JP4312048B2 - 子宮頚管軟化剤 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、重量平均分子量６０万〜３１０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする子宮頚管軟化剤に関する。
背景技術
ＰＣＴ国際公開パンフレットＷＯ９８／１６５５９号には、ヒアルロン酸およびヒアルロン酸誘導体から構成される群から選択される少なくとも１つを有効成分とする子宮頸管熟化剤が記載されており、分子量２０００〜５０万程度の低分子量のヒアルロン酸が好ましく用いられる旨が記載されている。
しかし、高分子量のヒアルロン酸、具体的には重量平均分子量６０万〜３１０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする子宮頚管軟化剤については、記載も示唆もない。
発明の開示
本発明は、ヒアルロン酸を有効成分とする高い効果を有する子宮頚管軟化剤を提供することを目的とする。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、特定の重量平均分子量のヒアルロン酸が極めて顕著な子宮頚管軟化作用を有し、これを使用することにより上記課題を解決し得る子宮頚管軟化剤を提供し得ることを見出した。本発明はこのような知見に基づき完成されたものである。
すなわち本発明は、重量平均分子量６０万〜３１０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする子宮頚管軟化剤（以下、本発明軟化剤という）を提供する。
本発明軟化剤に用いられるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は好ましくは６０万〜２６０万、より好ましくは６０万〜１２０万、さらに好ましくは７０万〜１１０万、特に好ましくは８０万〜１００万、非常に好ましくは８５万〜９５万であり、約９０万であることが極めて好ましい。一方、重量平均分子量が２００万〜３１０万のものも好ましく、２００万〜２６０万のものもより好ましく、２１０万〜２５０万のものもさらに好ましく、２２０万〜２４０万のものも特に好ましく、２２５万〜２３５万のものも非常に好ましく、約２３０万のものも極めて好ましい。
また、本発明は、子宮頚管を熟化させる目的、子宮頚管を拡張させる目的等のために用いられる、本発明軟化剤を提供する。
さらに、本発明は、本発明軟化剤の有効量をヒトまたは非ヒト動物に投与する、子宮頚管の軟化方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
＜１＞ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩
本発明において用いるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の由来は特に限定されず、鶏冠、臍帯、ヒアルロン酸を産生する微生物等から分離、精製されたヒアルロン酸等を用いることができる。特に、高純度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものが好ましい。
ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容される塩を用いることができる。なかでもヒアルロン酸ナトリウムであることが好ましい。
本発明軟化剤において用いるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は、６０万以上、３１０万以下である限りにおいて特に限定されない。
後述の実施例に示すように、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は重量平均分子量９０万付近において顕著な子宮頚管軟化作用、すなわち顕著な薬理作用を示す。本発明に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量の下限は、６０万、好ましくは７０万、より好ましくは８０万、さらに好ましくは８５万であり、その上限は１２０万、好ましくは１１０万、より好ましくは１００万、さらに好ましくは９５万である。本発明に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は特に好ましくは約９０万程度である。
また、後述の実施例に示すように、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は重量平均分子量２３０万付近においても顕著な子宮頚管軟化作用、すなわち顕著な薬理作用を示す。本発明に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量の下限は、２００万、好ましくは２１０万、より好ましくは２２０万、さらに好ましくは２２５万であり、その上限は３１０万、好ましくは２６０万、より好ましくは２５０万、さらに好ましくは２４０万、特に好ましくは２３５万である。本発明に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は極めて好ましくは約９０万程度又は約２３０万程度である。
ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、このような特定の重量平均分子量の範囲において優れた効果を発揮する。
なお、本発明に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は、第十三改正日本薬局方：一般試験法・第３６項粘度測定法に従って極限粘度を測定し、Ｌａｕｒｅｎｔらの式（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４２，４７６（１９６０））によって算出できる。
また、前記ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、約１１．５〜４５．０ｄｌ／ｇ程度の極限粘度を有するものである。
好ましくは約１１．５〜３９．０ｄｌ／ｇ、より好ましくは約１１．５〜２０ｄｌ／ｇ、さらに好ましくは約１３〜１８．５ｄｌ／ｇ、特に好ましくは約１４．５〜１７．５ｄｌ／ｇ、非常に好ましくは１５〜１６．５ｄｌ／ｇ、極めて好ましくは１６ｄｌ／ｇ程度の極限粘度を有するものである。また、好ましくは約３１．５〜４５．０ｄｌ／ｇ、より好ましくは約３１．５〜３９．０ｄｌ／ｇ、さらに好ましくは約３３．０〜３８．０ｄｌ／ｇ、特に好ましくは約３４．０〜３６．５ｄｌ／ｇ、非常に好ましくは３４．５〜３６．０ｄｌ／ｇ、極めて好ましくは３５．５ｄｌ／ｇ程度の極限粘度を有するものである。
上記のようなヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を用いることにより、優れた薬理作用を有する子宮頚管軟化剤とすることができる。
なお、本発明に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩中のエンドトキシン濃度は、溶液形態の剤とした場合において０．３ＥＵ／ｍＬ以下であることが好ましい。エンドトキシン濃度は、当業者に周知慣用のエンドトキシンの測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。なおＥＵ（エンドトキシン単位）は、日本工業規格生化学試薬通則（ＪＩＳ Ｋ８００８）に従って測定・算出できる。また、鉄含量は２０ｐｐｍ以下であることが好ましい。
＜２＞本発明軟化剤の剤型等
本発明軟化剤の投与方法や剤型は、本発明軟化剤による子宮頚管軟化作用が発揮される限りにおいて特に限定されず、例えば膣内に直接投与するための方法・剤型を選択することができる。
膣内に直接投与する方法としては、膣内に散布する方法、膣内に塗布する方法、膣内に挿入する方法等が例示される。このような投与方法に応じて、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、錠剤、カプセル剤、ペッサリー剤、坐剤など、適宜剤型を選択することができる。
本発明軟化剤中のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の配合量も特に限定されず、後述する投与量等に応じて適宜設定することができるが、例えば本発明軟化剤を液剤として提供する場合には、０．１〜１０％（ｗ／ｖ）程度とすることができ、０．５〜５％（ｗ／ｖ）程度とするのがより好ましい。
