CN106928310B - 一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物及其合成与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物的结构通式。本发明进一步提供了一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物的合成路线及其合成步骤。本发明还提供了一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。本发明提供的一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物及其合成与应用，经过体外抗肿瘤活性测试，发现该类化合物对肿瘤细胞生长具有显著抑制作用，为抗药肿瘤药物开发提供了新的靶点和治疗策略，具有新型抗肿瘤药物的开发潜力。
Description
技术领域
本发明属于化学制药技术领域，涉及一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物及其合成与应用，具体涉及一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物及其合成方法且在治疗肿瘤的药物的应用。
背景技术
肿瘤是目前危害人类健康最严重的疾病之一，在世界范围内肿瘤发病率呈逐年上升趋势。在中国，肿瘤年死亡率也高居不下。肿瘤的发生发展是复杂的多因素、多阶段过程。其发生、发展与调控细胞增殖与死亡的相关基因的异常表达有着密切的联系。肿瘤细胞中存在肿瘤抑制基因的突变，致使肿瘤细胞对凋亡的敏感性降低。同时，肿瘤细胞还能够通过药物外排机制和DNA修复等多种途径，增强其药物耐受能力。化疗是通过化学药物对肿瘤进行杀伤治疗，抗肿瘤药物进入人体后可分布至全身，既能够抑制肿瘤生长和扩散，也能杀灭转移的肿瘤，对原发灶、转移灶和亚临床转移灶均有疗效，多数情况可以手术、放疗合用，已成为肿瘤治疗的有效手段。但随着肿瘤细胞对化疗药物的耐受增加，极大地限制了其在临床治疗中的应用。所以，新型抗肿瘤靶点的研究具有特殊意义。现阶段临床上采用的化疗药物多通过引起肿瘤细胞凋亡而发挥杀伤作用，但化疗时间的延迟会导致肿瘤耐药性的形成。
细胞死亡是生命活动过程中一项重要的生理或病理现象。肿瘤药物主要通过特异性抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞死亡来发挥作用。细胞凋亡(Apoptosis)和细胞坏死(Necrosis)是最主要的两种细胞死亡方式。凋亡是一种细胞为维持内环境稳定而发生的自发性死亡机制，受多种凋亡相关信号通路的调控；而坏死是指在外界损伤作用下，细胞被动、无序的一种死亡方式，通常伴随着炎症反应。近年来，随着对细胞死亡机制研究的不断深入，研究人员发现细胞的死亡方式，除了细胞凋亡和细胞坏死这两类以外，还包括如细胞程序性坏死(Necroptosis)、自噬性细胞死亡(Autophagic Cell Death)、副凋亡(Paraptosis)、胀亡(Oncosis)和铁死亡(Ferroptosis)等其它多种死亡模式。巨泡式死亡(methuosis)是一种新发现的细胞死亡方式，在这种细胞死亡过程中，由于过度刺激导致细胞发生严重的巨胞饮，细胞内水泡吸收、积累、融合而逐步形成相对于细胞本身而言的大量巨大液泡，最终导致细胞代谢活动减少、细胞膜破裂、细胞死亡。巨胞饮(macropinocytosis)是非特异性的內吞胞外大量液相物质的过程，由于缺乏颗粒或细胞的包被诱导其形成，因此形成的巨胞饮体大小各异。在过去的研究，发现的能够诱导肿瘤细胞发生巨泡式死亡的化学小分子化合物主要有2011年Maltese研究组发现的查耳酮衍生物MIPP(J.Med.Chem.2012,55,1940-1956.)，以及随后深入结构优化获得的活性更好的化合物MOMIPP(J.Med.Chem.2015,58,2489-2512.US 2015/0152049 Al)。巨泡式死亡的研究为细胞死亡的途径增添了新的研究方向，发现利用药物诱导肿瘤细胞发生巨泡式死亡，将为肿瘤治疗提供新的靶点和思路。
熊果酸(ursolic acid，UA)，是一种存在于天然植物中的乌苏烷型五环三萜类化合物，具有镇静、抗炎、护肝、降血脂等多种生物活性，是已知多种中草药的主要活性成分。近年来，国内外陆续报道了熊果酸对多种肿瘤细胞增殖的显著抑制作用，并具有确定的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。因此，有必要对其进行进一步的研究与探讨。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物及其合成与应用，用于诱导肿瘤细胞发生巨泡式死亡的方式杀伤肿瘤细胞，具有新型抗肿瘤药物的开发潜力。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物，所述衍生物具有如下式6所示的结构通式：
式中，
R1选自氢(-H)、C1-C4烷基、卤代烷基、C(O)OR’；所述R’为C1-C4烷基；
R2选自C1-C4烷基、C1-C3羟基烷基、C3-C6环烷基、环烷基烷基、芳基、杂芳基。
优选地，所述R1中C1-C4烷基为甲基(-CH3)。
优选地，所述R1中卤代烷基为三氟甲基(-CF3)。
优选地，所述R1中C(O)OR’为-CO2Et。
优选地，所述R2中C1-C4烷基为甲基(methyl)或异丙基(isopropyl)。
优选地，所述R2中C1-C3羟基烷基为2-羟乙基(2-hydroxyethy)。
优选地，所述R2中C3-C6环烷基为环戊基(cyclopentyl)。
优选地，所述R2中环烷基烷基为环丙基甲基(cyclopropylmethyl)。
优选地，所述R2中芳基为苯基(phenyl)、4-氟苯基(4-fluorophenyl)、3-氟苯基(3-fluorophenyl)、4-氰基苯基(4-cyanophenyl)、4-氯苯基(4-chlorophenyl)、3-氯苯基(3-chlorophenyl)、3,5-二氯苯基(2,4-dichlorophenyl)或4-羧基苯基(4-carboxyphenyl)。
