JP4203611B2 - 子宮頸管熟化剤 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は子宮頸管の熟化を促進し、産道の確保により分娩時の胎児の娩出を補助するなどの作用をもつヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸誘導体を有効成分とする子宮頸管熟化剤およびそれを塗布した子宮頸管拡張器に関する。
背景技術
正常な出産過程は主に２つの生理的プロセスが適切なタイミングで進行することによって調節されている。すなわち、胎児を娩出する子宮筋の収縮および胎児の娩出ルートである子宮頸管の熟化、開大反応である。これらのプロセス進行が不十分であったり不適切な連動関係にある状態が難産を誘発する。この様な事態に対応する手段として、従来プロスタグランジンなどの陣痛促進剤やクリステレル胎児圧出術（Kristeller maneuver）、吸引・鉗子手術などの薬剤的、医療手技的、物理的娩出手段が採られてきている。さらに、これらの手段が効を奏しない場合は帝王切開が行われる。今日、帝王切開術は非常に安全に行われるようになったとはいえ母子双方の死亡率は決して低くない。特に母体の死亡率は自然産道からの分娩に比べ格段に高い。従って、適切な方法がある限り、自然産道による分娩すなわち経腟分娩が好ましい。
子宮収縮に関与する代表的な生理的因子としてはオキシトシンならびにプロスタグランジンがあり、既に分娩期における子宮筋収縮不全の治療薬として臨床で使用されている。また、マレイン酸エルゴメトリン、マレイン酸メチルエルゴメトリン、硫酸スパルチンなども子宮収縮剤として医療現場で使用されている。
一方、子宮収縮力が正常に調節されていても子宮頸管の熟化が不十分な場合には産道が確保されず、分娩時間の延長あるいは子宮破裂など母体および胎児の生命が脅かされる事態にも進行する。子宮頸管を開大する手段の従来の代表例は物理的伸展法であり頸管部にラミナリア・ジャポニカなどの植物を利用したものや、ラミセル（Lamicel;商品名）、ダイラパン（Dailapan;商品名）などの合成樹脂や高分子吸収体により構成されるものがある。これらは円筒状（いわゆる棒状）で子宮頸管内に挿入し吸水作用による担体体積の膨張による力で頸管を押し広げる子宮頸管拡張器であり、種々の改良技術が公開されている（芝野ら：特開昭63-267370、丸岡ら：特開平2-92367、山田ら：特開平2-220667）。薬物的な方法では卵胞ホルモン製剤であるエストリオールの安息香酸エステルやプロピオン酸エステル、同様に子宮頸部に作用する製剤としてプラステロン硫酸ナトリウム（商品名；Mylis）がある。また、近年では種々のペプタイド、例えばインターロイキン８、インターロイキン１β、血小板第４因子などにも子宮頸管の熟化作用が見いだされ医薬としてのポテンシャルに期待が寄せられている。子宮頸管熟化における最も顕著な生化学的変化はコラーゲンおよびグリコサミノグリカンの減少とこれに反比例するかの様に生ずるヒアルロン酸の増加である（von Malliot,K.ら,Am.J.Obstet.Gynecol.,135,503,1979,Golichowski,in: Dilatation of Uterine Cervix（eds）Naftolin,F.and Stubblefield,P.G.,99p,Raven Press,New York,1980）。
ヒアルロン酸はＤ-グルクロン酸とＮ-アセチル-Ｄ-グルクロン酸との交互の残基から構成される天然ポリサッカライドの１種である（Laurent,T.C.and Fraser,R.E.,in: Functions of the Proteoglicans,eds,D.Everd and J.Whelan,9-14p,John Wiley）。これは調製の由来、製造方法および分子量を測定した方法に依存する広範囲の分子量を持つ線状のポリマーである。天然に於いてはヒアルロン酸は細胞周囲のゲル中に、脊椎動物の結合組織の基礎的物質の主成分として、関節の滑液中に、目の硝子体液中に、臍帯組織中に、さらに鶏の鶏冠中に存在する。ヒアルロン酸はヒト頸管組織の線維芽細胞によって合成される（Tanaka,K.ら、FEBS Letters,347,95,1994）。ヒアルロン酸合成は、ホルモンによって（Tanaka,K.ら、FEBS Letters,347,95,1994）、プロスタグランジンによって（Rath,W.ら、Prostaglandins,45,375,1993）、IL-1によって（Ito,A.ら、BIochim.Biophys.Acta,1158,91,1993）、リポポリサッカライドによって（Laurent,T.C.and Fraser,R.E.,in: Functions of Proteoglicans,（eds）Everd,D. & Whelan,J.,9p,John Wiley,Chichester,England 1986）など様々な刺激によって促進されることが分かっている。ヒアルロン酸の生物学的な役割については組織での保水性が最も有名であるが（Comper,W.D.and Laurent,T.C.,Physiol.Rev.,58,255,1978）、その他に細胞増殖（Tomida,M.ら,J.Cell Physiol.,86,121,1975）、細胞遊走（Toole,B.P.,Dev.Biol.,29,321,1972）、細胞の組織への侵入（Kunudson,W.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,6767,1984）、トランスフォーメーション（Hopwood,J.J.and Dorfman,A.,J.Biol.Chem.,252,4777,1977）、有糸分裂（Brechtら,Biochem.J.,239,445,1986）、血管新生（West,D.C.ら,Science,228,1324,1985）および創傷治癒（Mast,B.A.ら,Plastic a nd Reconstructive Surgery,89,503,1992）にも関与しているとする事実が蓄積されつつある。
子宮頚管熟化とヒアルロン酸との関係については以下の内容が報告されている。ヒアルロン酸はヒトの妊娠および非妊娠子宮頚管部に存在する。また、子宮頚管部の熟化に伴いヒアルロン酸の子宮頚管局所濃度が２倍から１２倍に増加する（von Maillot,K.ら,Am.J.Obstet.Gynecol.,135,503,1979,Osmers,R.ら.,Obstet.Gynecol.,81,88,1993）。妊娠の進行に伴う自然な熟化過程での頸管部ヒアルロン酸濃度の増加の他に、熟化を誘発する物質として知られている例えば、プロスタグランジンE2（Rath,W.ら.,Prostaglandins,45,375,1993）、アンチプロゲステロン（Cabrol,D.ら.,Prostaglandins,42,71,1991）、リラキシン（Downing,S.J.and Sherwood,O.D.,Endocrinol.,118,471,1986）の投与によっても子宮頚管部のヒアルロン酸含量が増加する。すなわち、ヒアルロン酸は頸管熟化の良いマーカーとなる事が知られている。一方、ヒアルロン酸の分解酵素であるヒアルロニダーゼと子宮頚管の関係についてはヒアルロン酸を分解する酵素であるヒアルロニダーゼを投与することでヒトおよび動物で子宮頚管を熟化出来るとの報告がある（Gupta,T.et al.,J.Indian Med.Association,92,47,1994,Li,W.J.ら.,Chinese Med.J.,107,552,1994,Li,Z.ら.,Chinese J.Obstet.Gynecol.,28,292,1993）。ヒアルロン酸濃度が頸管熟化に伴い増加することは、前述の様に頸管部が水腫状態となり軟化することと直接関係がある現象として理解されている。