また、本発明軟化剤を膣坐剤として提供する場合には、膣坐剤１錠あたり０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度を含有させることかできる。
本発明軟化剤の製剤化には、公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、界面活性剤等、通常医薬に用いられる成分を使用できる。
＜３＞本発明軟化剤の投与対象等
本発明軟化剤は哺乳動物に用いることができる。ヒトに用いることが好ましいが、ヒト以外の哺乳動物に用いることもできる。本発明軟化剤は、このような哺乳動物の中で子宮頚管の軟化が望まれている動物に投与することができる。
子宮頚管の軟化が望まれている動物としては、子宮頚管を拡張（開大）・熟化して行う医療処置に付される前の状態にある動物等が挙げられるが、妊娠しているか否かは問わない。
妊娠していて子宮頚管の軟化が望まれている動物としては、例えば人工妊娠中絶処置が施される前の動物、子宮内容物の排除処置が施される前の動物、スムーズな分娩が望まれている動物等が例示される。また、妊娠していないが子宮頚管の軟化が望まれている動物としては、人工授精処置が施される前の動物等が例示される。
このように本発明軟化剤は、子宮頚管熟化、子宮頚管拡張（子宮頚管開大）、人工妊娠中絶の前処置、子宮内容物排除前の前処置、分娩時の補助、人工授精時の処置、子宮頚管組織水分含量の増加、保水等のために用いることができる。なかでも、本発明軟化剤を子宮頚管の熟化のため、子宮頚管の拡張（開大）のために用いることが好ましい。
また、本発明軟化剤に用いることができるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩自体を、子宮頚管熟化剤、子宮頚管拡張剤（子宮頚管開大剤）、人工妊娠中絶の前処置剤、子宮内容物排除前の前処置剤、分娩の補助剤、人工授精時の処置剤等としてもよく、本発明はこのような思想をも包含する。これらの剤において用いることができるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩、本発明軟化剤の剤型等、および投与対象等については、本発明軟化剤の説明と全く同様である。
本発明軟化剤の投与量は、本発明軟化剤の投与方法、投与形態、使用目的、投与対象となる動物の具体的症状、子宮の状態、年齢、体重等に応じて、子宮頚管軟化作用が最も適切に発揮されるよう個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、例えば膣坐剤として膣内に挿入する場合、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の臨床量として、成人１人１回当り０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度が例示される。
なお、本発明軟化剤の有効成分であるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、医薬品等に既に利用されており、安全性が高いことが知られている。このことは、後述の毒性学的試験の結果からも裏付けられる。
また後述の実施例にも示すように、本発明軟化剤には積極的に分娩を誘発する作用がないことから、例えば子宮頚管が十分に軟化・熟化する前に子宮収縮を誘導する等の危険性もなく、この点でも安全性が高いといえる。
以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
材料等：
まず、本実施例において用いた被験物質等を説明する。
（１）被験物質
・リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）。
・ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量２０万〜３０万；極限粘度４．９〜６．７ｄｌ／ｇ）。以下、「ＨＡ２０−３０」という。
・ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量９０万；極限粘度１６ｄｌ／ｇ）。以下、「ＨＡ９０」という。
・ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量２３０万；極限粘度３５．４ｄｌ／ｇ）。以下、「ＨＡ２３０」という。
これらのヒアルロン酸ナトリウムを生理食塩水に溶解して測定したところ、エンドトキシン濃度はいずれも０．３ＥＵ／ｍＬ以下であり、また鉄含量はいずれも２０ｐｐｍ以下であった。
これらの被験物質のＰＢＳ溶液を調製し、液剤とした。
また、これらの被験物質のＰＢＳ溶液を用いて、常法により膣坐剤を作製した。膣坐剤１錠あたりのヒアルロン酸ナトリウムの配合量は２５ｍｇとした。
（２）実験動物
妊娠ウサギ（初産）及び非妊娠ウサギ（日本白色ウサギ、ＳＰＦ）を、北山ラベスより交配１日目に入手した。入手時に動物の一般状態を観察し、異常のない動物について約３週間の予備飼育を行った。予備飼育期間中にも一般状態の観察を行い、異常のない動物を試験に用いた。
実施例１ 妊娠ウサギに対するＨＡ２０−３０又はＨＡ９０の薬効薬理作用
（方法）
実験動物を被験物質ごとに以下の通り群分けし、妊娠２２日目〜２７日目（交配日を妊娠０日目とする。以下同じ。）の６日間にわたり、被験物質を含む膣坐剤１錠を、対応する群の動物の膣内に１日１回、毎日投与した。
無処置群（非妊娠ウサギ） ３匹
ＰＢＳ投与群（妊娠ウサギ） ５匹
ＨＡ２０−３０投与群（妊娠ウサギ） ５匹
ＨＡ９０投与群（妊娠ウサギ） ４匹
投与期間中を通じて実験動物（母動物）の観察を続け、妊娠２８日目に母動物を解剖し、子宮頚管の拡張（開大）の程度、子宮頚管組織の水分含量、子宮頚管組織におけるコラーゲンの断裂および組織の浮腫の程度について調べた。
（結果）
（１）子宮頚管の拡張（開大）の程度
解剖時に母動物の子宮頚管を摘出し、左側の子宮頚管に、ヘガール頚管拡張器（Ｈｅｇａｒ’ｓ ｄｉｌａｔｏｒ）を直径が小さいものから順に挿入し、組織を損傷することなく子宮頚管内を通過できるヘガール頚管拡張器の最大直径値を測定し、これを子宮頚管内部の拡張（開大）の程度の指標とした。各群の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第１図に示す。
この結果から、ＨＡ９０はＨＡ２０−３０に比して子宮頚管を顕著に拡張（開大）させることが示された。このＨＡ９０の効果は、ＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）の多重比較検定；ｐ＜０．０５）。
（２）子宮頚管組織の水分含量
子宮頚管組織の水分含量を測定し、子宮頚管の軟化や熟化の程度の指標とした。
ヘガール頚管拡張器を挿入していない側（ウサギには子宮頚管が２つある）の子宮頚管組織を採取し、この組織の湿重量及び乾燥重量を測定して、「湿重量／乾燥重量」の比を求め、この値を子宮頚管組織の水分含量の指標とした。各群の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第２図に示す。
この結果から、ＨＡ９０はＨＡ２０−３０に比して子宮頚管の水分含量を顕著に増加させ、子宮頚管の軟化や熟化を顕著に促進することが示された。このＨＡ９０の効果は、ＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定；ｐ＜０．０５）。
（３）子宮頚管組織におけるコラーゲンの断裂、および組織の浮腫の程度
子宮頚管組織の熟化に伴ってコラーゲンの断裂や組織の浮腫が促進されると、子宮頚管の軟化につながる。そこで、子宮頚管組織におけるコラーゲンの断裂や組織の浮腫の程度を測定し、子宮頚管の熟化や軟化の程度の指標とした。
ヘガール頚管拡張器を挿入していない側の子宮頚管組織の切片標本を作製し、マッソントリクローム染色（Ｍａｓｓｏｎ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ ｓｔａｉｎ）した。いずれの群の切片標本であるかを知らない者が光学顕微鏡下（３０倍および３００倍）で観察し、以下の基準に従って各切片標本にスコアを付した。
スコア１：非妊娠正常ウサギと同様の組織像が観察される
２：軽度のコラーゲン断裂、浮腫が観察される
３：中等度のコラーゲン断裂、浮腫が観察される