优选地，所述R2中杂芳基为4-吡啶基(4-pyridyl)。
优选地，所述一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物为化合物UA5、化合物UA8、化合物UA17、化合物UA21或化合物UA23，其中，所述化合物UA5中的R1为氢(-H)，R2为甲基(-CH3)；所述化合物UA8中的R1为氢(-H)，R2为环戊基所述化合物UA17中的R1为氢(-H)，R2为4-氰基苯基所述化合物UA21中的R1为氢(-H)，R2为3,5-二氯苯基所述化合物UA23中的R1为三氟甲基(-CF3)，R2为环戊基
更优选地，所述一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物为化合物UA17，所述化合物UA17中的R1为氢(-H)，R2为4-氰基苯基所述化合物UA17的结构式为：
本发明第二方面提供一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物的合成方法，其合成路线如下：
具体包括以下步骤：
a)使熊果酸(1)的C-28位羧基获得苄基保护，获得中间体(2)；
优选地，在步骤a)中，所述熊果酸(1)为商品化的熊果酸。
优选地，在步骤a)中，所述苄基保护是将熊果酸(1)与碳酸钾(K2CO3)、N,N-二甲基酰胺(DMF)、苄溴(BnBr)混合后进行加热反应，获得的混合物冷却至室温后，加水析出固体产物，将固体产物过滤、洗涤、干燥后，获得中间体(2)。
更优选地，所述熊果酸(1)与碳酸钾加入的摩尔(mol)比为1:1-3。进一步优选地，所述熊果酸(1)与碳酸钾加入的摩尔(mol)比为1:1.5。
更优选地，所述熊果酸(1)与N,N-二甲基酰胺加入的摩尔(mol)比为1:9-11。进一步优选地，所述熊果酸(1)与N,N-二甲基酰胺加入的摩尔(mol)比为1:10。
更优选地，所述熊果酸(1)与苄溴加入的摩尔(mol)比为1:1-2。进一步优选地，所述熊果酸(1)与苄溴加入的摩尔(mol)比为1:1.5。
更优选地，所述加热反应的条件为：反应温度为50-70℃；反应时间为3-5h。进一步优选地，所述加热反应的条件为：反应温度为60℃；反应时间为4h。
更优选地，所述室温为20-25℃。
更优选地，所述熊果酸(1)加入的质量(mg)与水加入的体积(mL)之比为450-470:40-60。进一步优选地，所述熊果酸(1)加入的质量(mg)与水加入的体积(mL)之比为460:50。
优选地，在步骤a)中，所述中间体(2)的产率为90-94％。
更优选地，在步骤a)中，所述洗涤采用水进行多次洗涤。
b)在中间体(2)中加入PCC进行氧化反应，使中间体(2)的C-3位羟基氧化形成羰基，获得中间体(3)；
优选地，在步骤b)中，所述氧化反应是将中间体(2)溶于二氯甲烷后冷却至0℃以下，加入PCC在室温下搅拌进行氧化反应，将获得的反应产物过滤、浓缩、分离纯化后，获得中间体(3)。
更优选地，所述中间体(2)加入的质量(mg)与二氯甲烷加入的体积(mL)之比为440-460:40-60。进一步优选地，所述中间体(2)加入的质量(mg)与二氯甲烷加入的体积(mL)之比为450:50。
更优选地，所述中间体(2)与PCC加入的摩尔比为1:1.2-3。进一步优选地，所述中间体(2)与PCC加入的摩尔比为1:1.5。所述PCC为吡啶和CrO3在盐酸溶液中的络合盐。
更优选地，所述搅拌时间为11-13h。进一步优选地，所述搅拌时间为12h。
优选地，在步骤b)中，所述中间体(3)的产率为83-85％。
c)将中间体(3)在碱性条件下加入酯类化合物进行反应，使中间体(3)的C-3位羰基的α-位上形成-CO-R1取代基，获得中间体(4)；
优选地，在步骤c)中，所述反应是将中间体(3)溶于四氢呋喃(THF)后冷却至0℃以下，加入碱性化合物、酯类化合物，在室温下搅拌混合反应，将获得的反应产物加水进行淬灭反应，经萃取、洗涤、干燥、过滤、浓缩、分离纯化后，获得中间体(4)，所述中间体(4)中，R1具有如式6化合物中相同的定义。
更优选地，所述中间体(3)加入的质量(mg)与四氢呋喃加入的体积(mL)之比为250-350:15-25。进一步优选地，所述中间体(3)加入的质量(mg)与四氢呋喃加入的体积(mL)之比为300:20。
更优选地，所述碱性化合物为甲醇钠。
更优选地，所述中间体(3)与碱性化合物加入的摩尔比为1:1-2。进一步优选地，所述中间体(3)与碱性化合物加入的摩尔比为1:1.5。
更优选地，所述酯类化合物选自甲酸乙酯、乙酸乙酯、三氟乙酸乙酯中的一种。
更优选地，所述中间体(3)与酯类化合物加入的摩尔比为1:1-1.5。进一步优选地，所述中间体(3)与酯类化合物加入的摩尔比为1:1.2。
更优选地，所述搅拌时间为3-5h。进一步优选地，所述搅拌时间为4h。
更优选地，所述淬灭反应是通过加水去除反应产物中不需要参与后续反应的溶于水的物质。
更优选地，所述萃取的反应条件为：萃取试剂为乙酸乙酯，萃取次数为3-4次，萃取试剂用量为25-35ml。进一步优选地，所述萃取的反应条件为：萃取试剂为乙酸乙酯，萃取次数为3次，萃取试剂用量为30ml。
更优选地，所述洗涤依次采用水、食盐进行多次洗涤。
更优选地，所述干燥采用无水硫酸钠进行干燥。
优选地，在步骤c)中，所述中间体(4)的产率为65-75％。
d)将中间体(4)与肼类化合物进行缩合反应，使中间体(4)的C-3位羰基脱水形成R2取代基的吡唑杂环，获得中间体(5)；
优选地，在步骤d)中，所述缩合反应是将中间体(4)与肼类化合物溶于有机溶剂，加热搅拌反应后冷却至室温，将获得的反应产物浓缩、洗涤、分离纯化后，获得中间体(5)，所述中间体(5)中，R1和R2具有如式6化合物中相同的定义。
更优选地，所述肼类化合物选自烷基肼、芳基肼、杂芳基肼中的一种。进一步优选地，所述肼类化合物选自苯肼、对甲苯肼、对氯苯肼、对溴苯肼、对羧基苯肼、对氰基苯肼中的一种。
更优选地，所述中间体(4)与肼类化合物加入的摩尔比为1:1-2。进一步优选地，所述中间体(4)与肼类化合物加入的摩尔比为1:1。
更优选地，所述有机溶剂为乙醇。
