CN103012417B - 黄皮属植物中的咔唑生物碱,以其为抗肿瘤活性成分的药物组合物,其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

结构式为（1-4）的咔唑生物碱lansine D（1）、lansine E（2）、lansine F（3）和lansine G（4），以其为有效成分的肿瘤细胞生长抑制剂，此类化合物的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

Description

黄皮属植物中的咔唑生物碱，以其为抗肿瘤活性成分的药物组合物，其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于药物技术领域，具体地，涉及一类新的咔唑生物碱，以其为有效成分的药物组合物，其作为肿瘤细胞生长抑制剂，其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

当今世界，肿瘤严重威胁着人类的健康和生命，其死亡率仅次于心血管疾病而位居第二，成为当今人类医学界一大难题。据世界卫生组织最近发表的报告，在28个工业化国家内，男性癌症死亡率上升55%，女性上升40%，其中胃癌居首位，其他依次为食道癌、肝癌、子宫颈癌和肠癌等。随着分子肿瘤学的发展，人们发现细胞内促增殖系统成分的过度表达与抑增殖系统成分的缺失均可引起细胞增殖失控而导致癌变。随着生命科学研究的飞速进展，恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明。

目前抗肿瘤药物的来源主要包括植物、动物、微生物、矿物和海洋生物的代谢产物及其人工合成和人工修饰等产物。根据其作用机理的不同，抗肿瘤药物又可分为以下几类：（1）细胞毒类抗肿瘤药；（2）以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物；（3）肿瘤新生血管生成抑制药物；（4）肿瘤细胞诱导分化剂；（5）细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂等。植物来源的天然产物在当今抗肿瘤药物市场上扮演了重要角色，由于植物来源抗肿瘤药物的作用机制独特、抗癌疗效显著，如今在临床上已经逐步占据了主导地位，达到40%的市场份额，但其资源来源和成本问题仍然困扰着这些药物的广泛推广和使用，如临床使用的植物来源的生物碱类型的抗肿瘤药物紫杉醇（paclitaxel）、喜树碱（camptothecin）和长春碱（vinblastine）等均面临这些问题。

