ES2268765T3 - Tratamiento y diagnostico de infertilidad usando tgfbeta o activina. - Google Patents
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Abstract
Uso de TGFbeta, o una modificación del mismo que es eficaz para provocar una reacción inmune tolerante transitoria eficaz, en la fabricación de un medicamento para tratar una afección de infertilidad en una posible madre humana o de mamífero, en el que el medicamento está adaptado para administrarse antes de la concepción intentada, caracterizado porque la afección de infertilidad implica la ausencia de tolerancia inmune a los antígenos paternos y se selecciona entre aborto natural recurrente, pre-eclampsia o restricción del crecimiento intra-uterino (IUGR).
Description
Tratamiento y diagnóstico de infertilidad usando
TGF\beta o activina.
Esta invención se refiere a un método de
diagnóstico para una afección de infertilidad que da lugar a
capacidad reducida de tener descendencia y a un método para tratar
dicha afección.
Una incapacidad o capacidad reducida de tener
niños puede causar graves dificultades personales y tiene un alto
coste social relacionado, particularmente en términos de costes de
intervención médica. Una gran parte de las parejas pertenece a esta
categoría. En los Estados Unidos, por ejemplo, se sabe que el
10-15% de las parejas en edad reproductora son
incapaces de tener niños, mientras que en el Reino Unido es del 14%.
En 1995 se calculó que 5,1 millones de mujeres tenían fertilidad
alterada sólo en los Estados Unidos, proyectándose esta cantidad a
un aumento a 5,9 millones para el año 2020 (56). En los Estados
Unidos, los costes de un embarazo concebido por IVF varían entre
60.000 dólares americanos para el primer ciclo a 114.000 dólares
americanos por el sexto ciclo (60).
En el contexto de esta patente, una afección de
infertilidad se entiende relacionada no sólo con la capacidad de
concebir sino también con abortos naturales, abortos espontáneos u
otras afecciones relacionadas con el embarazo, tales como
pre-eclampsia e incluye sub fertilidad.
Los recientes estudios han revelado que la
proporción mayor de parejas infértiles no tienen niños a causa de
una velocidad mayor que la normal de pérdida embrionaria temprana
(70% de abortos naturales frente al 21% de abortos naturales en
controles de fertilidad; 57), en lugar de una incapacidad de
concebir. Estos descubrimientos han iniciado una investigación de
las razones para la velocidad aumentada de la pérdida embrionaria
temprana en parejas infértiles, así como terapias potenciales para
desviar dichas pérdidas.
En los últimos 20 años se ha mantenido alguna
esperanza en las parejas infértiles con el desarrollo de técnicas
de fertilización in vitro (IVF). Estas técnicas de IVF
generalmente tienen forma de estimulación de la mujer para que
ovule, poner en contacto los óvulos recogidos con esperma in
vitro e introducir los óvulos fertilizados en el útero. También
existen múltiples variaciones de este proceso general. A pesar de
los considerables avances en la investigación y en la técnica en el
campo de IVF, la proporción de embarazos exitosos después del
tratamiento de IVF aún es bastante baja y está en el orden del 15 al
25% por ciclo.
Experimentar un programa de IVF a menudo causa
gran angustia, especialmente cuando no hay un embarazo exitoso
resultante. Actualmente se cree que la baja proporción de éxito en
el tratamiento de IVF se debe a una proporción extraordinariamente
alta de pérdida embrionaria temprana (58, 59), posiblemente
relacionada con el estado reproductor alterado del paciente o el
proceso de IVF en sí mismo.
La baja eficacia de IVF, junto con su alto coste
y los traumas psicológicos asociados por los fracasos repetidos del
tratamiento hace deseable que se busquen enfoques alternativos al
problema de infertilidad. Los métodos actuales de aumento de las
proporciones de embarazo durante el tratamiento de IVF incluyen
colocar múltiples embriones (2-5) en la cavidad
uterina, pero esto no siempre es eficaz ya que se cree que la
receptividad uterina falla al menos tan habitualmente como la
viabilidad embrionaria. Además, las consiguientes altas proporciones
de embarazos múltiples están asociados con un riesgo materno
aumentado de pre-eclampsia, hemorragia y parto por
operación, y riesgos para el feto que incluyen parto antes de llegar
a término con la posibilidad acompañante de un obstáculo físico y
mental.
De forma similar, la pérdida temprano del
embarazo es un inconveniente principal en los programas de cría de
ganado y especies raras o amenazadas. La mortalidad embrionaria
durante el período pre- y per-implante se ve como
la razón principal para el mal resultado del embarazo cuando se usan
tecnologías de reproducción asistida tales como inseminación
artificial. Incluso siguiendo un apareamiento natural, la
variabilidad en el tamaño de la camada y la viabilidad del la
descendencia son limitaciones adicionales con implicaciones
económicas serias.
Las razones para las proporciones aumentadas de
pérdida embrionaria temprana después de una concepción natural y
asistida permanecen desconocidas. Los estudios cromosómicos sobre
embriones que han sufrido un aborto natural han confirmado que al
menos la mitad de estos embriones eran genéticamente normales (61).
Los embriones normales parecen perderse principalmente a causa del
medio proporcionado por el tracto materno durante el desarrollo
pre-implante o en el momento del implante en el
endometrio que es suficiente para nutrir su crecimiento y
desarrollo. Los embriones pueden perder su viabilidad o potencial de
desarrollo si el medio del tracto materno comprende nutrientes o
factores de crecimiento peptídicos inapropiados o insuficientes.
Además, se proporciona un determinante principal de la receptividad
uterina por la respuesta inmune materna al concepto, que se percibe
como extraño o semi-alogénico debido a la expresión
de antígenos tanto maternos como paternos.
Medawar formuló originalmente la hipótesis de
que la acomodación inmune materna del concepto
semi-alogénico puede facilitarse por tolerancia
inmunológica a los antígenos de transplante paternos (antígenos de
histocompatibilidad principales [MHC]) (70). Esta hipótesis perdió
credibilidad cuando se descubrió que el embarazo no altera
permanentemente la capacidad de los ratones de rechazar injertos
cutáneos paternos (5, 46). Sin embargo, el concepto de
hiposensibilidad transitoria a los antígenos MHC paternos (46) está
ahora recibiendo una atención renovada, ya que un estudio reciente
de Tafuri et al (31) ha proporcionado evidencias claras que
muestran que durante el embarazo de los ratones, los linfocitos T
reactivos con MHC de clase I paterno llegan a ser "anérgicos",
o incapaces de reconocer el antígeno debido a la internalización de
receptores de células T. Este estado anérgico confería
"tolerancia" a células tumorales que expresaban antígeno MHC
paterno, y fue funcionalmente operativo en cuanto se implantó (día
4 de embarazo) y duró muy poco después del parto cuando los
linfocitos recuperaron su reactividad. Los datos apoyan la hipótesis
de que una respuesta inmune materna permisiva a otros antígenos
expresados en el embrión, o la unidad feto-placenta
(mencionada a partir de ahora como el concepto) puede deberse de
forma similar a la inducción de una respuesta inmune tolerante
específica para esos antígenos.
Precisamente no ha estado claro lo que es
responsable de inducir esta tolerancia de los antígenos MHC paternos
y otros antígenos del concepto hasta ahora. Adicionalmente, la
naturaleza de la tolerancia no estaba clara.
El término tolerancia en el contexto de esta
invención significa inhibición de la respuesta inmune mediada por
células potencialmente destructiva contra los antígenos del
concepto, y/o la inhibición de la síntesis de inmunoglobulina
reactiva al antígeno del concepto de isotipos de fijación del
complemento (por ejemplo, el compartimiento "Th1" de la
respuesta inmune). Esta tolerancia puede estar o puede no estar
asociada a la inducción de la síntesis de inmunoglobulina reactiva
al antígeno del concepto, no destructiva de los isotipos y
subclases de no fijación del complemento (por ejemplo, el
compartimiento "Th2" de la respuesta inmune). El término
tolerancia debe considerarse que incluye anergia de células T y
otras formas permanentes o transitorias de hiposensibilidad o
supresión del compartimiento Th1 materno.
Tafuri et al (31) han demostrado que la
tolerancia específica para antígenos paternos es activa por la
aparición del implante de blastocistos en el día 4 del embarazo en
ratones. El pre-implante de embriones es un estímulo
poco antigénico ya que habitualmente comprende menos de 100 células
y está envuelto por una envuelta protectora (zona pelluicida) hasta
justo antes del implante. Sin embargo, el semen tiene una gran
dotación de antígenos paternos presentes sobre y en el interior del
esperma, células somáticas y el plasma seminal en sí mismo, y
comprende un inóculo de sensibilización eficaz para muchos antígenos
paternos (5) que se sabe que están compartidos por el concepto.
Hasta ahora convencionalmente se ha creído que el plasma seminal
funciona principalmente como un medio transporte y supervivencia
para los espermatozoos que atraviesan el tracto reproductor femenino
(21). Los recientes estudios descritos en esta memoria descriptiva
han puesto de relieve un papel no apreciado hasta ahora para este
fluido en la interacción con las células maternas para inducir una
cascada de acontecimientos celulares y moleculares que finalmente
conducen a una tolerancia inmune materna a los antígenos paternos
presentes en el semen y compartidos por el concepto, suprimiendo de
este modo el rechazo inmune durante el implante.
La eyaculación durante el coito provoca una
infiltración de leucocitos en el sitio de deposición del semen
llamado la "reacción celular leucocitaria" en una diversidad de
especies de mamíferos, incluyendo el hombre (1). En ratones, la
cascada de cambios celulares y moleculares iniciados por la
introducción de semen en el útero, en muchos aspectos, se parece a
una respuesta inflamatoria clásica. En horas después del
apareamiento, sucede una afluencia notable y activación de
macrófagos, neutrófilos, y eosinófilos en el estroma del endometrio
(2-4), asociado con una expresión regulada
positivamente de antígenos del complejo de histocompatibilidad
principal (MHC) de clase II y antígenos CD86 por las células
dendríticas del endometrio, seguido por un agrandamiento de los
ganglios linfáticos de drenaje (5, 6). Esta respuesta inflamatoria
es transitoria y se disipa completamente con el tiempo de implante
del embrión en el día 4 del embarazo (2-4), cuando
los leucocitos que persisten en el endometrio son predominantemente
macrófagos con un fenotipo inmunosupresor (7).