従って、保水性維持に重要なヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼが逆に熟化を促進すると言う事はつじつまが合わない。この様に事実関係が曖昧な中で明確なのはヒアルロン酸は子宮頚管熟化の生化学的マーカーの一つであると言うことである。従って、本発明者らが見出したヒアルロン酸自体の投与が子宮頚管熟化を誘発したという事実は驚くべき事である。本発明者らはこの発見に基づき鋭意研究を重ねた結果、ヒアルロン酸による頸管熟化反応は単に形態学的な頸管の熟化変化のみならず例えば頸管部の水分含量、コラゲナーゼ活性の増加など他の頸管熟化の生化学マーカーによっても支持され、更に子宮頸管熟化の生理的因子として考えられているインターロイキン-８の子宮筋に於ける産生量を増大させる反応も見出し、ヒアルロン酸の子宮頚管熟化剤としての発明を完成させた。
前述のように出産過程を補助する方法としては、娩出力を高める手段と子宮頸管を開大させる手段がある。娩出力補強手段としてはブジー、コルポイリンテル、メトロイリンテルなどの機械的な方法の他に、薬剤としてはプロスタグランジンE2,F2αや脳下垂体後葉ホルモンであるオキシトシン、子宮収縮止血剤、子宮収縮剤などがある。これらは子宮収縮を高める手段であるため、妊婦に過強収縮や過強陣痛、ショックなどを起こすことがある。子宮頸管を軟化させる方法としてのラミナリア挿入などの物理的開大操作においては感染の危険性、子宮粘膜の刺激による母体の損傷や苦痛の惹起などの問題点がある。薬物学的な子宮頸管熟化法としてのエストリオールは筋肉注射が必要であり出産前に不必要な痛みを母体に与えることになる。同様にプラステロン硫酸ナトリウム（Mylis）も頻回の静脈注射を必要とする。また、ホルモン製剤は副作用の面から出来るだけ使用が控えられるという現状がある。近年、注目されてきたIL-8,IL-1βなどサイトカインに属する生理活性物質に関してはまだその臨床評価が定まっていないことの他に、製造コストも高価になると考えられる。
発明の開示
本発明はヒアルロン酸およびヒアルロン酸誘導体を有効成分とする子宮頸管熟化剤およびこれを含有する子宮頸管拡張器に関する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、インターロイキン８添加によるヒト子宮下部の子宮筋の組織培養で産生されるヒアルロン酸量の用量依存的な産生促進効果を示す。
第２図は、ヒアルロン酸添加によるヒト子宮下部の子宮筋の組織培養で上清中に産生されるコラゲナーゼおよびゼラチナーゼ活性に対する用量依存的な促進効果を示す。
第３図は、ヒアルロン酸添加によるヒト子宮下部の子宮筋の組織培養で上清中に産生されるインターロイキン８含量の促進効果を示す。
第４図は、ヒアルロン酸の腟内投与によるウサギ子宮頸管の含水率の増加を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明におけるヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸誘導体は天然に存在するものを一般的手法により分離精製して得られるものであってもよいし、既知の方法で化学合成して作成したものであってもよい。また、本発明においてヒアルロン酸およびヒアルロン酸誘導体はそれのみで医薬用途に用いてよいが、医薬品として容認し得る賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、安定化剤などを含んでいてもよい（医療薬 日本医薬品集 １９９５年８月版、９９０頁、（財）日本医療情報センター編）。
本発明で使用するヒアルロン酸の分子量に特に制限はないが、分子量２０００〜５０万程度の低分子量のものが頸管熟化作用が強いので好ましく用いられる。ヒアルロン酸誘導体としては、ヒアルロン酸と同程度の頸管熟化作用を持つものであれば特に制限はないが、ヒアルロン酸エステルやヒアルロン酸抗生物質を例示することができる。ここにヒアルロン酸エステルの例としては、ヒアルロン酸と脂肪族、芳香脂肪族またはヘテロ環アルコールとのエステルを挙げることができる。その際に、ヒアルロン酸のカルボキシル基は全部がエステル化されていても、一部がエステル化されていてもよい。
本剤におけるヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸誘導体の配合量は、投与対象たる妊婦の年齢、子宮の状態、例えば軟産道強靭の程度や体の健康状態により異なるが、例えば１ｎｇ〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ〜３０００ｍｇ/kg、さらに好ましくは１ｍｇ〜１０００ｍｇ/ｋｇであるが、この範囲に特に限定されず目的とする薬理効果を発揮するのに必要な量を配合すればよい。また、本発明のヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸誘導体の正確な投与量は、被検体の年齢、体重、性別、および疾患の種類、特性、症状のステージなどにより変化する。従って、正確な投与量は前以て特定され得ず、治療するものによって最終的には決定される。
本発明に係る子宮頸管熟化剤の剤型は本発明の目的を達成出来る限り特に限定されないが、通常用いられる方法により、膣内散布液などの液体剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲルなどの半固形剤、腟錠、膣用カプセル剤、ペッサリー剤、腟坐剤などの固形剤などにすることが出来る。また、液体剤や半固形剤などのように子宮頸管拡張器などに塗布することが出来るような剤型の場合は子宮頸管拡張器を用いて投与することもできる。ここで言う塗布とは薬剤を拡張器の表面に塗り付けることだけではなく、拡張器に適当な含浸手段を設けて薬剤を含浸させた場合も含む。この様に本発明の子宮頸管熟化剤に子宮頸管拡張器を組み合わせることによって、更に容易に子宮頸管の開大を達成させることが出来る。