４：重度のコラーゲン断裂、浮腫が観察される
各群の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第３図に示す。
この結果から、ＨＡ９０、ＨＡ２０−３０ともに子宮頚管組織のコラーゲンの断裂および組織の浮腫を促進し、子宮頚管の熟化や軟化を促進することが示された。この効果は、ＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（カイ二乗検定；ｐ＜０．０５）。
（４）子宮頚管組織におけるｐｒｏＭＭＰ−２活性
ｐｒｏＭＭＰ−２は、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の一種であるＭＭＰ−２の前駆体である。ＭＭＰ−２は、タンパク質分解を通じてコラーゲンの断裂を促進し、子宮頚管の軟化・熟化に寄与することから、ｐｒｏＭＭＰ−２の活性を測定して、子宮頚管の熟化や軟化の程度の指標とした。
ヘガール頚管拡張器を挿入していない側の子宮頚管組織を以下の手順に従って処理し、ｐｒｏＭＭＰ−２の活性を測定した。
（ａ）組織の処理
子宮頚管組織を凍結乾燥し、これに０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−）を１ｍｌ添加してホモジナイズした。遠心して上清を回収し、この上清中のタンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて測定して、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌになるように希釈したものをｐｒｏＭＭＰ−２活性の測定に用いた。
（ｂ）ｐｒｏＭＭＰ−２活性の測定
ｐｒｏＭＭＰ−２活性の測定は、ゼラチンを基質としたザイモグラフィーにより行った（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１８，３２５−３２９（１９９４））。
（ｃ）検出法
ザイモグラフィー後のゲルを画像解析し、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ製）により数値化し、標準ｐｒｏＭＭＰ−２（Ｎｏｖｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ．製；ＮＭＩ Ｎ４０４２２ ヒトＭＭＰ−２）に対する相対値を求めた。
各群の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第４図に示す。
この結果から、ＨＡ９０、ＨＡ２０−３０ともに子宮頚管組織におけるｐｒｏＭＭＰ−２活性が高く、子宮頚管の熟化や軟化が促進された状態にあることが示された。特に、ＨＡ９０の効果はＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）の多重比較検定；ｐ＜０．０５）。
以上の結果から、ＨＡ９０は、妊娠動物の子宮頚管組織に対して優れた軟化作用を発揮するとともに、ＨＡ２０−３０と比較して優れた子宮頚管熟化作用、子宮頚管拡張（開大）作用を発揮することが示された。
このことから、重量平均分子量９０万を中心として、重量平均分子量６０万〜１２０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、同様の優れた作用を奏することが示唆される。
実施例２ 妊娠ウサギに対するＨＡ９０又はＨＡ２３０の子宮頚管拡張（開大）作用
（方法）
妊娠ウサギを被験物質ごとに以下の通り群分けし、妊娠２０日目の９：００、１５：００及び２１：００の計３回投与した。ＰＢＳ、ＨＡ９０及びＨＡ２３０投与群については前記の液剤（２．５ｍｌ）をバルーンカテーテルを用いて膣内に投与し、市販薬投与群については市販の子宮頚管熟化剤（商品名：マイリス（株式会社鐘紡）、有効成分：プラステロン硫酸ナトリウム。膣坐薬）１錠を膣内に投与した。
ＰＢＳ投与群 ５匹
ＨＡ９０投与群 ５匹
ＨＡ２３０投与群 ５匹
市販薬投与群 ６匹
妊娠２１日目の９：００に母動物を解剖し、子宮頚管の拡張（開大）の程度について調べた。
（結果）
（１）子宮頚管の拡張（開大）の程度
解剖時に母動物の子宮頚管を摘出し、前記と同様に子宮頚管内を通過できるヘガール頚管拡張器の最大直径値を測定し、これを子宮頚管内部の拡張（開大）の程度の指標とした。各群の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第５図に示す。
この結果から、ＨＡ９０及びＨＡ２３０は、市販薬（プラステロン硫酸ナトリウム製剤）と同等又はそれ以上に子宮頚管を顕著に拡張（開大）させることが示された。特に、ＨＡ９０の効果はＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）ＬＴＤ；ｐ＜０．０５）。
実施例３ 非妊娠ウサギに対するＨＡ９０又はＨＡ２３０の子宮頚管拡張（開大）作用
（方法）
非妊娠ウサギを被験物質ごとに以下の通り群分けし、同日の９：００、１５：００及び２１：００の計３回投与した。ＰＢＳ、ＨＡ９０及びＨＡ２３０投与群については前記の液剤（２．５ｍｌ）を経口ゾンデを用いて膣内投与し、市販薬投与群については市販の子宮頚管熟化剤（商品名：マイリス（株式会社鐘紡）、有効成分：プラステロン硫酸ナトリウム。膣坐薬）１錠を膣内に投与した。
ＰＢＳ投与群 ６匹
ＨＡ９０投与群 ６匹
ＨＡ２３０投与群 ６匹
市販薬投与群 ６匹
翌日の９：００に解剖し、子宮頚管の拡張（開大）の程度について調べた。
（結果）
（１）子宮頚管の拡張（開大）の程度
解剖時に子宮頚管を摘出し、前記と同様に子宮頚管内を通過できるヘガール頚管拡張器の最大直径値を測定し、これを子宮頚管内部の拡張（開大）の程度の指標とした。各群の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第６図に示す。
この結果から、ＨＡ９０及びＨＡ２３０は、市販薬（プラステロン硫酸ナトリウム製剤）と同等又はそれ以上に子宮頚管を顕著に拡張（開大）させることが示された。特に、ＨＡ２３０の効果はＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（ダンネット（Ｄｕｎｎｎｅｔ）の多重比較検定；ｐ＜０．０１）
実施例４ 妊娠ウサギに対するＨＡ９０又はＨＡ２３０の子宮頚管熟化作用
（方法）
妊娠ウサギを被験物質ごとに以下の通り群分けし、妊娠２２〜２４日目に、前記の液剤（２．５ｍｌ）をフォガティーカテーテル（バルーンカテーテル）を用いて膣内に投与した。
ＰＢＳ投与群 １２匹
ＨＡ９０投与群 １８匹
ＨＡ２３０投与群 ９匹
妊娠２５日目に母動物を解剖し、次の通り子宮頚管の熟化の程度を調べた。
解剖時に母動物の子宮頚管を摘出し、第７図に示す通り子宮頚管の外径（Ａ）及び子宮頚管の体部の長さ（Ｂ）を測定した。Ａ及びＢの測定後、子宮頚管を第８図に示す通りセットし、種々の重量のおもりを負荷して伸展後の子宮頚管の内径（Ｃ）を測定した。
これらの測定結果をもとに、下記式を用いて熟化度を算出した。
伸展率＝（Ｃ／Ａ）×１００
熟化度＝伸展率／Ｂ
（結果）
各重量のおもりを負荷して求められた各群の熟化度の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第９図に示す。
この結果からも、ＨＡ９０及びＨＡ２３０のいずれも子宮頚管熟化作用を有することが確認された。なかでもＨＡ９０は、ＰＢＳに比して子宮頚管を顕著に熟化させることが確認された。このＨＡ９０の効果は、ＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（ダンネット（Ｄｕｎｎｅｔ）の多重比較検定；ｐ＜０．０１）。
実施例５ 非妊娠ウサギに対するＨＡ９０又はＨＡ２３０の子宮頚管熟化作用
（方法）
非妊娠ウサギを被験物質ごとに以下の通り群分けし、同日に前記の液剤（２．５ｍｌ）を胃用の内視鏡および特注ゾンデを用いて膣内に投与した。
ＰＢＳ投与群 ７匹
ＨＡ９０投与群 ６匹
ＨＡ２３０投与群 ７匹
翌日に解剖し、前記実施例４と同様に子宮頚管の熟化の程度を調べた。
（結果）
各重量のおもりを負荷して求められた各群の熟化度の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第１０図に示す。