Los cambios temporales en el tráfico y
comportamiento fenotípico de los leucocitos del endometrio durante
el período entre el apareamiento y el implante probablemente se
organizan principalmente por citoquinas que surgen de las células
epiteliales reguladas por hormonas esteroideas que recubren la
superficie del endometrio y que comprenden las glándulas del
endometrio (8). Son de particular importancia el factor estimulador
de colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CSF) e interleuquina-(IL)-6,
cuya síntesis está regulada positivamente al menos 20 veces y 200
veces respectivamente en las células epiteliales estimuladas con
estrógenos después de la inducción por factores proteicos
específicos en el plasma seminal (8, 9) que se sabe que deriva de la
glándula de la vesícula seminal (10). Estudios previos han implicado
la elevación en la liberación de GM-CSF epitelial
como un mediador clave en la respuesta inflamatoria después del
apareamiento ya que la inyección de GM-CSF
recombinante en el útero en celo es suficiente para producir cambios
celulares que se parecen a los observados cuando se produce un
apareamiento natural (11). Se ha descubierto que, usando ratones
deficientes en GM-CSF, la actividad quimiotáctica
de GM-CSF probablemente se compensa o aumenta por
una serie de quimioquinas, cuya expresión está regulada
positivamente de forma transitoria después del apareamiento (12), y
citoquinas sintetizadas por macrófagos del endometrio activados
incluyendo IL-1 y el factor de necrosis
tumoral-\alpha (TNF-\alpha)
(4).
Se ha investigado la naturaleza del factor
seminal que funciona para estimular la liberación de
GM-CSF a partir del epitelio del útero. Los
experimentos previos han demostrado que el aumento en el contenido
de GM-CSF en el útero no es el resultado de la
introducción de GM-CSF contenido en el eyaculado, ni
una consecuencia de una respuesta neuroendocrina a la estimulación
del cuello del útero, y es independiente tanto de la presencia de
esperma en el eyaculado como de la disparidad de MHC entre el macho
y la hembra (8). Se sugirió un mecanismo que implica la inducción
de la síntesis de ARNm de GM-CSF en células
epiteliales por factores proteicos derivados de la vesícula seminal
por experimentos que muestran que machos deficientes en la vesícula
seminal (SV-) no provocan la liberación de GM-CSF o
una respuesta tipo inflamación después del apareamiento en hembras,
y que el material de alto peso molecular sensible a tripsina
extraído de la vesícula seminal podría regular positivamente la
liberación de GM-CSF por las células epiteliales del
útero in vitro (10).
Sin embargo, no ha quedado claro a partir del
trabajo publicado previamente que esta respuesta inflamatoria esté
relacionada con la inducción de tolerancia por la madre al concepto,
o alternativamente no está claro si la respuesta inflamatoria tiene
un papel para potenciar el sistema inmune para combatir la afluencia
de materia extraña tal como bacterias patogénicas potenciales. No
hay ningún indicio sobre lo que desencadena la inducción de
tolerancia o si la tolerancia está mediada por el semen.
Un documento de la técnica anterior relevante
conocido es la memoria descriptiva de la Patente de Estados Unidos
5395825 por Feinberg. Esta memoria descriptiva describe un
descubrimiento que sugiere que TGF\beta elevado en el tracto
reproductor femenino puede facilitar la producción de fibronectina,
una proteína sobre la que existe la hipótesis de que ayuda al
implante promoviendo la adhesión del embrión a la superficie del
endometrio. La vida media de TGF\beta es sólo de unos pocos
minutos y su efecto sobre la fibronectina es a muy corto plazo. Por
lo tanto, la administración de TGF\beta en el método anterior sólo
puede contemplarse para ayudar al implante si se suministra en el
momento preciso en el que el embrión antes del implante llega a la
cavidad uterina. La presente invención no requiere dicha precisión
temporal en el suministro de TGF\beta, ni pretende que el efecto
de TGF\beta esté mediado a través de la fibronectina.
Se ha identificado TGF\beta como una molécula
inmunorreguladora principal en el plasma seminal. TGF\beta
producido en forma latente en la glándula de la vesícula seminal se
activa en el tracto reproductor femenino donde actúa para inducir
la síntesis de GM-CSF en las células epiteliales del
útero, iniciando de este modo la respuesta inflamatoria después del
coito.
Adicionalmente, se ha demostrado que TGF\beta,
cuando se administra al tracto reproductor femenino junto con
esperma o semen, puede provocar tolerancia hacia los antígenos
masculinos, incluyendo los antígenos MHC de clase I paternos. Este
estado de tolerancia es evidente por la inhibición de las respuestas
inmunes de tipo Th1 contra los antígenos paternos, incluyendo las
respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) estimuladas
por una inyección previa con esperma, la producción de isotipos de
fijación del complemento de inmunoglobulina específica para el
esperma, y el rechazo inmune mediado por células de células
tumorales que albergan los mismos antígenos de MHC de clase I que
los contenidos en el inóculo de esperma de estimulación. Se propone
que esta tolerancia puede conseguirse por exposición de la hembra a
TGF\beta con o sin antígeno masculino.
El significado de esto es que es muy probable
que ciertas afecciones de infertilidad estén relacionadas con la
incapacidad de producir tolerancia a antígenos del hombre y/o
proporcionar un medio de citoquinas adecuado para el crecimiento y
desarrollo del embrión antes del implante, como resultado de la
ausencia de TGF\beta en el fluido seminal del hombre, una
incapacidad de la mujer para procesar el TGF\beta a partir de una
forma inactiva a una activa, o una ausencia o niveles bajos de
antígenos paternos en el eyaculado. En algunos casos, la
infertilidad puede deberse a la incapacidad de la mujer de responder
a TGF\beta, en cuyo caso puede justificarse la aplicación directa
de moléculas inducidas por TGF\beta, tales como
GM-CSF.
El contenido de TGF\beta1 de secreciones de la
vesícula seminal murinas, como la del plasma seminal humano (22), se
descubrió que era extraordinariamente alto y sólo igualable al
presentado para el destilado plaquetario (23). En las especies de
mamíferos, la familia de TGF\beta comprende al menos tres
polipéptidos muy relacionados, TGF\beta_{1}, \beta_{2} y
\beta_{3} (24) que muestran una homología de secuencia del
70-80% y comparten muchas acciones biológicas.
TGF\beta_{1} es el isotipo de TGF\beta dominante responsable
de aumentar la producción de GM-CSF en el útero
murino, ya que ahora se ha descubierto que los anticuerpos
neutralizantes específicos de TGF\beta_{1} tienen la capacidad
de bloquear el 85% de la actividad estimulante de
GM-CSF de la vesícula seminal (Figura 2). Otros
miembros de la superfamilia de TGF\beta, tales como
TGF\beta_{2} y activina, también se han identificado ahora como
capaces de producir un aumento en la producción de
GM-CSF uterino (Figura 4). Estos miembros
adicionales de la familia de TGF\beta, complejados con otras
proteínas vehículo tales como la proteína betaglicano de unión de
250-300 kDa (25) puede representar la actividad de
peso molecular más alta presente en el fluido de la vesícula seminal
murino y en el plasma seminal humano (22).
Se cree que la síntesis de TGF\beta como un
complejo latente tiene un efecto estabilizante (26) y centra su
actividad en el sitio diana uniéndose a la matriz extracelular (27).
Se proporcionaron evidencias del mecanismo uterino para la
activación de TGF\beta latente por el presente descubrimiento de
que en contraste con la actividad en la vesícula seminal, la
mayoría de TGF\beta_{1} encontrado en el fluido luminal uterino
después del apareamiento estaba en forma activa (Figura 5). La
plasmina u otras enzimas proteolíticas derivadas de las células
uterinas o las glándulas secundarias masculinas (28, 29, 47) pueden
contribuir a la activación de TGF\beta después de la
eyaculación.
La propuesta de que los componentes del
eyaculado pueden contribuir indirectamente al éxito del embarazo
está apoyada por experimentos en ratones deficientes de glándulas
secundarias (36, 37) y el descubrimiento de que un mal resultado de
embarazo y un crecimiento fetal y/o placentario mal regulado después
de la transferencia del embrión o durante el primer embarazo en
diversas especies de ganado (38-40) puede mejorarse
parcialmente por exposición anterior a semen (41, 42). Asimismo,
estudios en seres humanos ahora han identificado claramente la
ausencia de exposición a semen debida a la experiencia sexual
limitada, el uso de métodos de barrera de anticoncepción, o en
embarazos por IVF con un riesgo aumentado de fallo de implante,
aborto espontáneo y pre-eclampsia
(43-45).
(43-45).
De forma amplia, la invención podría decirse que
se basa en el uso de TGF\beta, o una modificación del mismo que
es eficaz para producir una reacción inmune tolerante, transitoria y
eficaz, en la fabricación de un medicamento para tratar una
afección de infertilidad en una posible madre humana o de mamífero,
en la que el medicamento está adaptado para administrarse antes de
intentar la concepción, caracterizado porque la afección de
infertilidad implica una ausencia de tolerancia inmune a los
antígenos paternos y se selecciona entre aborto natural recurrente,
pre-eclampsia o restricción del crecimiento
intra-uterino (IUGR).
Preferiblemente, se expone una superficie mucosa
de la posible madre al antígeno, y más preferiblemente, la
superficie mucosa es la superficie de la mucosa genital, sin
embargo, es factible que la exposición de otras superficies mucosas
pueda dar lugar a la tolerancia transitoria a antígenos paternos.
