CN104829696A

CN104829696A - 开环茜草科类型环肽,以其为活性成分的药物组合物,其制备方法和应用

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Publication number: CN104829696A
Application number: CN201510240758.7A
Authority: CN
Inventors: 谭宁华; 陈小强; 赵思蒙; 汪哲; 曾广智
Original assignee: China Pharmaceutical University; Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: China Pharmaceutical University; Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2015-05-12
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2035-05-12
Also published as: CN104829696B

Abstract

本发明提供开环茜草科类型环肽，以其为活性成分的药物组合物，其用作为NF-κB信号通路的抑制剂，其制备方法及其在治疗与预防NF-κB信号通路异常激活的相关炎症疾病和癌症的药物中的应用。本发明的开环茜草科类型环肽，为一类由1个D-α-丙氨酸，2个L-α-丙氨酸，3个取代的N-甲基-L-α-酪氨酸经肽键缩合而成的环状化合物。优选结构式为(1-3)的开环茜草科类型环肽，为NF-κB信号通路的抑制剂。

Description

开环茜草科类型环肽,以其为活性成分的药物组合物,其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于药物技术领域，具体地，涉及一类开环茜草科类型环肽，其用作为NF-κB信号通路抑制剂，以其为有效成分的药物组合物，其制备方法及在制备治疗与预防NF-κB信号通路相关的炎症疾病与癌症的药物中的应用。

背景技术：

NF-κB信号通路是细胞内经典而重要的信号通路之一。Ranjan Sen和DavidBaltimore于1986年首次发现核转录因子NF-κB，它是存在成熟B细胞中能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异性结合的蛋白因子。研究表明，NF-κB广泛存在于真核细胞内，NF-κB通过与抑制蛋白IκB结合而以非活化形式存在于细胞质中，当被某些细胞因子(如IL-1和TNF-α)或其它试剂(如某些病毒蛋白、氧自由基或者紫外照射)，或在细菌脂多糖LPS与其受体结合而活化时，IκB蛋白迅速降解，活化的NF-κB能迁移到核内并激活多种特异基因的转录表达，广泛参与多种生物学效应，包括细胞增殖、细胞凋亡、炎症反应、免疫应答及肿瘤发生发展等重要的生理病理过程。NF-κB家族蛋白在体内各种类型细胞中普遍存在，在哺乳动物中，NF-κB家族成员主要有五种，分别是RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50/p105(NF-κB1)和p52/p100(NF-κB2)，它们N端有由大约300个氨基酸组成的保守序列，即Rel同源区(Rel homology domain)，这个结构域的同源性高达50％以上，它与DNA结合、二聚体化、与IκB结合等功能密切相关，并且包含了一个核定位序列。另外，各成员可形成同型或异型二聚体而存在，其中p65/p50二聚体是最主要的形式。NF-κB信号通路的激活主要分为两类：经典途径和非经典途径，IKK的激活及IκBα的降解是该通路激活的关键。

各个器官肿瘤的形成发展经常伴随着炎症的发生，说明炎症和肿瘤的形成有着非常密切的关系。近期研究阐明了炎症和致癌过程的关系，特别是在促进肿瘤生成方面。炎症能导致异常的细胞状态变化，如活性氧增加、基因突变及炎症诱导的细胞增殖，这些都被认为是致癌因素。同时，在致癌过程中的信号转导通路的作用也渐渐清晰。深入研究炎症能导致癌症的机制或许能在重要的生理过程中提供可能的药物作用靶点，成为阻止癌症发生的强有力的工具。许多研究表明，在慢性炎症导致癌症的过程中，NF-κB信号通路有着非常重要的作用，能作为潜在的药物作用靶点。目前，有700多种NF-κB信号通路抑制剂，按来源主要分为天然产物、合成化合物、siRNA、多肽以及蛋白(病毒、细菌、真菌)等。根据抑制剂在通路中的作用位置和作用机制不同可以分为作用于IKK复合体上游、直接针对IKK复合体、IKK与细胞核之间、细胞核内等四类。此外，NF-κB通路抑制剂已有被FDA批准上市作为临床药物的成功案例，例如用于治疗肿瘤的三氧化二砷(ATO)，Thalidomide，蛋白酶体抑制剂PS341(Bortezomib)以及治疗内风湿性关节炎等炎症相关疾病的TNF-α单克隆抗体Remicade和Humira。但是，其他作用模式、结构新颖的小分子抑制剂的临床应用报道还较少，同时该通路在相关疾病发生发展中的作用机制和调控机制有待更加深入阐明。所以发现结构新颖的NF-κB信号通路小分子抑制剂用于治疗该通路相关疾病，或发现特异性的工具分子或探针分子去阐明该通路的信号转导作用机制，具有十分重要的学术意义和很好的应用前景。