更优选地，所述中间体(4)加入的质量(mg)与有机溶剂加入的体积(mL)之比为310-330:15-25。进一步优选地，所述中间体(4)加入的质量(mg)与有机溶剂加入的体积(mL)之比为320:20。
更优选地，所述加热搅拌反应的条件为：加热温度为80-90℃，搅拌时间为11-13h。
进一步优选地，所述加热搅拌反应的条件为：加热温度为85℃，搅拌时间为12h。
更优选地，所述洗涤采用水进行多次洗涤。
优选地，在步骤d)中，所述中间体(5)的产率为80-90％。
e)将中间体(5)进行氢化反应，使中间体(5)脱出C-28位羧基上的苄基保护基，即得所需化合物(6)。
优选地，在步骤e)中，所述氢化反应是将中间体(5)和催化剂溶于有机溶剂，再通入氢气进行反应，将获得的反应产物过滤、洗涤、浓缩后搅拌打浆，再次过滤、干燥，即得所需化合物(6)。
更优选地，所述催化剂为10wt％钯碳混合物(Pd与C的重量之比为10:90)。
更优选地，所述中间体(5)与催化剂加入的质量之比为30-40:45-55。进一步优选地，所述中间体(5)与催化剂加入的质量之比为35:50。
更优选地，所述有机溶剂为甲醇。
更优选地，所述中间体(5)加入的质量(mg)与有机溶剂加入的体积(mL)之比为30-40:15-25。进一步优选地，所述中间体(5)加入的质量(mg)与有机溶剂加入的体积(mL)之比为35:20。
更优选地，所述氢气在常压下通入。
更优选地，所述催化氢化反应在常压下进行。
更优选地，所述洗涤采用甲醇进行多次洗涤。
更优选地，所述搅拌打浆是将残留物经乙醚搅拌打浆。
更优选地，所述再次过滤为减压抽滤方式。
更优选地，在步骤e)中，所述化合物(6)的产率为85-90％。
更优选地，在步骤a)、b)、c)或e)中，所述过滤是将反应产物经硅藻土过滤除去不溶物。
更优选地，在步骤b)、c)、d)或e)中，所述浓缩是将反应产物进行加压蒸馏浓缩。
更优选地，在步骤b)、c)或d)中，所述分离纯化是将反应产物经硅胶柱进行层析分离纯化。
更优选地，在步骤a)或e)中，所述干燥为真空干燥，所述真空干燥的条件分别为55-65℃，真空度0.005-0.015Pa。所述真空干燥为常规采用油泵进行抽真空的干燥方式。
本发明第三方面提供一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
优选地，所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、肝癌或神经上皮瘤。
更优选地，所述肿瘤的细胞为乳腺癌细胞MCF-7、宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞HepG2或神经上皮瘤细胞SK-N-MC中的一种或多种。
所述一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物制备用于治疗肿瘤的药物的机理为通过巨胞饮诱导肿瘤细胞发生巨泡式死亡，从而抑制肿瘤细胞生长。
本发明第四方面提供一种药物组合物，包括治疗有效量的一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物。
如上所述，本发明提供的一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物及其合成与应用，通过在熊果酸A环的结构修饰，合成了一系列在熊果酸A环上具有吡唑杂环的熊果酸衍生物。利用CCK-8法、western blot法、流式细胞术、免疫荧光和电镜等实验手段，经过体外抗肿瘤活性测试，发现该类化合物对肿瘤细胞生长具有显著抑制作用，能够通过诱导细胞发生巨泡式死亡的全新死亡模式而杀死肿瘤细胞，为抗药肿瘤药物开发提供了新的靶点和治疗策略，具有新型抗肿瘤药物的开发潜力。
附图说明
图1显示为本发明的一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物对肿瘤细胞MCF-7的抑制活性示意图。
图2显示为本发明的一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物对肿瘤细胞Hela的抑制活性示意图。
图3显示为本发明的一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物对肿瘤细胞HepG2的抑制活性示意图。
图4显示为本发明的一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物对肿瘤细胞SK-N-MC的抑制活性示意图。
图5显示为本发明的一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物中化合物UA17诱导肿瘤细胞出现大量空泡的透射电镜图5A、5B、5C、5D，其中，5A：诱导肿瘤细胞MCF-7；5B：诱导肿瘤细胞Hela；5C：诱导肿瘤细胞HepG2；5D：诱导肿瘤细胞SK-N-MC。
图6显示为本发明的一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物中化合物UA17对肿瘤细胞Hela凋亡的影响示意图6A、6B，其中，6A：凋亡和坏死细胞数量与存在时间以及剂量效应关系图；6B：对图6A结果的量化表示图。
图7显示为本发明的一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物中化合物UA17诱导HeLa细胞发生非传统的死亡模式示意图7A、7B、7C、7D，其中，7A：UA17诱导HeLa细胞是否存在PARP和caspase-3的活化示意图；7B：添加caspase通路抑制剂z-VAD-FMK检测UA17刺激下细胞活力的变化示意图；7C：UA17检测自噬标志物LC3-II的表达情况图；7D：添加自噬抑制剂3-MA检测UA17诱导HeLa细胞是否死亡示意图。