Hay dos razones básicas de que este pueda ser el caso, primero se
sabe que la tolerancia a antígenos externos puede provocarse en
superficies mucosas, por tanto, se sabe que las mujeres que se
exponen a fluido seminal oralmente muestran evidencias de efectos de
pre-eclampsia reducidos a antígenos MHC de patrón
masculino (48). Por tanto, la exposición podría ser oral,
respiratoria, gastrointestinal o genital. Por ejemplo, el antígeno
superficial y TGF\beta pueden presentarse en forma de una
pulverización oral o nasal, o en forma de un gel rectal o vaginal.
Dicho gel podría, por ejemplo, ser un gel tal como el usado en el
gel vaginal vendido con el nombre de marca PROSTIN (Upjohn Pty
Ltd.). Como alternativa, podría desearse tomar el TGF\beta y el
antígeno superficial en una forma que proporcione exposición al
intestino delgado y quizás al grueso, tal como quizás contenido en
una cápsula de gelatina.
Aunque puede preferirse la exposición de la
mucosa porque tiene mayor probabilidad de que de lugar a una
reacción inmune tolerante y transitoria, también puede ser factible
proporcionar otra vía de exposición. Por tanto, el antígeno
superficial y TGF\beta pueden inyectarse para contacto
sistémico.
Puede ser deseable suministrar el TGF\beta y
el antígeno juntos, por ejemplo, cuando se combinan los dos en un
gel, o pulverización, alternativamente, puede ser deseable
proporcionar una fuente de TGF\beta en la superficie mucosa de
interés, que podría ser el tracto genital, y el antígeno podría
depositarse posteriormente sobre la superficie de la mucosa.
Tampoco queda aún claro si el TGF\beta tiene que presentarse en el
mismo momento que se presenta el antígeno, aunque se cree que es
preferible, sin embargo, se propone que puede ser posible tener un
retardo entre el suministro del TGF\beta y el antígeno
superficial. Por tanto, una alternativa sería depositar el antígeno
primero quizás como eyaculado y después suministrar el TGF\beta
como un pesario después del coito.
La naturaleza de los antígenos superficiales
relevantes no está completamente clara, pero supuestamente será que
es particularmente antigénico y prominente en el esperma, o en el
concepto. Los candidatos más probables son antígenos MHC, y más
preferiblemente MHC de clase I. El modo más eficaz de presentar
estos antígenos es en una forma que estén presentes de forma natural
- en cualquier célula apropiada del hombre pretendido que los
exprese y esas células podrían incluir células espermáticas y pueden
incluir leucocitos. Los antígenos también pueden presentarse en
fluidos biológicos tales como plasma seminal que se sabe que lleva
ciertos antígenos masculinos (49). Este uso de células diferente a
las células espermáticas será pertinente cuando el recuento de
esperma del posible padre es algo bajo. El uso de células diferentes
a células espermáticas puede preferirse cuando se usa una vía no
genital. Como alternativa, los antígenos pueden presentarse en una
forma purificada o semi-purificada, que puede o
puede no presentarse en vehículos inertes o adyuvantes, por tanto,
por ejemplo, pueden presentarse en los vehículos conocidos como
ISCOMS. Este último enfoque, sin embargo, es probablemente más
complejo, desde el punto de vista técnico, y caro. También es
posible que los antígenos puedan codificarse en células
espermáticas en forma de ARNm (u otro ácido nucleico) y que después
este mensaje de ARN se exprese por las células del tracto genital
materno. Por lo tanto puede ser que TGF\beta juegue un papel para
promover los acontecimientos que conducen a la presentación de
antígenos paternos a los linfocitos maternos a través de la
activación de células presentadoras de antígeno del tracto genital
para captar y traducir el ARNm del esperma.
El nivel de TGF\beta puede variarse, y variará
dependiendo de qué especie se está tratando. Para seres humanos, el
nivel de TGF\beta será preferiblemente superior a 50 ng/ml con una
dosis total de 150 ng y más preferiblemente a una concentración
entre 100 y 400 ng/ml con una dosis total entre 100 a 2000 ng. El
nivel de TGF\beta en semen masculino normal es del orden de 200
ng/ml. Este nivel puede juzgarse empíricamente cuando se evalúan
otros animales, y por tanto, para caballos o ganado el nivel
preferido se espera que esté en el orden de 100 ng/ml. Estos niveles
pueden variar si se suministra el TGF\beta en un depósito de
liberación lenta, quizás como un parche o como un gel o complejo de
TGF\beta latente.
El nivel de exposición a los antígenos
superficiales puede variar, en una forma preferida, la exposición
será en el tracto genital de la posible madre en forma de eyaculado
del posible padre, y el nivel de exposición se determinará por
recuento celular y densidad antigénica en la superficie de dichas
células. Cuando se administran células de un modo diferente al
anterior, podría usarse una cantidad similar de células, sin
embargo, el modo más eficaz puede determinarse empíricamente. Se
cree que una exposición de leucocitos del orden de
10^{7}-10^{9} células podría ser el nivel
apropiado de exposición a una superficie mucosa.
\newpage
La especificidad de TGF\beta a
co-administrar con los antígenos masculinos
actualmente no queda completamente clara, y como se cree que
TGF\beta_{1} es responsable mientras que TGF\beta_{2,3} son
menos importantes, es más probable que se use TGF\beta_{1}. Sin
embargo, también se entenderá que pueden hacerse diversas
modificaciones a TGF\beta_{1} o de hecho a TGF\beta_{2}, o
TGF\beta_{3} que podrían ser eficaces para producir una
reacción inmune tolerante, transitoria y eficaz por separado o en
combinación con otro agente. Dichos TGF\beta modificados podrían
incluir mutantes de sustitución, deleción o adición, y podrían
incluir fragmentos peptídicos, que pueden o pueden no incorporarse
en otra proteína para hacer una proteína recombinante. Como
alternativa, también pueden usarse otros miembros de la superfamilia
de TGF\beta o usarse como punto de partida para desarrollar un
análogo de la actividad de TGF\beta, conociéndose uno de dichos
miembros como activina.
Cuando se usa TGF\beta no modificado se
administrará preferiblemente en forma de TGF\beta_{1}. El
TGF\beta_{1} puede administrarse en su forma activa, sin
embargo, cuando la posible madre es capaz de activar
TGF\beta_{1} también puede administrarse en su forma
precursora. Una opción de "suministro" alternativa sería
TGF\beta natural tal como en forma de plaquetas. Por tanto, en
lugar de TGF\beta purificado, puede usarse una preparación de
plaquetas u otra fuente rica en TGF\beta natural, tal como leche o
calostro.
La exposición es preferiblemente una exposición
múltiple. La exposición múltiple se realiza preferiblemente en un
período de al menos tres meses, exponiéndose la superficie mucosa a
TGF\beta durante cada exposición a los antígenos del posible
padre. Este período de tiempo podría, sin embargo, reducirse algo, y
puede ser posible conseguir una mejora con una exposición, pero como
mínimo se prevé que la exposición sería al menos una semana antes
de que se intente la concepción. También puede preferirse que no se
tomen medidas anticonceptivas de barrera antes de la concepción
planeada, en la que los antígenos están asociados con las células
espermáticas y estos se administran al tracto genital, de modo que
hay cierta seguridad de un período de exposición a los antígenos
del posible padre antes de la concepción. Este es particularmente el
caso cuando la afección de fertilidad es del tipo en el que la
concepción tiene lugar pero sucede un aborto natural, aborto
espontáneo o pre-eclampsia después de la
concepción.
Se prevé, por tanto, que la administración de
TGF\beta en presencia o ausencia de al menos un antígeno
superficial puede necesitar que continúe después de la posible
fecha de concepción quizás durante las primeras 12 semanas de
embarazo.
Se entenderá que esta invención no se limita
necesariamente a seres humanos, sino que también puede ampliarse al
tratamiento de otros mamíferos incluyendo especies de ganado.
Algunos trastornos específicos o procedimientos
que se benefician de la presente invención se analizan ahora en
algún grado.
Aborto natural recurrente. Se sabe que
aproximadamente el 2-5% de las parejas están
involuntariamente sin niños debido a abortos naturales recurrentes.
La etiología del aborto natural recurrente es compleja, pero en la
inmensa mayoría de los casos no puede encontrarse un defecto
cromosómico, hormonal ni anatómico y está implicada una lesión
inmunológica. Se ha ensayado una diversidad de terapias que intentan
modificar la respuesta inmune de la madre al concepto
semi-alogénico con éxito variable. El enfoque
terapéutico predominante en los pasados 20 años ha sido inyectar a
las mujeres leucocitos paternos con la esperanza de conseguir
"tolerancia" a los antígenos paternos. Esta terapia ha tenido
éxito limitado con un meta-análisis de 15 ensayos
que concluyeron que la inmunización con leucocitos paternos podía
aumentar las proporciones de embarazo en un 8-10%
(51).
Coulam y Stern (52) han administrado plasma
seminal de una fuente donante combinada al tracto genital de mujeres
con aborto natural recurrente y fueron capaces de producir un
aumento no estadísticamente significativo en las proporciones de
nacimientos vivos (60% frente al 48%, p=0,29 n=86). Este tratamiento
difiere significativamente de un régimen terapéutico preferido en
el que se administró plasma seminal en ausencia de antígeno paterno.
No es sorprendente que el éxito de esta terapia fuera limitado, ya
que no se administró antígeno paterno.
Los datos que apoyan la presente invención
proporcionan resultados alentadores que indican que TGF\beta puede
ser un tratamiento beneficioso para aborto natural recurrente a
causa de su potente capacidad inmunomoduladora potente. Se espera
que la administración de esperma en combinación con TGF\beta ayude
a producir una respuesta inmune tolerante o "nutritiva" frente
a un concepto futuro que compartiría algunos de los misamos
antígenos MHC de clase I u otros antígenos.
