KR102566028B1 - 신규한 다중 단백질 키나아제 억제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 다중 단백질 인산화효소 억제제에 관한 것으로, 우수한 항염증 활성을 나타내는 인돌린-2-온 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 치료 조성물을 제공한다.
상기 신규 화합물은 염증과 관련된 다양한 단백질 키나아제의 활성을 강력하게 억제하는 바, 다중 단백질 키나아제 억제제로 활용할 수 있으며, 다른 항염증제들과 비교하여 보다 우수한 항염증 효과를 가지는 바, 이를 염증성 질환의 치료제 개발에 활용할 수 있다.

Description

신규한 다중 단백질 키나아제 억제제{NOVEL MULTI-PROTEIN KINASE INHIBITOR}
본 발명은 신규한 다중 단백질 인산화효소 억제제에 관한 것으로, 우수한 항염증 활성을 나타내는 인돌린-2-온 신규 유도체에 관한 것이다.
염증은 유해한 자극으로부터 숙주를 보호하고 조직 항상성을 유지하는 신체의 중요하고 기본적인 면역 체계 반응이다. 효과적인 염증 반응은 감염 또는 상처의 경우 생존을 허용하나, 과도하거나 지속적인 염증은 천식, 암, 만성 통증, 통풍, 정신 장애, 신경 쇠약, 건선, 류마티스 관절염 및 혈관염과 같은 다양한 병리학적 상태로 이어질 수 있다. 더욱이, 유해 자극에 대한 염증 반응은 자극이 제거될 때 종료되는 것도 똑같이 중요하다. 그러므로, 효과적인 염증 반응 및 항염증 반응 사이의 균형은 건강한 상태를 유지하는 가장 중요한 조건 중 하나이다.
톨-유사 수용체(Toll-like receptors, TLRs)는 다양한 병원균 및 손상된 조직을 인식하는 선척적 면역 시스템에서 중요한 수용체 군을 구성한다. TLRs는 구조, 세포 내 위치 및 인식 분자 특성과 같은 특이성에 따라 여러 유형으로 나누어진다. 그람-음성 박테리아의 외벽을 구성하는 박테리아의 내독소(endotoxin)인 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)는 TLR4에 의해 인식된다. LPS가 TLR4와 결합할 때, 염증 관련 유전자 발현이 전사 인자 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)를 통해 조절된다. 염증은 사이토카인(cytokines)이라고 불리는 수용성 면역 신호 분자에 의해 조절되고, 인터류킨(interleukin (IL)-1β), IL-6, 및 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)와 같은 염증 사이토카인은 LPS에 의해 유도된다. 이러한 사이토카인은 다양한 염증 질환에 관여하며, 이들의 억제는 염증 질환 치료를 강력하게 돕는다.
염증 분자의 복합체인 인플라마좀(inflammasome)은 병원성 감염에 대한 선천 면역 반응으로, 전염증성 사이토카인의 형성에 중요한 역할을 한다. 이들 중에서, NOD-, LRR- 및 pyrin 도메인-포함 단백질 3 (NLRP3) 인플라마좀의 기능은 많이 연구되어 왔으며, 필수적으로 조절 단백질 NLRP3; CARD를 포함하는 아폽토시스 관련 speck-유사 단백질(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC) 연결 분자(adaptor molecule); 프로카스파제(procaspase)-1; 및 NIMA-관련 키나아제 7로 구성된다. NF-κB에 의한 NLRP3 및 IL-1β의 전사 및 번역 후, 활성 caspase-1는 pro-IL-1β를 성숙한 분비 형태로 처리할 수 있다. 그러므로, 염증성 질환에서 NLRP3 인플라마좀-관련 신호를 효과적으로 조절하는 것이 매우 중요하다.
단백질 인산화효소(단백질 키나아제, protein kinase)는 단백질의 인산화(phosphorylation)를 담당하며, 이는 염증에서 세포 내 신호 전달에 중요한 역할을 한다. 단백질 키나아제는 염증성 질환의 치료를 위한 약물 개발에서 매우 중요한 약물 표적이다. 예를 들어, 화이자(Pfizer)가 개발한 강력한 JAK(Janus-associated kinase) 1 및 JAK 3 길항체인 토파시티닙(tofacitinib)은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)의 징후와 증상을 줄이고, RA 환자의 신체 기능을 개선시켰다. 게다가, p38 키나아제 억제제인 semapimod는 크론병(Crohn’s disease) 환자에서 임상 결과를 개선시켰다. 비장 티로신 키나아제 억제제인 BAY 61-3606는 알레르기성 천식 환자에 대한 적응증(indication)으로 미국 식품의약국(Food and Drug Administration, FDA)에 승인되었다. 또한, 다양한 브루톤 티로신 카나아제(Bruton’s tyrosine kinase, BTK) 억제제는 임상 시험 중에 있다. 이렇듯 유망한 단백질 키나아제 억제제에 대한 개발 필요성이 높아지고 있다.
대한민국 공개특허 제10-2004-0026657호 (2004.03.31. 공개)
본 발명의 목적은 우수한 단백질 키나아제 억제 활성을 가지는 신규 화합물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 염증성 질환 치료 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:을 제공한다.
<화학식 1>
Figure 112021092000761-pat00001
상기 화학식 1에서, R1은 수소, 하이드록시, 할로겐, (C1-C4) 알킬, (C3-C10) 사이클로알킬, 또는 아다만타닐(adamantanyl)에서 선택되고, R2는 이미다졸일(imidazolyl), 피라졸일(pyrazolyl), 피롤일(pyrrolyl) 또는 피롤리딘일(pyrrolidinyl)에서 선택된다.
본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 화합물은 염증과 관련된 다양한 단백질 키나아제의 활성을 강력하게 억제하는 바, 다중 단백질 키나아제 억제제로 활용할 수 있다.
또한, 상기 화합물은 사이토카인 및 NLRP3 인플라마좀 활성을 조절하고, 다른 항염증제들과 비교하여 보다 우수한 항염증 효과를 가지는 바, 이를 염증성 질환의 치료제 개발에 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 신규의 KMU-시리즈 화합물의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따라 THP-1 세포에서 LPS-유도 상향 조절된 전염증성 사이토카인에 대한 KMU-시리즈 화합물의 억제 효과를 확인한 것이다 (*p < 0.05, **p < 0.01 , #p < 0.001 compared to LPS alone)
도 3은 RAW 264.7 세포의 RANKL 유도 파골세포 형성(osteoclastogenesis)에 대한 KMU-11342의 억제 효과를 확인한 것이다 (**p < 0.01, #p < 0.001 compared to RANKL alone).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 신규 화합물인 KMU-11170 (이하, 도면 및 실험결과에서는 "KMU-1170"으로 표기) 및 인간 단핵구 세포주 THP-1에서 LPS-유도 iNOS 및 COX-2에 대한 KMU-1170의 영향에 관한 것으로, (A)는 KMU-1170의 합성 과정을 나타낸 모식도, (B)는 XTT 분석을 통해 THP-1 세포에서 KMU-1170의 세포 독성 효과를 확인한 것, (C) 내지 (I)는 웨스턴 블롯 및 Image-J software를 사용하여 iNOS, COX-1, 및 COX-2의 mRNA 또는 단백질의 발현 변화를 확인한 그래프이다 (†p < 0.05, *p < 0.01, 및 #p < 0.001 compared to LPS).
도 5는 본 발명의 일 실험예에 따라 THP-1 세포에서 LPS-유도 상향 조절된 전염증성 사이토카인에 대한 KMU-1170의 억제 효과를 확인한 것으로, (A)는 전체 세포 용해물을 분리하여 웨스턴 블롯으로 pro-IL-1β, TNF-α, IL-6, 및 β-actin의 단백질 발현 수준을 측정한 것, (B)는 Image-J software를 사용하여 pro-IL-1β, TNF-α, 및 IL-6 밴드의 상대적 광학 밀도를 분석한 것, (C)는 총 RNA를 추출하여, RT-PCR로 IL-1β, TNF-α, 및 IL-6의 mRNA 발현 수준을 확인한 것, (D)는 Image-J software를 사용하여 IL-1β, TNF-α, 및 IL-6 밴드의 상대적 광학 밀도를 분석한 것, (E) 내지 (G)는 총 RNA를 추출하여 실시간 PCR로 IL-1β, TNF-α, 및 IL-6의 mRNA 발현 수준을 확인한 것이다 (†p < 0.05, *p < 0.01, 및 #p < 0.001 compared to LPS).