以上のような製剤を調製するためには、上記成分の他に、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して目的とする剤型にすることが出来る。これらの成分としては例えば、動植物油（大豆油、牛脂、合成グリセライドなど）、炭化水素（流動パラフィン、スクワレン、固形パラフィンなど）、エステル油（ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピルなど）、高級アルコール（セトステアリルアルコール、ベヘニルアルコールなど）、シリコン樹脂、シリコンオイル、界面活性剤（ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーなど）、水溶性高分子（ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロースなど）、アルコール（エチルアルコール、イソプロピルアルコールなど）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトールなど）、糖（グルコース、しょ糖など）、無機粉体（無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウムなど）、精製水などが上げられる。pH調製のためには無機酸（塩酸、リン酸など）、無機酸のアルカリ金属塩（リン酸ナトリウムなど）、無機塩基（水酸化ナトリウムなど）、有機酸（低級脂肪酸、クエン酸、乳酸など）、有機酸のアルカリ金属塩（クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウムなど）、有機塩基（アルギニン、エタノールアミンなど）などを用いることが出来る。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤などを添加する事が出来る。実際の添加物は本発明が対象とする疾患の治療剤の剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定されるものではない。
また本発明における子宮頸管拡張器としてはラミナリア・ジャポニカなどの植物の他に従来用いられている合成樹脂（吸水性樹脂であるか熱可塑性樹脂であるか，水の膨潤・不膨潤性、基体がスポンジ状であるか繊維質であるかなどを問わない）や高分子吸収体からなる拡張器の他に、当該目的に使用出来るものであれば特に材質、形状は問わない。
以上に記載した発明はヒト以外の動物に対しても実施することが出来る。つまり、ヒアルロン酸を有効成分とする子宮頸管熟化剤や当該熟化剤を塗布又は含浸させた子宮頸管拡張器を動物に応用し、非妊娠動物および妊娠動物での治療・手術・処置に使用することが出来る。すなわち、本発明はヒトおよびヒト以外の動物において分娩時に限らず、非妊娠時では頸管の開大・熟化を必要とする一般的治療的処置や人工授精処置前の処置に、妊娠時では子宮頸管を開大・熟化して行う全ての作業に用いることが出来る。例えば、妊娠初期においては人工妊娠中絶、妊娠中期においては子宮内容排除に先立つ子宮頸管の開大・熟化、妊娠後期においては軟産道の強靭に対して改善措置をとることが出来る。しかも、分娩誘発の前処置においては陣痛を惹起せずに子宮頸管を開大・熟化させる作用を有するという利点がある。
以下本発明の効果を示すために実施例を挙げる。但し、下記実施例は例示のためにのみ示すものであり、いかなる意味に於ても限定的に解釈してはならない。
【実施例】
実施例１
ヒト子宮頸管部におけるヒアルロン酸、CD44（ヒアルロン酸受容体）の分布：
（方法）
（１）サンプル調製インフォームドコンセントで文書による了解を得た患者３名より、帝王切開時に子宮頸管のバイオプシーにより組織を採取した。全ての患者の子宮頸管は熟化不全でビショップスコアは４以下であった。また、６名の良性腫瘍にて子宮摘出患者で病巣が子宮頸管部に達していない症例の頸部を採取した。
（２）ビオチン化ヒアルロン酸結合タンパクの調製ヒアルロン酸結合タンパク質（以下、ＨＡＢＰと略する）を、ウシ鼻軟骨からKnudsonとTooleの方法（Knudson,W.and Toole,B.P.,J.Cell Biol.,100,1753,1985）により軟骨抽出物を透析し、さらに凍結乾燥物として調製した。この凍結乾燥物をTengbladの方法（Tengblad,A.,Biochem.Biophys.Acta,578,281,1979）により0.1M酢酸ー0.1MTris/塩酸緩衝液（pH7.3）中でトリプシン処理を行った後、Hepes緩衝液に対し透析、さらに凍結乾燥、ついでHepes緩衝液に溶解した。遠心処理した後、UpdikeとNicolsonの方法（Updike,T.V.and Nicolson,G.L.,Methods Enzymol.,121,717,1986）により上清を２mMのSulfo-NHS-biotin（Sigma St. Louis,Mo）を用いビオチン化した。このビオチン化タンパクを0.4M 塩酸グアニジン、0.5M 酢酸ナトリウムに対して透析し、HAーsepharoseのカラムクロマトグラフィーにかけた。HA結合蛋白は８０mlの４Ｍ塩酸グアニジンで溶出した。
（３）ヒアルロン酸の免疫組織染色脱パラフィンした頸管切片を２％ウシ血清アルブミンおよび３％過酸化水素を含むメチルアルコール中でインキュベートした。ついで、ＰＢＳにて洗浄後、４℃で一晩１００μlのビオチン化ヒアルロン酸結合タンパク（biotinylated HABP）と反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、組織切片を１：２００に希釈したstrepto avidin-biotin-peroxidaseと室温で３０分間インキュベートした。ついで組織切片を１．５mg/mlのdiaminobenzidineおよび0.01%の過酸化水素を含む溶液に浸した。
（４）CD44（ヒアルロン酸受容体）の免疫組織染色Letarteの方法（Letarte,M.Molecular Immunol.,23,639,1985）に従い、CD44モノクローナル抗体（Serotec Ltd.,Oxford,England）とavidin-peroxidase complexを用い実施した。
（結果）
ヒト頸管組織中のヒアルロン酸は結合組織部分に局在して観察され平滑筋部分には存在していなかった。頸管組織中のヒアルロン酸は結合組織に一様に存在した。非妊娠に比べ妊娠子宮頸管ではより多量のヒアルロン酸が存在していた。また、血管周囲、頸管腺、および頸管上皮の直下で多くのヒアルロン酸が認められた。免疫組織染色による検討では非妊娠および妊娠ヒト子宮頸管部において、CD44は結合組織に一様に分布していることが判明し、分布量は非妊娠子宮頸管よりも妊娠子宮頸管でより多かった。とりわけCD44は血管の周囲および頸管腺部に豊富に存在した。頸管上皮の基底層では強いCD44染色像として検出された。
実施例２
ヒト子宮筋によるヒアルロン酸合成に対するインターロイキンー８の影響：
（方法）