この結果からも、ＨＡ９０及びＨＡ２３０のいずれも子宮頚管熟化作用を有することが確認された。なかでもＨＡ９０は、ＰＢＳに比して子宮頚管を顕著に熟化させることが確認された。このＨＡ９０の効果は、２．７８ｇ及び３４．７８ｇのおもりを負荷した場合には、ＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（ダンネット（Ｄｕｎｎｅｔ）の多重比較検定；ｐ＜０．０５）。
実施例６ ＨＡ９０投与による出産日に対する影響
本発明軟化剤が積極的に分娩を誘発するか否か調べるために、ＨＡ９０の投与による出産日に対する影響を調べた。
（方法）
妊娠ウサギを被験物質ごとに以下の通り群分けし、妊娠２２日目から１日１回、出産するまで膣内に投与した。ＰＢＳ及びＨＡ９０投与群については、ＰＢＳ又はＨＡ９０のＰＢＳ溶液を用いて常法によって膣坐剤を作製し、膣内に投与した。ＨＡ９０投与群の膣坐剤１錠あたりのヒアルロン酸ナトリウムの配合量は２５ｍｇとした。また、市販薬投与群については、市販の子宮頚管熟化剤（商品名：マイリス（株式会社鐘紡）、有効成分：プラステロン硫酸ナトリウム。膣坐薬）１錠を膣内に投与した。
ＰＢＳ投与群 ９匹
ＨＡ９０投与群 １０匹
市販薬投与群 １０匹
各群について、出産日及び当該日に出産した個体数を記録した。
（結果）
日本白色ウサギの平均出産日数は一般に妊娠３１日である。各群の平均値を第１１図に示す。
この結果、いずれの群についても出産日について実質的な差異は見られず、本発明軟化剤には積極的に分娩を誘発する作用がないことが示された。
以上の結果から、ＨＡ９０及びＨＡ２３０はいずれも、妊娠・非妊娠動物を問わず、子宮頚管組織に対して優れた軟化作用を発揮するとともに、優れた子宮頚管熟化作用、子宮頚管拡張（開大）作用を発揮することが示された。
このことから、重量平均分子量９０万〜２３０万を中心として、重量平均分子量６０万〜３１０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、同様の優れた作用を奏することが示唆される。
特に、重量平均分子量９０万を中心とした、重量平均分子量６０万〜１２０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、妊娠ウサギに対して極めて優れた効果を発揮することが示された。
また重量平均分子量２３０万を中心とした、重量平均分子量２００万〜３１０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、非妊娠ウサギに対して極めて優れた効果を発揮することが示された。
また本発明軟化剤には積極的に分娩を誘発する作用がないことが見出されたことから、例えば子宮頚管が十分に軟化・熟化する前に子宮収縮を誘導する等の危険性もなく、この点でも安全性が高いといえる。
実施例７ 毒性学的試験
本発明軟化剤の安全性を調べるため、ＨＡ９０投与群について毒性学的試験を行った。
（１）実験動物（母動物）の一般状態等
ＨＡ９０投与群の母動物の一般状態および体重については、ＰＢＳ投与群と大きな差はなく、異常は認められなかった。
（２）血液学的検査
解剖時に母動物の後大静脈より採血し、この静脈血２．０ｍｌに抗凝固剤としてＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を加えて、以下の項目について血液学的検査を行った。
赤血球数（ＲＢＣ）、白血球数（ＷＢＣ）、血小板数（ＰＬＴ）、ヘマトクリット値（ＨＴ）、ヘモグロビン量（ＨＢ）、平均赤血球色素量（ＭＣＨ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球色素濃度（ＭＣＨＣ）。
その結果、ＨＡ９０投与群はＰＢＳ投与群と大きな差はなく、異常は認められなかった。
（３）胎仔の状態等
また母動物の解剖時に、胎仔数、胎仔の体重、胎仔の外表面の状態、胎仔の死亡吸収数、着床数および黄体数について測定・観察した。
その結果、ＨＡ９０投与群はＰＢＳ投与群と大きな差はなく、異常は認められなかった。
以上の通り、ＨＡ９０の投与による毒性学的変化は認められず、本発明軟化剤の安全性が確認された。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００１年７月２７日出願の日本特許出願（特願２００１−２２７０６２）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
産業上の利用可能性
特定の重量平均分子量のヒアルロン酸を有効成分とする本発明軟化剤は、前記薬効薬理試験の結果からも明らかな通り、優れた子宮頚管軟化作用、子宮頚管熟化作用、子宮頚管拡張（開大）作用を有することから、種々の産科・婦人科学的処置に用いることができ、極めて有用である。
本発明軟化剤の有効成分であるヒアルロン酸は、既に市販の関節機能改善剤や眼科手術補助剤の有効成分として用いられていることから極めて安全性が高い素材であるといえる。実際、前記の毒性学的試験の結果から極めて安全性が高いことが確認されており、本発明軟化剤はこの点からも極めて有用であるといえる。
例えば、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などの分娩促進剤は、子宮頚管熟化剤としても使用されるが、本来子宮収縮剤であり、子宮頚管の軟化や熟化の前に子宮収縮を誘導する場合があり、このような場合には母子ともに危険な状態に陥ることとなる。これに対して本発明軟化剤には分娩の誘発作用がないことから、頚管の軟化の前に子宮収縮を誘導する等の危険もなく、極めて安全性が高い。また、分娩を誘発する必要がなく単に子宮頚管の軟化等のみを目的とする場合にも安心して使用することができ、必要に応じて子宮収縮剤と適宜組み合わせて使用することもでき、医療現場等においても極めて実用性が高いといえる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、子宮頚管内を通過できるヘガール頚管拡張器の最大直径値を示した図である。図中の＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
第２図は、子宮頚管組織の「湿重量／乾燥重量」の比を示した図である。図中の＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
第３図は、子宮頚管組織におけるコラーゲンの断裂や組織の浮腫の程度を示した図である。図中の＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
第４図は、子宮頚管組織におけるｐｒｏ−ＭＭＰ２の活性を示した図である。図中の＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
第５図は、子宮頚管内を通過できるヘガール頚管拡張器の最大直径値を示した図である。図中の＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
第６図は、子宮頚管内を通過できるヘガール頚管拡張器の最大直径値を示した図である。図中の＊＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
第７図は、子宮頚管の外径（Ａ）及び子宮頚管の体部の長さ（Ｂ）の測定方法を示す図である。
第８図は、おもりを負荷して伸展させた後の子宮頚管の内径（Ｃ）の測定方法を示す図である。
第９図は、各重量のおもりを負荷して求められた各群の熟化度を示す図である。図中の＊＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
第１０図は、各重量のおもりを負荷して求められた各群の熟化度を示す図である。図中の＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
第１１図は、平均出産日を示した図である。
本発明は、重量平均分子量６０万〜３１０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする子宮頚管軟化剤に関する。
背景技術
ＰＣＴ国際公開パンフレットＷＯ９８／１６５５９号には、ヒアルロン酸およびヒアルロン酸誘導体から構成される群から選択される少なくとも１つを有効成分とする子宮頸管熟化剤が記載されており、分子量２０００〜５０万程度の低分子量のヒアルロン酸が好ましく用いられる旨が記載されている。
しかし、高分子量のヒアルロン酸、具体的には重量平均分子量６０万〜３１０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする子宮頚管軟化剤については、記載も示唆もない。