现有技术中未见有开环茜草科类型环肽作为NF-κB信号通路抑制剂的报道。开环茜草科类型环肽在茜草科植物中的分离纯化较为困难，最重要的原因在于该类成分含量较低，同时茜草属植物中富含蒽醌类色素，且色素极性范围广，从脂溶性色素到水溶性色素均有，很难使此类色素与环肽类成分分开。现有技术中，从茜草属植物中分离开环茜草科类型环肽类成分已公开发表如下方法：(1)茜草科茜草属植物茜草的根用甲醇提取后，甲醇浸膏依次用HP-20大孔树脂、硅胶、活性炭、氨丙基键和硅胶色谱柱层析得到环肽富集部分。此环肽富集部分用甲醇/异丙醚重结晶，再结合各种层析材料包括HPLC对结晶或母液进行分离纯化，得到微量的开环茜草科类型环肽。参见：Hitotsuyanagi,Y.et al.O-Seco-RA-XXIV,a possible precursor of an antitumor peptide RA-XXIV,from Rubia cordifolia L.Phytochemistry Lett.,2012,5,335-339；Hitotsuyanagi,Y.et al.Isolation,structuredetermination,and synthesis of all-RA-V and neo-RA-V,RA-series bicyclic peptidesfrom Rubia cordifolia L.Chem.Eur.J.2012,18,2839-2846。其缺点在于活性炭对样品的吸附性强，氨丙基键和硅胶材料价格较贵，实验室和工业上不常用，甲醇/异丙醚重结晶技术可控性和重现性不好；(2)茜草科茜草属植物大叶茜草的根用70％甲醇提取后，甲醇浸膏加水混悬后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，含环肽部分依次用硅胶、RP-18反相、凝胶色谱柱层析得到环肽富集部分。再结合各种层析材料包括HPLC对环肽富集部位进行分离纯化，得到一系列开环茜草科类型环肽。参见：Huang,M.B.et al.Rubischumanins A-C,new cytotoxic cyclopeptidesfrom Rubia schumanniana.Tetrahedron,2014,70,7627-7631。其缺点在于70％甲醇作为提取溶剂提取不充分。

发明内容：

针对现有技术存在的上述不足之处，本发明的目的在于提供一类开环茜草科类型环肽化合物；提供制备该类化合物的方法，该提取分离方法可控性和重现性好，样品损失少，成本较低，操作方便，可分离得到微量环肽，溶剂可以反复回收利用，也适用于工业生产；本发明的目的还在于提供以开环茜草科类型环肽为有效成分的药物组合物，作为新型NF-κB信号通路抑制剂。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

开环茜草科类型环肽化合物，为由1个D-α-丙氨酸，2个L-α-丙氨酸，和3个取代的N-甲基-L-α-酪氨酸经肽键缩合而成的环状化合物。

本发明的开环茜草科类型环肽，优选具有下述结构式的化合物rubicordilin A(1)、rubicordilin B(2)和rubicordilin C(3)。

制备本发明上述开环茜草科类型环肽化合物的方法，取茜草属植物的根和根茎，经干燥、粉碎后，用甲醇回流充分提取；将甲醇浸膏加水混悬后，用乙酸乙酯充分萃取；乙酸乙酯部分反复用硅胶、Sephadex LH-20、RP-18和HPLC等层析柱分离纯化，再结合环肽的TLC检测方法即得到开环茜草科类型环肽。