Pre-eclampsia y profilaxis
IUGR. La pre-eclampsia y algunas formas de
restricción de crecimiento intra-uterino (IUGR) se
cree que son un trastorno inmunológico debido a una placentación
"superficial" como resultado de un daño, ataque inmune de tipo
Th1 en el trofoblasto invasivo. Hay evidencias epidemiológicas que
muestran que la exposición repetida de una mujer a los antígenos de
su compañero a través del coito en ausencia de anticonceptivos de
barrera disminuye su probabilidad de desarrollar
pre-eclampsia en un posterior embarazo con ese
compañero (54, 55). Esto puede provocar la generación de
"tolerancia" materna hacia los antígenos paternos como
consecuencia de la exposición repetida en el coito, que facilita el
crecimiento placentario y la invasión de la decidua materna. Algunas
mujeres tienen propensión a desarrollar
pre-eclampsia o de padecer restricción del
crecimiento fetal cada vez que se quedan embarazadas. Esto pude
deberse a un contenido de TGF\beta inadecuado del semen de su
compañero, o una incapacidad de procesar el TGF\beta latente en
una forma biológicamente activa.
La estimulación con antígenos del compañero en
combinación con TGF\beta antes de la concepción y quizás hasta 3
meses de embarazo, momento en el que se completa la invasión
placentaria, puede ayudar a prevenir el desarrollo de
pre-eclampsia e IUGR en estas mujeres de alto
riesgo.
Figura 1. Cromatografía de exclusión de tamaño
en Sephacryl S-400 de (A) la actividad estimuladora
de GM-CSF y (B) la inmunoactividad de TGF\beta en
el fluido de vesícula seminal murina. En A, las células epiteliales
del útero de los ratones en celo se incubaron durante 16 horas con
fracciones no tratadas (o, =TGF-\beta o activado
con ácido (\bullet=TGF-\beta activo + latente)
de fluido de vesícula seminal. Después de 24 horas adicionales de
cultivo, se determinó el contenido de GM-CSF de los
sobrenadantes por bioensayo FD 5/12. Los valores son la media de
cultivos triplicados y la línea discontinua horizontal es la
producción de GM-CSF por células epiteliales
cultivadas con DMEM-FCS solo. En B, el contenido de
TGF\beta_{1} (\bullet) inmunoactivo en fracciones de fluido
de vesícula seminal se determinó por ELISA. Se detectó la
bioactividad de TGF-\beta por bioensayo con
células Mv-1-Lu. Las fracciones
representadas por el área sombreada contenían > 300 pg/ml, y
otras fracciones contenían < 50 pg/ml. Los datos son
representativos de resultados similares obtenidos de tres
experimentos duplicados.
Figura 2. El efecto de anticuerpos
neutralizantes específicos para TGF\beta_{1,2,3} y
TGF\beta_{1} sobre la actividad estimuladora de
GM-CSF en fluido de vesícula seminal murina. Las
células epiteliales del útero de ratones en celo se incubaron
durante 16 horas con fluido de vesícula seminal en bruto al 2% o
DMEM-FCS solo, en presencia o ausencia de
anticuerpos de ratón anti-TGF\beta_{1,2,3}
bovino (20 \mug/ml) o anticuerpos de pollo
anti-TGF\beta_{1} bovino (10 \mug/ml). Después
de un cultivo adicional de 24 h, se determinó el contenido de
GM-CSF de los sobrenadantes por bioensayo FD 5/12.
Los valores son la media \pm SD de cultivos triplicados. Los
datos son representativos de resultados similares obtenidos a partir
de tres experimentos duplicados.
Figura 3. El efecto de
TGF-\beta1 sobre la producción de
GM-CSF por células epiteliales del útero in
vitro. Las células epiteliales del útero de ratones en celo se
incubaron durante 16 horas con 0,08 - 80 ng/ml de TGF\beta1 humano
recombinante. Después de un cultivo adicional de 24 horas, se
determinó el contenido de GM-CSF de los
sobrenadantes por bioensayo FD 5/12. Se muestra la media \pm SD de
pocillos triplicados. Los datos son representativos de resultados
similares obtenidos de cuatro experimentos duplicados.
Figura 4. El efecto de TGF\beta_{2},
activina e inhibina sobre la producción de GM-CSF
por células epiteliales del útero in vitro. Se incubaron
células epiteliales del útero de ratones en celo durante 16 horas
con 0,05 - 50 ng/ml de TGF\beta_{1} humano recombinante,
TGF\beta_{2} porcino, o activina e inhibina recombinantes
humanas. Después de un cultivo adicional de 24 horas, se determinó
el contenido de GM-CSF de los sobrenadantes por
bioensayo FD 5/12. Se muestra la media \pm SD de pocillos
triplicados. Los datos son representativos de resultados similares
obtenidos a partir de dos experimentos duplicados.
Figura 5. El efecto de la composición seminal
sobre el contenido de TGF-\beta_{1} de fluido
luminal uterino después del apareamiento. Se determinó la
inmunoactividad de TGF-\beta1 por ELISA en fluidos
luminales uterinos no tratados (o=TGF-\beta
activo) o activados con ácido (\bullet =
TGF-\beta activo + latente) recogidos de ratones
en celo, o de ratones 1 hora después del apareamiento con machos
intactos, sometidos a vasectomía (vas) o deficientes en la vesícula
seminal (SV-). Los símbolos representan datos de ratones
individuales y se marcan los valores medios para los grupos de
tratamiento. Los datos se compararon por un ensayo ANOVA de una vía
de Kruskal-Wallis y de Suma de Rango de Mann
Whitney. Los conjuntos de datos marcados en el eje x con letras
minúsculas diferentes indican un significado estadístico entre
grupos de tratamiento (p<0,01).
Figura 6. El efecto de TGF\beta_{1}
intra-uterino sobre el contenido de
GM-CSF del fluido luminal del útero. Los fluidos se
recogieron 16 horas después de un apareamiento natural con machos
intactos, o después de la administración de 0,4 - 40 ng de
TGF\beta_{1} humano recombinante en 50 \mul de PBS/BSA al 1%,
o sólo vehículo, a la cavidad luminal uterina de ratones en celo.
Los símbolos representan datos de ratones individuales y se marcan
los valores medios para grupos de tratamiento. Los datos se
compararon por un ensayo ANOVA de una vía de
Kruskal-Wallis y de Suma de Rango de Mann Whitney.
Los conjuntos de datos marcados en el eje x con letras minúsculas
diferentes indican significado estadístico entre grupos de
tratamiento (p<0,01).
Figura 7. El efecto de rTGF\beta_{1} y semen
sobre la producción de GM-CSF a partir de células
epiteliales del tracto reproductor humano. El contenido de
GM-CSF de sobrenadantes de cultivo se recogieron de
(A) queratinocitos del cuello del útero y (B) cultivos de células
del endometrio se determinó por ELISA comercial, 12 horas después de
la adición de semen completo diluido (10% vol/vol) o 10 ng/ml de
rTGF\beta_{1}.
Figura 8. El efecto de la estimulación
intra-uterina con esperma y TGF\beta sobre la
inducción de la inmunidad tipo Th1. Se inmunizaron ratones hembra
Balb/c F1 por infusión intra-uterina con esperma CBA
en presencia o ausencia de 10 ng de rTGF\beta_{1}. Se aparearon
grupos adicionales de ratones con ligadura uterina de forma natural
con machos CBA, o se les dio inmunizaciones subcutáneas con esperma
en adyuvante completo de Freund. Diez días después los ratones se
evaluaron para DTH frente a antígenos del esperma, o el contenido
de suero de inmunoglobulina IgG2b anti-esperma. Los
datos se compararon por un ensayo ANOVA de una vía de
Kruskal-Wallis, seguido por un ensayo de suma de
rango de Mann Whitney indicando los diferentes subíndices
diferencias significativas (p<0,05).
Figura 9. Efecto de una inmunización anterior
con esperma y TGF\beta sobre los pesos del feto y de la placenta
durante el embarazo posterior en ratones. Se inmunizaron ratones
hembra Balb/c F1 por infusión intra-uterina con
esperma CBA en presencia (\pm rTGF\beta_{1}), y se aparearon
de forma natural con machos CBA 2 semanas después. Se sacrificaron
las hembras en el día 17 del embarazo y se determinaron los pesos
del feto (A) y de la placenta (B).
Se hicieron comparaciones entre grupos de
acuerdo con la cantidad de unidades de feto-placenta
viables por trompa uterina, por un ensayo ANOVA de una vía de
Kruskal Wallis seguido por un ensayo de suma de rango de Mann
Whitney (p<0,05).
Se suplementó medio RPMI-1640 y
medio de Eagle modificado por Dulbecco bajo en glucosa (DMEM, GIBCO)
con suero de ternera fetal al 10% (CSL), HEPES 20 mM pH 7,2,
\beta-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M,
L-glutamina 2 mM y antibióticos
(RPMI-FCS y DMEM-FCS). Se cultivaron
células FD5/12 (14), fibroblastos 3T3, y células de fibrosarcoma
JR-5 Balb/c en RPMI-FCS y células
pulmonares de visón [Mv-1-Lu,
CCL-64] y se cultivaron células epiteliales del
útero en DMEM-FCS. Se cultivaron células
ectocervicales humanas en DMEM al 70%, Hams F-12 al
20% (Gibco), FCS al 9%, Neutridoma -SP al 1% (Boehringer Mannheim),
y 0,4 \mug/ml de hidrocortisona (Upjohn, Rydalmere, NSW)
(ECM-FCS), y se cultivaron células del endometrio
humano en DMEM-FCS.
El (rh)TGF\beta_{1} humano
recombinante era de R&D Systems, el GM-CSF
murino recombinante se proporcionó por N. Nicola, The Walter and
Eliza Hall Institute for Cancer Research, y la activina e inhibina
humanas recombinantes se proporcionaron por J. Findlay, Prince
Henry's Institute for Medical Research. Los anticuerpos monoclonales
(mAb) usados para inmunohistoquímica fueron
anti-CD45 (TIB 122),
anti-Mac-1 (CD11b, TIB 128),
anti-MHC de clase II (antígeno Ia, TIB 120; todos
de ATCC), F4/80 (15), y RB6-6C5 (16). El mAb de
ratón anti-TGF\beta_{1,2,3} bovino (que
neutraliza las tres isoformas de TGF\beta de mamífero) era de
Genzime (Cambridge, MA) y el mAb de pollo
anti-TGF\beta_{1} bovino (neutraliza
TGF\beta_{1}, < 2% de reactividad cruzada con
TGF\beta_{2} y \beta_{3}) era de R&D Systems.