도 6은 본 발명의 일 실험예에 따라 THP-1 세포에서 LPS-유도 TLR4 신호전달관련 단백질에 대한 KMU-1170의 효과를 확인한 것으로, (A)는 전체 세포 용해물을 분리하여 웨스턴 블롯으로 TLR, MyD88, 및 β-actin의 단백질 발현 수준을 측정한 것, (B)는 Image-J software를 사용하여 TLR4 및 MyD88 밴드의 상대적 광학 밀도를 분석한 것, (C)는 웨스턴 블롯으로 p-TAK1, TAK1, 및 β-actin의 단백질 발현 수준을 측정한 것, (D)는 Image-J software를 사용하여 p-TAK1 밴드의 상대적 광학 밀도를 분석한 것, (E)는 웨스턴 블롯으로 p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38, p38, 및 β-actin의 단백질 발현 수준을 측정한 것, (F)는 Image-J software를 사용하여 p-ERK, p-JNK, 및 p-p38 밴드의 상대적 광학 밀도를 분석한 것이다 (#p < 0.001 compared to LPS).
도 7은 본 발명의 일 실험예에 따라 THP-1 세포에서 LPS-유도 IKKα/β 및 NF-κB의 인산화 및 NF-κB의 핵 전좌에 대한 KMU-1170의 효과를 확인한 것으로, (A)는 웨스턴 블롯으로 p-IKKα/β, IKKα/β, p-NF-κB p65, NF-κB p65, 및 β-actin의 단백질 발현 수준을 측정한 것, (B)는 Image-J software를 사용하여 p-IKKα/β 및 p-NF-κB p65 밴드의 상대적인 광학 밀도를 분석한 것, (C)는 세포를 NF-κB p65 (녹색) 및 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌(4’,6-diamidino-2-phenylindole) (청색)의 항체로 염색하여 형광 현미경으로 확인한 것으로, 화살표는 400배의 확대를 나타낸다 (*p < 0.01 및 #p < 0.001 compared to LPS).
도 8은 본 발명의 일 실험예에 따라 THP-1 세포에서 LPS-유도 NLRP3 인플라마좀 활성화에 대한 KMU-1170의 억제 효과 및 KMU-1170의 항염증 잠재력에 관한 것으로, (A)는 세포 용해물(Lysate) 및 배지 상등액(Sup)을 분리하여 웨스턴 블롯으로 상등액에 대한 pro-IL-1β 및 IL-1β의 단백질 발현 수준과 세포 용해물에 대한 NLRP3, ASC, pro-caspase-1, pro-IL-1β, 및 β-actin의 단백질 발현 수준을 측정한 것, (B)는 Image-J software를 사용하여 용해물에서 NLRP3, ASC, pro-caspase-1, 및 pro-IL-1β 밴드의 상대적 광학 밀도를 분석한 것, (C)는 웨스턴 블롯으로 용해물에서 pro-IL-1β 및 β-actin의 단백질 발현 수준을 측정한 것, (D)는 Image-J software를 사용하여 pro-IL-1β 밴드의 상대적 광학 밀도를 분석한 것이다 (†p < 0.05, *p < 0.01, 및 #p < 0.001 compared to LPS).
도 9는 본 발명의 일 실험예에 따라 원발성 인간 골관절염(OA) 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)에서 LPS-유도 염증 반응에 대한 KMU-1170의 억제 효과를 확인한 것으로, (A) 내지 (C)는 총 RNA를 추출하여 실시간 PCR로 IL-1 β, TNF-α, 및 IL-6 mRNA 발현 수준을 측정한 것, (D) 내지 (F)는 전체 세포 용해물을 분리하여 웨스턴 블롯으로 각각 pro-IL-1β, TNF-α, IL-6, 및 β-actin의 단백질 발현 수준 (D); iNOS, COX-2, 및 β-actin의 단백질 발현 수준 (E); p-IKKα/β, p-NF-κB p65, 및 β-actin의 단백질 발현 수준 (F);을 측정한 것이다 (*p < 0.01 및 #p < 0.001 compared to LPS).
도 10은 본 발명의 일 실험예에 따라 확인한 KMU-1170의 항염증 효과 매커니즘을 도식화한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
단백질 키나아제는 포스포릴기(phosphoryl group)를 세린(serine), 트레오닌(threonine) 또는 티로신(tyrosine) 잔기에 부착하여 단백질 분자를 인산화하는 효소로, ATP와의 결합은 키나아제 활성에 필수적이다. 최근, 단백질 키나아제가 암 및 염증성 질환을 포함하는 다양한 인간 질병에 관련있음에 대한 보고들로 다양한 단백질 키나아제 억제제의 개발로 이어지고 있다.
이에, 본 발명자는 신규의 다중 표적 단백질 키나아제 억제제로 인돌린-2-온(indolin-2-one) 유도체인 KMU-시리즈 화합물을 합성하였고, 인간 단핵구 세포주 THP-1 및 원발성 인간 골관절염 섬유아세포 유사 활막세포를 이용하여 이의 항염증 메커니즘을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
<화학식 1>
Figure 112021092000761-pat00002
상기 화학식 1에서, R1은 수소, 하이드록시, 할로겐, (C1-C4) 알킬, (C3-C10) 사이클로알킬, 또는 아다만타닐(adamantanyl)에서 선택될 수 있고, R2는 이미다졸일(imidazolyl), 피라졸일(pyrazolyl), 피롤일(pyrrolyl) 및 피롤리딘일(pyrrolidinyl)로 이루어진 헤테로 고리화합물에서 선택될 수 있다.
바람직하게는, 상기 R1은 (C3-C8) 사이클로알킬, 또는 아다만타닐(adamantanyl)에서 선택될 수 있고, 상기 R2는 이미다졸일(imidazolyl) 또는 피롤일(pyrrolyl)에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 화합물 또는 이의 염은 (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-(사이클로프로필아미노)피라진-2-일)인돌린-2-온 [(Z)-3-((1H-imidazol-5-yl)methylene)-5-(6-(cyclopropylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one] (4a; KMU-11170), (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-(사이클로펜틸아미노)피라진-2-일)인돌린-2-온 [(Z)-3-((1H-imidazol-5-yl)methylene)-5-(6-(cyclopentylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one] (4b; KMU-11342), (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-(사이클로헥실아미노)피라진-2-일)인돌린-2-온 [(Z)-3-((1H-Imidazol-5-yl)methylene)-5-(6-(cyclohexylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one] (4c; KMU-11361), (Z)-3-((1H-피롤-2-일)메틸렌)-5-(6-(사이클로헥실아미노)피라진-2-일)인돌린-2-온 [(Z)-3-((1H- pyrrol -2- yl ) methylene )-5-(6-(cyclohexylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one] (4c'; KMU-11426), (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-(아다만탄-1-일아미노)피라진-2-일)인돌린-2-온 [(Z)-3-((1H-Imidazol-5-yl)methylene)-5-(6-(adamantan-1-ylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one] (4d; KMU-11421), 및 (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-(사이클로헵틸아미노)피라진-2-일)인돌린-2-온 [(Z)-3-((1H- Imidazol -5- yl ) methylene )-5-(6-(cycloheptylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one] (4e; KMU-11427)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 이와 동일한 효능을 갖는 범위 내에서 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있다.
본 명세서에서, "약학적으로 허용가능한"이란, 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없어, 인간에게 투여하기에 적합한 안전성 및 효능 프로파일을 갖는 염을 의미한다.
상기 염은 약학적으로 허용가능한 염기성 염 또는 산성염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있다. 염기성염은 유기 염기염, 무기 염기염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있으며, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염, 아미늄염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염 및 피리디늄염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
산성염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산, 이중 인산, 질산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 말산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산, 스테아르산 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 무기산 및 유기산을 이용하여 형성되는 염이 모두 포함될 수 있다.
또한, 상기 화합물은 상기 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물, 용매화물, 유도체 등을 모두 포함할 수 있다. 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있고, 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹여 과량의 유기염기를 가하거나 무기염기의 염기 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 또는 이 혼합물에서 용매나 과량의 염기를 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물 또는 이의 염은 다양한 염증 관련 단백질 키나아제를 억제할 수 있다.
바람직하게는, 상기 화합물 또는 이의 염은 MAPK (mitogen-activated protein kinase), TAK1 (TGF-beta activated kinase 1), Lck(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase), TYK2 (non-receptor tyrosine-protein kinase 2), JAK3 (janus kinase 3), 및 Txk (tyrosine-protein kinase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 키나아제를 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 화합물은 THP-1 세포에서 세포 사멸, 분화, 면역, 염증 및 생존을 포함한 다양한 세포 과정과 관련된, 특히 전염증성 사이토카인의 LPS-TLR4-TAK1 신호전달과 관련된 TAK1 ERK, 및 JNK의 LPS-유도 인산화를 억제함을 확인할 수 있었다.