制备如下结构式所示茜草科类型环肽化合物rubicordilin A(1)、rubicordilin B(2)和rubicordilin C(3)的方法，取茜草的根和根茎，经干燥、粉粹后，用甲醇回流提取3次，时间为每次1-4小时，提取液经减压浓缩得甲醇浸膏；将甲醇浸膏加水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等体积各萃取三次，回收溶剂得到乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分；将乙酸乙酯部分经硅胶柱层析，用100:0，20:1，10:1，9:1，8:2，7:3，0:100的氯仿/甲醇梯度洗脱，薄层层析，结合环肽TLC检测方法合并其中的20:1，10:1，9:1，8:2含有环肽的部分；以下的每一步骤都须结合环肽TLC检测方法来进行分离纯化；合并后的浸膏再次经硅胶柱层析，用60:1-0:100的氯仿/甲醇梯度洗脱，根据环肽点的不同合并为三个组分Fr.1-Fr.3；Fr.1组分经硅胶柱层析，用20:1-0:1氯仿/甲醇洗脱分离得到五个亚组分(Fr.1-1-Fr.1-5)；其中Fr.1-3部分用反相RP-18硅胶拌样，经RP-18柱层析，用10:90-90:10的甲醇/水梯度洗脱，得到四个亚组分(Fr.1-3-1-Fr.1-3-4)；组分Fr.1-3-3经Sephadex LH-20层析，1:1的氯仿/甲醇为洗脱剂，富集的环肽部分再经硅胶反复层析得到三个亚组分(Fr.1-3-3-1-Fr.1-3-3-3)；组分Fr.1-3-3-2再经ODS HPLC半制备柱纯化，25％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物rubicordilin A(1)和rubicordilin B(2)；Fr.2组分经硅胶柱层析，用30:1-0:100乙酸乙酯/甲醇洗脱分离得到六个亚组分(Fr.2-1-Fr.2-6)；其中Fr.2-4经硅胶柱层析，20:1-0:1氯仿/甲醇洗脱；再经Sephadex LH-20层析，1:1的氯仿/甲醇为洗脱剂，得到四个亚组分(Fr.2-4-1-Fr.2-4-4)；组分Fr.2-4-3再经ODS HPLC半制备柱纯化，40％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物rubicordilin C(3)。

以本发明的上述开环茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐为有效成分的NF-κB信号通路抑制剂。

本发明还提供了含有治疗有效量的上述结构式所示的开环茜草科类型环肽化合物rubicordilin A(1)、rubicordilin B(2)和rubicordilin C(3)或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明同时提供了本发明的开环茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐在制备NF-κB信号通路抑制剂中的应用。

本发明的开环茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐用作为NF-κB信号通路抑制剂。

本发明对茜草科茜草属植物茜草进行系统的环肽化学成分研究，利用多种分离纯化手段，包括正反相硅胶柱层析，Sephadex LH-20凝胶层析，HPLC半制备等，从中获得了一系列开环茜草科类型环肽。之后，对所有开环茜草科类型环肽类化合物进行了细胞毒活性筛选，后在HEK 293T细胞模型上用荧光素酶双报告基因方法检测NF-κB信号通路抑制活性。结果发现rubicordilin A(1)、rubicordilin B(2)和rubicordilin C(3)均具有细胞毒活性，且为新型NF-κB信号通路抑制剂。

本发明的所述开环茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐，可以列举例如与盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸等无机酸，或者马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对-苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸、单宁酸等有机酸，锂、钠、钾等碱金属，钙、镁等碱土金属，赖氨酸等碱性氨基酸成的盐。

本发明所述的治疗炎症和癌症相关疾病的药物组合物，由开环茜草科类型环肽化合物与药学上可接受的载体制备的药物剂型包括片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等。由于开环茜草科类型环肽可从茜草以及同属植物中提取分离，而片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等药物剂型的制备也是本领域的常规知识。因此由开环茜草科类型环肽化合物与相应载体制备的各种药物剂型也能够由本领域技术人员实现。