（１）サンプル採取および組織培養１５人の患者の帝王切開手術中に下部子宮筋からバイオプシーにより子宮筋サンプルを採取した。これらの患者年齢は２９±２．４歳で妊娠週令は３８±０．３週目であった。バイオプシーサンプルは加温生理食塩水で軽く洗浄して血餅を除去し小片に細切した。組織培養は１ｍｌの血清非添加の培地（MEM）に対し１００ｍｇの子宮筋を用いて行った。添加インターロイキンー８の量は５０、１００、１５０および２００ng/mlとし、３７℃で２４時間培養を行った後ヒアルロン酸含量とヒアルロニダーゼ活性を測定した。
（２）ヒアルロン酸量およびヒアルロニダーゼ活性の測定ヒアルロン酸量の測定は９６穴プレートによる固相法で行った。即ち、精製ＨＡＢＰ（０．５μｇ／ml）を９６穴プレートの各wellに１００μｌづつ入れ、４℃で１６時間放置し表面をコートした。プレートを軽く洗い、２％のウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ緩衝液で室温１時間処理しブロックした。測定サンプルを各wellに５０μｌづつ添加し室温で２時間反応させた。プレートを０．０５％Tween-20を含んだＴＢＳ緩衝液で３回以上洗浄後、２％ウシ血清アルブミンおよび０．５μｇ/mlのビオチン化ＨＡＢＰを含有するＴＢＳ緩衝液中をwellあたり１００μｌ添加して室温で２時間反応させた。ついでアビジン-パーオキシダーゼをwellに添加し発色させた。定量はBio-Rad EIA Reader（Bio-Red Model 2550,Bio-Rad Lab.,Richmond,CA）により吸光度を波長４５０nmで測定して行った。全てのサンプルは２連で測定した。ヒアルロニダーゼ活性は子宮筋培養上清および子宮筋のホモジネートをサンプルとして基質電気泳動法（Miura,R.O.et al.,Analytical Biochemistry,225,333,1995）によって行った。基質にはコンドロイチン硫酸を使用した。
（３）コラゲナーゼおよびゼラチナーゼ活性の測定ヒト子宮筋の培養系にヒト臍帯由来のヒアルロン酸（Sigma Co.,St Louis,MO）を培地1ｍｌに対し０ｍｇ、０.5ｍｇ，１ｍｇ，および２ｍｇで溶解したものを添加し実験を行った。上清中のコラゲナーゼおよびゼラチナーゼ活性は市販の特異的測定キット（Collagenase type I activity measurement,and Gelatinase type IX activity measurement,Yagai Co.,Cosmo Bio,Tokyo）を用いて測定した。
（結果）
妊娠ヒト子宮筋の下部組織の培養をそのまま行っても相対的に多量のヒアルロン酸を合成する。この組織培養系にヒトインターロイキンー８を添加したところ用量依存的にその培養上清中および組織ホモジネート中のヒアルロン酸の含量が増大した。図１には上清中のヒアルロン酸増加についての成績を示した。ヒアルロニダーゼ活性についてはインターロイキンー８による刺激の前後で特に大きく変化することはなかった。子宮筋組織培養系にヒアルロン酸を添加すると用量依存的なコラゲナーゼ活性の増加が認められた。同様にゼラチナーゼ活性もヒアルロン酸に反応して用量依存的に増加した（図２）。さらにヒアルロン酸の子宮筋組織培養系への添加は培養上清中のインターロイキン８量を増大させた。最も多量のインターロイキン８量産生は１ｍｇ/ｍｌのヒアルロン酸添加によってもたらされた。図３に示したように、２ｍｇ/ｍｌのヒアルロン酸添加でもインターロイキン８産生は促進されたが１ｍｇ/ｍｌよりは有意に（ｐ＜０．０５）低値であった。
実施例３
ウサギ子宮頸管に対するヒアルロン酸の作用：
（方法）
妊娠および非妊娠の体重３〜３．５ｋｇのニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）系のウサギ各８匹を実験に用いた。妊娠ウサギは初妊娠（primigravidae）で妊娠２３日目のものを用いた。ヒト臍帯由来のヒアルロン酸（Sigma St.Louis MO,USA）を１羽あたり２０ｍｇ投与量となる様に粘性のある基剤（adepos solidus,Mitsuba Co,Tokyo）に混合し１日１回膣内に投与した。３日目にウサギ子宮頸管を摘出し、頸管の硬度と拡張性をヘガール拡張器を用いて測定した。子宮頸管部の含水率測定は文献（Sumitomo,K.and Terao,T.1993,Jpn.Soc.ME&BE.,32,337）の方法に従い、赤外線水分計IM-3SCV（Fuji Technica Co.,Osaka）を用い頸管部の異なる４カ所を測定、平均含水率を求めた。更に、子宮頸管は１０％中性緩衝ホルマリン液にて固定後パラフィンに包埋し、外子宮口から約０．３mmの位置（子宮頸管の中央部）で切片を作成した。切片はヘマトキシリン-エオジン染色で頸管構造の変化を、あるいはピクロシリウスレッド染色（Junqueira,L.C.V.ら、１９８０、Am.J.Obstet.Gynecol.,138,273）を行ってコラーゲンの状態を観察した。
（結果）
ヒアルロン酸の投与により妊娠および非妊娠ウサギの両方において子宮頸管は熟化した。すなわち、色調は紫色になり、肉眼的にも軟化した頸管はヘガール拡張器により容易に開大させることが出来た。含水率もヒアルロン酸投与群で有意に増加した（図４）。コントロールはプラセボ、HAはヒアルロン酸を示す。ヘマトキシリン−エオジン染色ではヒアルロン酸投与群の頸管部は浮腫状態を示し、コラーゲン繊維を分けるように基質が増加していた。妊娠および非妊娠ウサギの両方に於いて、内部に赤血球を満たした多くの拡張した血管が結合組織中に見られると共に、マイルドな好中球浸潤が結合組織内に認められた。一方、プラセーボを投与した非妊娠ウサギでは、ピクロシリウスレッドで染め出されたコラーゲン繊維はその構造をしっかりと保ち、繊維束として密に分布していた。プラセーボを投与した妊娠ウサギでは、コラーゲン繊維束は緩やかに分布し繊維間腔隙の増大によりお互いに解離していた。ヒアルロン酸を投与した妊娠および非妊娠ウサギではコラーゲン繊維束は解離し、細く分断された繊維によるネットワーク構造に変化した。ネットワークを形成するコラーゲン繊維には方向性も失われていた。また、浮腫によりコラーゲン繊維間の腔隙は著しく拡張した。
産業上の利用可能性
本発明により、ヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸誘導体の子宮頸管熟化作用が明らかとなった。妊娠動物に限らず非妊娠動物においても同作用が証明されたことにより、ヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸誘導体の出産、流産処置はもとより人工授精に関連した処置に関する医薬および使用方法としての有効性が示された。
本発明は子宮頸管の熟化を促進し、産道の確保により分娩時の胎児の娩出を補助するなどの作用をもつヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸誘導体を有効成分とする子宮頸管熟化剤およびそれを塗布した子宮頸管拡張器に関する。
背景技術