Ratones y Procedimientos Quirúrgicos. Se
obtuvieron ratones hembra de las cepas [Balb/c X C57B1]F1,
Balb/c o Balb/k, y ratones macho adultos de las cepas [CBA X
C57B1]F1, CBA, o Balb/c se obtuvieron de University of
Adelaide Central Animal House y se mantuvieron en una instalación
con barreras de seguridad mínimas en un ciclo de 12 horas de luz/12
horas de oscuridad con alimento y agua disponibles ad
libitum. Las hembras se sincronizaron en el celo usando el
efecto de Whitten (17) y se confirmó la fase del ciclo por análisis
de frotis vaginales. Para un apareamiento natural, se colocaron 2
hembras por jaula con machos individuales y el día de la
observación de una carga vaginal se denominó día 1 de embarazo. Los
machos sementales usados para la recogida de secreciones de
glándulas secundarias tenían todos fertilidad probada y se dejaron
descansar durante una semana antes de su uso.
Para inyecciones intra-uterinas,
se exteriorizaron las trompas uterinas de hembras en celo a través
de una escisión en la línea media dorsal y se les inyectó
0,2-40 ng de rhTGF\beta_{1} en 50 ml de RPMI/BSA
al 0,1%, o sólo vehículo, antes de sacrificar los ratones 16 horas
después de la evaluación del contenido de citoquinas luminales o la
recogida del tejido uterino para inmunohistoquímica. La
administración no quirúrgica de esperma/TGF\beta_{1} al lumen
uterino se consiguió pasando un catéter Tom Cat^{TM} (Sherwood
Medical, St. Louis, MO) de calibre 3 French en el lumen uterino
(proximal al punto de bifurcación) de hembras cohibidas, después de
la visualización del cuello del útero con la ayuda de un auriscopio
(Heine, Alemania), y dilatación manual del cuello de útero con un
alambre fino. Cada catéter uterino se cargó con 50 \mul de
esperma/TGF\beta_{1}, que se suministraron a la cavidad uterina
con la ayuda de una pipeta de boca.
Se prepararon ratones vasectomizados por
ligadura bilateral de los conductos deferentes a través de una
incisión transversal en el abdomen (Hogan et al., 1986), y se
prepararon ratones con vesiculectomía seminal por retirada de las
vesículas seminales a través de una incisión transversal en el
abdomen después de la ligadura y corte del túbulo proximal en la
base de la glándula. La pared y la piel corporales se suturaron y
los ratones se dejaron recuperar durante al menos dos semanas antes
del apareamiento.
Todos los procedimientos quirúrgicos se
realizaron con anestesia usando Avertina [1 mg/ml de alcohol
tribromoetílico n alcohol amílico terciario (Sigma) diluido al 2,5%
v/v en solución salina; 15 \mul/g de peso corporal inyectado
i.p.].
Recogida de Fluidos del Tracto
Reproductor. Se extrajeron secreciones de la vesícula seminal de
las glándulas intactas y se solubilizaron en guanidina HCl 6 M (1:4
v/v), después se desalaron en DMEM usando columnas de desalado
Sephadex G-25 de 5 ml (Pharmacia) antes de la
aplicación a cultivos de células epiteliales. Se extrajeron
secreciones de la próstata y de la glándula de coagulación por
homogeneización de las glándulas intactas en 0,5 ml de PBS/BSA al
1%, seguido por sedimentación de los desechos a 5000 g. Se recogió
el fluido luminal uterino 16 horas después del apareamiento o la
infusión de rhTGF\beta_{1} en el útero lavando abundantemente
cada trompa con 500 \mul de RPMI-FCS. Los desechos
se sedimentaron a 2000 g y el sobrenadante se almacenó a -80ºC antes
del ensayo de citoquinas. En experimentos en los que se midió
TGF\beta_{1} uterino, los lavados abundantes de la trompa
derecha se hicieron con guanidina HCl 6 M/BSA al 0,1%, y se
desalaron en PBS/BSA al 0,1% antes del ensayo de citoquinas. Para
apareamiento con machos intactos y deficientes en la vesícula
seminal la trompa izquierda se lavó abundantemente con DMEM para
posibilitar la confirmación de que había sucedido la inseminación
adecuada (> 1 x 10^{6} espermas por ml).
Cromatografía. Se aplicó aproximadamente
1 ml de fluido de la vesícula seminal en guanidina HCl 6 M a una
columna Sephacryl S-400 (40 cm x 16 mm; Pharmacia)
equilibrada en guanidina HCl 6 M/Hepes 0,05 M pH 7,4. Se recogieron
fracciones de 1 ml, se desalaron en DMEM y se ensayaron para la
actividad estimuladora de GM-CSF. Antes de la
adición al cultivo uterino o el ensayo de
TGF-\beta se activó con ácido cada fracción como
se ha descrito previamente (18).
Cultivos de células epiteliales del útero
murino. Se prepararon células epiteliales uterinas como se ha
descrito previamente (19) y se sembraron en pocillos de 1 ml de
cultivo (Nunc) a 1-2 x 10^{5} células/ml en 500
\mul de DMEM-FCS. Después de 4 h de incubación a
37ºC en CO_{2} al 5% para permitir la adherencia de las células,
se añadieron 500 \mul adicionales de fluido de la vesícula seminal
desalado en DMEM-FCS, citoquinas en
DMEM-FCS, o DMEM-FCS solo. Se
recogieron los sobrenadantes del cultivo y se reemplazaron por medio
fresco a las 16 horas, después se recogieron de nuevo 24 horas
después, momento en el cual se cuantificaron las células adherentes
como se ha descrito previamente (19). Todos los tratamientos se
realizaron por duplicado o triplicado.
Cultivos del endometrio humano. Se
prepararon cultivos de células del endometrio humano en condiciones
estériles usando una modificación del procedimiento descrito por
Bentin-Ley (64). En resumen, se embebieron células
del estroma en una matriz de colágeno, se cubrieron con una capa
fina de Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA),
que a su vez se que recubrió con células epiteliales del útero. Los
sobrenadantes de las células epiteliales del útero se recogieron a
las 12 horas (basal), se reemplazaron con 400 \mul de medio que
contenía rTGF\beta_{1}, semen, o medio de cultivo fresco, y se
recogieron los sobrenadantes 12 horas después. El contenido de
GM-CSF de sobrenadantes de 24 horas se normalizó al
contenido de GM-CSF de sobrenadantes
correspondientes a 12 horas (basal).
Queratinocitos del cuello del útero
humano. Se cultivaron queratinocitos del cuello del útero humano
usando una modificación de la técnica descrita por Rheinwald y Green
(65). Se obtuvieron biopsias del cuello del útero a partir de
mujeres que consintieron experimentar histerectomía para
indicaciones ginecológicas no malignas. Todas las mujeres eran
pre-menopáusicas, pero no se hizo distinción con
respecto a la fase del ciclo menstrual en el momento de la cirugía.
Se colocaron las biopsias del cuello del útero en HBSS enfriado en
hielo para su transporte al laboratorio; se lavaron dos veces en
medio que contenía antibiótico, y se incubaron durante una noche a
4ºC en DMEM que contenía 5 U de dispasa (Boehringer Mannheim). Se
extendieron mecánicamente grandes láminas de queratinocitos a partir
de la biopsia usando un fórceps estéril después de una incubación
posterior de 1 hora a temperatura ambiente. La disgregación en
células sencillas se facilitó por incubación en DMEM/tripsina al
0,25%/colagenasa al 0,05% durante 30 minutos a 37ºC, y aspiración
repetida usando una aguja y una jeringa. Los queratinocitos se
cultivaron en ECM-FCS, a una densidad de
1-2 x 10^{5} células/ml, sobre monocapas de
fibroblastos 3T3 murinos que se habían vuelto mitogénicamente
inactivos por exposición a mitomicina C al 4% (Sigma). Los
queratinocitos se incubaron durante 5-7 días para
posibilitar la unión y el desplazamiento de los fibroblastos 3T3,
cuando los medios se reemplazaron con ECM-FCS
fresco. Se recogió el sobrenadante 12 horas después (basal) y se
reemplazó con 500 \mul de ECM-FCS que contenía 10
ng de rTGF\beta_{1}, semen al 10% o sólo medio de cultivo
(control), que a su vez se recogió 12 horas después Se normalizó el
contenido de GM-CSF de los sobrenadantes de 24 horas
al contenido de GM-CSF de los sobrenadantes
correspondientes a 12 horas (basal).
Citoquinas y Ensayos de Citoquinas. Se
ensayó GM-CSF usando la línea celular FD5/12
dependiente de GM-CSF, esencialmente como se ha
descrito previamente (19). Se determinó la proliferación celular por
la adición de Alamar Blue (Alamar Biosciences) durante las últimas
24 horas del ensayo o pulsando con 1 \muCi de
[^{3}H]-timidina por pocillo durante las últimas
6 horas del ensayo. La cantidad detectable mínima de
GM-CSF fue 1 U/ml (50 U/ml definido como la que
produce la mitad de la proliferación máxima de FD5/12). Se midió la
bioactividad de TGF-\beta usando células
Mv-1-Lu como se ha descrito
previamente (71), excepto que se cuantificaron las cantidades de
células por la adición de Alamar Blue durante las últimas 24 horas
del ensayo. La cantidad detectable mínima de
TGF-\beta en este ensayo fue 15 pg/ml. Se
normalizaron los bioensayos de citoquinas frente a las citoquinas
recombinantes y la especificidad de los ensayo se confirmó por el
uso de anticuerpos neutralizantes específicos de citoquinas. Se
midió la inmunoactividad de TGF\beta_{1} en un ELISA específico
(R&D Systems) de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes.
