage später injiziert wurden, abzustoßen, während Tumore von naiven Mäusen oder Mäusen, denen Sperma alleine verabreicht wurde, abgestoßen wurden (Tabelle 4). Die Tumorabstoßung war ebenfalls in Mäusen, denen TGF-β ohne Spermien-Antigen verabreicht wurde, beeinträchtigt, obwohl die Tumore in dieser Behandlungsgruppe nicht so groß wuchsen, wie die Tumore bei Mäusen, die sowohl Antigen als auch TGF-β erhielten.
Diese beiden Experimente zeigen, dass eine Zufuhr von väterlichen Antigenen in Kombination mit TGF-β zu dem weiblichen Produktionstrakt systemische väterliche Antigen-spezifische Toleranz ausbilden kann, insbesondere durch Hemmen des Th1-Kompartments der Immunantwort. Der immunabweichende Effekt ist abhängig von der Verabreichung von TGF-β, da eine alleinige Gabe von Antigenen eine Th1-Immunität im Gegensatz zu Toleranz hervorruft. TGF-β verabreicht in Abwesenheit von Antigenen kann einen Zustand von teilweise nicht antigen-spezifischer Toleranz hervorrufen.
Tabelle 4: Wirkung von intra-uterinärer Immunisierung mit Balb/c-Sperma und TGF-β auf ein Abstoßen von Balb/c JR-5-Fibrosarkomzellen in jungfräulichen Balb/k Mäusen
Weiblichen Balk/k Mäuse wurde die Gebärmutter ligiert und nach zweiwöchiger Ruhe wurden sie in ihrem Zyklus durch Verabreichung von GnRH-Agonisten synchronisiert. Zum Zeitpunkt 9:00 Uhr bis 12:00 Uhr am Tag des Zyklus wurden die Mäuse narkotisiert und ihnen wurde intra-uterinär Injektionen von 5 × 10⁶ Balb/c-Sperma und/oder 10 ng TGF-β in 100 μl PBS (50 μl verabreicht pro Horn) verabreicht. Balb/c-Tumorzellen (JR-5-Fibrosarkomzellen, 10⁵) wurden s.c. 72 Stunden nach Operation injiziert und das Tumorwachstum (Durchmesser, in zwei Dimensionen) wurde 13 Tage später gemessen (++++=> 8 mm; +++=> 5 mm; += 1–3 mm).
Beispiel 4
Väterliche Antigen-spezifische Immunabweichung verbessert die Reproduktionsleistung
Die oben beschriebene Experimente zeigten, dass Sekret der Bläschendrüsen die Th1-Hypoempfindlichkeit hervorrufen kann, die sich als Toleranz in weiblicher Immunantwort spezifisch für die Sperma-Antigene manifestiert, einschließlich aber nicht nur auf väterliche MHC-Antigene begrenzt, die in den weiblichen Reproduktionstrakt nach dem Paaren vorliegen. Die Daten suggerieren, dass ein verringerter Erfolg bei der Reproduktion eintritt, wenn eine Schwangerschaft in Abwesenheit des Aussetzens gegenüber Samenflüssigkeit initiiert wurde, wahrscheinlich aufgrund einer inadäquaten Induktionen der weiblichen Toleranz gegenüber den Conceptus-Antigenen. Ein Experiment wurde daher durchgeführt, um diese Überlegung zu testen, ob ein vorheriger Zustand von TGF-vermittelte „Toleranz" gegenüber Antigenen in väterlichem Sperma, die Fortpflanzungsleistung fördern kann. Dieses Experiment bestand aus der Immunisierung durch intra-uterinäre Infusion von Balb/c F1 Weibchen mit CBA-Sperma mit oder ohne rTGF-β₁ zwei Wochen vor dem Paaren mit gesunden CBA zeugungsfähigen Männchen. Die Immunisierung mit Sperma plus TGF-β führte zu einer Erhöhung des durchschnittlichen Fötus- und Plazentagewichts (Tabelle 5) abgesehen von einem geringen Abfall in der Wurfgröße, was deutlich war bei allen Weibchen, die mit Sperma immunisiert wurden, egal ob in Anwesenheit oder Abwesenheit von TGF-β. Diese Zunahme war nach wie vor sichtbar nach Einstellen verschiedener Fötuszahlen pro Gebärmutterhorn um den Effekt der Wurfgröße herausnehmen (9).