発明の開示
本発明は、ヒアルロン酸を有効成分とする高い効果を有する子宮頚管軟化剤を提供することを目的とする。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、特定の重量平均分子量のヒアルロン酸が極めて顕著な子宮頚管軟化作用を有し、これを使用することにより上記課題を解決し得る子宮頚管軟化剤を提供し得ることを見出した。本発明はこのような知見に基づき完成されたものである。
すなわち本発明は、重量平均分子量６０万〜３１０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする子宮頚管軟化剤（以下、本発明軟化剤という）を提供する。
本発明軟化剤に用いられるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は好ましくは６０万〜２６０万、より好ましくは６０万〜１２０万、さらに好ましくは７０万〜１１０万、特に好ましくは８０万〜１００万、非常に好ましくは８５万〜９５万であり、約９０万であることが極めて好ましい。一方、重量平均分子量が２００万〜３１０万のものも好ましく、２００万〜２６０万のものもより好ましく、２１０万〜２５０万のものもさらに好ましく、２２０万〜２４０万のものも特に好ましく、２２５万〜２３５万のものも非常に好ましく、約２３０万のものも極めて好ましい。
また、本発明は、子宮頚管を熟化させる目的、子宮頚管を拡張させる目的等のために用いられる、本発明軟化剤を提供する。
さらに、本発明は、本発明軟化剤の有効量をヒトまたは非ヒト動物に投与する、子宮頚管の軟化方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
＜１＞ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩
本発明において用いるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の由来は特に限定されず、鶏冠、臍帯、ヒアルロン酸を産生する微生物等から分離、精製されたヒアルロン酸等を用いることができる。特に、高純度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものが好ましい。
ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容される塩を用いることができる。なかでもヒアルロン酸ナトリウムであることが好ましい。
本発明軟化剤において用いるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は、６０万以上、３１０万以下である限りにおいて特に限定されない。
後述の実施例に示すように、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は重量平均分子量９０万付近において顕著な子宮頚管軟化作用、すなわち顕著な薬理作用を示す。本発明に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量の下限は、６０万、好ましくは７０万、より好ましくは８０万、さらに好ましくは８５万であり、その上限は１２０万、好ましくは１１０万、より好ましくは１００万、さらに好ましくは９５万である。本発明に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は特に好ましくは約９０万程度である。
また、後述の実施例に示すように、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は重量平均分子量２３０万付近においても顕著な子宮頚管軟化作用、すなわち顕著な薬理作用を示す。本発明に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量の下限は、２００万、好ましくは２１０万、より好ましくは２２０万、さらに好ましくは２２５万であり、その上限は３１０万、好ましくは２６０万、より好ましくは２５０万、さらに好ましくは２４０万、特に好ましくは２３５万である。本発明に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は極めて好ましくは約９０万程度又は約２３０万程度である。
ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、このような特定の重量平均分子量の範囲において優れた効果を発揮する。
なお、本発明に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は、第十三改正日本薬局方：一般試験法・第３６項粘度測定法に従って極限粘度を測定し、Ｌａｕｒｅｎｔらの式（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４２，４７６（１９６０））によって算出できる。
また、前記ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、約１１．５〜４５．０ｄｌ／ｇ程度の極限粘度を有するものである。
好ましくは約１１．５〜３９．０ｄｌ／ｇ、より好ましくは約１１．５〜２０ｄｌ／ｇ、さらに好ましくは約１３〜１８．５ｄｌ／ｇ、特に好ましくは約１４．５〜１７．５ｄｌ／ｇ、非常に好ましくは１５〜１６．５ｄｌ／ｇ、極めて好ましくは１６ｄｌ／ｇ程度の極限粘度を有するものである。また、好ましくは約３１．５〜４５．０ｄｌ／ｇ、より好ましくは約３１．５〜３９．０ｄｌ／ｇ、さらに好ましくは約３３．０〜３８．０ｄｌ／ｇ、特に好ましくは約３４．０〜３６．５ｄｌ／ｇ、非常に好ましくは３４．５〜３６．０ｄｌ／ｇ、極めて好ましくは３５．５ｄｌ／ｇ程度の極限粘度を有するものである。
上記のようなヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を用いることにより、優れた薬理作用を有する子宮頚管軟化剤とすることができる。
なお、本発明に使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩中のエンドトキシン濃度は、溶液形態の剤とした場合において０．３ＥＵ／ｍＬ以下であることが好ましい。エンドトキシン濃度は、当業者に周知慣用のエンドトキシンの測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。なおＥＵ（エンドトキシン単位）は、日本工業規格生化学試薬通則（ＪＩＳ Ｋ８００８）に従って測定・算出できる。また、鉄含量は２０ｐｐｍ以下であることが好ましい。
＜２＞本発明軟化剤の剤型等
本発明軟化剤の投与方法や剤型は、本発明軟化剤による子宮頚管軟化作用が発揮される限りにおいて特に限定されず、例えば膣内に直接投与するための方法・剤型を選択することができる。
膣内に直接投与する方法としては、膣内に散布する方法、膣内に塗布する方法、膣内に挿入する方法等が例示される。このような投与方法に応じて、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、錠剤、カプセル剤、ペッサリー剤、坐剤など、適宜剤型を選択することができる。
本発明軟化剤中のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の配合量も特に限定されず、後述する投与量等に応じて適宜設定することができるが、例えば本発明軟化剤を液剤として提供する場合には、０．１〜１０％（ｗ／ｖ）程度とすることができ、０．５〜５％（ｗ／ｖ）程度とするのがより好ましい。
また、本発明軟化剤を膣坐剤として提供する場合には、膣坐剤１錠あたり０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度を含有させることかできる。
本発明軟化剤の製剤化には、公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、界面活性剤等、通常医薬に用いられる成分を使用できる。
＜３＞本発明軟化剤の投与対象等
本発明軟化剤は哺乳動物に用いることができる。ヒトに用いることが好ましいが、ヒト以外の哺乳動物に用いることもできる。本発明軟化剤は、このような哺乳動物の中で子宮頚管の軟化が望まれている動物に投与することができる。