正常な出産過程は主に２つの生理的プロセスが適切なタイミングで進行することによって調節されている。すなわち、胎児を娩出する子宮筋の収縮および胎児の娩出ルートである子宮頸管の熟化、開大反応である。これらのプロセス進行が不十分であったり不適切な連動関係にある状態が難産を誘発する。この様な事態に対応する手段として、従来プロスタグランジンなどの陣痛促進剤やクリステレル胎児圧出術（Kristeller maneuver）、吸引・鉗子手術などの薬剤的、医療手技的、物理的娩出手段が採られてきている。さらに、これらの手段が効を奏しない場合は帝王切開が行われる。今日、帝王切開術は非常に安全に行われるようになったとはいえ母子双方の死亡率は決して低くない。特に母体の死亡率は自然産道からの分娩に比べ格段に高い。従って、適切な方法がある限り、自然産道による分娩すなわち経腟分娩が好ましい。
子宮収縮に関与する代表的な生理的因子としてはオキシトシンならびにプロスタグランジンがあり、既に分娩期における子宮筋収縮不全の治療薬として臨床で使用されている。また、マレイン酸エルゴメトリン、マレイン酸メチルエルゴメトリン、硫酸スパルチンなども子宮収縮剤として医療現場で使用されている。
一方、子宮収縮力が正常に調節されていても子宮頸管の熟化が不十分な場合には産道が確保されず、分娩時間の延長あるいは子宮破裂など母体および胎児の生命が脅かされる事態にも進行する。子宮頸管を開大する手段の従来の代表例は物理的伸展法であり頸管部にラミナリア・ジャポニカなどの植物を利用したものや、ラミセル（Lamicel;商品名）、ダイラパン（Dailapan;商品名）などの合成樹脂や高分子吸収体により構成されるものがある。これらは円筒状（いわゆる棒状）で子宮頸管内に挿入し吸水作用による担体体積の膨張による力で頸管を押し広げる子宮頸管拡張器であり、種々の改良技術が公開されている（芝野ら：特開昭63-267370、丸岡ら：特開平2-92367、山田ら：特開平2-220667）。薬物的な方法では卵胞ホルモン製剤であるエストリオールの安息香酸エステルやプロピオン酸エステル、同様に子宮頸部に作用する製剤としてプラステロン硫酸ナトリウム（商品名；Mylis）がある。また、近年では種々のペプタイド、例えばインターロイキン８、インターロイキン１β、血小板第４因子などにも子宮頸管の熟化作用が見いだされ医薬としてのポテンシャルに期待が寄せられている。子宮頸管熟化における最も顕著な生化学的変化はコラーゲンおよびグリコサミノグリカンの減少とこれに反比例するかの様に生ずるヒアルロン酸の増加である（von Malliot,K.ら,Am.J.Obstet.Gynecol.,135,503,1979,Golichowski,in: Dilatation of Uterine Cervix（eds）Naftolin,F.and Stubblefield,P.G.,99p,Raven Press,New York,1980）。
ヒアルロン酸はＤ-グルクロン酸とＮ-アセチル-Ｄ-グルクロン酸との交互の残基から構成される天然ポリサッカライドの１種である（Laurent,T.C.and Fraser,R.E.,in: Functions of the Proteoglicans,eds,D.Everd and J.Whelan,9-14p,John Wiley）。これは調製の由来、製造方法および分子量を測定した方法に依存する広範囲の分子量を持つ線状のポリマーである。天然に於いてはヒアルロン酸は細胞周囲のゲル中に、脊椎動物の結合組織の基礎的物質の主成分として、関節の滑液中に、目の硝子体液中に、臍帯組織中に、さらに鶏の鶏冠中に存在する。ヒアルロン酸はヒト頸管組織の線維芽細胞によって合成される（Tanaka,K.ら、FEBS Letters,347,95,1994）。ヒアルロン酸合成は、ホルモンによって（Tanaka,K.ら、FEBS Letters,347,95,1994）、プロスタグランジンによって（Rath,W.ら、Prostaglandins,45,375,1993）、IL-1によって（Ito,A.ら、BIochim.Biophys.Acta,1158,91,1993）、リポポリサッカライドによって（Laurent,T.C.and Fraser,R.E.,in: Functions of Proteoglicans,（eds）Everd,D. & Whelan,J.,9p,John Wiley,Chichester,England 1986）など様々な刺激によって促進されることが分かっている。ヒアルロン酸の生物学的な役割については組織での保水性が最も有名であるが（Comper,W.D.and Laurent,T.C.,Physiol.Rev.,58,255,1978）、その他に細胞増殖（Tomida,M.ら,J.Cell Physiol.,86,121,1975）、細胞遊走（Toole,B.P.,Dev.Biol.,29,321,1972）、細胞の組織への侵入（Kunudson,W.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,6767,1984）、トランスフォーメーション（Hopwood,J.J.and Dorfman,A.,J.Biol.Chem.,252,4777,1977）、有糸分裂（Brechtら,Biochem.J.,239,445,1986）、血管新生（West,D.C.ら,Science,228,1324,1985）および創傷治癒（Mast,B.A.ら,Plastic a nd Reconstructive Surgery,89,503,1992）にも関与しているとする事実が蓄積されつつある。
子宮頚管熟化とヒアルロン酸との関係については以下の内容が報告されている。ヒアルロン酸はヒトの妊娠および非妊娠子宮頚管部に存在する。また、子宮頚管部の熟化に伴いヒアルロン酸の子宮頚管局所濃度が２倍から１２倍に増加する（von Maillot,K.ら,Am.J.Obstet.Gynecol.,135,503,1979,Osmers,R.ら.,Obstet.Gynecol.,81,88,1993）。妊娠の進行に伴う自然な熟化過程での頸管部ヒアルロン酸濃度の増加の他に、熟化を誘発する物質として知られている例えば、プロスタグランジンE2（Rath,W.ら.,Prostaglandins,45,375,1993）、アンチプロゲステロン（Cabrol,D.ら.,Prostaglandins,42,71,1991）、リラキシン（Downing,S.J.and Sherwood,O.D.,Endocrinol.,118,471,1986）の投与によっても子宮頚管部のヒアルロン酸含量が増加する。すなわち、ヒアルロン酸は頸管熟化の良いマーカーとなる事が知られている。一方、ヒアルロン酸の分解酵素であるヒアルロニダーゼと子宮頚管の関係についてはヒアルロン酸を分解する酵素であるヒアルロニダーゼを投与することでヒトおよび動物で子宮頚管を熟化出来るとの報告がある（Gupta,T.et al.,J.Indian Med.Association,92,47,1994,Li,W.J.ら.,Chinese Med.J.,107,552,1994,Li,Z.ら.,Chinese J.Obstet.Gynecol.,28,292,1993）。ヒアルロン酸濃度が頸管熟化に伴い増加することは、前述の様に頸管部が水腫状態となり軟化することと直接関係がある現象として理解されている。