Inmunohistoquímica. Se embebió tejido
uterino en OCT Tissue Tek (Miles Scientific) y se congeló en
isopropanol enfriado por N_{2} líquido, después se almacenó a
-80ºC hasta su uso. Se cortaron seis \mum de disecciones
semi-seriadas de los úteros recogidos a las 1400 h
en el día del celo o el día 1 del embarazo, o de ratones a los que
se les había inyectado rhTGF\beta_{1} y se fijaron en etanol al
96% (4ºC/10 min). Para la tinción de mAb, se incubaron secciones
con mAb (sobrenadante de hibridoma neto que contenía suero de ratón
normal al 10% [NMS]) y anticuerpo de cabra
anti-rata-peroxidasa de rábano
rusticano (HRP; Dako, 1:20 en PBS que contenía NMS al 10%) como se
ha detallado previamente (19). Para visualizar HRP o la peroxidasa
endógena (para detectar los eosinófilos), se incubaron portaobjetos
en diaminobencidina (Sigma) (5 mg/ml en Tris-HCl
0,05 M pH 7,2) más peróxido de hidrógeno al 0,02% durante 10
minutos a temperatura ambiente. Después de la contratinción en
hematoxilina, se analizaron las secciones usando un paquete de
análisis de imágenes de vídeo (Video Pro, Faulding Imaging,
Adelaide) en el que se expresó el área de la tinción positiva en el
estroma del endometrio como un porcentaje de tinción total de
células.
ELISA de anticuerpos
anti-esperma: Se usó una técnica ELISA en fase
sólida modificada por el protocolo de Okada (66) para cuantificar el
contenido en suero de inmunoglobulinas específicas de esperma de un
modo específico de isotipo. Se preparó el antígeno por alteración
del esperma CBA aislado recientemente (5 x 10^{6} espermas/ml en
PBS) usando un sonicador Branson. Se añadieron 50 \mul de
suspensión de antígenos de esperma a placas ELISA de fondo redondo
de 96 pocillos de poliestireno (Maxisorb^{TM}, Nunc) y se
incubaron durante una noche a 4ºC. Las placas se bloquearon con
PBS/BSA al 3% durante 1 hora, y se almacenaron a -20ºC hasta su uso.
Se diluyó el suero 1:4 en PBS, después se diluyó en serie 1:2 a una
dilución final de 1:128, antes de 2 horas de incubación en las
placas recubiertas con antígeno de esperma descongelado. Se detectó
la inmunoglobulina unida con anticuerpo de conejo contra \alpha
de ratón (Mouse Typer^{TM}, BioRad; 1 hora), seguido por
anticuerpo de burro biotinilado contra \alpha de conejo (Amersham,
UK; 1:2000 en PBS/BSA al 1%; 1 hora) y
estreptavidina-HRP (Amersham; 1:4000 en PBS; 30
minutos). Se visualizó HRP por la adición de tetrametilbencidina
(TMB, Sigma; 20 minutos) seguido por acidificación del producto con
H_{2}SO_{4} 1 M. La cuantificación de cada isotipo de
inmunoglobulina (IgG_{1}, IgG_{2a}, IgG_{2b}) se realizó por
duplicado, y todas las incubaciones fueron a temperatura ambiente.
El título de anticuerpo de cada suero se determinó representando
A_{450} frente a la titulación.
Respuesta de hipersensibilidad de tipo
retardado (DTH) contra el antígeno de esperma: Se empleó un
ensayo de hinchazón de la almohadilla de la pata (69) para medir la
respuesta DTH contra los antígenos de esperma. Se estimularon
ratones Balb/c F1 en dos ocasiones separadas por un mes por
inoculación intra-uterina con antígenos de esperma
en presencia o ausencia de TGF\beta, y 10 días después, se midió
el grosor de la almohadilla de la pata usando un calibre
micrométrico (incrementos de 0,01 mm) (Mitutoyo, Tokio, Japón) antes
y 24 horas después de la inyección en la almohadilla de la pata
trasera de 25 \mul de suspensión de esperma (1 x 10^{8}
espermas/ml en HBSS). Se calculó la hinchazón específica para el
antígeno sustrayendo el grosor de la almohadilla de la pata
contralateral a la que se le había inyectado HBSS.
Ensayo de quimiotaxis de leucocitos
humanos: Se obtuvieron poblaciones de leucocitos a partir de
sangre periférica humana usando centrifugación en gradiente de
densidad de Ficoll-Paque^{TM}, de acuerdo con el
método descrito por Boyum (68). Se suspendieron células
mononucleares de sangre periférica (PBMC: linfocitos y monocitos) en
HBSS que contenía ECM-FCS al 10% a 5 x 10^{5}
células/ml. El ensayo de quimiotaxis era una modificación de un
protocolo de cámara de Boyden descrito por Bignold (69). Los
sobrenadantes de cultivo de queratinocitos del cuello uterino
(diluido 1:1 con HBSS/ECM-FCS al 10%),
HBSS/ECM-FCS al 10%, o
N-formil-metionil-leucil-fenilalanina
(FMLP, Sigma) se añadieron a la mitad inferior de las cámaras y se
separaron de las PBMC por policarbonato de 3 \mum montado
adyacente a un filtro de poro disperso de policarbonato de 8 \mum
(Nuclepore). Después de 45-60 minutos de incubación
a 37ºC, tiempo durante el cual se atraparon las PBMC que migraban a
través del filtro de poro disperso de 8 \mum en la superficie del
filtro del 3 \mum subyacente, se fijaron las células por adición
de 1 ml de formalina al 10% y se cuantificaron por recuento manual
después de tinción con hematoxilina de Mayer. Las cantidades medias
de células (\pm s.d.) de medidas triplicadas se hicieron para cada
muestra de ensayo.
La citoquina GM-CSF, producida
por el epitelio uterino después del contacto con las secreciones de
la vesícula seminal, se cree que es fundamental para la generación
de la tolerancia materna ya que es en gran medida responsable de
iniciar la afluencia de leucocitos en el tracto reproductor femenino
después del apareamiento y de aumentar la capacidad presentadora de
antígenos, de estas células.
Se fraccionó el fluido de la vesícula seminal
por cromatografía de exclusión de tamaño para identificar la
actividad estimuladora de GM-CSF. Se identificaron
dos fracciones; un resto proteico de alto peso molecular (650 kDa)
y un resto más heterogéneo de peso molecular intermedio que eluye
entre 150-144 kDa (10,62). El último resto se
identificó como TGF\beta_{1}, en base a descubrimientos de que
la actividad estimuladora de GM-CSF se potenció por
la activación con ácido, de que la inmunoactividad y bioactividad de
TGF\beta_{1} co-eluían en la misma fracción, y
de que el anticuerpo neutralizante
anti-TGF\beta_{1} no podía bloquear la
actividad estimuladora de GM-CFS (Figuras 1,2). El
peso molecular de la actividad estimuladora de
GM-CSF en el fluido de la vesícula seminal
(150-440 kDa) es coherente con la forma latente de
TGF\beta_{1}, un complejo de 230-290 kDa que
comprende el dímero maduro de TGF\beta (25 kDa) asociado no
covalentemente con una proteína asociada a la latencia de
75-80 kDa y una proteína de unión de
130-190 kDa (23).
Se descubrió que el contenido de
TGF\beta_{1} de las secreciones de la vesícula seminal murina,
como el de plasma seminal humano (22), era extraordinariamente alto
e igualable sólo al presentado para destilado plaquetario (23).
Además, las secreciones de la glándula de la vesícula seminal se
identificaron como contribuyentes en exceso del 90% del contenido
de TGF\beta_{1} del eyaculado total, conteniendo la próstata y
las secreciones de la glándula de coagulación sólo pequeñas
cantidades de TGF\beta_{1}. Se confirmó que la adición de
rTGF\beta_{1} a las células del epitelio uterino en cultivo e
in vivo aumenta la producción de GM-CDF de un
modo sensible a la dosis (Figura 3).
Se observó que la administración de
rTGF\beta_{1} al lumen uterino de ratones en celo no sólo
aumenta la producción de GM-CSF uterino, sino que
también inicia la afluencia y activación de células inflamatorias
similares a las observadas después del apareamiento (Tabla 1 y
Figura 6). Este resultado apoya adicionalmente la propuesta de que
TGF\beta puede replicar completamente la respuesta inflamatoria
después del apareamiento en la situación natural por el plasma
seminal.
Los experimentos in vitro con
queratinocitos del cuello del útero humanos y el tejido endometrial
indicaron que tanto el semen como rTGF\beta_{1} pueden provocar
un aumento en la producción de GM-CSF de los tejidos
del tracto reproductor en mujeres (Figura 7). Además, el contenido
de actividad quimiotáctica para los leucocitos en los sobrenadantes
de cultivos de queratinocitos se potenció por el tratamiento con
semen o rTGF\beta_{1} (Figura 8), que apoya adicionalmente un
papel principal para TGF\beta seminal en la cascada inflamatoria
después de la cópula en mujeres (63).
| tratamiento | n | CD45 | F4/80 | Mac-1 | 1a | RB6-8C5 | peroxidasa |
| vehículo | 5 | 15 (8-19)^{a} | 15 (12-25)^{a} | 9 (7-21)^{a} | 20 (8-23)^{a} | 11 (5-15)^{a} | 4 (4-7)^{a} |
| rhTGF-\beta1 | 4 | 28 (13-39)^{ab} | 37 (30-48)^{b} | 23 (18-42)^{a} | 25 (15-35)^{ab} | 15 (4-20)^{a} | 15 (11-19)^{9} |
| apareado | 4 | 41 (30-60)^{b} | 31 (21-49)^{b} | 48 (46-56)^{b} | 32 (26-57)^{b} | 36 (15-41)^{b} | 13 (10-20)^{b} |
Se recogieron los tejidos 16 h después del
apareamiento natural con machos intactos, o después de la
administración de 20 ng de rhTGF\beta_{1} en 50 \mul de
PBS/BSA al 1%, o sólo vehículo, a la cavidad luminal del útero de
ratones en celo. Se determinó la reactividad del tejido endometrial
con mAb específicos para todos los leucocitos
(anti-LCA), macrófagos (F4/80 y
anti-Mac), neutrófilos
(anti-Mac-1 y
RB6-8C5), y macrófagos activados/células
dendríticas (Ia), por inmunohistoquímica y análisis de imágenes de
vídeo. Los eosinófilos se detectaron por tinción para la actividad
peroxidasa endógena (peroxidasa). La reactividad con mAb se expresa
como el porcentaje medio (intervalo) de la positividad. La cantidad
de ratones en cada grupo de experimento = n. Los datos se compararon
por un ensayo ANOVA de una vía de Kruskal-Wallis y
de Suman de Rando de Mann Whitney. Los conjuntos de datos marcados
con diferentes letras minúsculas en las columnas indican significado
estadístico entre grupos de tratamiento (p<0,01).
