KR100382685B1

KR100382685B1 - 경관의성숙을유도하기위한단핵세포화학주성펩타이드-1의용도

Info

Publication number: KR100382685B1
Application number: KR1019960705481A
Authority: KR
Inventors: 로드니 윌리암 켈리
Original assignee: 메디칼 리서취 카운실
Priority date: 1994-03-31
Filing date: 1995-03-31
Publication date: 2003-08-02
Also published as: US5908829A; WO1995026748A1; JPH09510988A; ATE253933T1; NO964076D0; CA2186370A1; NZ282876A; EP0752883B1; AU703297B2; FI963915A; GB9406463D0; RU2207873C2; DE69532112T2; EP0752883A1; NO964076L; DK0752883T3; AU2080195A; DE69532112D1; ES2210287T3; PT752883E

Abstract

본 발명은 경관 성숙을 유도하는데 유용한, 예를 들면 (A) 예정일에 분만의 유도, (B) 병리학적 임신과 관련된 분만의 유도, (C) 자궁내 태아 사망과 관련된 분만의 유도, (D) 낙태의 유도, (E) 예정일전 분만의 유도, (F) 외과 또는 진단 방법을 보조하기 위한 비임신 여성 또는 임신 여성의 경관 성숙 유도, 및 (G) 시험관내 수정에 의해 치료되는 여성의 경관 성숙 유도에 유용한, 단핵세포 화학주성 펩타이드-1 또는 이의 작용성 유도체에 관한 것이다.

Description

경관의 성숙을 유도하기 위한 단핵세포 화학주성 펩타이드-1의 용도{Use of MCP-1 for inducing ripening of the cervix}

분만(자궁으로부터 태아의 만출)은 충분히 신장되고 확장되어 태아가 만출될 수 있도록 자궁근층의 수축, 자궁 평활근의 수축 및 경관의 고도의 결합 조직의 연화를 필요로 한다. 이러한 연화는 “성숙”으로서 공지되어 있다.

현재 사용되는 바람직한 경관 성숙 방법은 프로스타글란딘 E2를 사용하는 것이다. 이는 질용 겔제 또는 정제로서 또는 경관 내에 위치하는 겔제로서 사용된다. PGE₂를 사용하는 것과 관련한 한 가지 염려스러운 점은 자궁의 과다 자극(hyper-stimulation)으로 경관이 성숙되기 전에, 그에 따라 편안하거나 또는 안전한 출산이 이루어지기 전에 자궁근층의 수축을 유도할 가능성이 있다는 것이다. 이상적인 제법은 자궁근층의 수축을 유발하지 않으면서 경관을 연화 및 소멸시킬 수 있다. 이는 후속하는 수축(소량의 프로스타글란딘이 필요한 경우 유도될 수 있음)이 최소 저항으로 아기를 분만할 수 있게 한다.

RU486 등의 안티프로게스틴이 이들 요건을 만족시킬 수 있다는 충분한 증거를 동물 실험으로부터 얻을 수 있지만, 이러한 약물이 갖는 문제점은 코르티솔 및 ACTH 수준의 증가를 유도하는 관련된 안티글루코코르티코이드 활성을 갖고[참조: X. Bertagna et al. J Clin Endocrinol Metab 78, 375-380(1994)], 태아에게 유해할 수도 있다는 것이다.

인터류킨-8을 사용하는 것은 경관을 성숙시키기 위한 시약으로서 이미 제안되어 있다(WO 93/09796). IL-8의 생산은 프로게스테론에 의해 억제되는 것으로 공지되어 있다[참조: R W Kelly et al., The Lancet, 339, 776-777(1992); R W Kelly et al., Human reproduction 9, 253-258(1994)].