상기 화합물 또는 이의 염은 NLRP3 인플라마좀의 활성을 억제할 수 있으며, 다양한 사이토카인의 LPS-유도 상향 조절을 억제하는 바, 우수한 항염증 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 화합물은 염증 반응의 중요한 매개체인, 산화 질소(NO) 생성에 필요한 촉매적 효소 계열에 속하는 iNOS를 억제하고, 염증성 질환, 종양성 질환 및 알츠하이머 질환과 같은 다양한 인간 질환과 관련된 COX-2를 선택적으로 억제하며, 염증 반응에서 사이토카인 및 인플라마좀과 같은 주요 인자를 조절하는 면역계의 주요 매개체인 NF-κB 인자와 관련된 LPS 유도 IKKα/β 및 NF-κB p65의 인산화, NF-κB p65의 핵 전좌(nuclear translocation), 및 IL-1β, TNF-α, IL-6의 상향조절을 억제함을 확인할 수 있었다. 반면, 상기 화합물은 THP-1 세포에서 LPS-매개 TLR4 및 MyD88의 상향 조절을 억제하지 않은 바, 이러한 결과는 상기 화합물이 THP-1 세포의 LPS 매개 염증 반응에서 TLR4/MyD88의 downstream에 항염증 효과를 가짐을 보여준다.
또한, 상기 화합물의 항염증 효과를 다른 표적 항염증제와 비교한 결과, COX-2 억제제 (celecoxib), a BTK 억제제 (ibrutinib), a JAK 억제제 (ruxolitinib), 및 메토트레세이트를 포함하는 다른 약물과 비교하여 현저히 우수한 항염증 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
이에, 상기 화합물 또는 이의 염은 염증성 질환 예방 또는 치료를 위한 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 염증성 질환은 골관절염, 류마티스관절염, 골다공증, 골 파제트병, 및 강직성척추염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실험예에 따르면, 지속적인 활막 염증 및 진행성 연골 분해를 특징으로 하는 골관절염 진행에서 중요한 역할을 하는 골관절염 FLS에서 상기 화합물이 LPS-유도 염증 반응을 억제함을 확인할 수 있는 바, 이를 활용하여 골관절염을 예방, 치료 또는 개선시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.
상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제 등으로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
상기 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 상세하게는 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 사용될 수 있다.
보다 상세하게는, 상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 주사제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당업계에 널리 공지된 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.
또한, 상기 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 항산화제를 더 첨가할 수 있다. 상기 항산화제로는 티아민(thiamin, 비타민 B1), 리보플라빈(riboflavin, 비타민 B2), 나이아신(niacin, 비타민 B3), 판토펜산(pantothenic acid, 비타민 B5), 피리독신(pyridoxine, 비타민 B6) 및 코발라민(cobalamin, 비타민 B12) 등의 비타민 B군의 화합물과 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 당업계에 널리 공지된 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.
상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 염증성 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여될 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 염증성 질환은 골관절염, 류마티스관절염, 골다공증, 골 파제트병, 및 강직성척추염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 염증성 질환의 예방 또는 개선 목적으로, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 음료 및 각종 드링크, 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 잼 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 베이컨 등), 빵류 및 면류, 쿠키 및 스낵류, 유제품(버터, 치즈 등) 등이 가능하며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용가능한 식품 첨가제(식품 첨가물) 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다. 상기 '식품첨가물공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
상기 기타 보조 성분은 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품에 함유된 상기 화합물 또는 이의 염의 유효용량은 염증성 질환 예방 또는 개선 등 그 사용 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 식품을 원료로 하여 일반 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 염증성 질환 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> KMU -series ( KMU -11421, 11426, 11427, 11361, 11342, 11170) 화합물의 합성
1. 합성 시약 및 기기
모든 반응은 제조업체가 명시한 적절한 조건에서 추가 정제없이 시판되는 시약 및 용매를 사용하여 수행되었다. CEM Discover BenchMate는 마이크로파-지원 반응에 사용되었다. 반응의 완료는 E. Merck 실리카 겔 F254 TLC 플레이트에서 모니터링되었다. 합성된 화합물의 정제는 Merck Silica Gel 60 (230-400 mesh)을 사용한 플래쉬 컬럼 크로마토그래프로 수행되었다. 합성된 화합물은 1H on Bruker AVANCE 400 (1H: 400 MHz) 및 JEOL ECA 500 (1H: 500 MHz) spectrometer로 특정되었고, 화학적 이동(chemical shift) δ 값은 TMS를 참조 표준으로 하여 ppm 단위로 측정되었다. 질량 스펙트럼은 Waters ACQUI-TY UPLC, Micromass Quattro microTM API를 사용하여 획득하였다.
2. 합성 방법
KMU-시리즈 화합물은 도 1에 나타난 바와 같이 5-브로모인돌린-2,3-디온(5-bromoindoline-2,3-dione)에서 하기와 같은 조건에서 합성되었다:
화합물 1은 환원 및 보릴화(borylation)로 얻어졌고 [(a) i) NH2NH2, NaOH, EtOH; ii) bis(pincholato)diboron, PdCl2(dppf), KOAc, 1,4-dioxane: EtOH(1: 1.5), microwave], 화합물 1과 피라진 유도체인 화합물 2[(b) K2CO3, amines or alcohols, DMF]의 Suzuki 커플링 반응으로 화합물 3이 수득되었다[(c) PdCl2(PPh3)2, 2M K2CO3, 1,4-dioxane : EtOH (1: 1.5), microwave]. 마지막으로, 1H-이미다졸-4-카르발데히드(1H-imidazole-4-carbaldehyde)와의 크네페나겔 축합(Knoevenagel condensation) 반응을 통해 KMU-시리즈 화합물을 합성하였다 [(d) piperidine, 1H-imidazole-4-carbaldehyde, EtOH, microwave].
2-1. 5-(4,4,5,5- 테트라메틸 -1,3,2- 디옥사보롤란 -2-일) 인돌린 -2-온 [ 5-(4,4,5,5-Tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)indolin-2-one ] 합성 : 화합물 (1)
<화합물 1>
마이크로파 용기를 5-브로모인돌린-2,3-디온(5-bromoindoline-2,3-dione; 0.50 g, 2.2 mmol), 하이드라진 수화물(hydrazine hydrate; 0.14 g, 4.4 mmol), 및 에탄올(EtOH, 2 mL)로 채웠다. 상기 혼합물에 100℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 수산화나트륨(sodium hydroxide; 0.18 g, 4.4 mmol) 첨가 후, 혼합물에 80℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 2 M 염산(HCl)을 사용하여 상기 혼합물을 산성화하고 냉수를 첨가하여 형성된 침전물을 여과를 통해 수집한 다음, 2 M HCl로 세척 후 물로 다시 세척하였다. 진공 하에서 건조하여 0.42 g의 5-브로모인돌린-2-온(5-bromoindolin-2-one, 89% 수율)을 얻었고, 이는 추가 정제없이 다음 단계에 사용되었다.
마이크로파 용기에 5-브로모인돌린-2-온(5-bromoindoline-2-one; 0.40 g, 1.9 mmol) 및 1,4-다이옥산(1,4-dioxane; 2.0 mL)을 채운 다음, 상기 혼합물에 비스(피나콜라토)디보론[bis(pinacolato)diboron; 0.72 g, 3.8 mmol] 및 아세트산 칼륨(potassium acetate, KOAc; 0.56 g, 5.7 mmol)을 추가하여 5분 동안 N2 가스로 제거(purge)하였다. 반응 혼합물에 N2 가스 내 [1,1′-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)([1,1′-bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium (II), PdCl2(dppf); 0.069 g, 0.094 mmol)를 첨가하고, 혼합물에 110℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 진공에서 용매를 제거한 후, 잔여물은 1:1 헥산(HEX)/에틸아세테이트(EA)를 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.410 g (82 %)의 표제 화합물 (1)을 수득하였다.
2-2-1. 6- 클로로 -N- 사이클로프로필피라진 -2- 아민 [ 6- Chloro -N-cyclopropylpyrazin-2-amine ] 합성 : 화합물 (2a)
<화합물 2a>
사이클로프로필아민(cyclopropylamine; 5.1 mmol, 0.35 mL) 및 탄산칼륨(potassium carbonate, K2CO3; 6.7 mmol, 0.93 g)을 5.0 mL의 N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide, DMF)에 첨가하고 이 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 2,6-디클로로피라진(2,6-dichloropyrazine; 3.4 mmol, 0.50 g) 첨가 후, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 진공에서 용매를 제거하였다. 잔여물을 디클로로메탄(dichloromethane, DCM)으로 처리하고 셀라이트(celite)로 여과한 다음, 여액을 수집하고 진공에서 용매를 제거하였다. 최종 잔여물은 5:1 DCM/EA를 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.21 g (36 %)의 표제 화합물 (2a)를 수득하였다.