Previamente, se descubrió que la exposición a
semen en el apareamiento causa una respuesta inflamatoria intensa
pero transitoria, y se implicaron en esta respuesta factores del
plasma seminal derivados de la vesícula seminal. En estudios en
ratones, se ha identificado el fluido de la vesícula seminal como un
determinante fundamental en el desarrollo y el implante del embrión.
Además, la exposición a semen en el apareamiento ha demostrado
tener un importante papel en la inducción de tolerancia materna
antes del implante, y se han identificado factores presentes en el
plasma seminal como necesarios para la inducción de este estado, lo
que sugiere que el efecto beneficioso del plasma seminal sobre el
resultado del embarazo puede deberse al menos en parte a los efectos
de desviación inmune de este fluido.
Para ensayar la importancia de la exposición al
fluido residual seminal para el éxito del embarazo, se aparearon
hembras Balb/c F1 con machos CBA de los que se habían retirado
quirúrgicamente las vesículas seminales (sementales SV). No había
sitios de implante en el útero en el día 17 de embarazo (n = 12
hembras). Esta infertilidad total no se debía a una ausencia de
fertilización, sino que estaba asociada al fracaso del implante o la
resorción fetal temprana. Esto puede reflejar una intolerancia
materna insuficiente de los embriones
semi-alogénicos debida a la ausencia o exposición a
TGF\beta residual seminal en el apareamiento.
| Intacto | SV- | ||
| Número de hembras con embriones en el día 3 (%) | 8/8 (100%) | 8/8 (100%) | |
| # embriones @ día 3 (media\pmSD) | 8,0\pm2,1 | 9,0\pm2,0 | |
| Número de hembras con sitios de implante en el día 17 (%) | 10/10 (100%) | 0/12 (0%) | |
| # implantes @ día 17 (media\pmSD) | 7,5\pm1,8 | 0 |
Se sacrificaron ratones Balb/c F1 que habían
apareado de forma natural con machos CBA intactos o deficientes en
la vesícula seminal (SV-) a las 1600 h del día 3 para evaluar el
desarrollo embrionario, o en el día 17 para determinar la cantidad
de sitios de implante.
Para investigar la importancia del semen,
particularmente el fluido de la vesícula seminal, sobre la inducción
de la respuesta inmune Th1 contra antígenos MHC paternos, se
aparearon ratones hembra Balb/c (H-2^{k}) con
machos sementales Balb/k intactos o Balb/c oncogénicos
(H-2^{d}), o sementales Balb/c SV-. Para conseguir
un pseudoembarazo, se ligaron los úteros de las hembras Balb/c en
la unión del ovario y las trompas 2 semanas antes del apareamiento.
La sensibilidad inmune a antígeno MHC de clase I
(H-2^{d}) se evaluó midiendo el crecimiento de
células tumorales inyectadas en el día 4 de embarazo o
pseudoembarazo. Las células tumorales se rechazaron en la mayoría
de las hembras Balb/k que se habían apareado con machos Balb/k, pero
crecieron en hembras Balb/k embarazadas u pseudoembarazadas que se
habían apareado con machos Balb/c. En contraste, los tumores
habitualmente no crecieron en ratones Balb/k que se habían apareado
con machos SV-Balb/c. Estos datos demuestran que
la exposición a semen es suficiente para inducir tolerancia
específica a antígenos MHC de clase I paternos, incluso en ausencia
de un embarazo consiguiente, y demuestran que esta tolerancia
depende de factores derivados de la vesícula seminal (Tabla
III).
| Hembra | Macho | estado en el momento | crecimiento del | tamaño medio |
| de inyección de JR-5 | tumor en el día 17 (%) | del tumor # | ||
| Balb/c | virgen | 11/11(100) | ++++ | |
| Balb/c | Balb/c | d4 embarazada | 5/5(100) | ++++ |
| Balb/k | virgen | 0/10(0) | - | |
| Balb/k | Balb/c | d4 embarazada | 13/14(93) | +++ |
| Balb/k | Balb/c(vas) | d4 pseudo embarazada | 5/7(71) | ++ |
| Balb/k | Balb/c(SV-) | d4 embazarada | 4/11(36) | ++ |
| Balb/k (ut lig) | Balb/c | d4 pseudo embarazada | 9/9(100) | +++ |
| Balb/k | Balb/k | d4 embarazada | 5/51(33) | ++ |
| Balb/k | C57B1k x CBA | d4 embarazada | 4/8(50) | + |
| Balb/k (ut lig) | C57B1k x CBA | d4 pseudo embarazada | 4/8(50) | + |
Se aparearon ratones hembra Balb/c
(H-2d) o Balb/k (H-2k) con
sementales Balb/c o C57Blk x CBA F1 (H-2b/k). En
algunos grupos se ligaron los úteros de las hembras Balb/k en la
unión del ovario y las trompas 2 semanas antes del apareamiento (ut
lig). Otros grupos de ratones Balb/k se aparearon con machos Balb/c
vasectomizados (vas) o machos Balb/c de los que se habían retirado
las vesículas seminales al menos 2 semanas antes del apareamiento
(SV-). El día del descubrimiento de la carga vaginal se llamó día 1
de embarazo o pseudoembarazo. Se inyectaron células tumorales
Balb/c (células de fibrosarcoma JR-5, 10^{5}) s.c.
en el día 4, y se midió el crecimiento tumoral (diámetro, en dos
dimensiones) en el día 17 de embarazo o pseudoembarazo (++++ = >8
mm; +++ = >5 mm; + = 1-3 mm).
Para evaluar el efecto de TGF\beta sobre la
inducción de las respuestas inmunes Th1 y Th2 contra los antígenos
de esperma CBA, se inmunizaron hembras Balb/c F1 por infusión
intra-uterina con esperma CBA, en presencia o
ausencia de rTGF\beta, en dos ocasiones separados por semanas. El
desarrollo de inmunidad Th1 anti-esperma se evaluó
dos semanas después midiendo la respuesta DTH frente a una
estimulación subcutánea con antígeno de esperma, y midiendo el
contenido en suero de inmunoglobulina anti-esperma
reactiva de la subclase IgG_{2b}. Mientras que el esperma
administrado solo o en presencia de Adyuvante Completo de Freund
provocó una respuesta DTH fuerte y una respuesta de anticuerpos
IgG2b moderada, la inmunización en presencia de TGF\beta disminuyó
sustancialmente estos parámetros, y fue comparable con la respuesta
provocada por un apareamiento natural (Figura 8). En contraste, la
síntesis de inmunoglobulina reactiva a esperma del isotipo IgG1 (que
indica inducción de una respuesta Th2) sucedió a un grado similar en
todos los grupos de tratamiento, independientemente de la presencia
de TGF\beta en el inóculo de inmunización.
En otro experimento, se investigó el efecto de
TGF\beta sobre la inducción de "tolerancia" a antígenos MHC
paternos asociado con el esperma. Los ratones hembra Balb/k
(H-2k) a los que se había dado infusiones
intra-uterinas de esperma de machos Balb/c
(H-2d) junto con rTGF\beta_{1} no pudieron
rechazar las células tumorales que albergan antígeno MHC paterno
inyectadas 4 días después, mientras que los tumores se rechazaron en
ratones vírgenes o ratones a los que se había dado esperma solo
(Tabla IV). El rechazo tumoral también estuvo comprometido en
ratones a los que se había administrado TGF\beta sin antígeno de
esperma, aunque los tumores en este grupo de tratamiento no fueron
tan grandes como los que crecieron en ratones que habían recibido
tanto antígeno como TGF\beta.
Estos dos experimentos demuestran que el
suministro de antígenos paternos en combinación con TGF\beta al
tracto reproductor femenino puede generar tolerancia sistémica
específica de antígenos paternos, específicamente inhibiendo el
compartimiento Th1 de la respuesta inmune. Este efecto de desviación
inmune depende de la administración de TGF\beta ya que el
antígeno dado solo provoca inmunidad Th1 en oposición a la
tolerancia. TGF\beta dado en ausencia de antígeno puede otorgar un
estado de tolerancia parcial, no específico de antígeno.
| Tratamiento | crecimiento del | tamaño medio |
| tumor en el día 17 (%) | del tumor # | |
| 5 x 10^{6} espermas Balb/c | 3/8 (38) | + |
| 10 ng TGF\beta | 5/7 (71) | +++ |
| 5 x 10^{6} espermas Balb/c + 10 ng TGF\beta | 6/9 (67) | ++++ |
| Control (PBS) | 0/6 (0) | - |
Se ligó el útero de ratones hembra Balb/k, y
después de dos semanas se sincronizaron en el celo por
administración de agonista de GnRH. A las 0900 h - 1200 h del día
del celo, se anestesió a los ratones y se les dieron inyecciones
intra-uterinas de 5 x 10^{6} espermas de Balb/c
y/o 10 ng de TGF\beta en 100 \mul de PBS (50 \mul
administrados por trompa). Se inyectaron s.c. células tumorales
Balb/c (células de fibrosarcoma JR-5, 10^{5}) 72
horas después de la cirugía, y se midió el crecimiento tumoral
(diámetro, en dos dimensiones) 13 días después (++++ = >8 mm; +++
= >5 mm; + = 1-3 mm).