上文中所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、以及聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如，使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％～99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％～95％的活性成分。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～10mg/kg体重，优选0.1～5mg/kg体重。可以一次或多次施用。

本发明开环茜草科类型环肽提取方法的优点在于，首先提取分离思路具有新颖性，成功利用色谱层析技术将蒽醌色素和开环茜草科类型环肽分离。概括地说，利用Sephadex LH-20的分子筛原理，可分开一部分与开环茜草科类型环肽分子量相差很大的蒽醌类成分，再利用反相RP-18色谱柱的吸附层析原理，成功分离得到含色素较少的开环茜草科类型环肽部分，再结合各种层析材料包括HPLC分离纯化即得开环茜草科类型环肽纯品；其次，仅利用实验室或工业上常规的层析材料，包括正反相硅胶、Sephadex LH-20和HPLC等，不必运用特殊层析材料如氨丙基键和硅胶，也避免运用吸附性较强的活性碳和氧化铝等层析材料；没有使用可控性和重现性较差的沉淀析出或重结晶法，在实际操作中，发现因样品成分复杂，色素重，很难得到沉淀或结晶进行进一步分离；最后，开环茜草科类型环肽的分离过程中必须结合环肽的TLC检测方法(参见：周俊，谭宁华，科学通报，2000，45(10)，1047-1051)。总之，本发明提取分离方法可控性和重现性好，样品损失少，成本较低，操作方便，可分离得到微量环肽，溶剂可以反复回收利用，也适用于工业生产。

附图说明：

图1为本发明的开环茜草科类型环肽化合物的制备方法流程图；

图2为本发明的开环茜草科类型环肽化合物的结构示意图。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的改进都属于本发明的范围。

实施例1：

开环茜草科类型环肽化合物rubicordilin A(1)、rubicordilin B(2)和rubicordilin C(3)的制备及其结构鉴定：

取茜草根和根茎(200kg)，经干燥、粉碎后，用工业甲醇回流提取3次(300L×3次)，每次3小时。提取液经减压浓缩得甲醇浸膏29.2kg。将甲醇浸膏加热水混悬后，滤去不溶物，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，减压浓缩各部分萃取物，得到石油醚部分(2.6kg)、乙酸乙酯部分(4.0kg)、正丁醇部分(3.0kg)和水部分(14.0kg)。将乙酸乙酯部分(4.0kg)经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇梯度洗脱(100:0，20:1，10:1，9:1，8:2，7:3，0:100)，结合环肽TLC检测方法，确定其中的20:1，10:1，9:1和8:2为含有环肽的部分(1.93kg)，合并这些含环肽部分后的浸膏再次经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇洗脱(60:1～0:1)，根据环肽点极性的不同合并分为三个组分(Fr.1-Fr.3)。Fr.1(607g)组分经硅胶柱层析，氯仿/甲醇(20:1～0:1)洗脱分离得到5个亚组分(Fr.1-1-Fr.1-5)；含环肽组分Fr.1-3(51g)再经中压RP-18柱层析，甲醇/水(10～90％)为洗脱溶剂，得到4个亚组分(Fr.1-3-1-Fr.1-3-4)；含环肽组分Fr.1-3-3(4.7g)经SephadexLH-20层析，氯仿/甲醇(1:1)为洗脱溶剂，所富集的含有环肽的部分再经硅胶柱层析得到3个亚组分(Fr.1-3-3-1-Fr.1-3-3-3)；含有环肽的组分Fr.1-3-3-2经半制备HPLC，25％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物1(30mg)和2(7mg)。Fr.2(598g)组分经硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇(30:1～0:1)洗脱分离得到6个亚组分(Fr.2-1-Fr.2-6)；含环肽组分Fr.2-4(48g)再经硅胶柱层析，氯仿/甲醇(20:1～0:1)为洗脱溶剂，后经Sephadex LH-20层析，氯仿/甲醇(1:1)为洗脱溶剂，得到4个亚组分(Fr.2-4-1-Fr.2-4-4)；含环肽组分Fr.2-4-3(95mg)经半制备HPLC，40％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物3(8mg)。