图8显示为本发明的一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物中化合物UA17通过过度活化巨胞饮诱导肿瘤细胞发生methuosis示意图8A、8B、8C、8D、8E、8F，其中，8A：UA17诱导的细胞内空泡大小不一的透射电镜图；8B：UA17诱导细胞内空泡产生的透射电镜图；8C：添加巨胞饮抑制剂Baf-A1缓解UA17的细胞毒性作用示意图；8D：添加巨胞饮抑制剂Baf-A1减少UA17引起的细胞内空泡效应的透射电镜图；8E：UA17作用后LAMP-1的表达显著增强的透射电镜图；8F：A17诱导产生细胞内空泡与线粒体，溶酶体无关的透射电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例中使用的试剂均为本领域常规使用的试剂，使用的仪器均为本领域常规使用的仪器。
实施例1
取熊果酸(1)460mg、无水碳酸钾280mg溶于10ml N,N-二甲基酰胺中，再加入BnBr300mg，反应混合物在60℃左右加热4小时至反应进行完全。混合物冷却至室温下，加入50mLH2O，析出白色固体。所得固体依次经过滤、水洗、真空干燥即得0.50g中间体(2)，中间体(2)的产率为92％。
中间体(2)的谱图鉴定结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝7.36-7.29(m,5H),5.24-5.23(m,1H),5.10(d,J＝12.5Hz,1H),4.98(d,J＝12.5Hz,1H),3.20(dd,J＝11.0,4.5Hz,1H),2.04-1.98(m,1H),1.89-1.76(m,3H),1.73-1.67(m,2H),1.64-1.55(m,4H),1.53-1.44(m,6H),1.37-1.26(m,6H),1.07(s,3H),1.05-1.02(m,2H),0.98(s,3H),0.93(d,J＝6.0Hz,3H),0.89(s,3H),0.85(d,J＝6.5Hz,3H),0.78(s,3H),0.64(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝177.3,138.1,136.3,128.4(2C),128.1(2C),127.9,125.7,79.0,66.0,55.2,52.9,48.1,47.5,42.0,39.5,39.1,38.8,38.7,38.6,36.9,36.6,33.0,30.6,28.1,27.9,27.2,24.2,23.5,23.2,21.2,18.3,17.0(2C),15.6,15.4.
合成过程如下：
实施例2
取中间体(2)450mg溶于50mL无水二氯甲烷中，冷却至0℃以下，加入PCC355mg反应，混合物缓慢升至室温下搅拌12小时左右至反应进行完全。反应混合物经硅藻土过滤除去不溶物，有机相加压浓缩，残留物经硅胶柱层析分离纯化即得375mg中间体(3)，中间体(3)为白色固体，中间体(3)的产率为84％。
中间体(3)的谱图鉴定结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝7.37-7.29(m,5H),5.25(t,J＝3.5Hz,1H),5.11(d,J＝12.5Hz,1H),4.99(d,J＝12.5Hz,1H),2.57-2.50(m,1H),2.40-2.34(m,1H),2.27(d,J＝11.5Hz,1H),2.04-1.98(m,1H),1.92-1.87(m,3H),1.82-1.68(m,3H),1.64-1.54(m,3H),1.50-1.41(m,5H),1.35-1.28(m,4H),1.10-1.07(m,1H),1.08(s,6H),1.03(d,J＝9.0Hz,6H),0.93(d,J＝6.0Hz,3H),0.85(d,J＝6.5Hz,3H),0.68(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝177.2,138.2,136.3,128.4(2C),128.1(2C),127.9,125.4,66.0,55.2,52.9,48.1,47.4,46.7,42.1,39.4,39.3,39.1,38.8,36.6,36.5,34.2,32.5,30.6,27.9,26.5,24.2,23.5,23.3,21.4,21.1,19.5,17.0,16.9,15.2.
合成过程如下：
实施例3
取中间体(3)300mg溶于20mL无水四氢呋喃中，反应液冷却至0℃下，向其中加入甲醇钠45mg，然后加入甲酸乙酯45mg。反应混合物置于室温下搅拌约4小时至反应进行完全。加入少量水淬灭反应，混合物经乙酸乙酯萃取三次(3x30ml)。合并有机相依次用水、食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤。有机相浓缩，残留经硅胶柱层析快速分离得中间体(4a)。
中间体(4a)的谱图鉴定结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝14.92(br s,1H),8.57(s,1H),7.37-7.30(m,5H),5.28(t,J＝3.3Hz,1H),5.12(d,J＝12.5Hz,1H),4.99(d,J＝12.5,1H),2.32-2.28(m,2H),2.05-1.92(m,4H),1.82-1.69(m,3H),1.65-1.56(m,2H),1.50-1.43(m,3H),1.39-1.26(m,5H),1.18(s,3H),1.14-1.10(m,2H),1.11(s,3H),1.08(s,3H),0.94(d,J＝6.5Hz,3H),0.89(s,3H),0.86(d,J＝6.5Hz,3H),0.68(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝177.2,138.1,136.3,128.4(2C),128.2(2C),127.9,125.4,105.8,66.0,53.0,52.0,48.1,45.5,42.2,40.1,39.4,39.3,39.1,38.8,36.6,36.2,32.3,30.6,28.4,27.9,24.2,23.4,23.3,21.1,20.9,19.4,17.0,16.9,14.6.
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C38H52O4:572.3866；found:572.3871.