2-2-2. 6- 클로로 -N- 사이클로펜틸피라진 -2- 아민 [ 6- Chloro -N-cyclopentylpyrazin-2-amine ] 합성 : 화합물 (2b)
<화합물 2b>
사이클로펜틸아민(cyclopentylamine; 5.0 mmol, 0.50 mL) 및 K2CO3 (6.7 mmol, 0.93 g)를 5.0 mL의 DMF에 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 2,6-디클로로피라진 (3.4 mmol, 0.50 g)을 첨가 후, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 진공에서 용매를 제거하였다. 잔여물을 DCM으로 처리하고 셀라이트로 여과한 다음, 여액을 수집하고 진공에서 용매를 제거하였다. 최종 잔여물은 5:1 DCM/EA를 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.43 g (65 %)의 표제 화합물 (2b)를 수득하였다.
2-2-3. 6- 클로로 -N- 사이클로헥실피라진 -2- 아민 [ 6- Chloro -N-cyclohexylpyrazin-2-amine ] 합성 : 화합물 (2c)
<화합물 2c>
사이클로헥실아민(cyclohexylamine; 5.0 mmol, 0.58 mL) 및 K2CO3 (6.7 mmol, 0.93 g)를 5.0 mL의 DMF에 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 2,6-디클로로피라진 (3.4 mmol, 0.50 g)을 첨가 후, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 진공에서 용매를 제거하였다. 잔여물을 DCM으로 처리하고 셀라이트로 여과한 다음, 여액을 수집하고 진공에서 용매를 제거하였다. 최종 잔여물은 40:1 DCM/EA를 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.25 g (35 %)의 표제 화합물 (2c)를 수득하였다.
2-2-4. N-( 아다만탄 -1-일)-6- 클로로피라진 -2- 아민 [ N-( Adamantan -1- yl )-6-chloropyrazin-2-amine ] 합성 : 화합물 (2d)
<화합물 2d>
2,6-디클로로피라진 (1.5 mmol, 0.22 g)에 용해된 톨루엔(toluene; 50 mL) 용액에 1-아다만탄아민(1-adamantanamine; 0.99 mmol, 0.15 g) 및 칼륨터트-부티르산염(potassium tert-butoxide, KOtbu; 4.0 mmol, 0.45 g)을 실온에서 첨가하여 아르곤(Ar) 가스 하에서 10분 동안 환류시켰다. (2-바이페닐)터트-부틸포스핀[(2-biphenyl)di-tert-butylphosphine (JohnPhos); 0.027 mmol, 0.0079 g] 및 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)[tris(dibenzylideneacetone)dipalladium(0) (Pd2(dba)3); 0.026 mmol, 0.024 g]을 첨가한 후, 반응 혼합물을 아르곤 가스에서 4시간 동안 환류시킨 다음, 진공에서 용매를 제거하였다. 잔여물을 EA로 처리하고 셀라이트로 여과한 다음, 여액을 수집하고 감압 하에서 용매를 제거하였다. 최종 잔여물은 실리카 겔 크로마토그래피 DCM으로 정제하여, 0.033 g (13 %)의 표제 화합물 (2d)를 수득하였다.
2-2-5. 6- 클로로 -N- 사이클로헵틸피라진 -2- 아민 [ 6- Chloro -N-cycloheptylpyrazin-2-amine ] 합성 : 화합물 (2e)
<화합물 2e>
사이클로펩틸아민(cycloheptylamine; 4.0 mmol, 0.31 mL) 및 K2CO3 (6.7 mmol, 0.93 g)를 5.0 mL의 DMF에 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 2,6-디클로로피라진 (3.4 mmol, 0.50 g)을 첨가 후, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 진공에서 용매를 제거하였다. 잔여물을 DCM으로 처리하고 셀라이트로 여과한 다음, 여액을 수집하고 진공에서 용매를 제거하였다. 최종 잔여물은 실리카 겔 크로마토그래피 DCM으로 정제하여, 0.33 g (44 %)의 표제 화합물 (2e)를 수득하였다.
2-3-1. 5-(6-( 사이클로프로필아미노 ) 피라진 -2-일) 인돌린 -2-온 [ 5-(6-(Cyclopropylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one ] 합성 : 화합물 (3a)
<화합물 3a>
마이크로파 용기를 화합물 1 (0.45 g, 1.8 mmol), 화합물 2a (0.20 g, 1.2 mmol), 1,4-다이옥산 (2.0 mL), 에탄올 (0.40 mL), 및 2 M 수성 탄산칼륨 (1.8 mL, 2.54 mmol)으로 채웠다. N2 분위기에서 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(Ⅱ) 디클로라이드[bis(triphenylphosphine) palladium(Ⅱ) dichloride, PdCl2(PPh3)2; 0.041 g, 0.059 mmol]을 첨가한 후, 혼합물에 110℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 용매는 진공에서 제거하고 잔여물은 DCM으로 처리한 다음, 셀라이트의 도움으로 여과하고 여액을 수집하였으며, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔여물은 5:1 DCM/EA를 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.19 g (41 %)의 표제 화합물 (3a)를 수득하였다.
2-3-2. 5-(6-( 사이클로펜틸아미노 ) 피라진 -2-일) 인돌린 -2-온 [ 5-(6-(Cyclopentylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one ] 합성 : 화합물 (3b)
<화합물 3b>
마이크로파 용기를 화합물 1 (0.23 g, 0.91 mmol), 화합물 2b (0.15 g, 0.76 mmol), 1,4-다이옥산 (2.0 mL), 에탄올 (0.40 mL), 및 2 M 수성 탄산칼륨 (0.91 mL, 1.5 mmol)으로 채웠다. N2 분위기에서 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(Ⅱ) 디클로라이드[PdCl2(PPh3)2; 0.027 g, 0.038 mmol]을 첨가한 후, 혼합물에 110℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 용매는 진공에서 제거하고 잔여물은 DCM으로 처리한 다음, 셀라이트의 도움으로 여과하고 여액을 수집하였으며, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔여물은 95:5 DCM/MeOH을 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.11 g (49 %)의 표제 화합물 (3b)를 수득하였다.
2-3-3. 5-(6-( 사이클로헥실아미노 ) 피라진 -2-일) 인돌린 -2-온 [ 5-(6-(Cyclohexylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one ] 합성 : 화합물 (3c)
<화합물 3c>
마이크로파 용기를 화합물 1 (0.12 g, 0.47 mmol), 화합물 2c (0.12 g, 0.56 mmol), 1,4-다이옥산 (2.0 mL), 에탄올 (0.40 mL), 및 2 M 수성 탄산나트륨(sodium carbonate; 0.70 mL, 1.4 mmol)으로 채웠다. N2 분위기에서 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(Ⅱ) 디클로라이드[PdCl2(PPh3)2; 0.017 g, 0.024 mmol]을 첨가한 후, 혼합물에 110℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 용매는 진공에서 제거하고 잔여물은 DCM으로 처리한 다음, 셀라이트의 도움으로 여과하고 여액을 수집하였으며, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔여물은 95:5 DCM/MeOH을 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.070 g (48 %)의 표제 화합물 (3c)를 수득하였다.
2-3-4. 5-(6-( 아다만탄 -1- 일아미노 ) 피라진 -2-일) 인돌린 -2-온 [ 5-(6-(Adamantan-1-ylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one ] 합성 : 화합물 (3d)
<화합물 3d>
마이크로파 용기를 화합물 1 (0.062 g, 0.24 mmol), 화합물 2d (0.052 g, 0.20 mmol), 1,4-다이옥산 (2.0 mL), 에탄올 (0.40 mL), 및 2 M 수성 탄산나트륨 (0.30 mL, 0.6 mmol)으로 채웠다. N2 분위기에서 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(Ⅱ) 디클로라이드[PdCl2(PPh3)2; 0.0070 g, 0.010 mmol]을 첨가한 후, 혼합물에 110℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 용매는 진공에서 제거하고 잔여물은 실리카 겔 상에서 90:10 DCM/MeOH을 사용한 건식 컬럼 진공 크로마토그래피(dry column vacuum chromatography, DCVC)로 정제하였다. 진공에서 용매를 제거한 후, 잔여물은 95:5 DCM/MeOH을 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.034 g (47 %)의 표제 화합물 (3d)를 수득하였다.