Es wurde berichtet, dass die Induktion einer Th1-Hypoempfindlichkeit gegenüber väterlichen Antigenen zu verbesserten Schwangerschaftsverläufen bei Frauen, die vorher wiederholten Fehlgeburten ausgesetzt waren, führt (102). Während keine Daten existieren über die Fähigkeit von väterlichen Antigen/TGF-β-Immunisierung eine Th1-Hypoempfindlichkeit gegenüber väterlichen Antigenen zu initiieren oder die vorher bestehende Th1-Immunantwort in Frauen zu verändern, noch über die Fähigkeit von TGF-β das Ergebnis der Fortpflanzung zu verbessern, ist es doch sehr wahrscheinlich. Die Erfinder sind die ersten, die einen großen randomisierten kontrollierten Versuch durchgeführt haben, die die Wirkung eines Aussetzens von Sperma bei IVF-Behandlung auf das Ergebnis untersucht. Dieser Versuch bestätigte, dass Frauen, die Sperma ausgesetzt waren (enthaltend väterliches Antigen und natürliches TGF-β) zum Zeitpunkt des Embryotransfers ein reduziertes Risiko an einem frühen Embryoverlust hatten im Vergleich zu solchen, die nicht so behandelt wurden (Tabelle 6). Diese Verbesserung in dem Fortpflanzungsergebnis wird wahrscheinlich durch die mütterliche Immuntoleranz gegenüber väterlichen Antigenen induziert durch TGF-β und Sperma-Antigen zum Zeitpunkt des Geschlechtsverkehrs vermittelt.
Tabelle V Wirkung einer vorherigen Immunisierung mit Sperma und TGF-β auf das Ergebnis der Fortpflanzung bei Mäusen
Weibliche Balb/c F1 Mäuse wurden durch intra-uterinäre Infusion mit CBA-Sperma in Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 ng rTGF-β1 immunisiert und wurden dann zwei Wochen später natürlich mit CBA Männchen gepaart. Die Weibchen wurden am Tag 17 der Schwangerschaft getötet und die Zahl an gesamtlebenden und resorbierten Einnistbereichen genauso wie das Fötusgewicht, Plazentagewicht und Plazentagewicht der lebenden Conceptusse wurde bestimmt. Die Werte sind Durchschnitt ± Standardabweichung. Die Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit Hilfe des Kruskal Wallis Ein-Weg ANOVA gefolgt von Mann Whitney Rangsummentest (p < 0,05) bestimmt.
Tabelle VI Wirkung des Aussetzens gegenüber Sperma zum Zeitpunkt des Transfers des aufgetauten Embryos auf das Ergebnis der frühen Schwangerschaft
Das Ergebnis der Schwangerschaft nach Transfer von auftauten Embryonen und die Patienteneigenschaften waren zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant unterschiedlich. Eine biochemische Schwangerschaft wurde definiert als eine, bei der das βHCG-Serum 25 IU überschritt und eine klinische Schwangerschaft als eine bei der ein Conceptus/Fötuspol mit Ultraschall zum Zeitpunkt von 6 Wochen nach Empfängnis sichtbar war. Statistische Analyse wurde unter Verwendung des Chi-Quadrat-Tests durchgeführt. NS = nicht signifikant. * = eine Zwillingsschwangerschaft.
Referenzen

1. Barratt et al. (1990) Hum. Reprod. 5, 639-648.
2. De of al (1991) J. Leukocyte Biol. 50, 252-262.
3. Kachkacheet al (1991) Biol. Reprod. 45, 860868-868.
4. Mcmaster of al (1992) J. Immunol. 148, 1699-1705.
5. Beer & Billingham (1974) J. Reprod. Fert. Suppl. 21, 59-88.
6. Clarke (1984) in Immunological aspects of reproduction in mammals, ed. Crighton, (Butterworths, London), pp. 153-182.
7. Hunt et al (1984) Cell. Immunol. 85, 499-510.
8. Robertson & Seamark (1990) Reprod. Fertil. Dev. 2, 359-368.
9. Head et al (1991) in The Molecular and Cellular Immunobiology of the Maternal-Fetal Interface, eds. Wegmann of al (Oxford University Press, New York),