발명의 요약

본 발명에 이르러, 놀랍게도 융모탈락막 조직에 의한 단핵세포 화학주성 펩타이드-1(MCP-1)의 생성이 프로게스테론에 의해 억제되는 것으로 밝혀졌다. 융모탈락막 조직은 태낭의 외부에 있고, 그에 따라 경관 영역내의 자궁과 접촉하는 것으로 밝혀졌다. MCP-1과 다른 β-케모카인 및 그 단편과 유사체는 경관 성숙에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 활성성분으로서의 폴리펩타이드 (a)단핵세포 화학주성 펩타이드-1 (MCP-1) 또는 다른 β-케모카인, (b)단핵세포에 화학주성인 상기 (a)의 단편, 또는 (c)상기 (a) 또는 (b)와 75% 이상의 상동성이 있고 단핵세포에 화학주성인 상기 (a) 또는 (b)의 유사체 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 이의 혼합물을 포함하는 자성 포유동물의 경관의 성숙을 유도하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 자성 포유동물은 사람 또는 동물일 수 있다. 전형적으로는 여성인 사람이다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 포유동물의 출산 또는 낙태를 보조하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 유도체는 국소 작용을 개시할 수 있으며, 때때로 프로스타글란딘의 사용과 관련된 과도한 자궁근층 수축을 유도하지 않는다. 따라서, 이들 화합물은 태아를 손상시키지 않을 수 있다. 출산 중에 경관은 외부의 도움 없이 통상적으로 성숙한다. 그러나, 본 발명의 화합물은 성숙이 충분하지 않은 모든 출산 상황 중에 및 통상적인 성숙 중에 조력할 수 있다. 추가로, 이들 화합물은 여성의 출산 과정이 보다 용이해지도록 통상적인 성숙을 지원할 것이다. 따라서, 출산, 낙태 및 수술 및 진단 치료 중에 고통을 완화시키거나 또는 피할 수 있다.

본 발명은 경관의 성숙을 위한 치료, 특히 포유동물의 출산을 보조하는 작용을 유도하는 치료에 관한 것이다.

단핵세포 화학주성 및 활성화 인자(MCAF)로서도 알려진 MCP-1은 섬유아세포 또는 단핵세포로부터 얻을 수 있다[참조: T Yoshimura et al., FEBS Letters, 244, 487-493; T Yoshimura et al., J Immunol 144, 2377-2383(1990); M W Rolfe et al., Am J Physiol 263 L536-L545(1992)]. MCP-1은 IL-8의 합성 방법의 변형을 사용하는 펩타이드 합성에 의해 또는 재조합 DNA 합성에 의해 얻을 수 있다[참조: I Clark-Lewis, Biochemistry, 30 3128-3135(1991)]. MCP-1은 배양중인 폴리I/폴리C 자극된 섬유아세포 등의 생물학적 공급원으로부터 얻을 수도 있다. MCP의 천연 변이체는 상이한 탄수화물 치환으로 인해 존재한다. 펩타이드는 말단 시알산 잔기를가지며, 어느 정도의 0-글리코실화는 상이한 분자량의 종을 유발한다[참조: T Yoshimura, Baggiolini M and Sorg, C "Interleukin-8(NAP-1) and related cytokines" Karger, Basel, 131-152(1992)].

MCP-1외의 β-케모카인, 그리고 MCP-1 또는 다른 β-케모카인의 단편 및 유사체역시 자궁 경관 성숙을 유도할 수 있다. 이는 시험에 의해 측정될 수 있다. MCP-1의 “단편”이란 MCP-1의 단축된 형태이다. 단편은 전형적으로 6 내지 n-1개와 잔기를 함유할 수 있으며, 여기서 n은 천연 분자의 아미노산 잔기수이다. 따라서, 단편은 6 내지 50개의 잔기, 예를 들면 10 내지 40개 또는 15 내지 25개의 잔기로 구성될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드의 다른 예로는 MCP-2 및 MCP-3로 불리는 종양-유도된 변이체가 있다[참조: J van Damme et al., J Exp Med 176, 59-65(1992)]. MCP-1의 “유사체”는 MCP-1 또는 이의 단편과 실질적으로 유사한 천연적으로 존재하지 않는 분자이다. 분자는 두 분자 중의 아미노산 서열이 실질적으로 동일하고 두 분자가 유사한 생물학적 활성을 갖는 경우에 다른 분자와 “실질적으로 유사하다”고 말한다.

MCP-1은 일종의 β-케모카인 또는 C-C 케모카인이다. β-케모카인은 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 전형적으로, 사람 β-케모카인은 사람 여성의 치료에 사용된다. 동물 β-케모카인은 사람 β-케모카인과 병용할 수 있는 경우에 사람 여성의 치료에 사용될 수 있다. 이는 시험에 의해 측정될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 바람직한 β-케모카인은

사람 MCP-1, 사람 MCP-2, 사람 MCP-3;

사람 RANTES;

사람 MIP-1α, 사람 MIP-1β; 및

1-309이다.