合成过程如下：
实施例4
取中间体(3)300mg溶于20mL无水四氢呋喃中，反应液冷却至0℃下，向其中加入甲醇钠45mg，然后加入乙酸乙酯55mg。将反应置于室温下搅拌4小时左右至反应进行完全，加入少量水淬灭反应。混合物用乙酸乙酯萃取三次(3x30mL)。合并有机相依次经水洗、食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤、滤液经加压蒸馏浓缩，残留物经硅胶柱层析快速分离即得中间体(4b)。
合成过程如下：
实施例5
取中间体(3)300mg溶于20mL无水四氢呋喃中，反应液冷却至0℃下，向其中加入甲醇钠45mg，然后加入三氟乙酸乙酯55mg。将反应置于室温下搅拌4小时左右至反应进行完全，加入少量水淬灭反应。混合物用乙酸乙酯萃取三次(3x30mL)。合并有机相依次经水洗、食盐水洗、无水硫酸钠干燥、过滤、滤液经加压蒸馏浓缩，残留物经硅胶柱层析快速分离即得中间体(4c)。
合成过程如下：
实施例6
取中间体(4a)320mg、甲基肼盐酸盐45mg溶于20mL乙醇中，加热至80℃下搅拌反应12小时左右至反应进行完全。反应液冷却至室温下，减压蒸馏除去溶剂，残留物加水洗涤数次。所得固体物溶于20mL甲醇中，加入10％Pd/C 50mg，常压催化氢化。待反应进行完全，过滤除去钯碳，甲醇洗涤数次。滤液加压浓缩，所得残留物经乙醚搅拌打浆，过滤，固体真空干燥即得175mg化合物UA5，化合物UA5为白色固体，化合物UA5的产率为64％。
化合物UA5的谱图鉴定结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝10.25(br s,1H),6.92(s,1H),5.29(s,1H),3.82(s,3H),2.53(d,J＝12.0Hz,1H),2.23(d,J＝8.8Hz,1H),2.01-1.98(m,3H),1.93-1.90(m,1H),1.76-1.64(m,4H),1.56-1.49(m,3H),1.40-1.30(m,6H),1.27(s,3H),1.27-1.23(m,1H),1.17(s,3H),1.09(s,3H),0.94(d,J＝4.8Hz,3H),0.88(d,J＝6.0Hz,3H),0.86(s,3H),0.84(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝182.8，156.3，137.9,127.4,125.6,113.5,53.5,52.7,47.9,45.9,42.1,39.4,39.1,38.8,38.5,37.9,36.8,36.4,34.0,32.5,31.6,30.7,28.0,24.4,23.4,23.3,22.6,21.2,19.3,17.0,16.9,15.3.
LC/MS:[MH+]493.8
化合物UA5的合成过程如下：
实施例7
取中间体(4a)320mg、环戊基肼盐酸盐76mg溶于25mL乙醇中，加热至80℃下搅拌反应12小时左右至反应进行完全。反应液冷却至室温下，减压蒸馏除去溶剂，残留物加水洗涤数次。所得固体物溶于15mL甲醇中，加入10％Pd/C 42mg，常压催化氢化。待反应进行完全，过滤除去钯碳，甲醇洗涤数次。滤液加压浓缩，所得残留物经乙醚搅拌打浆，过滤，固体真空干燥即得170mg化合物UA8，化合物UA8为白色固体，化合物UA8的产率为56％。
化合物UA8的谱图鉴定结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝10.40(br s,1H),7.22(s,1H),5.30(s,1H),4.78-4.71(m,1H),2.53(d,J＝11.6Hz,1H),2.23(d,J＝9.2Hz,1H),2.23-2.00(m,3H),1.96-1.87(m,1H),1.74-1.62(m,4H),1.57-1.49(m,3H),1.42-1.40(m,3H),1.32(s,3H),1.17(s,3H),1.09(s,3H),0.94(d,J＝5.2Hz,3H),0.86(s,3H),0.85(d,J＝6.0Hz,3H),0.83(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝183.7，143.9，137.8，137.2,125.8,112.8,60.8,55.1,52.6,48.0,46.2,42.0,39.4,39.1,38.8,37.9,37.1,36.7,33.9,33.2,33.1,32.4,30.6,29.0,27.9,26.9,24.8,24.7,23.4,23.2,21.5,21.2,19.2,16.97,16.93,15.2.
LC/MS:[MH+]547.8
化合物UA8的合成过程如下：
实施例8
取中间体(4a)320mg、4-氰基苯肼盐酸盐95mg溶于20mL乙醇中，加热至80℃下搅拌反应12小时左右至反应进行完全。反应液冷却至室温下，减压蒸馏除去溶剂，残留物加水洗涤数次，初产物进一步经硅胶柱层析纯化得到315mg中间体(5)，中间体(5)为白色固体，中间体(5)的产率为84％。
中间体(5)的质谱鉴定结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝7.78(d,J＝8.5Hz,2H),7.55(d,J＝8.5Hz,2H),7.34(s,1H),7.37-7.31(m,5H),5.32(t,J＝3.0Hz,1H),5.12(d,J＝12.5,1H),4.98(d.J＝12.5Hz,1H),4.14-4.09(m,1H),2.77(d,J＝15.5Hz,1H),2.31(d,J＝11.0Hz,1H),2.15(d,J＝15.5Hz,1H),2.05-1.99(m,3H),1.90-1.84(m,1H),1.82-1.60(m,4H),1.50-1.47(m,3H),1.39-1.24(m,6H),1.12-1.08(m,1H),1.09(s,3H),1.03(s,3H),1.02(s,3H),0.95(s,3H),0.93(s,3H),0.88(d,J＝3.9Hz,3H),0.69(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝177.3,146.7,146.5,139.5,138.1,136.4,132.6,130.0,128.5(2C),128.2(2C),128.0,125.7,118.1,115.1,112.9,66.1,58.5,54.6,53.1,48.3,46.4,42.2,39.5,39.2,38.9,38.0,37.1,36.7,34.7,32.6,30.7,29.7,28.0,24.3,23.4,23.3,22.8,21.2,19.2,18.5,17.0,16.9,15.5.
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C45H55N3O2:669.4294；found:669.4283.