従って、保水性維持に重要なヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼが逆に熟化を促進すると言う事はつじつまが合わない。この様に事実関係が曖昧な中で明確なのはヒアルロン酸は子宮頚管熟化の生化学的マーカーの一つであると言うことである。従って、本発明者らが見出したヒアルロン酸自体の投与が子宮頚管熟化を誘発したという事実は驚くべき事である。本発明者らはこの発見に基づき鋭意研究を重ねた結果、ヒアルロン酸による頸管熟化反応は単に形態学的な頸管の熟化変化のみならず例えば頸管部の水分含量、コラゲナーゼ活性の増加など他の頸管熟化の生化学マーカーによっても支持され、更に子宮頸管熟化の生理的因子として考えられているインターロイキン-８の子宮筋に於ける産生量を増大させる反応も見出し、ヒアルロン酸の子宮頚管熟化剤としての発明を完成させた。
前述のように出産過程を補助する方法としては、娩出力を高める手段と子宮頸管を開大させる手段がある。娩出力補強手段としてはブジー、コルポイリンテル、メトロイリンテルなどの機械的な方法の他に、薬剤としてはプロスタグランジンE2,F2αや脳下垂体後葉ホルモンであるオキシトシン、子宮収縮止血剤、子宮収縮剤などがある。これらは子宮収縮を高める手段であるため、妊婦に過強収縮や過強陣痛、ショックなどを起こすことがある。子宮頸管を軟化させる方法としてのラミナリア挿入などの物理的開大操作においては感染の危険性、子宮粘膜の刺激による母体の損傷や苦痛の惹起などの問題点がある。薬物学的な子宮頸管熟化法としてのエストリオールは筋肉注射が必要であり出産前に不必要な痛みを母体に与えることになる。同様にプラステロン硫酸ナトリウム（Mylis）も頻回の静脈注射を必要とする。また、ホルモン製剤は副作用の面から出来るだけ使用が控えられるという現状がある。近年、注目されてきたIL-8,IL-1βなどサイトカインに属する生理活性物質に関してはまだその臨床評価が定まっていないことの他に、製造コストも高価になると考えられる。
発明の開示
本発明はヒアルロン酸およびヒアルロン酸誘導体を有効成分とする子宮頸管熟化剤およびこれを含有する子宮頸管拡張器に関する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、インターロイキン８添加によるヒト子宮下部の子宮筋の組織培養で産生されるヒアルロン酸量の用量依存的な産生促進効果を示す。
第２図は、ヒアルロン酸添加によるヒト子宮下部の子宮筋の組織培養で上清中に産生されるコラゲナーゼおよびゼラチナーゼ活性に対する用量依存的な促進効果を示す。
第３図は、ヒアルロン酸添加によるヒト子宮下部の子宮筋の組織培養で上清中に産生されるインターロイキン８含量の促進効果を示す。
第４図は、ヒアルロン酸の腟内投与によるウサギ子宮頸管の含水率の増加を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明におけるヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸誘導体は天然に存在するものを一般的手法により分離精製して得られるものであってもよいし、既知の方法で化学合成して作成したものであってもよい。また、本発明においてヒアルロン酸およびヒアルロン酸誘導体はそれのみで医薬用途に用いてよいが、医薬品として容認し得る賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、安定化剤などを含んでいてもよい（医療薬 日本医薬品集 １９９５年８月版、９９０頁、（財）日本医療情報センター編）。
本発明で使用するヒアルロン酸の分子量に特に制限はないが、分子量２０００〜５０万程度の低分子量のものが頸管熟化作用が強いので好ましく用いられる。ヒアルロン酸誘導体としては、ヒアルロン酸と同程度の頸管熟化作用を持つものであれば特に制限はないが、ヒアルロン酸エステルやヒアルロン酸抗生物質を例示することができる。ここにヒアルロン酸エステルの例としては、ヒアルロン酸と脂肪族、芳香脂肪族またはヘテロ環アルコールとのエステルを挙げることができる。その際に、ヒアルロン酸のカルボキシル基は全部がエステル化されていても、一部がエステル化されていてもよい。
本剤におけるヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸誘導体の配合量は、投与対象たる妊婦の年齢、子宮の状態、例えば軟産道強靭の程度や体の健康状態により異なるが、例えば１ｎｇ〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ〜３０００ｍｇ/kg、さらに好ましくは１ｍｇ〜１０００ｍｇ/ｋｇであるが、この範囲に特に限定されず目的とする薬理効果を発揮するのに必要な量を配合すればよい。また、本発明のヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸誘導体の正確な投与量は、被検体の年齢、体重、性別、および疾患の種類、特性、症状のステージなどにより変化する。従って、正確な投与量は前以て特定され得ず、治療するものによって最終的には決定される。
本発明に係る子宮頸管熟化剤の剤型は本発明の目的を達成出来る限り特に限定されないが、通常用いられる方法により、膣内散布液などの液体剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲルなどの半固形剤、腟錠、膣用カプセル剤、ペッサリー剤、腟坐剤などの固形剤などにすることが出来る。また、液体剤や半固形剤などのように子宮頸管拡張器などに塗布することが出来るような剤型の場合は子宮頸管拡張器を用いて投与することもできる。ここで言う塗布とは薬剤を拡張器の表面に塗り付けることだけではなく、拡張器に適当な含浸手段を設けて薬剤を含浸させた場合も含む。この様に本発明の子宮頸管熟化剤に子宮頸管拡張器を組み合わせることによって、更に容易に子宮頸管の開大を達成させることが出来る。