이들 β-케모카인은 문헌[참조: R. Callard and A. Gearing, "The Cytokine Facts Books", Academic Press, London 1994]에 상세히 기재되어 있다. 이들의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타낸다. β-케모카인은 단핵세포에 대해 모두 화학주성이다. MCP-1, MCP-2, MCP-3, PANTES, MIP-1α, MIP-1β 및 I-309의 시험관내 생물학적 작용은 하기 표 2에 나타낸다. I-309는 쥐 TCA-3 유전자의 사람 상동물이다[참조: S.D Wilson et al., J Immunol 145, 2745-2744(1990); M.D. Miller et al., J. Immunol 143, 2907-2916(1989); P.R. Burd et al., J. Immunol 139, 3126-3131(1987)].

β-케모카인의 단편은 본 발명에 사용될 수 있다. 이 단편은 경관의 성숙을 유도할 수 있어야 한다. 이는 시험에 의해 측정될 수 있다. 적절한 단편은 6 내지 n-1개의 아미노산 잔기를 함유할 수 있으며, 여기서 n은 β-케모카인의 아미노산 잔기수이다. 따라서, 단편은 6 내지 50개의 잔기, 예를 들면 10 내지 40개 또는 15 내지 25개의 잔기로 구성될 수 있다.

경관의 성숙을 유도할 수 있는 β-케모카인 유사체는 본 발명에서 별개로 사용될 수 있다. 경관 성숙을 유도하는 유사체의 능력은 시험에 의해 측정될 수 있다. 유사체는 β-케모카인의 아미노산 서열, 예를 들면 표 1에 기재된 아미노산 서열 중의 하나, 또는 β-케모카인의 단편 중의 하나를 변형시킴으로써 유도될 수 있다.

β-케모카인의 아미노산 서열 또는 이의 단편은 1개 이상의 아미노산의 치환 및/또는 삽입에 의해 및/또는 말단중 어느 하나 또는 각 말단에서의 신장에 의해 변형될 수 있다. 변형되지 않은 β-케모카인 또는 β-케모카인 단편의 아미노산 서열과 이의 유사체의 아미노산 서열 사이에는 75% 이상의 상동성이 있다. 상동성은 85% 이상 또는 95% 이상일 수 있다.

보존적인 아미노산 치환체는 β-케모카인 또는 β-케모카인 단편의 천연 서열이 될 수 있다. 15개 이하의 이러한 치환체는 예를 들면 1 내지 10개, 또는 2 내지 6개로 이루어질 수 있다. 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 치환체가 제조될 수 있다.

보존적 치환체의 후보자는 하기 표 3에 나타낸다. 표 3에 사용된 기호 및 약어는 생화학적 명명법[참조: "Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides, Recommendations 1983" J. Biol. Chem. 260, 14-42(1985)]에 의거IUPAC-IUB Joint Commission에 의해 추천 받은 것들이다. 사용된 다른 약어는 아래와 같다:

- Nle: 노르류신,

- Aib: 아미노이소부티르산,

- AdaA: β -아다만틸알라닌,

- AdaG: α -아다만틸글리신,

- homo-Arg: L-호모아르기닌,

- D-homo-Arg: D-호모아르기닌,

- Acp: 아미노카프로산,

- Chg: L-α-사이클로헥실글리신,

- allo-Thr: L-알로트레오닌,

- Cha : β-사이클로헥실알라닌,

- Orn : 오르니틴,

- pyro-Glu : 파이로글루타밀,

- Met(0) 및 D-Met(0) : 각각 L- 및 D-메티오닌으로부터 유도된 설폭사이드,

- β-Ala : β-알라닌,

- Acm : 아세트아미도메틸,

- L-Dopa : 3-(3,4-디하이드록시페닐)-L-알라닌, 및

- Bpa : 4-벤조일-페닐알라닌.

따라서, 최초 서열의 물리화학적 특성, 즉 충전 밀도, 소수성/친수성, 크기 및 배열이 보존될 수 있다. 따라서, 천연 β-케모카인 또는 β-케모카인 단편과 실질적으로 유사한 분자가 생산될 수 있다. 유사성은 시험에 의해, 예를 들면 단핵세포와 관련시켜 화학주성에 대해 측정할 수 있다. 상기한 바와 같은 바람직한 개개의 β-케모카인의 유사체의 경우, 그 유사체는 표 2에 나타낸 시험관 내에서의 생물학적 작용에 대해 시험할 수 있다.