2-3-5. 5-(6-( 사이클로헵틸아미노 ) 피라진 -2-일) 인돌린 -2-온 [ 5-(6-(Cycloheptylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one ] 합성 : 화합물 (3e)
<화합물 3e>
마이크로파 용기를 화합물 1 (0.12 g, 0.46 mmol), 화합물 2e (0.13 g, 0.56 mmol), 1,4-다이옥산 (2.0 mL), 에탄올 (0.40 mL), 및 2 M 수성 탄산나트륨 (0.69 mL, 1.4 mmol)으로 채웠다. N2 분위기에서 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(Ⅱ) 디클로라이드[PdCl2(PPh3)2; 0.016 g, 0.023 mmol]을 첨가한 후, 혼합물에 110℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 용매는 진공에서 제거하고 잔여물은 97:3 DCM/MeOH로 처리한 다음, 셀라이트의 도움으로 여과하고 여액을 수집하였으며, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔여물은 97:3 DCM/MeOH 및 95:5 DCM/MeOH을 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.12 g (79 %)의 표제 화합물 (3e)를 수득하였다.
2-4-1. (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-( 사이클로프로필아미노 ) 피 라진-2-일)인돌린-2-온 [ (Z)-3-((1H- imidazol -5- yl ) methylene )-5-(6-(cyclopropylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one ] 합성 : 화합물 (4a; KMU-11170)
<화합물 4a>
마이크로파 용기를 화합물 3a (0.15 g, 0.056 mmol), 피페리딘(piperidine; 6.0 μL, 0.06 mmol), 1H-이미다졸-4-카르발데히드(1H-imidazole-4-carbaldehyde; 0.081 g, 0.85 mmol), 및 에탄올 (2.0 mL)로 채우고, 혼합물에 80℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 용매는 진공에서 제거하고 잔여물은 95:5 DCM/MeOH을 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.042 g (22 %)의 표제 화합물 (4a)를 수득하였다.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.27-11.14 (1H), 8.41 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.29 (s, 1H), 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 2.71 (s, 1H), 0.79 (m, 2H), 0.57-0.45 (m, 2H); ESI MS: m/z = 345[M+H]+, 173[(M+H)/2]+.
2-4-2. (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-( 사이클로펜틸아미노 ) 피라 진-2-일)인돌린-2-온 [ (Z)-3-((1H- imidazol -5- yl ) methylene )-5-(6-(cyclopentylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one ] 합성 : 화합물 (4b; KMU-11342)
<화합물 4b>
마이크로파 용기를 화합물 3b (0.080 g, 0.27 mmol), 피페리딘 (6.0 μL, 0.05 mmol), 1H-이미다졸-4-카르발데히드 (0.031 g, 0.33 mmol), 및 에탄올 (2.0 mL)로 채우고, 혼합물에 80℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 용매는 진공에서 제거하고 잔여물은 80:10 DCM/MeOH을 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.042 g (22 %)의 표제 화합물 (4b)를 수득하였다.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.19 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.09 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.26 (q, J = 6.1 Hz, 1H), 2.18-1.91 (m, 2H), 1.82-1.67 (m, 2H), 1.67-1.57 (m, 2H), 1.57-1.32 (m, 2H); ESI MS: m/z = 373[M+H]+, 187[(M+H)/2]+.
2-4-3-1. (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-( 사이클로헥실아미노 ) 피 라진-2-일)인돌린-2-온 [ (Z)-3-((1H- Imidazol -5- yl ) methylene )-5-(6-(cyclohexylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one ] 합성 : 화합물 (4c; KMU-11361)
<화합물 4c>
마이크로파 용기를 화합물 3c (0.056 g, 0.18 mmol), 피페리딘 (1.8 μL, 0.018 mmol), 1H-이미다졸-4-카르발데히드 (0.021 g, 0.22 mmol), 및 에탄올 (2.0 mL)로 채우고, 혼합물에 80℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 용매는 감압 하에서 제거하고 생성된 고체는 증류수를 첨가하여 여과하였다. 잔여물은 100:5:0.5 클로로포름(CHCl3)/MeOH/암모니아수(NH4OH)를 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.053 g (75 %)의 표제 화합물 (4c)를 수득하였다.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 8.31 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.89 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.78 (s, 1H), 6.96 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 3.88-3.74 (m, 1H), 2.00-1.89 (m, 2H), 1.76-1.65 (m, 2H), 1.61-1.52 (m, 1H), 1.41-1.30 (m, 2H), 1.28-1.13 (m, 4H); ESI MS: m/z = 387[M+H]+, 194[(M+H)/2]+.
2-4-3- 2.( Z)-3-((1H-피롤-2-일)메틸렌)-5-(6-( 사이클로헥실아미노 ) 피라진 -2-일)인돌린-2-온 [ (Z)-3-((1H- pyrrol -2- yl ) methylene )-5-(6-(cyclohexylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one ] 합성 : 화합물 (4c'; KMU-11426)
<화합물 4c'>
마이크로파 용기를 화합물 3c (0.079 g, 0.26 mmol), 피페리딘 (2.5 μL, 0.025 mmol), 1H-이미다졸-4-카르발데히드 (0.029 g, 0.31 mmol), 및 에탄올 (2.0 mL)로 채우고, 혼합물에 80℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 용매는 감압 하에서 제거하고 생성된 고체는 증류수를 첨가하여 여과하였다. 잔여물은 100:3:0.3 CHCl3/MeOH/NH4OH를 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.068 g (68 %)의 표제 화합물 (4c')을 수득하였다.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 11.03 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.85 (m, 2H), 7.77 (s, 1H), 7.35 (br, 1H), 6.95 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.82 (t, J = 1.7 Hz, 1H), 6.39-6.32 (m, 1H), 3.85-3.75 (m, 1H), 1.99-1.90 (m, 2H), 1.71 (dt, J = 13.5, 3.5 Hz, 2H), 1.58 (dt, J = 12.5, 4.0 Hz, 1H), 1.36 (q, J = 11.1 Hz, 2H), 1.28-1.14 (m, 3H); ESI MS: m/z = 386[M+H]+.
2-4-4. (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-( 아다만탄 -1- 일아미노 ) 피라 진-2-일)인돌린-2-온 [ (Z)-3-((1H- Imidazol -5- yl ) methylene )-5-(6-( adamantan -1-ylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one ] 합성 : 화합물 (4d; KMU-11421)
<화합물 4d>
마이크로파 용기를 화합물 3d (0.034 g, 0.094 mmol), 피페리딘 (0.9 μL, 0.0091 mmol), 1H-이미다졸-4-카르발데히드 (0.011 g, 0.11 mmol), 및 에탄올 (1.0 mL)로 채우고, 혼합물에 80℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 용매는 감압 하에서 제거하고 생성된 고체는 증류수를 첨가하여 여과하였다. 잔여물은 90:10 DCM/MeOH를 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.030 g (72 %)의 표제 화합물 (4d)를 수득하였다.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 11.20 (br, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.97 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.03 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 2.27-2.14 (m, 6H), 2.14-2.04 (m, 3H), 1.83-1.64 (m, 6H); ESI MS: m/z = 439[M+H]+, 220[(M+H)/2]+.
2-4-5. (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-( 사이클로헵틸아미노 ) 피라 진-2-일)인돌린-2-온 [ (Z)-3-((1H- Imidazol -5- yl ) methylene )-5-(6-(cycloheptylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one ] 합성 : 화합물 (4e; KMU-11427)
<화합물 4e>
마이크로파 용기를 화합물 3e (0.12 g, 0.7 mmol), 피페리딘 (4.1 μL, 0.037 mmol), 1H-이미다졸-4-카르발데히드 (0.042 g, 0.44 mmol), 및 에탄올 (2.0 mL)로 채우고, 혼합물에 80℃에서 10분간 100 W 마이크로파를 조사하였다. 용매는 감압 하에서 제거하고 생성된 고체는 증류수를 첨가하여 여과하였다. 잔여물은 100:3:0.3 CHCl3/MeOH/NH4OH를 사용한 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 0.062 g (42 %)의 표제 화합물 (4e)을 수득하였다.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 11.20 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.09-6.98 (m, 2H), 4.14-3.94 (m, 1H), 2.06-1.89 (m, 2H), 1.76-1.65 (m, 2H), 1.65-1.47 (m, 8H); ESI MS: m/z = 401[M+H]+, 201[(M+H)/2]+.