10. Robertson et al. (1996) J Reprod Fert 107, 265-277
11. Robertson et al (1994) in Serono Symposium on the Immunobiology of Reproduction, eds. Hunt & Burnett.
13. Wilbanks et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22, 165-173.
14. Duhrsen (1988) Leukaemia 2, 334-342.
15. Austyn & Gordon. (1981) Eur. J. Immunol. 11, 805
16. Conlan & North. (1994) J. Exp. Med. 179, 259-268.
17. Whitten. (1956) J. Endocrinol. 14, 160-163.
18. Lawrence et al. (1984) J. Cell Physiol. 121, 184-188.
19. Robertson of al. (1992) Biol Reprod. 46, 1069-1079.
20. Anderson et al. (1983) J. Reprod. Fertil. 68, 1-7.
21. Mann, T. (1964) The biochemistry of semen and the male reproductive tract (John Wiley and Sons, Inc.,
22. Nocera & Chu (1995) Am. J. Reprod. Immunol. 33, 282-291.
23. Wakefield of al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 7646-7654.
24. Massague. (1990) Annu. Rev. Cell Biol. 6, 597-641.
25. Andres. (1989) J. Cell Biol. 109, 3137-3145.
26. Wakefield et al (1990) J. Clin. Invest. 86, 1976-1984.
27. Wahl (1992) J. Clin. Immunol 12, 61-74.
28. Finlay et al. (1983) Endocrinology 112, 856-861.
29. Danglot et al. (1986) FEBS Lett. 194, 96-100.
30. Weiner et al (1994) Annu. Rev. Immunol. 12, 809-837.
31. Tafuri et al. (1995) Science 270, 630-633.
32. Wegmann of al. (1993) Immunol. Today 14, 353-356.
34. Anderson & Tarter (1982) J. Immunol. 128, 535-539.
35. Lee & Ha (1989) Int Arch Allergy Appl Immunol 88, 412-419.
36. Pang et al. (1979) J. Reprod. Fert. 56, 129-132.
37. Peitz & Olds Clarke. (1986) Biol. Reprod. 35, 608-617.
38. Polge. (1982) in Control of pig reproduction, eds. Cole & Foxcroft. (Butterworths, London), pp. 277-291.
39. Mah et al (1985) J. Anim. Sci. 60, 1052-1054.
40. Walker of al. (1992) Theriogenology 37, 111-126.
41. Murray of al. (1983) J Anim Sci 56, 895-900.
42. Stone et al. (1987) Proc. Am. Fert. Soc. 43, 88
43. Klonoff-Cohen of al. (1989) JAMA. 262, 3143-3147.
44. Robillard et al (1995) The Lancet 344, 973-975.
45. Bellinge et al. (1986) Fertil. Steril. 46, 2523-2526.
46. Breyere and Burhoe (1964) Ann. NY Acad. Sci. 120, 430-434
47. Kester et al (1971) J. Clin. Path. 24, 726-730
48. Dekker et al (1996) Abstract No 516 Am J Obstet Gyn
49. Kajina et al Am J Reprod. Immun. 17, 91-95
50. Scott et al (1987) Obst. Gyn. 70, 645
51. Gleicher (1994) Am. J Reprod Immun. 32, 55-72
52. Coulam & Stern Reprod Immun Serono Symposium 97, 205-216, Eds Donero & Johnson
53. Kutten et al (1992) Mot Androl 4, 183-193
54. Klonoff-Cohen et al (1989) JAMA 262, 3143-3147
55. Robillard et al (1995) Lancet 344, 93-975
56. Stephen EH (1996) Fert Steril 66, 205-9
57. Hakim et al (1995) Am J Obstet Gyn 172, 1510-7
58. Weinberg et al (1988) Fert Steril 50, 993-5
59. Lenton et al (1988) Ann NY Acad Sci 541, 498-509
60. Neumann et al (1994) N Eng J Med 331, 239-43
61. Stern et al (1997) Am J Reprod Immun 37, 352-3
63. Tremellen et al (1997) J Reprod Immun 34, 76-7
64. Bentin-Ley et al (1994) J Reprod Fert 101, 327-32
65. Reinwald et al (1975) Cell 6, 331-44
66. Okada et al (1993) Am J Reprod Immunol 29, 241-6
67. Lee et al (1989) Int Arch Allergy Appl Immun 88, 412-19
68. Boyden SV (1962) J Exp Med 115, 453-61
69. Bignold LP (1989) J Immun Method 118, 217-25
70. Medwar PB (1953) Symp Soc Exp Biol 44, 320-38
71. Like et al (1986) J Biol Chem 261, 13426-29
72. Gordon et al (1987) Nature. 326: 403-5
73. Robertson et al. (1991) The Molecular and Cellular Immunobiology of the Maternal-Fetal Interface. (Oxford University Press, New York) pp 191-206. Eds: Wegmann, Nisbett-Brown & Gill.