유사체는 β-케모카인 또는 β-케모카인 단편의 아미노산 서열에 10개 이하의 아미노산 잔기, 예를 들면 1 내지 5개의 잔기를 삽입함으로써 유도할 수 있다. 유사체는 β-케모카인의 C-말단 또는 N-말단에서 신장시킴으로써 유도할 수 있다. 이러한 신장은 10개 이하의 아미노산 잔기 길이, 예를 들면 1 내지 5개의 잔기 길이일 수 있다. 신장부로서 삽입 및/또는 부가를 위한 잔기는 생성되는 유사체가 β-케모카인 또는 적절한 경우 이로부터 유도되는 β-케모카인 단편과 실질적으로 유사한 활성을 갖도록 선택된다.

또한, 본 발명은 유효량의 MCP-1 또는 이의 작용성 유도체를 자성 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 요하는 자성 포유동물의 경관의 성숙을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 경관 성숙이 요구되는, 사람 및 사람의 그것과 유사한 기본적 분만 메카니즘을 갖는 임의의 다른 포유동물에 적용된다.

투여는 경관에 도달할 수 있는 임의의 방식으로 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 따라서, 활성 화합물은 통상적으로 질내로 또는 경관에 직접적으로, 예를 들면 전형적으로 겔제 또는 크림제로서 적용할 수 있다. 경관에 주사할 수도 있다. 또한, 양막-외부에, 즉 자궁벽과 양막 낭 사이에 카테테르를 사용하여 적용할 수 있다.

안전하고 효과적인 양의 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 투여된다. 적용량은 숙주, 투여 모드 및 목적 등의 많은 인자에 따라 좌우될 것이다. 투여량은 통상적으로 경관에 대해 0.001 내지 20mg, 예를 들면 0.01 내지 20mg일 것이다. 투여는 일시에 모두, 분복 용량으로 또는 서방출에 의해 이루어질 수 있다.

투여 시간은, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 투여하는 목적 등 많은 인자에좌우될 것이다. 출산과 관련되는 경우, 그 시간은 분만 과정에 의존할 것이다. 출산 중에, 경관은 자궁근층의 수축이 시작되기 전에 또는 시작하려 할 때에 성숙되도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따는 폴리펩타이드는 출산 또는 낙태와 관련하여 사용될 수 있다. 이러한 임신 상황에서, 경관은 미리 처리된다. 임신중에 호르몬은 이후 다른 자극원에 효과적으로 반응하는 경향이 있는 경관을 변화시킨다. 본 발명에 따는 폴리펩타이드는 수술 방법 및 진단 방법과 관련하여 사용될 수도 있다. 따라서, 이들은 다음 용도로 사용될 수 있다:

(A) 예정일(통상적인 출산 시간, 옥시토신 또는 유사한 시약을 사용하는 후속 치료가 임의로 조합됨)에 분만의 유도,

(B) 병리학적 임신(태아 기형)과 관련된 분만의 유도(바람직한 제2의 3개월기 낙태),

(C) 자궁내 태아 사망과 관련된 분만의 유도,

(D) 낙태의 유도(바람직한 제2의 3개월기 낙태),

(E) 예정일 전의 분만 유도,

(F) 수술 또는 진단 방법을 보조하기 위해 비임신 여성 또는 임신 여성의 경관 성숙 유도, 및

(G) 시험관내 수정에 의해 치료되는 여성의 경관 성숙의 유도

본 발명에 따는 폴리펩타이드는 자연 분만 또는 수술에 의해 보조되는 방법인지를 불문하고 분만을 보조하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따는 폴리펩타이드는 원치 않는 태아의 제거, 예를 들면 자연적으로 또는 수술에 의해 보조될 수 있는 낙태 방법에 유용하다.

또한, 본 발명에 따는 폴리펩타이드는 보조된 수태 방법 및 내시경 검사 등의 다른 조작을 조장하도록 경관을 연화시키기 위해 사용될 수 있다. 연화된 경관의 처리는 상기 조작 및 다른 조작을 마취 없이 수행하도록 한다.