<실험방법>
1. 실험 및 분석방법
1-1. 시약
LPS (Escherichia coli serotype)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 셀레콕시브(celecoxib), 이브루티닙(ibrutinib), 메토트렉세이트(methotrexate), 및 룩소리티닙(ruxolitinib)은 Selleck Chemicals (Houston, TX, USA)에서 구입하였다. NF-κB 리간드의 수용체 활성제 (RANKL)는 PeproTech (Rocky Hill, NH, USA)에서 구입하였다.
iNOS, TLR4, MyD88, p-TAK1 (Ser412), p-ERK, ERK, p-JNK, p-IKKα/β, IKKα/β, p-NF-κB p65, NF-κB, ASC, caspase-1, 및 NLRP3에 대한 1차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-IL-1β 항체는 Novus Biologicals (Centennial, CO, USA)에서 구입하였다. IL-6, COX-1, COX-2, TAK1, p-p38, 및 p38에 대한 항체는 각각 Santa Cruz Bio-technology (Santa Cruz, CA, USA) 및 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Anti-TNF-α 항체는 Abcam (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-β-actin 항체는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP) 및 anti-mouse IgG-HRP 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
1-2. 세포주 및 세포 배양
인간 단핵구 세포주(human monocytic cell line) THP-1 세포 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)는 RPMI1640 배지 (Welgene Inc., Gyeongsan, Korea), 10% 소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS; Welgene Inc., Gyeongsan, Korea), 및 1% 항생제(antibiotic)-항진균제(antimycotic) 용액 (Welgene Inc., Gyeongsan, Korea)에서 배양되었다. 세포는 완전 습한 공기 내 37.5℃, 5% CO2에서 배양되었다.
alpha-MEM은 Welgene Inc. (Gyeongsan, Korea)에서 구입하였다.
1-3. 파골세포 분화( osteoclast differentiation)
RAW 264.7 세포를 파골세포 분화 배지 (alpha-MEM+50 ng/ml RANKL)에서 성장시켜 파골세포 유사 세포를 생성하였다. 분화 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 TRAP 염색 키트 (TaKaRa, Japan)를 이용하여 다핵세포(multinucleated cells, MNCs)를 시각화하였다.
1-4. 원발성 인간 골관절염 섬유아세포 유사 활막세포의 분리 및 배양
인간 골관절염(osteoarthritis, OA) 섬유아세포 유사 활막세포(fibroblast-like synoviocytes, FLS)의 분리는 계명대학교 동산의료원에서 활막절제술(synovectomy)을 받은 골관절염 환자의 활막 조직을 효소 소화하여 수행하였다.
등록된 골관절염 환자는 미국 류마티스학회(American College of Rheumatology, ACR) 기준을 충족하고 사전 동의(informed consent)를 제공하는 데 동의하였다. 실험 연구는 2020년 11월 20일 계명대학교 동산의료원 기관 심의 위원회(IRB)의 승인을 받았다 [IRB No. 2020-11-031].
골관절염 조직을 2-3 mm 조각으로 분쇄한 다음, 다져진 조직을 37.5℃, 5% CO2 하, Dulbecco’s modified Eagle 배지 (DMEM; Welgene Inc., Gyeongsan, Korea)에서 0.5 mg/mL II 타입 콜라게나제(collagenases; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 처리하였다. 분리된 세포는 원심분리 (3,000 rpm, 5 min) 한 후, DMEM, 10% FBS, 및 1% 항생제-항진균제 용액에 현탁시켜, 75 cm2 플라스크에서 교반하였다. 1일 후, 부착 세포는 5% CO2 하 37.5℃, DMEM, 10% FBS 및 1% 항생제-항진균제 용액에서 배양되었고, 배양액은 3일마다 교체하였다. 플라스크 바닥의 90-95%가 섬유아세포로 채워졌을 때, 배지를 새로운 배양물을 사용하여 1:3의 비율로 희석하였다.
1-5. 키나아제-프로파일링 분석
신규한 다중-단백질 키나아제 억제제 KMU-1170의 특이성을 평가하기 위하여, Eurofins Cerep S.A.에 의해 키나아제-프로파일링 서비스(kinase-profiling service)를 수행하였다. 키나아제-프로파일링 분석은 1μM의 화합물 및 Eurofin의 프로토콜에 따른 각 개별 키나아제 및 키나아제 기질에 대한 Km 값의 ATP 농도로 수행되었다.
1-6. 세포 생존율 분석
세포 생존율 분석은 XTT assay (Welgene Inc., Gyeongsan, Korea)을 사용하여 수행되었다. 간략하게, 2×105 THP-1 세포를 96-well plates에 24시간 동안 플레이팅한 다음, 다양한 농도의 KMU-1170을 세포에 처리하여 5% CO2 하, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 0.5 mg/mL XTT 용액을 배양액에 첨가하고, 5% CO2 하, 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 450 nM 파장에서 microplate reader (BMG Labtech, Ortenberg, Germany)로 광학 밀도(optical density, OD)를 측정하였다.
1-7. 웨스턴 블로팅 분석
웨스턴 블로팅 분석을 위해 THP-1 세포 (2×106 cells/well in 60-mm dishes) 및 FLS (2×106 cells/well in 100-mm dishes)를 플레이팅하였다. 24시간 동안 배양한 후, 세포를 RIPA buffer (20 mM HEPES and 0.5% Triton X-100, pH 7.6)에 용해시키고, 상등액 분획을 수집하였다. 단백질 농도는 BCA assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정되었다. 동량의 단백질을 SDS-PAGE에서 전기영동하고 니트로셀룰로오스 막 (GE Healthcare Life Science, Pittsburgh, PA, USA)으로 옮겼다. 그 후, 막을 blocking buffer (0.05% Tween 20 with 5% non-fat dry milk in Tris-buffered saline (TBS))로 1시간 동안 배양한 다음, 특정 표적 단백질에 대해 적절히 희석된 1차 항체로 24시간 동안 배양하였다. 다음, 막을 Tween 20과 함께 TBS로 세척하고, 적절한 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다.
특정 단백질은 제조사의 프로토콜에 따라 ECL western blotting kit (EMD Millipore, Darmstadt, Germany)로 검출되었고, 신호 강도는 Chemi Image System Fusion FX (Vilber Lourmat, France)를 사용하여 측정되었다. 단백질 밴드는 Image-J software를 사용하여 정량화되었다. Image-J를 사용한 밴드 밀도의 정량 분석은 세 번의 독립적인 실험의 평균±표준편차(standard deviation, SD)로 표시되었다.
1-8. RNA 분리 및 역전사 중합효소 연쇄 반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT- PCR ) 및 실시간 정량 PCR ( qPCR )
총 세포 RNA는 TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 분리되고, 각 RNA는 NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 정량화되었다. 각 cDNA는 제조사의 지침에 따라 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 1μg의 분리된 RNA로부터 획득하였다.
하기 표 1은 본 실험예에 사용된 프라이머 서열을 나타낸 것이다.
Primers 방향 Sequences ( 5’→ 3’) 서열번호

Cathepsin K		 Forward CAG CAG AAC GGA GGC ATT GA 1
Reverse CCT TTG CCG TGG CGT TAT AC 2

iNOS		 Forward CTG TCT GGT TCC TAC GTC ACC 3
Reverse CCC ACG TTA CAT GGG AGG ATA 4

COX-1		 Forward ACC TTG AAG GAG TCA GGC ATG AG 5
Reverse TGT TCG GTG TCC AGT TCC AAT A 6

COX-2		 Forward ATC ACA GGC TTC CAT TGA CC 7
Reverse TAT CAT CTA GTC CGG AGG GG 8

IL-1β		 Forward CCT TGG GCC TCA AGG AAA A 9
Reverse CTC CAG CTG TAG AGT GGG CTT A 10

TNF-α		 Forward GGA GAA GGG TGA CCG ACT CA 11
Reverse CTG CCC AGA CTC GGC AA 12

IL-6		 Forward ATG GCA CAG TAT CTG GAG GAG 13
Reverse TAA GCT GGA CTC ACT CTC GGA 14

β-actin		 Forward AAT CTG GCA CCA CAC CTT CTA 15
Reverse ATA GCA CAG CCT GGA TAG CAA 16
PCR의 경우, DNA 중합효소는 IL-1β, TNF-α, 및 IL-6를 표적으로 하는 프라이머와 함께 사용되었다. 증폭된 PCR 산물은 2% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리되고 자외선 하에서 검출되었다. 특이적 프라이머 및 SYBR GREEN Premix (Toyobo, Osaka, Japan) 사용에 의한 qPCR의 경우, LightCycler® 480 real-time PCR system (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)로 수행되었다. 실험은 3회 수행되었고, 각 표적 mRNA의 threshold cycle number (Ct)는 β-actin으로 정규화하였다. 각 유전자의 delta-delta Ct(ΔΔ Ct) 값은 세 번의 독립적인 실험의 평균±표준편차로 표시되었다.