合成过程如下：
实施例9
取中间体(5)35mg、10％Pd/C 50mg溶于20mL甲醇中，常压催化氢化。待反应进行完全，过滤除去钯碳，甲醇洗涤数次。滤液加压浓缩，所得残留物经乙醚搅拌打浆，过滤，固体真空干燥即得25mg化合物UA17，化合物UA17为白色固体，化合物UA17的产率为86％。
化合物UA17的谱图鉴定结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝10.95(br s,1H),7.75(d,J＝8.5Hz,2H),7.52(d,J＝8.5Hz,2H),7.37(s,1H),5.32(t,J＝3.5Hz,1H),2.64(d,J＝15.0Hz,1H),2.23(d,J＝11.5Hz,1H),2.14(d,J＝15.5Hz,1H),2.05-1.99(m,3H),1.90-1.84(m,1H),1.72-1.66(m,4H),1.53-1.49(m,3H),1.42-1.26(m,6H),1.15-1.12(m,1H),1.10(s,3H),1.03(s,3H),0.99(s,3H),0.95(d,J＝6.5Hz,3H),0.93(s,3H),0.89(d,J＝6.0Hz,3H),0.84(s,3H).
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝183.6，146.6，146.2，139.3，137.8，132.5(2C),129.9(2C),125.6,117.9,115.0,112.9,54.4,52.6,47.9,46.3,42.1,39.4,39.1,38.7,37.9,36.9,36.6,34.6,32.3,30.6,29.5,27.9,24.0,23.4,23.2,22.7,21.1,19.1,16.9,16.7,15.4.
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C44H63N4O2:579.3825；found:579.3816.
合成过程如下：
实施例10
取中间体(4a)、3,5-二氯苯基肼盐酸盐溶于乙醇中，加热至80℃下搅拌反应12小时左右至反应进行完全。反应液冷却至室温下，减压蒸馏除去溶剂，残留物加水洗涤数次。所得固体物溶于甲醇中，加入10％Pd/C，常压催化氢化。待反应进行完全，过滤除去钯碳，甲醇洗涤数次。滤液加压浓缩，所得残留物经乙醚搅拌打浆，过滤，固体真空干燥即得化合物UA21，化合物UA21为白色固体，化合物UA21的结构式如下：
实施例11
取中间体(4c)500mg、环戊基肼盐酸盐105mg溶于30mL乙醇中，加热至80℃下搅拌反应12小时左右至反应进行完全。反应液冷却至室温下，减压蒸馏除去溶剂，残留物加水洗涤数次。所得固体物溶于30mL甲醇中，加入10％Pd/C 60mg，常压催化氢化。待反应进行完全，过滤除去钯碳，甲醇洗涤数次。滤液加压浓缩，所得残留物经乙醚搅拌打浆，过滤，固体真空干燥即得345mg化合物UA23，化合物UA23为白色固体，化合物UA23的产率为72％。
化合物UA23的质图鉴定结果如下：
LC/MS:[MH+]615.8
化合物UA23的合成过程如下：
实施例12熊果酸衍生物体外抗肿瘤活性
对熊果酸衍生物进行了抗肿瘤活性研究，选取肿瘤细胞MCF-7、Hela、HepG2和SK-N-MC为检测细胞，以CCK-8比色法为检测方法，酶标仪以450nm条件下测其吸光度并计算细胞抑制率。
实验药液的配制：将测试样品用少量的DMSO溶解配制成储备液，即按试验最高浓度的1000倍配制储备液。储备液保存于-20℃冰箱中备用。
人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(Hela)、肝癌细胞(HepG2)以及人神经上皮瘤细胞(SK-N-MC)的培养：为贴壁生长细胞，常规培养于DMEM培养液内(含10％胎牛血清、青链霉素)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每隔3-5d传代一次。取对数生长期的肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为1-1.5x103个/mL。在96孔板培养板中每孔加细胞悬液100μL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
培养24h后，分别按设计加入药液。将测试药液分别加入各孔中，每个浓度设6个平行孔。实验分为药物试验组(分别加入不同测试药物)、对照组(只加培养液和细胞，不加测试药物)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药物)。将加药后的96孔板置于37℃、5％CO2培养箱中培养。熊果酸(Ursolic Acid，UA)作为阳性对照药物，其活性按照测试样品的方法测定。
药物处理48h后，向每孔加入10μL的CCK-8溶液，将培养板置于培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定各孔在450nm处的OD值，计算细胞抑制率。
细胞抑制率(％)＝(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白孔OD值)x100％
测得的细胞抑制率见附图1-4，表明熊果酸衍生物对各癌细胞系均具有较好的抑制作用，其中，图1为肿瘤细胞MCF-7；图2为肿瘤细胞Hela；图3为肿瘤细胞HepG2；图4为肿瘤细胞SK-N-MC。
从上述实验可知：本发明的熊果酸衍生物对人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(Hela)、肝癌细胞(HepG2)以及人神经上皮瘤细胞(SK-N-MC)有明显的抑制作用，对比阳性化合物UA表现出了相当或者优于阳性对照化合物的抑制活性。
实施例13化合物UA17对肿瘤细胞巨胞饮的诱导作用