化合物rubicordilin A(1)、rubicordilin B(2)和rubicordilin C(3)的结构式如下所示：

Rubicordilin A(1)、rubicordilin B(2)和rubicordilin C(3)的结构鉴定数据为：

Rubicordilin A(1):白色无定型粉末；(c 0.30，MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)201.8(4.60)，223.2(4.39)，276.6(3.48)nm；IR(KBr)ν_max 3444，2930，1631，1514，1450，1414，1384，1302，1244，1178，1098，1075，1044，824，626，563cm^-1；¹H(600MHz)和¹³C(150MHz)NMR数据，见表1；positiveHRESIMS m/z 943.4066[M+Na]⁺，calcd for C₄₆H₆₀N₆O₁₄Na，943.4065。

Rubicordilin B(2):白色无定型粉末；(c 0.83，MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)201.8(4.64)，223.6(4.42)，275.8(3.48)nm；IR(KBr)ν_max 3443，2934，1631，1513，1449，1414，1384，1302，1247，1180，1101，1075，1042，823，627，565cm^-1；¹H(600MHz)和¹³C(150MHz)NMR数据，见表2；positiveHRESIMS m/z 957.4223[M+Na]⁺，calcd for C₄₇H₆₂N₆O₁₄Na，957.4222。

Rubicordilin C(3):白色无定型粉末；(c 0.72，MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)201.6(4.66)，224.6(4.45)，254.6(3.67)，275.8(3.57)nm；IR(KBr)ν_max3442，2932，1632，1514，1447，1411，1302，1249，1179，1035，824，562cm^-1；¹H(600MHz)和¹³C(150MHz)NMR数据，见表3；positive HRESIMS m/z809.3844[M+Na]⁺，calcd for C₄₂H₅₄N₆O₉Na，809.3850。

表1 Rubicordilin A(1)的¹H NMR和¹³C NMR数据(δin ppm，J in Hz)

^a In C₅D₅N,600MHz for ¹H and 150MHz for ¹³C；J-values given in Hz in parentheses.

Population of conformers-I and-II were 64％and 36％,respectively.

表2 Rubicordilin B(2)的¹H NMR和¹³C NMR数据(δin ppm，J in Hz)

Population of conformers-I and-II were 58％and 42％,respectively.

表3 Rubicordilin C(3)的¹H NMR和¹³C NMR数据(δin ppm，J in Hz)

Population of conformers-I and-II were 52％and 48％,respectively.

实施例2：

本发明开环茜草科类型环肽化合物rubicordilin A(1)、rubicordilin B(2)和rubicordilin C(3)用SRB法测定其人非小细胞肺癌细胞株(A549)、人胃癌细胞株(SGC-7901)和人宫颈癌细胞(HeLa)的细胞毒活性，发现开环茜草科类型环肽化合物具有较好的细胞毒活性。实验原理、方法和结果如下：

实验原理：将药物与细胞共培养后测定细胞存活率。SRB为一种水溶性蛋白染料，分子中具有磺酸基阴离子，在弱酸性条件下可与细胞内蛋白质的碱性氨基酸结合，用碱性溶液溶解细胞内的SRB并测定其吸光值，由SRB的含量反映细胞内的蛋白质含量，即反映细胞存活率。

实验方法：以含有10％胎牛血清的RPMI-1640或DMEM培养基将细胞配制成细胞悬浮液，以5000cell/well浓度接种于96孔板中，37℃培养24h后，加入不同浓度的化合物处理细胞，继续培养48h或72h。加入预冷的50％三氯乙酸水溶液固定细胞1h，洗净晾干。以0.4％SRB的1％醋酸水溶液染色15min，以1％醋酸水溶液洗净。后以10mM的Tris溶液溶解SRB，540nm测定吸光值。计算抑制率并计算IC₅₀值。