1-9. 면역 형광 염색
THP-1 세포 (1×103)를 8-챔버 유리 슬라이드에서 24시간 동안 배양하고, KMU-1170 1μmol/L로 1시간 동안 처리한 다음, 6시간 동안 LPS로 자극하였다. 세포를 phosphate-buffered saline (PBS)으로 세척하고 4% 포름알데히드(formaldehyde)로 고정한 다음, 0.2% Triton X-100이 용해된 PBS를 사용하여 투과시키고 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 1시간 동안 배양하여 비특이적 결합을 차단하였다. 그 후, 세포는 4℃에서 24시간 동안 1차 항체와 함께 배양한 다음, FITC-conjugated goat anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌(4’,6-diamidino-2-phenylindole; Thermo Fisher Scientific, Wal-tham, MA, USA; for nuclear staining) 처리한 다음, 염색된 세포를 현광 현미경으로 확인하였다.
1-10. 통계적 분석
정량적 결과는 평균 및 표준편차로 표시되었다. 데이터는 Statisti-cal Package for Social Science 26.0 software (SPSS Inc.; Chicago, IL, USA)를 사용하여 one-was ANOVA 및 post-hoc comparisons (Student-Newman-Keuls)에 의해 분석되었다. 0.05 이하의 p 값은 중요한 것으로 간주되었다.
< 실험예 1> 실시예 1에 따른 KMU -시리즈 화합물의 항염 활성 분석
KMU-시리즈 화합물의 항염증제로서의 가능성을 조사하기 위하여, THP-1 세포에서 LPS-매개 염증에 대한 KMU-시리즈의 항염증 효과를 분석하였다.
THP-1 세포를 PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate) 100 nM을 사용하여 24시간 동안 대식세포로 분화시켰다. 상기 세포에 KMU-11421, 11426, 11427, 11361, 11342, 11170 (1μM), 및 룩소리티닙(Ruxolitinib) (50μM)을 1시간 동안 처리한 다음, LPS (1μg/mL)를 3시간 동안 첨가하였다. 총 RNA를 추출하여 실시간 PCR을 이용해 IL-1β, TNF-α, 및 IL-6의 mRNA 발현 수준을 결정하였다.
그 결과, 도 2A 및 2B에 나타난 바와 같이, KMU-11426을 제외한 KMU-시리즈 화합물 및 룩소리티닙(JAK 억제제)로 세포를 전처리하면, IL-1β 및 TNF-α의 LPS-유도 상향 조절이 약화되었다. 반면, 도 2C에 나타난 바와 같이, 모든 KMU-시리즈 화합물 및 룩소리티닙은 IL-6의 LPS-유도 상향 조절을 억제하였다.
< 실험예 2> KMU -11342의 RANKL -유도 파골세포 분화 억제 확인
RANKL-유도 파골세포 분화에서 KMU-11342의 효과를 평가하기 위하여, KMU-11342 (0.01, 0.25, 0.5μM)을 1시간 동안 처리한 다음, RAW 264.7 세포를 RANKL (50ng/mL)로 5일 동안 처리하여 파골세포로 분화시켜 TRAP 염색 키트를 사용하여 세포를 염색하였다. TRAP-양성 다핵세포(MNC)는 자줏빛 붉은색으로 염색되었고, 파골세포 분화 정도를 나타내는 TRAP 염색된 세포의 수가 5일 동안 시간 의존적으로 증가하였다.
그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, KMU-11342의 농도가 높을수록, TRAP-양성 MNC가 더 적게 관찰되었으며, 이는 KMU-11342가 RAW 264.7 세포의 RANKL-유도 파골세포 분화를 용량 의존적으로 억제함을 나타낸다.
그 다음, 총 RNA를 추출하여 실시간 PCR을 이용해 파골세포 분화의 최종 조절 단계에 관여하는 파골세포 특이적 바이오마커 카뎁신 K (cathepsin K)의 발현에 대한 KMU-11342의 효과를 분석한 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, KMU-11342는 카뎁신 K mRNA 발현 수준의 RANKL-유도 상향 조절을 억제하였다.
< 실험예 3> KMU -11170 (이하, 실험결과 및 도면에서는 " KMU -1170"으로 표기) 화합물의 여러 가지 활성 분석
3-1. 다양한 단백질 키나아제의 활성에 대한 KMU -1170의 영향 확인
하기 표 2는 1μM KMU-1170 처리에 따른 15개 단백질 키나아제의 키나아제 활성을 나타낸 것이다.
하기 표 2를 참조하면, 단백질 키나아제 분석은 KMU-1170이 염증 반응과 관련된 다양한 키나아제를 억제함을 보여주며, 특히 미토겐-활성 단백질 키나아제 1(mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1), Lck, TYK2, JAK3, 및 Txk에 대해 강한 억제를 나타내었다.
3-2. THP -1 세포에서 KMU -1170의 LPS -유도 상향 조절된 iNOS 및 COX-2의 억제 효과 확인
THP-1 세포에서 KMU-1170의 독성을 조사하기 위하여, 2,3-비스-(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-2H-테트라졸리움-5-카르복스아닐리드[2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide, XTT] 분석을 수행하였다.
THP-1 세포를 PMA 100 nM을 사용하여 24시간 동안 대식세포로 분화시킨 다음, 세포에 다양한 농도의 KMU-1170 (0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 및 10μM)을 처리한 결과, 도 4B에 나타난 바와 같이, KMU-1170은 1μM 농도까지 독성을 나타내지 않았다.
이 후, KMU-1170 (0.1, 0.5, 및 1μM)을 1시간 동안 전처리한 후, 6시간 동안 LPS (1μg/mL)를 처리하여 이에 따라 상향 조절된 iNOS 및 COX-2의 변화를 확인한 결과, 1μM의 KMU-1170은 LPS-유도된 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS) mRNA 및 단백질의 상향 조절을 억제하였고 (도 4C, D, E), 전처리로 LPS-유도된 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2) mRNA 및 단백질의 상향 조절을 억제하였으나, COX-1의 mRNA 및 단백질은 유의미한 변화를 확인하지 못하였다 (도 4F, G, H, I).
3-3. THP -1 세포에서 KMU -1170의 LPS -유도 전염증성 사이토카인 생성 억제 효과 확인
KMU-1170의 항염증 작용 기전을 평가하기 위해, IL-1β, TNF-α, 및 IL-6과 같은 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines)의 수준 조절에 대해 조사하였다. THP-1 세포를 PMA (100 nM)을 사용하여 24시간 동안 대식세포로 분화시킨 다음, KMU-1170 (0.1, 0.5, 및 1μM)를 1시간 동안 전처리한 후 6시간 동안 LPS (1μg/mL)를 처리하여 확인한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 1μM KMU-1170으로 전처리된 세포는 LPS-유도로 상향 조절된 IL-1β(interleukin-1β), TNF-α(tumor necrosis factor-α), 및 IL-6를 억제하는 것으로 나타났다.
3-4. THP -1 세포에서 KMU -1170의 LPS -유도 TAK1 및 MAPKs의 인산화 억제 효과 확인
KMU-1170이 TLR4 및 MyD88 발현에 영향을 미치는지 조사하였다. THP-1 세포를 PMA (100 nM)을 사용하여 24시간 동안 대식세포로 분화시킨 다음, KMU-1170 (0.1, 0.5, 및 1μM)를 1시간 동안 전처리한 후 6시간 동안 LPS (1μg/mL)를 처리하여 확인한 결과, 도 6A 및 6B에 나타난 바와 같이, 1μM KMU-1170로 전처리된 THP-1 세포는 TLR4(toll-like receptor 4) 및 MyD88(myeloid differentiation factor 88)의 LPS-유도 상향 조절을 약화시키지 않는 것으로 나타났다.
염증에서 KMU-1170의 잠재적인 분자 표적을 확인하기 위하여, MAPKs 및 NF-κB의 기능을 조절하는 전환 성장 인자-베타-활성화 키나아제 1(transforming growth factor-β-activated kinase 1, TAK1)의 인산화를 조사한 결과, 도 6C 및 도 6D에 나타난 바와 같이, THP-1 세포에서 KMU-1170의 전처리는 LPS-유도 TAK1의 인산화를 억제하는 것으로 나타났다.
또한, THP-1 세포를 PMA (100 nM)을 사용하여 24 시간 동안 대식세포로 분화시킨 다음, 24시간 동안 KMU-1170의 유무에 관계없이 처리하고 LPS (1μg/mL)로 유도한 결과, 도 6E 및 도 6F에 나타난 바와 같이, MAPKs 중에서는 오직 ERK(extracellular signal-regulated kinases) 및 JNK(c-Jun N-terminal kinases)만이 LPS에 대한 반응으로 인산화되었고, 1μM KMU-1170의 전처리는 THP-1 세포에서 LPS 유도 ERK 및 JNK의 인산화를 억제하는 것으로 나타났다.