子宮頚管の軟化が望まれている動物としては、子宮頚管を拡張（開大）・熟化して行う医療処置に付される前の状態にある動物等が挙げられるが、妊娠しているか否かは問わない。
妊娠していて子宮頚管の軟化が望まれている動物としては、例えば人工妊娠中絶処置が施される前の動物、子宮内容物の排除処置が施される前の動物、スムーズな分娩が望まれている動物等が例示される。また、妊娠していないが子宮頚管の軟化が望まれている動物としては、人工授精処置が施される前の動物等が例示される。
このように本発明軟化剤は、子宮頚管熟化、子宮頚管拡張（子宮頚管開大）、人工妊娠中絶の前処置、子宮内容物排除前の前処置、分娩時の補助、人工授精時の処置、子宮頚管組織水分含量の増加、保水等のために用いることができる。なかでも、本発明軟化剤を子宮頚管の熟化のため、子宮頚管の拡張（開大）のために用いることが好ましい。
また、本発明軟化剤に用いることができるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩自体を、子宮頚管熟化剤、子宮頚管拡張剤（子宮頚管開大剤）、人工妊娠中絶の前処置剤、子宮内容物排除前の前処置剤、分娩の補助剤、人工授精時の処置剤等としてもよく、本発明はこのような思想をも包含する。これらの剤において用いることができるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩、本発明軟化剤の剤型等、および投与対象等については、本発明軟化剤の説明と全く同様である。
本発明軟化剤の投与量は、本発明軟化剤の投与方法、投与形態、使用目的、投与対象となる動物の具体的症状、子宮の状態、年齢、体重等に応じて、子宮頚管軟化作用が最も適切に発揮されるよう個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、例えば膣坐剤として膣内に挿入する場合、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の臨床量として、成人１人１回当り０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度が例示される。
なお、本発明軟化剤の有効成分であるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、医薬品等に既に利用されており、安全性が高いことが知られている。このことは、後述の毒性学的試験の結果からも裏付けられる。
また後述の実施例にも示すように、本発明軟化剤には積極的に分娩を誘発する作用がないことから、例えば子宮頚管が十分に軟化・熟化する前に子宮収縮を誘導する等の危険性もなく、この点でも安全性が高いといえる。
以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
材料等：
まず、本実施例において用いた被験物質等を説明する。
（１）被験物質
・リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）。
・ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量２０万〜３０万；極限粘度４．９〜６．７ｄｌ／ｇ）。以下、「ＨＡ２０−３０」という。
・ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量９０万；極限粘度１６ｄｌ／ｇ）。以下、「ＨＡ９０」という。
・ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量２３０万；極限粘度３５．４ｄｌ／ｇ）。以下、「ＨＡ２３０」という。
これらのヒアルロン酸ナトリウムを生理食塩水に溶解して測定したところ、エンドトキシン濃度はいずれも０．３ＥＵ／ｍＬ以下であり、また鉄含量はいずれも２０ｐｐｍ以下であった。
これらの被験物質のＰＢＳ溶液を調製し、液剤とした。
また、これらの被験物質のＰＢＳ溶液を用いて、常法により膣坐剤を作製した。膣坐剤１錠あたりのヒアルロン酸ナトリウムの配合量は２５ｍｇとした。
（２）実験動物
妊娠ウサギ（初産）及び非妊娠ウサギ（日本白色ウサギ、ＳＰＦ）を、北山ラベスより交配１日目に入手した。入手時に動物の一般状態を観察し、異常のない動物について約３週間の予備飼育を行った。予備飼育期間中にも一般状態の観察を行い、異常のない動物を試験に用いた。
実施例１ 妊娠ウサギに対するＨＡ２０−３０又はＨＡ９０の薬効薬理作用
（方法）
実験動物を被験物質ごとに以下の通り群分けし、妊娠２２日目〜２７日目（交配日を妊娠０日目とする。以下同じ。）の６日間にわたり、被験物質を含む膣坐剤１錠を、対応する群の動物の膣内に１日１回、毎日投与した。
無処置群（非妊娠ウサギ） ３匹
ＰＢＳ投与群（妊娠ウサギ） ５匹
ＨＡ２０−３０投与群（妊娠ウサギ） ５匹
ＨＡ９０投与群（妊娠ウサギ） ４匹
投与期間中を通じて実験動物（母動物）の観察を続け、妊娠２８日目に母動物を解剖し、子宮頚管の拡張（開大）の程度、子宮頚管組織の水分含量、子宮頚管組織におけるコラーゲンの断裂および組織の浮腫の程度について調べた。
（結果）
（１）子宮頚管の拡張（開大）の程度
解剖時に母動物の子宮頚管を摘出し、左側の子宮頚管に、ヘガール頚管拡張器（Ｈｅｇａｒ’ｓ ｄｉｌａｔｏｒ）を直径が小さいものから順に挿入し、組織を損傷することなく子宮頚管内を通過できるヘガール頚管拡張器の最大直径値を測定し、これを子宮頚管内部の拡張（開大）の程度の指標とした。各群の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第１図に示す。
この結果から、ＨＡ９０はＨＡ２０−３０に比して子宮頚管を顕著に拡張（開大）させることが示された。このＨＡ９０の効果は、ＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）の多重比較検定；ｐ＜０．０５）。
（２）子宮頚管組織の水分含量
子宮頚管組織の水分含量を測定し、子宮頚管の軟化や熟化の程度の指標とした。
ヘガール頚管拡張器を挿入していない側（ウサギには子宮頚管が２つある）の子宮頚管組織を採取し、この組織の湿重量及び乾燥重量を測定して、「湿重量／乾燥重量」の比を求め、この値を子宮頚管組織の水分含量の指標とした。各群の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第２図に示す。
この結果から、ＨＡ９０はＨＡ２０−３０に比して子宮頚管の水分含量を顕著に増加させ、子宮頚管の軟化や熟化を顕著に促進することが示された。このＨＡ９０の効果は、ＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定；ｐ＜０．０５）。
（３）子宮頚管組織におけるコラーゲンの断裂、および組織の浮腫の程度
子宮頚管組織の熟化に伴ってコラーゲンの断裂や組織の浮腫が促進されると、子宮頚管の軟化につながる。そこで、子宮頚管組織におけるコラーゲンの断裂や組織の浮腫の程度を測定し、子宮頚管の熟化や軟化の程度の指標とした。
ヘガール頚管拡張器を挿入していない側の子宮頚管組織の切片標本を作製し、マッソントリクローム染色（Ｍａｓｓｏｎ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ ｓｔａｉｎ）した。いずれの群の切片標本であるかを知らない者が光学顕微鏡下（３０倍および３００倍）で観察し、以下の基準に従って各切片標本にスコアを付した。
スコア１：非妊娠正常ウサギと同様の組織像が観察される
２：軽度のコラーゲン断裂、浮腫が観察される
３：中等度のコラーゲン断裂、浮腫が観察される
４：重度のコラーゲン断裂、浮腫が観察される
各群の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第３図に示す。
この結果から、ＨＡ９０、ＨＡ２０−３０ともに子宮頚管組織のコラーゲンの断裂および組織の浮腫を促進し、子宮頚管の熟化や軟化を促進することが示された。この効果は、ＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（カイ二乗検定；ｐ＜０．０５）。
（４）子宮頚管組織におけるｐｒｏＭＭＰ−２活性
ｐｒｏＭＭＰ−２は、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の一種であるＭＭＰ−２の前駆体である。ＭＭＰ−２は、タンパク質分解を通じてコラーゲンの断裂を促進し、子宮頚管の軟化・熟化に寄与することから、ｐｒｏＭＭＰ−２の活性を測定して、子宮頚管の熟化や軟化の程度の指標とした。