74. de Moraes & Hansen (1997) Biol Reprod 57: 1060-1065.
75. Imakawa of al. (1993) Endocrin. 132: 1869-71.

Claims

Verwendung von TGFβ oder einer Modifikation davon, die wirksam ist eine effektive transiente Immuntoleranzreaktion hervorzurufen für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustandes der Unfruchtbarkeit bei einer angehenden menschlichen oder Säugetiermutter, wobei das Medikament angepasst ist, um vor der versuchten Empfängnis verabreicht zu werden, dadurch gekennzeichnet, dass der Zustand der Unfruchtbarkeit ein Mangel an Immuntoleranz gegenüber väterlichen Antigenen beinhaltet und ausgewählt ist aus wiederholten Fehlgeburten, Präeklampsie oder intra-uterinären Wachstumsbeschränkungen (inter-uterine growth restriction, IUGR).
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das TGFβ ein TGFβ oder eine Modifikation davon ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass TGFβ ein TGFβ₂ oder eine Modifikation davon ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das TGFβ ein TGFβ₃ oder eine Modifikation davon ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das TGFβ oder eine Modifikation davon ein Mitglied der TGF-Superfamilie ist.
Verwendung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Mitglied der TGF-Superfamilie Aktivin ist.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das TGFβ zur Verabreichung in einem unaufgereinigtem Zustand ist, unter Verwendung einer biologischen Quelle, die reich an TGFβ ist.
Verwendung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das TGFβ zur Verabreichung in Form von Plättchen ist.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur Verabreichung ausgebildet ist, das es TGFβ mit 50 ng/ml oder mehr pro Dosis, mit einer Gesamtdosis von 150 ng bereitstellt.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur Verabreichung ausgebildet ist, dass es TGFβ zwischen 100 und 400 ng/ml pro Dosis mit einer Gesamtdosis von zwischen 100 bis 2000 ng bereitstellt.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur Verabreichung über mukosale Oberflächen angepasst ist.
Verwendung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die mukosale Oberfläche eine orale mukosale Oberfläche, eine mukosale Oberfläche der Atemwege, eine gastrointestinale mukosale Oberfläche oder eine mukosale Oberfläche der Genitalien ist.
Verwendung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament angepasst ist zur Verabreichung im weiblichen Genitaltrakt.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ein Gel ist.
Verwendung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel ein Vaginalgel ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ein Pessar ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur Injektion für systemischen Kontakt ist.
Verwendung einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur mehrfachen Verabreichung an die angehende Mutter ist.
Verwendung gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die mehrfache Verabreichung durchgeführt wird über einen Zeitraum, der mindestens drei Monate vor der versuchten Empfängnis überspannt.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ausgebildet ist zur Verabreichung mindestens eine Woche vor versuchter Empfängnis.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ausgebildet ist, um mindestens einmal nach dem voraussichtlichen Tag der Empfängnis verabreicht zu werden.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur Verabreichung für die ersten 12 Wochen der Schwangerschaft ausgebildet ist.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ausgebildet ist für die Verabreichung an ein oder mehreren Stellen.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ausgebildet ist zur Verabreichung zusammen mit väterlichen Antigenen.
Verwendung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die mukosale Oberfläche der zukünftigen Mutter den väterlichen Antigenen ausgesetzt wird.
Verwendung gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die mukosale Oberfläche eine mukosale Oberfläche der Genitalien ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene MHC-Antigene sind.
Verwendung gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die MHC-Antigene MHC-Klasse 1 Antigene sind.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die väterlichen Antigene auf Zellen vorhanden sind, die MHC-Antigene enthalten.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 24 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene auf oder in den Spermazellen des zukünftigen Vaters vorhanden sind.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 24 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene in dem Plasma der Samen des zukünftigen Vaters vorhanden sind.
Verwendung gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene auf Leukozyten des zukünftigen Vaters vorhanden sind.
Verwendung gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ausgewählt ist zur Verabreichung von zwischen 10⁷ und 10⁹ Leukozyten, die väterliche Antigene tragen.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 24 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament und die Antigene zur zeitlich getrennten Verabreichung ausgebildet sind.
Verwendung gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die väterlichen Antigene im Sperma zu der mukosalen Oberfläche der Genitalien der zukünftigen Mutter in Form des Ejakulats des zukünftigen Vaters bereitgestellt wird.