3-5. THP -1 세포에서 KMU -1170의 LPS -유도 NF - κB의 활성 억제능 확인
THP-1 세포에서 LPS는 NF-κB kinase α/β 억제제 (inhibitor NF-κB kinase α/β, IKKα/β) 및 NF-κB p65의 인산화를 유도했지만, 도 7A 및 도 7B를 참조하면, KMU-1170로 전처리하면 LPS-유도 인산화가 억제되는 것으로 나타났다.
형광 현미경을 사용하여 KMU-1170이 NF-κB p65의 핵 전좌(nuclear translocation)에 영향을 미치는지 여부를 조사한 결과, 도 7C에 나타난 바와 같이, KMU-1170의 전처리가 THP-1 세포에서 NF-κB p65의 LPS-유도 핵 전좌를 억제하는 것으로 나타났다.
3-6. THP -1 세포에서 KMU -1170의 LPS -유도 NLRP3의 활성 약화 확인
KMU-1170이 NLRP3 인플라마좀 신호에 영향을 미치는지 확인하기 위해, THP-1 세포를 PMA (100 nM)을 사용하여 24시간 동안 대식세포로 분화시킨 다음, KMU-1170 1μM를 1시간 동안 전처리한 후 6시간 동안 LPS (1μg/mL) 및/또는 ATP (1 mM)를 처리하였다.
그 결과, 도 8A와 같이, THP-1 세포에 1μM KMU-1170의 전처리는 LPS-유도 pro-IL-1β 및 IL-1β의 세포질 방출을 억제하는 것으로 나타났다. 게다가, 1μM KMU-1170의 전처리는 LPS 및 LPS와 ATP 공동 처리에 의해 유도된 NLRP3, ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD), pro-caspase-1, 및 pro-IL-1β의 상향 조절을 약화시켰다.
이러한 정량적 결과는 KMU-1170이 NLRP3 인플라마좀 활성을 유의하게 억제할 수 있음을 보여준다 (도 8B).
3-7. THP -1 세포에서 KMU -1170의 강력한 항염증 활성 확인
항염증제로서 KMU-1170의 작용을 고려하여, KMU-1170의 항염증 효능의 잠재적 우수성을 다른 다양한 항염증제와 비교하여 분석하였다. THP-1 세포를 PMA (100 nM)을 사용하여 24시간 동안 대식세포로 분화시킨 다음, KMU-1170 (1μM), 셀레콕시브(celecoxib, 25μM), 이브루티닙(ibrutinib, 5μM), 룩소리티닙(luxolitinib, 50μM), 및 메토트렉세이트(metotrexate, 1μM)로 1시간 동안 전처리한 후, 6시간 동안 LPS (1μg/mL)를 처리하였다.
그 결과, 도 8C 및 8D에 나타난 바와 같이, 1μM KMU-1170는 THP-1 세포에서 LPS-유도로 증가된 IL-1β 단백질을 유의적으로 억제한 반면, 셀레콕시브 (COX-2 억제제), 이브루티닙 (BTK 억제제), 룩소리티닙 (JAK 억제제) 및 메토트렉세이트 (RA의 항염증제)와 같은 다른 시험된 약물은 고 농도에서도 이러한 효과가 확인되지 않았다. 1μM 메토트렉세이트 만이 KMU-1170을 처리한 경우와 유사하게 LPS-유도로 상향 조절된 IL-1β를 억제하는 것으로 나타났다.
3-8. 골관절염 섬유아세포 유사 활막세포에서 KMU -1170의 LPS -유도 염증 억제 활성 확인
마지막으로, 인간 골관절염(OA) 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)를 사용하여 골관절염에 대한 KMU-1170의 항염증 활성을 확인하였다. 무릎 골관절염 환자의 활액 조직에서 인간 골관절염 섬유아세포 유사 활막세포를 획득하였고, 이 세포에 KMU-1170 (0.1, 0.5, 및 1μM)를 1시간 동안 전처리한 후 6시간 동안 LPS (1μg/mL)를 처리하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, KMU-1170 전처리된 FLS는 LPS-유도 상향 조절된 IL-1β, TNF-α, 및 IL-6의 mRNA 및 단백질 수준 (도 9A 내지 9D)과 iNOS 및 COX-2 단백질 수준 (도 9E)을 억제하였다. 또한, KMU-1170 전처리는 FLS에서 IKKα/β 및 NF-κB p65의 LPS-유도 인산화를 억제하였다 (도 9F).
즉, 본 발명은 새로운 다중-단백질 키나아제 억제제 KMU-1170이 p-TAK1/ p-IKKα/β/p-NF-κB/전염증성 사이토카인 신호 조절 경로 및 NLRP3 인플라마좀을 조절하여 항염증 효과를 가짐을 확인하였다 (도 10). 이러한 결과는 KMU-시리즈 화합물이 강력한 항염증제 개발에 대해 매우 유리한 화합물임을 시사한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
<110> INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION KEIMYUNG UNIVERSITY <120> NOVEL MULTI-PROTEIN KINASE INHIBITOR <130> ADP-2021-0035 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin K-f <400> 1 cagcagaacg gaggcattga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin K-r <400> 2 cctttgccgt ggcgttatac 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS-f <400> 3 ctgtctggtt cctacgtcac c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS-r <400> 4 cccacgttac atgggaggat a 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-1-f <400> 5 accttgaagg agtcaggcat gag 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-1-r <400> 6 tgttcggtgt ccagttccaa ta 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2-f <400> 7 atcacaggct tccattgacc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2-r <400> 8 tatcatctag tccggagggg 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta-f <400> 9 ccttgggcct caaggaaaa 19 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta-r <400> 10 ctccagctgt agagtgggct ta 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha-f <400> 11 ggagaagggt gaccgactca 20 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha-r <400> 12 ctgcccagac tcggcaa 17 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6-f <400> 13 atggcacagt atctggagga g 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6-r <400> 14 taagctggac tcactctcgg a 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin-f <400> 15 aatctggcac cacaccttct a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin-r <400> 16 atagcacagc ctggatagca a 21

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    <화학식 1>
    Figure 112021092000761-pat00021

    상기 화학식 1에서,
    R1은 수소, 하이드록시, 할로겐, (C1-C4) 알킬, (C3-C10) 사이클로알킬, 또는 아다만타닐(adamantanyl)에서 선택되고,
    R2는 이미다졸일(imidazolyl), 피라졸일(pyrazolyl), 피롤일(pyrrolyl) 또는 피롤리딘일(pyrrolidinyl)에서 선택됨.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 화합물 또는 이의 염은,
    상기 R1이 (C3-C8) 사이클로알킬, 또는 아다만타닐(adamantanyl)에서 선택되고,
    상기 R2는 이미다졸일(imidazolyl) 또는 피롤일(pyrrolyl)에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 화합물 또는 이의 염은,
    (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-(사이클로프로필아미노)피라진-2-일)인돌린-2-온 [(Z)-3-((1H-imidazol-5-yl)methylene)-5-(6-(cyclopropylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one] (4a; KMU-11170), (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-(사이클로펜틸아미노)피라진-2-일)인돌린-2-온 [(Z)-3-((1H-imidazol-5-yl)methylene)-5-(6-(cyclopentylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one] (4b; KMU-11342), (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-(사이클로헥실아미노)피라진-2-일)인돌린-2-온 [(Z)-3-((1H-Imidazol-5-yl)methylene)-5-(6-(cyclohexylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one] (4c; KMU-11361), (Z)-3-((1H-피롤-2-일)메틸렌)-5-(6-(사이클로헥실아미노)피라진-2-일)인돌린-2-온 [(Z)-3-((1H-pyrrol-2-yl)methylene)-5-(6-(cyclohexylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one] (4c'; KMU-11426), (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-(아다만탄-1-일아미노)피라진-2-일)인돌린-2-온 [(Z)-3-((1H-Imidazol-5-yl)methylene)-5-(6-(adamantan-1-ylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one] (4d; KMU-11421), 및 (Z)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸렌)-5-(6-(사이클로헵틸아미노)피라진-2-일)인돌린-2-온 [(Z)-3-((1H-Imidazol-5-yl)methylene)-5-(6-(cycloheptylamino)pyrazin-2-yl)indolin-2-one] (4e; KMU-11427)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 화합물 또는 염은,
    MAPK, TAK1, Lck, TYK2, JAK3, 및 Txk로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 키나아제를 억제하는 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 화합물 또는 염은,
    NLRP3 인플라마좀의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 화합물 또는 염은,
    항염증 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  7. 제 1 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 염증성 질환은,
    골관절염, 류마티스관절염, 골다공증, 골 파제트병, 및 강직성척추염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제 1 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 염증성 질환은,
    골관절염, 류마티스관절염, 골다공증, 골 파제트병, 및 강직성척추염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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