ヘガール頚管拡張器を挿入していない側の子宮頚管組織を以下の手順に従って処理し、ｐｒｏＭＭＰ−２の活性を測定した。
（ａ）組織の処理
子宮頚管組織を凍結乾燥し、これに０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−）を１ｍｌ添加してホモジナイズした。遠心して上清を回収し、この上清中のタンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて測定して、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌになるように希釈したものをｐｒｏＭＭＰ−２活性の測定に用いた。
（ｂ）ｐｒｏＭＭＰ−２活性の測定
ｐｒｏＭＭＰ−２活性の測定は、ゼラチンを基質としたザイモグラフィーにより行った（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１８，３２５−３２９（１９９４））。
（ｃ）検出法
ザイモグラフィー後のゲルを画像解析し、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ（ＮＩＨ製）により数値化し、標準ｐｒｏＭＭＰ−２（Ｎｏｖｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ．製；ＮＭＩ Ｎ４０４２２ ヒトＭＭＰ−２）に対する相対値を求めた。
各群の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第４図に示す。
この結果から、ＨＡ９０、ＨＡ２０−３０ともに子宮頚管組織におけるｐｒｏＭＭＰ−２活性が高く、子宮頚管の熟化や軟化が促進された状態にあることが示された。特に、ＨＡ９０の効果はＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）の多重比較検定；ｐ＜０．０５）。
以上の結果から、ＨＡ９０は、妊娠動物の子宮頚管組織に対して優れた軟化作用を発揮するとともに、ＨＡ２０−３０と比較して優れた子宮頚管熟化作用、子宮頚管拡張（開大）作用を発揮することが示された。
このことから、重量平均分子量９０万を中心として、重量平均分子量６０万〜１２０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、同様の優れた作用を奏することが示唆される。
実施例２ 妊娠ウサギに対するＨＡ９０又はＨＡ２３０の子宮頚管拡張（開大）作用
（方法）
妊娠ウサギを被験物質ごとに以下の通り群分けし、妊娠２０日目の９：００、１５：００及び２１：００の計３回投与した。ＰＢＳ、ＨＡ９０及びＨＡ２３０投与群については前記の液剤（２．５ｍｌ）をバルーンカテーテルを用いて膣内に投与し、市販薬投与群については市販の子宮頚管熟化剤（商品名：マイリス（株式会社鐘紡）、有効成分：プラステロン硫酸ナトリウム。膣坐薬）１錠を膣内に投与した。
ＰＢＳ投与群 ５匹
ＨＡ９０投与群 ５匹
ＨＡ２３０投与群 ５匹
市販薬投与群 ６匹
妊娠２１日目の９：００に母動物を解剖し、子宮頚管の拡張（開大）の程度について調べた。
（結果）
（１）子宮頚管の拡張（開大）の程度
解剖時に母動物の子宮頚管を摘出し、前記と同様に子宮頚管内を通過できるヘガール頚管拡張器の最大直径値を測定し、これを子宮頚管内部の拡張（開大）の程度の指標とした。各群の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第５図に示す。
この結果から、ＨＡ９０及びＨＡ２３０は、市販薬（プラステロン硫酸ナトリウム製剤）と同等又はそれ以上に子宮頚管を顕著に拡張（開大）させることが示された。特に、ＨＡ９０の効果はＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）ＬＴＤ；ｐ＜０．０５）。
実施例３ 非妊娠ウサギに対するＨＡ９０又はＨＡ２３０の子宮頚管拡張（開大）作用
（方法）
非妊娠ウサギを被験物質ごとに以下の通り群分けし、同日の９：００、１５：００及び２１：００の計３回投与した。ＰＢＳ、ＨＡ９０及びＨＡ２３０投与群については前記の液剤（２．５ｍｌ）を経口ゾンデを用いて膣内投与し、市販薬投与群については市販の子宮頚管熟化剤（商品名：マイリス（株式会社鐘紡）、有効成分：プラステロン硫酸ナトリウム。膣坐薬）１錠を膣内に投与した。
ＰＢＳ投与群 ６匹
ＨＡ９０投与群 ６匹
ＨＡ２３０投与群 ６匹
市販薬投与群 ６匹
翌日の９：００に解剖し、子宮頚管の拡張（開大）の程度について調べた。
（結果）
（１）子宮頚管の拡張（開大）の程度
解剖時に子宮頚管を摘出し、前記と同様に子宮頚管内を通過できるヘガール頚管拡張器の最大直径値を測定し、これを子宮頚管内部の拡張（開大）の程度の指標とした。各群の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第６図に示す。
この結果から、ＨＡ９０及びＨＡ２３０は、市販薬（プラステロン硫酸ナトリウム製剤）と同等又はそれ以上に子宮頚管を顕著に拡張（開大）させることが示された。特に、ＨＡ２３０の効果はＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（ダンネット（Ｄｕｎｎｎｅｔ）の多重比較検定；ｐ＜０．０１）
実施例４ 妊娠ウサギに対するＨＡ９０又はＨＡ２３０の子宮頚管熟化作用
（方法）
妊娠ウサギを被験物質ごとに以下の通り群分けし、妊娠２２〜２４日目に、前記の液剤（２．５ｍｌ）をフォガティーカテーテル（バルーンカテーテル）を用いて膣内に投与した。
ＰＢＳ投与群 １２匹
ＨＡ９０投与群 １８匹
ＨＡ２３０投与群 ９匹
妊娠２５日目に母動物を解剖し、次の通り子宮頚管の熟化の程度を調べた。
解剖時に母動物の子宮頚管を摘出し、第７図に示す通り子宮頚管の外径（Ａ）及び子宮頚管の体部の長さ（Ｂ）を測定した。Ａ及びＢの測定後、子宮頚管を第８図に示す通りセットし、種々の重量のおもりを負荷して伸展後の子宮頚管の内径（Ｃ）を測定した。
これらの測定結果をもとに、下記式を用いて熟化度を算出した。
伸展率＝（Ｃ／Ａ）×１００
熟化度＝伸展率／Ｂ
（結果）
各重量のおもりを負荷して求められた各群の熟化度の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第９図に示す。
この結果からも、ＨＡ９０及びＨＡ２３０のいずれも子宮頚管熟化作用を有することが確認された。なかでもＨＡ９０は、ＰＢＳに比して子宮頚管を顕著に熟化させることが確認された。このＨＡ９０の効果は、ＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（ダンネット（Ｄｕｎｎｅｔ）の多重比較検定；ｐ＜０．０１）。
実施例５ 非妊娠ウサギに対するＨＡ９０又はＨＡ２３０の子宮頚管熟化作用
（方法）
非妊娠ウサギを被験物質ごとに以下の通り群分けし、同日に前記の液剤（２．５ｍｌ）を胃用の内視鏡および特注ゾンデを用いて膣内に投与した。
ＰＢＳ投与群 ７匹
ＨＡ９０投与群 ６匹
ＨＡ２３０投与群 ７匹
翌日に解剖し、前記実施例４と同様に子宮頚管の熟化の程度を調べた。
（結果）
各重量のおもりを負荷して求められた各群の熟化度の平均値及び標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を第１０図に示す。
この結果からも、ＨＡ９０及びＨＡ２３０のいずれも子宮頚管熟化作用を有することが確認された。なかでもＨＡ９０は、ＰＢＳに比して子宮頚管を顕著に熟化させることが確認された。このＨＡ９０の効果は、２．７８ｇ及び３４．７８ｇのおもりを負荷した場合には、ＰＢＳ（コントロール）に比して統計学的に有意であった（ダンネット（Ｄｕｎｎｅｔ）の多重比較検定；ｐ＜０．０５）。
実施例６ ＨＡ９０投与による出産日に対する影響
本発明軟化剤が積極的に分娩を誘発するか否か調べるために、ＨＡ９０の投与による出産日に対する影響を調べた。
（方法）
妊娠ウサギを被験物質ごとに以下の通り群分けし、妊娠２２日目から１日１回、出産するまで膣内に投与した。ＰＢＳ及びＨＡ９０投与群については、ＰＢＳ又はＨＡ９０のＰＢＳ溶液を用いて常法によって膣坐剤を作製し、膣内に投与した。ＨＡ９０投与群の膣坐剤１錠あたりのヒアルロン酸ナトリウムの配合量は２５ｍｇとした。また、市販薬投与群については、市販の子宮頚管熟化剤（商品名：マイリス（株式会社鐘紡）、有効成分：プラステロン硫酸ナトリウム。膣坐薬）１錠を膣内に投与した。