본 발명에 따는 폴리펩타이드는 또한 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물로서 통상적으로 제형화된다. 바람직한 조성물은 겔제 및 크림제이다. 겔제 및 크림제는 비히클 등의 임의의 적절한 수성 유성 물질을 함유할 수 있다. 다르게는, 본 발명에 따는 폴리펩타이드는 연질 캡슐, 리포좀, 좌약, 서방형 또는 방출지연형 제제, 또는 수용액, 예를 들면 염수 또는 단백질-함유 용액으로서 제형화될 수 있다,

겔제는 통상적으로 가교결합된 폴리에틸렌 글리콜, 가교결합된 전분 또는 폴리비닐 피롤리돈 등의 친수성 중합체일 수 있다. 겔제는 주사용 겔일 수 있다. 캡슐은 체액에 서서히 용해되는 중합체 또는 젤라틴 등과 같이 체열에 의해 연화될 수 있는 중합체로 이루어질 수 있다. 다양한 유형의 서방형 조성물, 예를 들면 매트릭스형(예를 들면 미합중국 특허 공보 제3,851,648호 참조) 또는 멤브레인형이 공지되어 있다.

본 발명에 따는 폴리펩타이드는 자궁근층의 수축을 유도하는 물질, 예를 들면 프로스타글란딘 E₂등의 프로스타글란딘 또는 자궁수축성 유효 화합물과 동시에투여될 수 있다. 이러한 동시 투여는 출산 또는 낙태와 관련하여 사용될 수 있다. 자궁수축성 유효 화합물은 유럽 특허 공보 제0 214 924호 및 유럽 특허 공보 제0 184 471호에 기재되어 있다. 바람직한 자궁수축성 유효 화합물은 옥시토신이다.

자궁근층의 수축을 유도하는 물질 또는 자궁수축성 유효 화합물과, 본 발명에 따는 폴리펩타이드는 상이한 경로(예를 들면 겔 및 주사)로 상이한 시간(예를 들면 먼저 MCP-1 또는 이의 작용성 유도체 및 6 내지 48시간 후 옥시토신)에 투여될 수 있다.

자궁근층의 수축을 유도하는 물질 또는 자궁수축성 유효 화합물과, 본 발명에 따는 폴리펩타이드는 하나의 키트내에 개별포장되어 충전될 수 있다. 그러나, 본 발명은 (1)본 발명에 따른 폴리펩타이드; (2) 프로스타글란딘 등의 자궁근층의 수축을 유도하는 물질, 예를 들면 프로스타글란딘 E₂; 및 (3) 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 상기 또는 하기 언급한 임의의 형태일 수 있다. 이는 제WO 93/07976호에 기재된 특정 형태의 IL-8을 포함한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명한다.

실시예 1

자궁내막 조직

자궁내막 조직은 환자의 동의하에 비악성 원인을 위해 전체 복식 자궁 절제술에 의해 얻었다. 작은(약 2mm x 2mm x 1mm) 조직편을 액체/공기 계면에 무균 폴리프로필렌 모세관 매트상에 위치시킨다. 사용된 매질은 10% 태아 송아지 혈청(Gibco) 페니실린(50㎍/ml) 및 스트렙토마이신(50단위/ml) 및 겐타마이신 5㎍/ml를 함유하는 RPMI 1640(Hyclone)이다. 조직은 공기중 5% CO₂분위기에서 배양액 중에 위치시키고 30분 내에 수집한다. 처리당 6개의 복제 웰을 사용한다. 조직 단백질 수준은 수산화나트륨에서 조직을 분해시킨 다음 열량 분석에 의해 측정한다.

융모 탈락막 세포

부착된 탈락막을 갖는 태아의 막은 만기에 선택적 제왕절개술로부터 얻었으며, 태반 위에 겹쳐 놓인 막의 영역은 사용하지 않는다. 융모막을 양막으로부터 분리시키고, 3-4mm 조각으로 절단하여 티로신 0.5%(w/v) 및 DNA아제 20mg/l를 갖는 RPMI 300ml와 함께 분해 플라스크에 넣는다. 조직을 40분 동안 분해시키고, 0.16mm 메쉬 나일론 필터를 통해 여과시킨다. 모든 세포의 생존 능력(트리판 블루만출)은 90% 이상이었다. 세포들을 웰당 200,000 세포로 1.7cm 직경의 웰에 플레이팅시키고, 공기중 5% CO₂분위기로 항온처리한다. 처리당 6개의 복제 웰을 사용한다. 스테로이드 처리는 배양한지 7일 후에 시작한다. 나타낸 데이터는 포르볼(phorbol) 에스테르(포르볼 미리스토일 아세테이트) 처리 후 24 내지 72시간에서 수집한 배지의 데이타이다.