Los experimentos descritos anteriormente
demuestran que las secreciones de la vesícula seminal pueden
provocar hipo-sensibilidad Th1 que se manifiesta
como "tolerancia" en la respuesta inmune materna específica
para antígenos seminales, incluyendo pero probablemente no
limitados a antígenos MHC paternos, depositados en el tracto
reproductor femenino en el apareamiento. Los datos sugieren que se
produce un resultado reproductor disminuido cuando se ha iniciado
el embarazo en ausencia de exposición a plasma seminal, quizás a
causa de la inducción inadecuada de la "tolerancia" materna a
los antígenos del concepto. Por lo tanto se realizó un experimento
para ensayar la hipótesis de que un estado previo de
"tolerancia" mediada por TGF\beta a antígenos del semen
paterno puede beneficiar al rendimiento reproductor. Este
experimento constó de inmunización intra-uterina de
hembras Balb/c F1 con esperma CBA, con o sin rTGF\beta_{1}, dos
semanas antes del apareamiento con sementales machos CBA intactos.
La inmunización con esperma más TGF\beta_{1} produjo un aumento
en el peso medio del feto y la placenta (Tabla V), a pesar de una
pequeño descenso en el tamaño de la camada que fue evidente en
todas las hembras inmunizadas con esperma independientemente de la
presencia de TGF\beta. Este aumento aún fue evidente después del
ajuste para diferentes cantidades de fetos por trompa uterina,
rebajando de este modo el efecto del tamaño de la camada (Figura
9).
Se ha informado de que la inducción de
hipo-sensibilidad Th1 contra antígenos paternos
produce un resultado del embarazo mejorado en mujeres que han
experimentado previamente aborto natural recurrente (102). Aunque
no existen datos sobre la capacidad de la inmunización con antígeno
paterno/TGF\beta para iniciar la hipo-sensibilidad
Th1 contra los antígenos paternos, o para desviar las respuestas
inmunes Th1 previamente existentes en mujeres, ni sobre la
capacidad de TGF\beta de mejorar el resultado reproductor, es
probable que éste sea el caso. Es la primera vez que se ha
realizado un ensayo controlado, a gran escala y aleatorizado que
investiga el efecto de la exposición a semen sobre el resultado del
tratamiento IVF. Este ensayo ha confirmado que las mujeres
expuestas a semen (que contiene antígeno paterno y TGF\beta
natural) aproximadamente en el momento de la transferencia del
embrión descongelado tienen un riesgo reducido de pérdida
embrionaria temprana en comparación con aquéllas a las que se pidió
abstinencia (Tabla VI). Esta mejora en el resultado reproductor está
probablemente mediado por la tolerancia inmune materna hacia los
antígenos paternos iniciada por TGF\beta y antígenos seminales en
el momento del coito.
| Control | esperma + | esperma | |
| <TGF\beta1 | |||
| número | 139 | 144 | 103 |
| tamaño más pequeño (total) | 11,4 \pm 1,0^{a} | 10,4 \pm 1,2^{b} | 10,3 \pm 0,9^{b} |
| tamaño más pequeño (viable) | 11,25 \pm 1,3^{a} | 10,1 \pm 1,5^{b} | 10,1 \pm 0,9^{b} |
| Nº de resorciones | 0,167 \pm 0,58^{a} | 0,21\pm 0,58^{a} | 0,20 \pm 0,42^{a} |
| peso fetal (mg) | 645,2 \pm 61,2^{a} | 677,6 \pm 56,6^{b} | 646,1 \pm 49,9^{a} |
| peso de la placenta (mg) | 97,7 \pm 12,1^{a} | 105,2 \pm 12,4^{b} | 101,8 \pm 9,8^{b} |
| proporción en peso fetal:placenta | 6,69 \pm 0,9^{a} | 6,5 \pm 0,8^{ab} | 6,36 \pm 0,8^{b} |
Se inmunizaron ratones hembra Balb/c por
infusión intra-uterina con esperma CBA en presencia
o ausencia de 10 ng de rTGF\beta_{1}, y se aparearon con machos
CBA 2 semanas después. Las hembras se sacrificaron en el día 17 del
embarazo y se determinaron la cantidad de sitios de implantes total,
viables y en resorción, así como los pesos del feto y de la placenta
de conceptos viables. Los valores son medias \pm SD. Las
comparaciones entre grupos fueron por ensayo ANOVA de una vía de
Kruskal Wallis seguido por ensayo de suma de rango de Mann Whitney
(p<0,05).
| Coito | abstinencia | significado | |
| ciclos de transferencia | 59 | 56 | NS |
| embriones transferidos | 106 | 107 | NS |
| implantes (%) | 11/106 (10,3) | 11/107 (10,2) | NS |
| conceptos viables a las 6 semanas (%) | 10/106 (9,4) | 7/107 (6,5) | NS |
| ciclos de transferencia con embarazo | 9/59* (15,3) | 7/56 (12,5) | NS |
| bioquímico | |||
| pérdida de embarazo bioquímico | 0 (0) | 2/11 (8,2) | NS |
| aborto natural clínico | 1/11 (9) | 2/11 (18,2) | NS |
| pérdida total del embarazo | 1/11 (9) | 4/11 (36,4) | 0,043 |
Resultado del embarazo después de la
transferencia del embrión descongelado. Las características del
paciente no fueron significativamente diferentes entre los dos
grupo. Se definió un embarazo bioquímico como \betaHCG en suero
que exceda de 25 IU y un embarazo clínico como un concepto/polo
fetal observado por ultrasonidos a las 6 semanas de gestación. El
análisis estadístico se realizó usando el cálculo de Chi cuadrado.
NS = no significativo. * = embarazo de gemelos.
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Claims (34)
1. Uso de TGF\beta, o una modificación del
mismo que es eficaz para provocar una reacción inmune tolerante
transitoria eficaz, en la fabricación de un medicamento para tratar
una afección de infertilidad en una posible madre humana o de
mamífero, en el que el medicamento está adaptado para administrarse
antes de la concepción intentada, caracterizado porque la
afección de infertilidad implica la ausencia de tolerancia inmune a
los antígenos paternos y se selecciona entre aborto natural
recurrente, pre-eclampsia o restricción del
crecimiento intra-uterino (IUGR).
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque el TGF\beta es TGF\beta_{1}, o
una modificación del mismo.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque el TGF\beta es TGF\beta_{2}, o
una modificación del mismo.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque el TGF\beta es TGF\beta_{3}, o
una modificación del mismo.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque el TGF\beta, o una modificación del
mismo, es un miembro de la superfamilia de TGF\beta.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5,
caracterizado porque el miembro de la superfamilia de
TGF\beta es activina.
7. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación
precedente, caracterizado porque TGF\beta es para
administrarse en una forma no purificada usando una fuente biológica
rica en TGF\beta.
8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7,
caracterizado porque el TGF\beta es para administrarse en
forma de plaquetas.
9. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación
precedente, caracterizado porque el medicamento es para
administrarse para proporcionar TGF\beta a 50 ng/ml o más por
dosis, con una dosis total de 150 ng.
10. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el medicamento
es para administrarse para proporcionar TGF\beta entre 100 y 400
ng/ml por dosis, con una dosis total de 100 a 2000 ng.
11. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación
precedente, caracterizado porque el medicamento está adaptado
para administrarse a una superficie mucosa.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11,
caracterizado porque la superficie mucosa es una superficie
de la mucosa oral, una superficie de la mucosa respiratoria, una
superficie de la mucosa gastrointestinal, o la superficie de la
mucosa genital.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 11,
caracterizado porque el medicamento está adaptado para
administrase al tracto genital femenino.
14. Uso de acuerdo con cualquier reivindicación
precedente, caracterizado porque el medicamento es un
gel.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14,
caracterizado porque el gel es un gel vaginal.
16. Uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el medicamento
es un pesario.
17. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el
medicamento es para inyectarse para el contacto sistémico.
18. Uso de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, caracterizado porque el
medicamento es para exposición múltiple de la posible madre.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación
18, caracterizado porque la exposición múltiple se realiza en
un periodo que abarca al menos tres meses antes de intentar la
concepción.
20. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el
medicamento es para administrarse al menos una semana antes de
intentar la concepción.
21. Uso de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, caracterizado porque el
medicamento es para administrarse al menos una vez después de la
posible fecha de concepción.
22. Uso de acuerdo con la reivindicación
21, caracterizado porque el medicamento es para administrarse
durante las primeras 12 semanas de embarazo.
23. Uso de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, caracterizado porque el
medicamento es para administrarse en uno o más sitios.
24. Uso de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, caracterizado porque el
medicamento es para administrarse junto con antígenos paternos.
25. Uso de acuerdo con la reivindicación
24, caracterizado porque se expone una superficie mucosa de
la posible madre a los antígenos paternos.
26. Uso de acuerdo con la reivindicación
25, caracterizado porque la superficie mucosa es una
superficie de la mucosa genital.
27 Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 24 a 26, caracterizado porque los
antígenos son antígenos MHC.
28. Uso de acuerdo con la reivindicación
27, caracterizado porque los antígenos MHC son antígenos MHC
de clase 1.
29. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 24 a 28, caracterizado porque los
antígenos paternos están presentes en células que contienen
antígenos MHC.
30. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 24 a 29, caracterizado porque los
antígenos están presentes sobre y/o en el interior de las células
espermáticas del posible padre.
31. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 24 a 29, caracterizado porque los
antígenos están presentes en el plasma seminal del posible
padre.
32. Uso de acuerdo con la reivindicación
24, caracterizado porque los antígenos están presentes en los
leucocitos del posible padre.
33. Uso de acuerdo con la reivindicación
32, caracterizado porque el medicamento es para administrarse
con entre 10^{7} y 10^{9} leucocitos que llevan antígenos
paternos.
34. Uso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 24 a 33, caracterizado porque el
medicamento y los antígenos son para administrarse temporalmente
espaciados entre sí.
35. Uso de acuerdo con la reivindicación
25, caracterizado porque los antígenos paternos se
proporcionan en el semen a la superficie de la mucosa genital de la
posible madre en forma del eyaculado del posible padre.
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