在倒置相差显微镜下观察化合物UA17处理24h后的肿瘤细胞，具体结果见图5。如图5所示，UA17经过处理后，各癌细胞系均产生空泡，由于过度刺激导致细胞内水泡吸收、积累、融合而逐步形成相对于细胞本身而言的大量巨大液泡，最终导致细胞代谢活动减少、细胞膜破裂、细胞死亡。
实施例14化合物UA17对肿瘤细胞Hela凋亡的影响
细胞培养同实施例2。凋亡检测方法根据试剂盒Alexa 488annexin V/Dead CellApoptosis Kit with Fluor 488annexin V and PI for FlowCytometry(Invitrogen)，具体结果见图6。如图6A、6B所示，UA17作用后，肿瘤细胞Hela中凋亡和坏死细胞的数量的显著增加，且存在时间以及剂量效应，表明化合物UA17能够促进Hela细胞株的凋亡，并呈现了浓度、时间依赖性，能够有效抑制肿瘤细胞Hela活力。
实施例15化合物UA17诱导HeLa细胞发生非传统的死亡模式
细胞培养同实施例2。通过western实验检测UA17处理后HeLa细胞是否存在PARP和caspase-3的活化，具体结果见图7A。如图7A所示，UA17和紫杉醇(作为阳性对照)处理后，不同于副凋亡，UA17诱导的细胞死亡涉及caspase通路，UA17诱导的细胞导致细胞内caspase-3和PARP1活化。
利用凋亡的caspase依赖性，在广谱的caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理HeLa后，利用CCK-8法检测UA17刺激下细胞活力的变化，具体结果见图7B。如图7B所示，添加caspase通路抑制剂z-VAD-FMK，并没有阻止UA17诱导的细胞死亡，说明UA17死亡作用机制并不是细胞凋亡，证明UA17诱导的细胞死亡模式并非是caspase依赖性的。
同时，western实验检测自噬标志物LC3-II的表达情况，CCK-8法分析UA17诱导的细胞死亡情况能否被缓解，具体结果见图7C。如图7C所示，UA17的细胞毒性作用激活LC3，A17诱导的细胞死亡具有自噬标志物LC3-II表达。
添加自噬抑制剂3-MA进行预处理，具体结果见图7D。如图7D所示，3-MA预处理并不能阻止UA17诱导的细胞死亡，说明UA17死亡作用机制并不是细胞自噬。
实施例16化合物UA17通过过度活化巨胞饮诱导肿瘤细胞发生methuosis
(1)探究UA17诱导肿瘤细胞产生的空泡来源
A.透射电镜观察细胞及空泡内部结构。HeLa细胞接种于蓝宝石玻片上，UA17处理24h后，按照电镜样品制备程序，固定、脱水、浸透、包埋、修块、切片、染色后，电镜下观察拍照，具体结果见图8A。如图8A所示，透射电镜(TEM)证实了UA17处理24h后，HeLa细胞内大量液泡生成，液泡较大且大小不一，大多数是单层膜的空泡，这些特征与巨胞饮体相一致。
B.HeLa细胞经UA17处理24h，与示踪剂荧光黄LY于37℃共孵育20min，Hank’s缓冲液洗两次后，于共聚焦荧光显微镜下进行免疫荧光活细胞成像，观测HeLa对胞外液相物质的摄取情况。具体结果见图8B。如图8B所示，免疫荧光实验观察到示踪剂荧光黄(LY)与HeLa共孵育20min后，会积累在液泡内，进一步说明UA17处理后的HeLa发生了巨胞饮，可以快速内陷大量液相物质，UA17诱导细胞内空泡产生与胞饮有关。
C.HeLa细胞经UA17处理24h后，分别按照说明书LysoTacker Red和MitoTrackerRed CXMRos进行不同细胞器的染色，于共聚焦荧光显微镜下进行免疫荧光活细胞成像，其他细胞器(如溶酶体、线粒体等)标志物与UA17诱导形成的空泡进行定位观察，以判断空泡来源与UA17诱导的methuosis发生过程中其它微器官的活化情况。随后，我们分别利用在巨胞饮活化过程中必需的肌动蛋白和发动蛋白的小分子抑制剂Cytochalasin D和dynasore，以及液泡H+-ATPase特异性抑制剂Bafilomycin A1(Baf-A1)，发现抑制剂预处理后HeLa细胞对UA17诱导的死亡出现不同程度的耐受，且Baf-A1预处理后，可以明显抑制空泡生成，具体结果见图8C、8D。如图8C所示，添加巨胞饮抑制剂Baf-A1，细胞活力增强，能有效缓解UA17的细胞毒性作用，说明UA17是通过过度刺激细胞产生胞饮作用而诱导细胞死亡。如图8D所示，添加巨胞饮抑制剂Baf-A1，能有效减少UA17引起的细胞内空泡效应。同时，免疫荧光实验也证明UA17通过巨胞饮派生的液泡招募了晚期内体和溶酶体的标志物LAMP1的表达，具体结果见图8E。如图8E所示，UA17作用后，LAMP-1的表达显著增强，说明UA17诱导巨胞饮发生。以上结果都证实了UA17起始巨胞饮，进而诱导细胞发生灾难性的液泡化，最终导致肿瘤细胞巨泡式死亡的发生。
另一方面，利用各个细胞器的荧光示踪剂进行活细胞成像，我们发现就像Ras诱导的巨泡式死亡，富集的液泡最终也具备晚期内体的某些特征，但并不与溶酶体和线粒体等降解的细胞器成分存在重叠，具体结果见图8F。如图8F所示，这不仅说明了液泡来源与线粒体肿胀、溶酶体等其它细胞器无关，也证明了巨胞饮导致的巨泡式死亡也有其它细胞器的参与。
实施例17
同理，采用上述与针对化合物UA17相同的实验手段，对一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物中化合物UA5、化合物UA8、化合物UA21、化合物UA23进行测试，具体结果见表1。由表1可知，一类含吡唑杂环的熊果酸衍生物对肿瘤细胞生长具有显著抑制作用，能够通过诱导细胞发生巨泡式死亡的全新死亡模式而杀死肿瘤细胞。
表1熊果酸衍生物对肿瘤细胞的抑制作用及诱导巨泡式死亡数据表
*Results are expressed as percent of controls that received vehiclealone(DMSO).Values are the mean±SD of quadruplicate(MTT).