ＰＢＳ投与群 ９匹
ＨＡ９０投与群 １０匹
市販薬投与群 １０匹
各群について、出産日及び当該日に出産した個体数を記録した。
（結果）
日本白色ウサギの平均出産日数は一般に妊娠３１日である。各群の平均値を第１１図に示す。
この結果、いずれの群についても出産日について実質的な差異は見られず、本発明軟化剤には積極的に分娩を誘発する作用がないことが示された。
以上の結果から、ＨＡ９０及びＨＡ２３０はいずれも、妊娠・非妊娠動物を問わず、子宮頚管組織に対して優れた軟化作用を発揮するとともに、優れた子宮頚管熟化作用、子宮頚管拡張（開大）作用を発揮することが示された。
このことから、重量平均分子量９０万〜２３０万を中心として、重量平均分子量６０万〜３１０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、同様の優れた作用を奏することが示唆される。
特に、重量平均分子量９０万を中心とした、重量平均分子量６０万〜１２０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、妊娠ウサギに対して極めて優れた効果を発揮することが示された。
また重量平均分子量２３０万を中心とした、重量平均分子量２００万〜３１０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、非妊娠ウサギに対して極めて優れた効果を発揮することが示された。
また本発明軟化剤には積極的に分娩を誘発する作用がないことが見出されたことから、例えば子宮頚管が十分に軟化・熟化する前に子宮収縮を誘導する等の危険性もなく、この点でも安全性が高いといえる。
実施例７ 毒性学的試験
本発明軟化剤の安全性を調べるため、ＨＡ９０投与群について毒性学的試験を行った。
（１）実験動物（母動物）の一般状態等
ＨＡ９０投与群の母動物の一般状態および体重については、ＰＢＳ投与群と大きな差はなく、異常は認められなかった。
（２）血液学的検査
解剖時に母動物の後大静脈より採血し、この静脈血２．０ｍｌに抗凝固剤としてＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を加えて、以下の項目について血液学的検査を行った。
赤血球数（ＲＢＣ）、白血球数（ＷＢＣ）、血小板数（ＰＬＴ）、ヘマトクリット値（ＨＴ）、ヘモグロビン量（ＨＢ）、平均赤血球色素量（ＭＣＨ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球色素濃度（ＭＣＨＣ）。
その結果、ＨＡ９０投与群はＰＢＳ投与群と大きな差はなく、異常は認められなかった。
（３）胎仔の状態等
また母動物の解剖時に、胎仔数、胎仔の体重、胎仔の外表面の状態、胎仔の死亡吸収数、着床数および黄体数について測定・観察した。
その結果、ＨＡ９０投与群はＰＢＳ投与群と大きな差はなく、異常は認められなかった。
以上の通り、ＨＡ９０の投与による毒性学的変化は認められず、本発明軟化剤の安全性が確認された。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００１年７月２７日出願の日本特許出願（特願２００１−２２７０６２）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
産業上の利用可能性
特定の重量平均分子量のヒアルロン酸を有効成分とする本発明軟化剤は、前記薬効薬理試験の結果からも明らかな通り、優れた子宮頚管軟化作用、子宮頚管熟化作用、子宮頚管拡張（開大）作用を有することから、種々の産科・婦人科学的処置に用いることができ、極めて有用である。
本発明軟化剤の有効成分であるヒアルロン酸は、既に市販の関節機能改善剤や眼科手術補助剤の有効成分として用いられていることから極めて安全性が高い素材であるといえる。実際、前記の毒性学的試験の結果から極めて安全性が高いことが確認されており、本発明軟化剤はこの点からも極めて有用であるといえる。
例えば、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などの分娩促進剤は、子宮頚管熟化剤としても使用されるが、本来子宮収縮剤であり、子宮頚管の軟化や熟化の前に子宮収縮を誘導する場合があり、このような場合には母子ともに危険な状態に陥ることとなる。これに対して本発明軟化剤には分娩の誘発作用がないことから、頚管の軟化の前に子宮収縮を誘導する等の危険もなく、極めて安全性が高い。また、分娩を誘発する必要がなく単に子宮頚管の軟化等のみを目的とする場合にも安心して使用することができ、必要に応じて子宮収縮剤と適宜組み合わせて使用することもでき、医療現場等においても極めて実用性が高いといえる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、子宮頚管内を通過できるヘガール頚管拡張器の最大直径値を示した図である。図中の＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
第２図は、子宮頚管組織の「湿重量／乾燥重量」の比を示した図である。図中の＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
第３図は、子宮頚管組織におけるコラーゲンの断裂や組織の浮腫の程度を示した図である。図中の＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
第４図は、子宮頚管組織におけるｐｒｏ−ＭＭＰ２の活性を示した図である。図中の＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
第５図は、子宮頚管内を通過できるヘガール頚管拡張器の最大直径値を示した図である。図中の＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
第６図は、子宮頚管内を通過できるヘガール頚管拡張器の最大直径値を示した図である。図中の＊＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
第７図は、子宮頚管の外径（Ａ）及び子宮頚管の体部の長さ（Ｂ）の測定方法を示す図である。
第８図は、おもりを負荷して伸展させた後の子宮頚管の内径（Ｃ）の測定方法を示す図である。
第９図は、各重量のおもりを負荷して求められた各群の熟化度を示す図である。図中の＊＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
第１０図は、各重量のおもりを負荷して求められた各群の熟化度を示す図である。図中の＊は、ＰＢＳ群に対して危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
第１１図は、平均出産日を示した図である。
Claims (12)
- 重量平均分子量６０万〜３１０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、子宮頚管軟化剤。
- 該重量平均分子量が６０万〜２６０万の範囲にある、請求の範囲１記載の子宮頚管軟化剤。
- 該重量平均分子量が６０万〜１２０万の範囲にある、請求の範囲１記載の子宮頚管軟化剤。
- 該重量平均分子量が７０万〜１１０万の範囲にある、請求の範囲１記載の子宮頚管軟化剤。
- 該重量平均分子量が８０万〜１００万の範囲にある、請求の範囲１記載の子宮頚管軟化剤。
- 該重量平均分子量が２００万〜３１０万の範囲にある、請求の範囲１記載の子宮頚管軟化剤。
- 該重量平均分子量が２００万〜２６０万の範囲にある、請求の範囲１記載の子宮頚管軟化剤。
- 該重量平均分子量が２１０万〜２５０万の範囲にある、請求の範囲１記載の子宮頚管軟化剤。
- 該重量平均分子量が２２０万〜２４０万の範囲にある、請求の範囲１記載の子宮頚管軟化剤。
- 子宮頚管の熟化のために用いられる、請求の範囲１〜９のいずれか１項に記載の子宮頚管軟化剤。
- 子宮頚管の拡張のために用いられる、請求の範囲１〜１０のいずれか１項に記載の子宮頚管軟化剤。
- 重量平均分子量６０万〜３１０万のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の有効量を非ヒト動物に投与する、子宮頚管の軟化方法。
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