实验结果(见表4)：

表4开环茜草科类型环肽化合物1-3的细胞毒活性(IC₅₀，μM)

	A549	SGC-7901	HeLa
				1	20.70	2.58	3.42
2	18.74	2.33	2.57
				3	1.26	0.41	0.33

实验结果表明，化合物1-3对三株肿瘤细胞均具有细胞毒活性，其中rubicordilin C(3)活性最强，对A549、SGC-7901、HeLa的IC₅₀值分别为1.26、0.41、0.33μM。

实施例3：

本发明开环茜草科类型环肽化合物rubicordilin A(1)、rubicordilin B(2)和rubicordilin C(3)用荧光素酶双报告基因方法检测其NF-κB信号通路抑制活性，发现环肽化合物能够抑制NF-κB通路活性。实验原理、方法和结果如下：

实验原理：荧光素酶双报告基因系统常用来评价化合物对某信号通路活性的影响，荧光素在荧光素酶的催化下发出荧光，通过化学发光微孔板读数仪检测发光强度以体现通路活性的强弱。在HEK 293T细胞中瞬时转染NF-κB依赖的萤火虫荧光素酶质粒(5×κB-luciferase)以特异反映NF-κB通路活性的强弱，同时转染海肾荧光素酶质粒(pTK-Renilla Luciferase)作为内参。TNF-α作为NF-κB通路激活剂，转染后的HEK 293T细胞在TNF-α刺激下能高表达荧光素酶而发出高强度的荧光，当有NF-κB信号通路的抑制剂时该荧光强度被减弱，反之，荧光强度增强。

实验方法：(1)细胞培养与转染：用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK 293T细胞，达到80～90％汇合度时传代并接种于24孔板中，待贴壁后，使用Lipofectamine 2000瞬时转染质粒5×κB-luciferase和pTK-Renilla。(2)化合物处理：细胞转染18h后，以不同浓度的样品处理细胞6h，再以10ng/ml TNF-α刺激2h。(3)荧光素酶活性检测：弃去细胞上清，PLB裂解液裂解细胞，离心后取上清，采用Promega公司的双荧光素酶检测试剂盒测值，记录结果，以单独TNF-α处理组为100％，对原始读值均一化处理，以浓度为横坐标，荧光素酶信号相对值为纵坐标绘制曲线，计算化合物的IC₅₀值。

实验结果(见表5)：

表5开环茜草科类型环肽化合物1-3对NF-κB信号通路的抑制作用

Compound	1	2	3
				IC₅₀(μM)	3.41	20.30	6.87

实验结果表明，化合物1-3均具有NF-κB信号通路的抑制活性，其中rubicordilin A(1)活性最强，IC₅₀为3.41μM。结合文献检索发现此开环茜草科类型环肽为一类新型的NF-κB信号通路天然抑制剂。

实施例4：

实施例1所得化合物1-3，加入4％的硫酸乙醇溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成硫酸盐化合物1-3。

实施例5：

实施例1所得化合物1-3，加入4％的盐酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成盐酸盐化合物1-3。

实施例6：

实施例1所得化合物1-3，加入4％的酒石酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成酒石酸盐化合物1-3。

实施例7：

实施例1所得化合物1-3，加入4％的柠檬酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成柠檬酸盐化合物1-3。

实施例8：

片剂：实施例1所得化合物1-3或实施例4-7所得的盐10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg。

制备方法：将化合物或其盐、乳糖和淀粉混和，用水均匀湿润、把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。

实施例9：

安瓿剂：实施例1所得化合物1-3或实施例4-7所得的盐2mg，氯化钠10mg。

制备方法：将化合物或其盐和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例10：

注射用冻干剂：实施例1所得化合物1-3或实施例4-7所得的盐10mg，碳酸氢钠2mg，甘露醇252mg。

制备方法：将碳酸氢钠、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30min除热原，过滤除去活性碳，在滤液中加入化合物或其盐，超声处理使溶解，用1N盐酸调节PH为5.0-7.0，微孔滤膜滤过，加注射用水，分装，冷冻干燥，上塞，轧盖，即得。