프로게스테론, 및 메드록시 프로게스테론 아세테이트(MPA:6a-메틸-17a-아세톡시 프레근-4-엔-3,20-디온)은 시그마사로부터 입수한다. 스테로이드 스톡은 에탄올 중에 2mg/ml로 유지하고, 완전 배기중에서 희석하여 10배 농축 용액을 수득한다. 이러한 작업 용액의 10%를 항온처리 웰에 첨가한다. 에탄올의 최종 농도는 0.02%였으며, 이러한 농도의 에탄올을 가하여 웰을 조절한다. 스테로이드는 웰중에서 10^-6M로 사용한다.

MCP-1 분석

웰 중에서 생산된 MCP-1은 특이적 방사선 면역 분석에 의해 측정한다. MCP-1에 대한 항혈청(염소)는 R&D System, Oxford로부터 구매하고, 대략 1:12500의 희석비로 사용한다. 표지를 R&D System, Oxford의 사람 재조합 MCP-1의 요오드화(클로라민-T)에 의해 제조한 후, 카복시메틸 실리카 칼럼 상에서 크로마토그래피시킨다. 자궁내막 조직과 관련하여 상이한 중량의 전체 조직이 사용되는 경우, 그 결과는 용액 ml당 조직 mg당 MCP-1 ng으로 표현된다. 결과는 아래 표 4 및 5에 나타낸다.

동일한 조직에 대해서만 비교할 수 있는 결과는 MCP-1이 자궁내막(자궁 내부의 점막) 내에서 및 융모-탈락막 조직 내에서도 생산되었다. 생산은 임신을 유지하는 호르몬인 프로게스테론에 의해 억제된다. 경관에 융모-탈락막 조직이 근접하는 것은 MCP-1이 경관에 사용될 수 있음을 의미한다. 상기 설명한 바와 같이, 이러한 정보로부터 MCP-1이 경관 성숙에 유용하고, 그에 따라 이러한 성숙은 경관 부위에 MCP-1을 투여함으로써 유도 또는 증진될 수 있는 것으로 당연히 추정할 수 있다.

실시예 2

24마리의 암컷 래빗을 4개의 동일한 그룹으로 나눈다. 각각의 그룹은 6마리의 래빗으로 구성되었으며, 3마리는 임신하지 않았고, 3마리는 임신하였다. 모든 동물은 위약(대조군) 또는 MCP-1 100ng을 함유하는 질 좌약으로 처리한다. MCP-1은 폴리 1/폴리 C로 자극된 사람 섬유아세포로부터 제조하여 정제한다. MCP-1은 Toray Industries Inc. (Kamakara, Japan)으로부터 입수하고, ml당 0.1 내지 1ng에서 마크로파지에 대한 화학주성 활성을 갖고, ml당 1ng에서 THP-1 세포 중에서 칼슘 유입을 유도한다. 각각의 래빗에게 1, 2 또는 3일 동안 1일에 1개의 좌약을 투여한다. 동물들을 최종 투여후 24시간 경과하여 희생시킨다. 절개된 경관을 헤가 확장기(Hegar's dilator)를 사용하여 경도 및 확장에 대해 조사한다.

조직학적 절편을 준비하고, 헤모톡실린 및 에오신(H&E)로 염색하여 병리학적 변화를 연구한다. 래빗의 백혈구에서 발견되는 표면 항원 RT-2에 대한 면역조직학적 염색은 항-래빗 RT-2 모노클로날 항체(Cedarlane Laboratories Limited, 캐나다)를 사용하여 수행한다. 각각의 생검 시험편의 결합 조직중 5개의 랜덤 부분 내의 백혈구의 총수를 계수한다(배율 x 20).

상대적인 콜라겐 농도는 피크로시리어스 레드(Sirius red F3BA ChromaGesellschaft Schmid Gmbh, 독일)로 염색하여 평가하고, 경관의 것을 포함하는 조직의 중합된 콜라겐 농도의 조직학적 측정 방법으로서 확인한다.