以上のような製剤を調製するためには、上記成分の他に、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して目的とする剤型にすることが出来る。これらの成分としては例えば、動植物油（大豆油、牛脂、合成グリセライドなど）、炭化水素（流動パラフィン、スクワレン、固形パラフィンなど）、エステル油（ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピルなど）、高級アルコール（セトステアリルアルコール、ベヘニルアルコールなど）、シリコン樹脂、シリコンオイル、界面活性剤（ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーなど）、水溶性高分子（ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロースなど）、アルコール（エチルアルコール、イソプロピルアルコールなど）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトールなど）、糖（グルコース、しょ糖など）、無機粉体（無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウムなど）、精製水などが上げられる。pH調製のためには無機酸（塩酸、リン酸など）、無機酸のアルカリ金属塩（リン酸ナトリウムなど）、無機塩基（水酸化ナトリウムなど）、有機酸（低級脂肪酸、クエン酸、乳酸など）、有機酸のアルカリ金属塩（クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウムなど）、有機塩基（アルギニン、エタノールアミンなど）などを用いることが出来る。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤などを添加する事が出来る。実際の添加物は本発明が対象とする疾患の治療剤の剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定されるものではない。
また本発明における子宮頸管拡張器としてはラミナリア・ジャポニカなどの植物の他に従来用いられている合成樹脂（吸水性樹脂であるか熱可塑性樹脂であるか，水の膨潤・不膨潤性、基体がスポンジ状であるか繊維質であるかなどを問わない）や高分子吸収体からなる拡張器の他に、当該目的に使用出来るものであれば特に材質、形状は問わない。
以上に記載した発明はヒト以外の動物に対しても実施することが出来る。つまり、ヒアルロン酸を有効成分とする子宮頸管熟化剤や当該熟化剤を塗布又は含浸させた子宮頸管拡張器を動物に応用し、非妊娠動物および妊娠動物での治療・手術・処置に使用することが出来る。すなわち、本発明はヒトおよびヒト以外の動物において分娩時に限らず、非妊娠時では頸管の開大・熟化を必要とする一般的治療的処置や人工授精処置前の処置に、妊娠時では子宮頸管を開大・熟化して行う全ての作業に用いることが出来る。例えば、妊娠初期においては人工妊娠中絶、妊娠中期においては子宮内容排除に先立つ子宮頸管の開大・熟化、妊娠後期においては軟産道の強靭に対して改善措置をとることが出来る。しかも、分娩誘発の前処置においては陣痛を惹起せずに子宮頸管を開大・熟化させる作用を有するという利点がある。
以下本発明の効果を示すために実施例を挙げる。但し、下記実施例は例示のためにのみ示すものであり、いかなる意味に於ても限定的に解釈してはならない。
【実施例】
実施例１
ヒト子宮頸管部におけるヒアルロン酸、CD44（ヒアルロン酸受容体）の分布：
（方法）
（１）サンプル調製インフォームドコンセントで文書による了解を得た患者３名より、帝王切開時に子宮頸管のバイオプシーにより組織を採取した。全ての患者の子宮頸管は熟化不全でビショップスコアは４以下であった。また、６名の良性腫瘍にて子宮摘出患者で病巣が子宮頸管部に達していない症例の頸部を採取した。
（２）ビオチン化ヒアルロン酸結合タンパクの調製ヒアルロン酸結合タンパク質（以下、ＨＡＢＰと略する）を、ウシ鼻軟骨からKnudsonとTooleの方法（Knudson,W.and Toole,B.P.,J.Cell Biol.,100,1753,1985）により軟骨抽出物を透析し、さらに凍結乾燥物として調製した。この凍結乾燥物をTengbladの方法（Tengblad,A.,Biochem.Biophys.Acta,578,281,1979）により0.1M酢酸ー0.1MTris/塩酸緩衝液（pH7.3）中でトリプシン処理を行った後、Hepes緩衝液に対し透析、さらに凍結乾燥、ついでHepes緩衝液に溶解した。遠心処理した後、UpdikeとNicolsonの方法（Updike,T.V.and Nicolson,G.L.,Methods Enzymol.,121,717,1986）により上清を２mMのSulfo-NHS-biotin（Sigma St. Louis,Mo）を用いビオチン化した。このビオチン化タンパクを0.4M 塩酸グアニジン、0.5M 酢酸ナトリウムに対して透析し、HAーsepharoseのカラムクロマトグラフィーにかけた。HA結合蛋白は８０mlの４Ｍ塩酸グアニジンで溶出した。
（３）ヒアルロン酸の免疫組織染色脱パラフィンした頸管切片を２％ウシ血清アルブミンおよび３％過酸化水素を含むメチルアルコール中でインキュベートした。ついで、ＰＢＳにて洗浄後、４℃で一晩１００μlのビオチン化ヒアルロン酸結合タンパク（biotinylated HABP）と反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、組織切片を１：２００に希釈したstrepto avidin-biotin-peroxidaseと室温で３０分間インキュベートした。ついで組織切片を１．５mg/mlのdiaminobenzidineおよび0.01%の過酸化水素を含む溶液に浸した。
（４）CD44（ヒアルロン酸受容体）の免疫組織染色Letarteの方法（Letarte,M.Molecular Immunol.,23,639,1985）に従い、CD44モノクローナル抗体（Serotec Ltd.,Oxford,England）とavidin-peroxidase complexを用い実施した。
（結果）
ヒト頸管組織中のヒアルロン酸は結合組織部分に局在して観察され平滑筋部分には存在していなかった。頸管組織中のヒアルロン酸は結合組織に一様に存在した。非妊娠に比べ妊娠子宮頸管ではより多量のヒアルロン酸が存在していた。また、血管周囲、頸管腺、および頸管上皮の直下で多くのヒアルロン酸が認められた。免疫組織染色による検討では非妊娠および妊娠ヒト子宮頸管部において、CD44は結合組織に一様に分布していることが判明し、分布量は非妊娠子宮頸管よりも妊娠子宮頸管でより多かった。とりわけCD44は血管の周囲および頸管腺部に豊富に存在した。頸管上皮の基底層では強いCD44染色像として検出された。
実施例２
ヒト子宮筋によるヒアルロン酸合成に対するインターロイキンー８の影響：
（方法）
（１）サンプル採取および組織培養１５人の患者の帝王切開手術中に下部子宮筋からバイオプシーにより子宮筋サンプルを採取した。これらの患者年齢は２９±２．４歳で妊娠週令は３８±０．３週目であった。バイオプシーサンプルは加温生理食塩水で軽く洗浄して血餅を除去し小片に細切した。組織培養は１ｍｌの血清非添加の培地（MEM）に対し１００ｍｇの子宮筋を用いて行った。添加インターロイキンー８の量は５０、１００、１５０および２００ng/mlとし、３７℃で２４時間培養を行った後ヒアルロン酸含量とヒアルロニダーゼ活性を測定した。