实施例11：

胶囊剂：实施例1所得化合物1-3或实施例4-7所得的盐10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg。

制备方法：将化合物或其盐与助溶剂混和，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

Claims

1.如下述结构式所示的开环茜草科类型环肽rubicordilin A(1)、rubicordilinB(2)、rubicordilin C(3)及其药理学上容许的盐，

2.以权利要求1中的开环茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐为有效成分的NF-κB信号通路抑制剂。

3.药物组合物，其中含有治疗有效量的如权利要求1所述的结构式所示的开环茜草科类型环肽化合物rubicordilin A(1)、rubicordilin B(2)、rubicordilin C(3)或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。

4.权利要求1所述的开环茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐在制备治疗与预防NF-κB信号通路异常激活的相关炎症疾病和癌症的药物中的应用。

5.权利要求1中的开环茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐用作为NF-κB信号通路抑制剂。

6.如权利要求1所述的开环茜草科类型环肽化合物rubicordilin A(1)、rubicordilin B(2)、rubicordilin C(3)或其药理学上容许的盐，其中所述的药理学上容许的盐包括与无机酸盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸，或者有机酸马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对-苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸、单宁酸，或者碱金属锂、钠、钾，或者碱土金属钙、镁，或者碱性氨基酸赖氨酸形成的盐。

7.制备权利要求1所述的开环茜草科类型环肽化合物的方法，取茜草属植物的根和根茎，经干燥、粉碎后，用甲醇回流充分提取；将甲醇浸膏加水混悬后，用乙酸乙酯充分萃取；乙酸乙酯部分反复用硅胶、Sephadex LH-20、RP-18和HPLC等层析柱分离纯化，再结合环肽的TLC检测方法得到开环茜草科类型环肽。

8.如权利要求7所述的制备开环茜草科类型环肽化合物的方法，其特征在于，取茜草的根和根茎，经干燥、粉粹后，用甲醇回流提取3次，时间为每次1-4小时，提取液经减压浓缩得甲醇浸膏；将甲醇浸膏加水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等体积各萃取三次，回收溶剂得到乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分；将乙酸乙酯部分经硅胶柱层析，用100:0，20:1，10:1，9:1，8:2，7:3，0:100的氯仿/甲醇梯度洗脱，薄层层析，结合环肽TLC检测方法合并其中的20:1，10:1，9:1，8:2含有环肽的部分；以下的每一步骤都须结合环肽TLC检测方法来进行分离纯化；合并后的浸膏再次经硅胶柱层析，用60:1-0:100的氯仿/甲醇梯度洗脱，根据环肽点的不同合并为三个组分Fr.1-Fr.3；Fr.1组分经硅胶柱层析，用20:1-0:1氯仿/甲醇洗脱分离得到五个亚组分Fr.1-1-Fr.1-5；其中Fr.1-3部分用反相RP-18硅胶拌样，经RP-18柱层析，用10:90-90:10的甲醇/水梯度洗脱，得到四个亚组分Fr.1-3-1-Fr.1-3-4；组分Fr.1-3-3经Sephadex LH-20层析，1:1的氯仿/甲醇为洗脱剂，富集的环肽部分再经硅胶反复层析得到三个亚组分Fr.1-3-3-1-Fr.1-3-3-3；组分Fr.1-3-3-2再经ODS HPLC半制备柱纯化，25％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物rubicordilin A(1)和rubicordilin B(2)；Fr.2组分经硅胶柱层析，用30:1-0:100乙酸乙酯/甲醇洗脱分离得到六个亚组分Fr.2-1-Fr.2-6；其中Fr.2-4经硅胶柱层析，20:1-0:1氯仿/甲醇洗脱；再经Sephadex LH-20层析，1:1的氯仿/甲醇为洗脱剂，得到四个亚组分Fr.2-4-1-Fr.2-4-4；组分Fr.2-4-3再经ODS HPLC半制备柱纯化，40％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物rubicordilin C(3)。