所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (14)
1.一种化合物，其特征在于，所述化合物为化合物UA5、化合物UA8、化合物UA17、化合物UA21或化合物UA23，
其中，所述UA5具有如下结构式：
所述UA8具有如下结构式：
所述UA17具有如下结构式：
所述UA21具有如下结构式：
所述UA23具有如下结构式：
所述化合物用于制备治疗肿瘤的药物；所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、肝癌或神经上皮瘤；所述肿瘤的细胞为乳腺癌细胞MCF-7、宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞HepG2或神经上皮瘤细胞SK-N-MC中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述一种化合物的合成方法，其合成路线如下：
具体包括以下步骤：
a)使熊果酸(1)获得苄基保护，获得中间体(2)；
b)在中间体(2)中加入PCC进行氧化反应，获得中间体(3)；
c)将中间体(3)在碱性条件下加入酯类化合物进行反应，获得中间体(4)；
d)将中间体(4)与肼类化合物进行缩合反应，获得中间体(5)；
e)将中间体(5)进行氢化反应，即得所需化合物(6)；
R1为氢、三氟甲基(-CF3)；R2为甲基、环戊基、4-氰基苯基、3,5-二氯苯基。
3.根据权利要求2所述的化合物的合成方法，其特征在于，在步骤a)中，所述苄基保护是将熊果酸(1)与碳酸钾、N,N-二甲基酰胺、苄溴混合后进行加热反应，获得的混合物冷却至室温后，加水析出固体产物，将固体产物过滤、洗涤、干燥后，获得中间体(2)。
4.根据权利要求3所述的化合物的合成方法，其特征在于，还包括如下技术特征中的一种或多种：
A1)所述熊果酸(1)与碳酸钾加入的摩尔比为1:1-3；
A2)所述熊果酸(1)与N,N-二甲基酰胺加入的摩尔比为1:9-11；
A3)所述熊果酸(1)与苄溴加入的摩尔比为1:1-2；
A4)所述加热反应的条件为：反应温度为50-70℃；反应时间为3-5h；
A5)所述熊果酸(1)加入的质量与水加入的体积之比mg/mL为450-470:40-60。
5.根据权利要求2所述的化合物的合成方法，其特征在于，在步骤b)中，所述氧化反应是将中间体(2)溶于二氯甲烷后冷却至0℃以下，加入PCC在室温下搅拌进行氧化反应，将获得的反应产物过滤、浓缩、分离纯化后，获得中间体(3)。
6.根据权利要求5所述的化合物的合成方法，其特征在于，还包括如下技术特征中的一种或多种：
B1)所述中间体(2)加入的质量与二氯甲烷加入的体积之比mg/mL为440-460:40-60；
B2)所述中间体(2)与PCC加入的摩尔比为1:1.2-3；
B3)所述搅拌时间为11-13h。
7.根据权利要求2所述的化合物的合成方法，其特征在于，在步骤c)中，所述反应是将中间体(3)溶于四氢呋喃后冷却至0℃以下，加入碱性化合物、酯类化合物，在室温下搅拌混合反应，将获得的反应产物加水进行淬灭反应，经萃取、洗涤、干燥、过滤、浓缩、分离纯化后，获得中间体(4)，所述中间体(4)中，R1具有如式6化合物中相同的定义。
8.根据权利要求7所述的化合物的合成方法，其特征在于，还包括如下技术特征中的一种或多种：
C1)所述中间体(3)加入的质量与四氢呋喃加入的体积mg/mL之比为250-350:15-25；
C2)所述碱性化合物为甲醇钠；
C3)所述中间体(3)与碱性化合物加入的摩尔比为1:1-2；
C4)所述酯类化合物选自甲酸乙酯、乙酸乙酯、三氟乙酸乙酯中的一种；
C5)所述中间体(3)与酯类化合物加入的摩尔比为1:1-1.5；
C6)所述搅拌时间为3-5h；
C7)所述萃取的反应条件为：萃取试剂为乙酸乙酯，萃取次数为3-4次，萃取试剂用量为25-35ml。
9.根据权利要求2所述的化合物的合成方法，其特征在于，在步骤d)中，所述缩合反应是将中间体(4)与肼类化合物溶于有机溶剂，加热搅拌反应后冷却至室温，将获得的反应产物浓缩、洗涤、分离纯化后，获得中间体(5)，所述中间体(5)中，R1和R2具有如式6化合物中相同的定义。
10.根据权利要求9所述的化合物的合成方法，其特征在于，还包括如下技术特征中的一种或多种：
D1)所述肼类化合物选自烷基肼、芳基肼、杂芳基肼中的一种；
D2)所述中间体(4)与肼类化合物加入的摩尔比为1:1-2；
D3)所述有机溶剂为乙醇；
D4)所述中间体(4)加入的质量与有机溶剂加入的体积mg/mL之比为310-330:15-25；
D5)所述加热搅拌反应的条件为：加热温度为80-90℃，搅拌时间为11-13h。
11.根据权利要求2所述的化合物的合成方法，其特征在于，在步骤e)中，所述氢化反应是将中间体(5)和催化剂溶于有机溶剂，再通入氢气进行反应，将获得的反应产物过滤、洗涤、浓缩后搅拌打浆，再次过滤、干燥，即得所需化合物(6)。
12.根据权利要求11所述的化合物的合成方法，其特征在于，还包括如下技术特征中的一种或多种：
E1)所述催化剂为10wt％钯碳混合物，Pd与C的重量之比为10:90；
E2)所述中间体(5)与催化剂加入的质量之比为30-40:45-55；
E3)所述有机溶剂为甲醇；
E4)所述中间体(5)加入的质量与有机溶剂加入的体积mg/mL之比为30-40:15-25。
13.根据权利要求1所述化合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途；所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、肝癌或神经上皮瘤；所述肿瘤的细胞为乳腺癌细胞MCF-7、宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞HepG2或神经上皮瘤细胞SK-N-MC中的一种或多种。
14.一种药物组合物，包括治疗有效量的如权利要求1所述的化合物。
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