조직학적 분석은 각 생검의 결합 조직의 5개의 랜덤 부분으로부터 광학 밀도(편광 투과율 %)를 측정함으로써 수행하고, 평균 광학 밀도를 산출한다. 모든 조직학적 측정을 위해 영상 분석기를 사용한다(Microscope: Olympus IMT-2, Video Camera SIT C2400-80 및 컴퓨터 분석기 시스템: ARGUS-100 Hamamatsu photonics). 피크로시리어스 레드 염색에서, 콜라겐 농도가 보다 클수록 복굴절이 보다 커지며, 따라서 광 투과율(%)이 보다 커진다.

각각의 경관에서, 결합 조직 100mg을 절개하고, 인산염-완충 염수로 균질화시키고, 원심분리한다. 상층 유체를 수집하여 사용하기 전까지 -80℃에서 저장한다. 콜라게나제 활성을 고도의 특이적 키트를 사용하여 이들 경관 유체 중에서 측정한다(콜라게나제 타입 I 활성 측정, Yagai, Japan). 한편, 엘라스타제 활성은 과립구 엘라스타제 S-2484에 대한 특이적 색소원 기질에 의해 측정한다(L-피로글루타밀-L-프롤릴-L-발린-P-니트라닐리드, KABI Diagnostic, Sweden). 엘라스타제 수준은 표 6에 나타냈으며, 호중구 효소 방출을 반영한다.

연화 및 확장은 MCP-1로 처리한 경관에서 관찰되었다. MCP-1의 효과는 시간에 따라 증가되었다. 조직학적 절편의 조사는 MCP-1의 적용 후 콜라겐 함량의 현저한 증가를 나타냈다. 콜라겐 번들은 느슨하게 되어 그라운드 매트릭스에 의해 광범위하게 분리된다. 동시에, 혈관은 확장되어 백혈구로 채워진다. 또한, 백혈구는 혈관 주변 및 선 상피 하부의 결합 조직내에 분포한다. 결합 조직을 침입하는 백혈구수의 현저한 증가가 관찰되었다.

광학 밀도를 측정함으로써 MCP-1로 처리한 경관 조직내에서 상대적인 콜라겐 함량의 현저한 감소가 나타났다(표 6). 콜라게나제 활성은 대조군에 비해 시험된 비임신 및 임신 경관에서 현저히 증가되었다. 엘라스타제 활성(호중구 효소 방출의 측정)은 대조군에 비해 MCP-1-처리된 그룹에서 경관의 체액 중에서 증가되었다(표 6).

실시예 3

수용액 중의 단핵세포 화학주성 펩타이드-1(0.5mg)을 가교결합된 전분 0.1g에 첨가하고, 중합체가 용액을 흡수하게 한다. 이어서, 제제를 동결-건조시키고, 건조 상태로 저장한다. 의사가 적용하기 전에, 생리적 식염수를 중합체에 첨가하여 주사기에 의한 적용을 위해 요구되는 경도의 겔제를 얻었다. 이어서, 이 겔제를 주사기에 의해 경관으로 분출시킨다.

Claims

활성성분으로서 폴리펩타이드인 (a)단핵세포 화학주성 펩타이드-1(MCP-1) 또는 다른 β-케모카인; (b)단핵세포에 화학주성인 상기 (a)의 단편; 또는 (c)상기 (a) 또는 (b)와 75% 이상의 상동성이 있고 단핵세포에 화학주성인 상기 (a) 또는 (b)의 유사체를 포함하고 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 이의 혼합물을 포함하는 자성 포유동물의 경관의 성숙을 유도하기 위한 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 인간의 출산 또는 낙태와 관련하여 사용되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 MCP-1, MCP-2, MCP-3 또는 단핵세포에 화학주성인 MCP-1 단편인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 자궁근층의 수축을 유도하는 물질 또는 자궁수축성 유효 화합물과 함께 투여되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, (1)제1항에 정의된 폴리펩타이드, (2)자궁근층의 수축을 유도하는 물질 및 (3)약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
제4항에 있어서, 폴리펩타이드와 함께 투여되는 물질 또는 화합물이 프로스타글란딘 E2인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 겔제 또는 크림제인 약제학적 조성물.
제5항에 있어서, 물질이 프로스타글란딘-E 인 약제학적 조성물.
제5항에 있어서, 겔제, 크림제, 마이크로캡슐제, 서방형 또는 방출지연형 제제, 또는 멸균 주사제 또는 현탁제인 약제학적 조성물.