（２）ヒアルロン酸量およびヒアルロニダーゼ活性の測定ヒアルロン酸量の測定は９６穴プレートによる固相法で行った。即ち、精製ＨＡＢＰ（０．５μｇ／ml）を９６穴プレートの各wellに１００μｌづつ入れ、４℃で１６時間放置し表面をコートした。プレートを軽く洗い、２％のウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ緩衝液で室温１時間処理しブロックした。測定サンプルを各wellに５０μｌづつ添加し室温で２時間反応させた。プレートを０．０５％Tween-20を含んだＴＢＳ緩衝液で３回以上洗浄後、２％ウシ血清アルブミンおよび０．５μｇ/mlのビオチン化ＨＡＢＰを含有するＴＢＳ緩衝液中をwellあたり１００μｌ添加して室温で２時間反応させた。ついでアビジン-パーオキシダーゼをwellに添加し発色させた。定量はBio-Rad EIA Reader（Bio-Red Model 2550,Bio-Rad Lab.,Richmond,CA）により吸光度を波長４５０nmで測定して行った。全てのサンプルは２連で測定した。ヒアルロニダーゼ活性は子宮筋培養上清および子宮筋のホモジネートをサンプルとして基質電気泳動法（Miura,R.O.et al.,Analytical Biochemistry,225,333,1995）によって行った。基質にはコンドロイチン硫酸を使用した。
（３）コラゲナーゼおよびゼラチナーゼ活性の測定ヒト子宮筋の培養系にヒト臍帯由来のヒアルロン酸（Sigma Co.,St Louis,MO）を培地1ｍｌに対し０ｍｇ、０.5ｍｇ，１ｍｇ，および２ｍｇで溶解したものを添加し実験を行った。上清中のコラゲナーゼおよびゼラチナーゼ活性は市販の特異的測定キット（Collagenase type I activity measurement,and Gelatinase type IX activity measurement,Yagai Co.,Cosmo Bio,Tokyo）を用いて測定した。
（結果）
妊娠ヒト子宮筋の下部組織の培養をそのまま行っても相対的に多量のヒアルロン酸を合成する。この組織培養系にヒトインターロイキンー８を添加したところ用量依存的にその培養上清中および組織ホモジネート中のヒアルロン酸の含量が増大した。図１には上清中のヒアルロン酸増加についての成績を示した。ヒアルロニダーゼ活性についてはインターロイキンー８による刺激の前後で特に大きく変化することはなかった。子宮筋組織培養系にヒアルロン酸を添加すると用量依存的なコラゲナーゼ活性の増加が認められた。同様にゼラチナーゼ活性もヒアルロン酸に反応して用量依存的に増加した（図２）。さらにヒアルロン酸の子宮筋組織培養系への添加は培養上清中のインターロイキン８量を増大させた。最も多量のインターロイキン８量産生は１ｍｇ/ｍｌのヒアルロン酸添加によってもたらされた。図３に示したように、２ｍｇ/ｍｌのヒアルロン酸添加でもインターロイキン８産生は促進されたが１ｍｇ/ｍｌよりは有意に（ｐ＜０．０５）低値であった。
実施例３
ウサギ子宮頸管に対するヒアルロン酸の作用：
（方法）
妊娠および非妊娠の体重３〜３．５ｋｇのニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）系のウサギ各８匹を実験に用いた。妊娠ウサギは初妊娠（primigravidae）で妊娠２３日目のものを用いた。ヒト臍帯由来のヒアルロン酸（Sigma St.Louis MO,USA）を１羽あたり２０ｍｇ投与量となる様に粘性のある基剤（adepos solidus,Mitsuba Co,Tokyo）に混合し１日１回膣内に投与した。３日目にウサギ子宮頸管を摘出し、頸管の硬度と拡張性をヘガール拡張器を用いて測定した。子宮頸管部の含水率測定は文献（Sumitomo,K.and Terao,T.1993,Jpn.Soc.ME&BE.,32,337）の方法に従い、赤外線水分計IM-3SCV（Fuji Technica Co.,Osaka）を用い頸管部の異なる４カ所を測定、平均含水率を求めた。更に、子宮頸管は１０％中性緩衝ホルマリン液にて固定後パラフィンに包埋し、外子宮口から約０．３mmの位置（子宮頸管の中央部）で切片を作成した。切片はヘマトキシリン-エオジン染色で頸管構造の変化を、あるいはピクロシリウスレッド染色（Junqueira,L.C.V.ら、１９８０、Am.J.Obstet.Gynecol.,138,273）を行ってコラーゲンの状態を観察した。
（結果）
ヒアルロン酸の投与により妊娠および非妊娠ウサギの両方において子宮頸管は熟化した。すなわち、色調は紫色になり、肉眼的にも軟化した頸管はヘガール拡張器により容易に開大させることが出来た。含水率もヒアルロン酸投与群で有意に増加した（図４）。コントロールはプラセボ、HAはヒアルロン酸を示す。ヘマトキシリン−エオジン染色ではヒアルロン酸投与群の頸管部は浮腫状態を示し、コラーゲン繊維を分けるように基質が増加していた。妊娠および非妊娠ウサギの両方に於いて、内部に赤血球を満たした多くの拡張した血管が結合組織中に見られると共に、マイルドな好中球浸潤が結合組織内に認められた。一方、プラセーボを投与した非妊娠ウサギでは、ピクロシリウスレッドで染め出されたコラーゲン繊維はその構造をしっかりと保ち、繊維束として密に分布していた。プラセーボを投与した妊娠ウサギでは、コラーゲン繊維束は緩やかに分布し繊維間腔隙の増大によりお互いに解離していた。ヒアルロン酸を投与した妊娠および非妊娠ウサギではコラーゲン繊維束は解離し、細く分断された繊維によるネットワーク構造に変化した。ネットワークを形成するコラーゲン繊維には方向性も失われていた。また、浮腫によりコラーゲン繊維間の腔隙は著しく拡張した。
産業上の利用可能性
本発明により、ヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸誘導体の子宮頸管熟化作用が明らかとなった。妊娠動物に限らず非妊娠動物においても同作用が証明されたことにより、ヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸誘導体の出産、流産処置はもとより人工授精に関連した処置に関する医薬および使用方法としての有効性が示された。
Claims (7)
- ヒアルロン酸を有効成分とする子宮頸管熟化剤。
- ヒアルロン酸が天然物由来もしくは化学合成由来である請求項１に記載の子宮頸管熟化剤。
- ヒアルロン酸の分子量が２０００〜５０万のものである請求項１または２に記載の子宮頸管熟化剤。
- ヒアルロン酸を塗布もしくは含有せしめたことを特徴とする子宮頸管拡張器。
- ヒアルロン酸の分子量が２０００〜５０万のものである請求項４に記載の子宮頸管拡張器。
- ヒト以外の動物の出産、流産または人工授精に際して子宮頸管熟化のためにヒアルロン酸を用いることを特徴とするヒト以外の動物の処置方法。
- ヒアルロン酸の分子量が２０００〜５０万のものである請求項６に記載の処置方法。
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