目前已经报道的应用于抗肿瘤药物研究的天然产物包括多种结构类型，除上述提到的具有代表性的生物碱类化合物外，还有萜类、木脂素类和黄酮类等，但是尚未见到已经上市的咔唑生物碱类抗肿瘤药。咔唑类生物碱及其衍生物是一类重要的含氮芳杂环化合物，分子内含有较大的共轭体系和强的分子内电子转移，这种特殊的刚性稠环结构使咔唑生物碱类化合物表现出许多独特的生物活性，例如：细胞毒、抗微生物、抗氧化、抗结核、抗艾滋、乙酰胆碱酯酶抑制、拓扑异构酶抑制等。目前已有一些合成出来的咔唑生物碱类药物进入临床试验，例如：Cephalon公司的抗肿瘤新药CEP-9722已经进入临床二期，该药是一个合成的咔唑生物碱，以多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-2为靶标，该药经临床观察无明显的毒副作用；Cephalon公司的另一个咔唑类的抗肿瘤新药CEP-11981进入临床一期，该药以Tek酪氨酸激酶受体和血管内皮生长因子受体作为靶标。另外还有一些合成的咔唑生物碱类化合物体内外都表现出了良好的研发前景，例如中国医学科学院的Hu LX合成的咔唑生物碱类化合物9-ethyl-N-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-carbazole-3-sulfonamide体外对肿瘤细胞株MCF-7的细胞毒活性IC₅₀达到89nM，而体内试验给药100mg/kg，肿瘤抑制率达到75%，而LD₅₀为500mg/kg。参见：Hu LX, et al, Synthesis and structure-activityrelationships of carbazole sulfonamides as a novelclass of antimitotic agents against solid tumors, J.Med. Chem., 2006, 49, 6273-6282。Cephalon公司的另一个咔唑生物碱类化合物CEP-5214对肿瘤细胞株VEGF-R2的体外IC₅₀达到4nM，体内给药23.8mg/kg，肿瘤抑制率达到70%，没有观察到明显的毒副作用。参见：Gingrich DE, et al, A new class of potent vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors: Structure-activity relationships for aseries of 9-alkoxymethyl-12-(3-hydroxypropyl)indeno[2,1-a]pyrrolo[3,4-c]carbazole-5-ones and the identificationof CEP-5214 and its dimethylglycine ester prodrug clinical candidate CEP-7055, J. Med. Chem., 2003, 46, 5375-5388。另外也有一些来自天然的咔唑生物碱类化合物具有良好的抗肿瘤活性，可以作为抗肿瘤药物的先导物，但截至目前仅限于文献报道或专利申请，尚未进入临床试验阶段，例如：YH Taufiq-Yap等从小叶臭黄皮中得到的咔唑生物碱类化合物clausine-TY对肿瘤细胞株CEM-SS的IC₅₀为8.2 μg/mL。参见：Taufiq-Yap YH, et al, Anew cytotoxic carbazole alkaloid from Clausena excavate, Nat. Prod. Res., 2007, 21, 810-813。W Maneerat 等人从黄皮根部分离得到咔唑生物碱mafaicheenamine E对肿瘤细胞株MCF-7的IC₅₀达到3.1 μg/mL。参见：Maneerat W, et al. Carbazole alkaloids and coumarins from Clausena lansium roots, Phytochem. Lett., 2012, 5, 26-28。TThongthoom 等从Clausena harmandiana 根部分离得到的咔唑生物碱类化合物7-methoxymukonal对肿瘤细胞株MCF-7 和KB的IC₅₀分别达到2.21μg/mL和1.74μg/mL。参见：Thongthoom T, et al. Biological activity of chemical constituents from Clausena harmandiana, Arch. Pharmacal Res., 2010, 33, 675-680。咔唑生物碱类化合物在植物界分布广泛，尤其以芸香科黄皮属植物中最为丰富。黄皮属植物在我国南方分布广，容易生长栽培，资源丰富，从黄皮属植物中分离到的咔唑生物碱类化合物含量大、种类多、分离提取容易、抗肿瘤活性强，对咔唑生物碱进行抗肿瘤药物方面的研究有利于黄皮属植物资源的综合开发利用。

本专利中申请保护的四个咔唑生物碱为新化合物，具有较强的细胞毒活性。

黄皮属植物中的咔唑生物碱类化合物的提取分离有一定的特点，该类天然产物主要分布于植物的根和茎，含色素，化合物极性大多数中等偏小，含量不同，另外由于该类化合物结构中含有较大的共轭体系，因此紫外吸收比较强，在分离纯化时可充分利用该特点。现有技术中，从黄皮属植物中分离咔唑生物碱类化合物已公开发表如下方法：（1）20世纪80年代，黄皮属植物Clausena harmandiana的根茎经正己烷回流提取，用TLC检测，经反复硅胶柱层析分离得到咔唑生物碱heptaphylline。参见：Wangboonskul JD, et al, Five Coumarins and a carbazole alkaloid from the root bark of Clausena harmandiana, J. Nat. Prod., 1984, 47, 1058-1059。其缺点是用正己烷提取样品不充分，只利用TLC检测和硅胶柱层析进行分离得不到微量成分。（2）20世纪90年代，黄皮属植物Clausena anisata的茎由石油醚和乙醇分别提取，然后用氯仿和乙酸乙酯分别萃取，再经硅胶柱层析，分别以石油醚，石油醚/二氯甲烷1:1，氯仿，氯仿/甲醇1:50为洗脱剂反复硅胶柱层析得到咔唑生物碱clausenol 和 clausenine。参见：Chakraborty A, et al, Clausenol and clausenine-Two carbazole alkaloids from Clausenaanisata, Phytochemistry, 1995, 40, 295-298。其缺点是只用正相硅胶，没有应用反相硅胶，容易吸附微量样品。（3）近年来，黄皮属植物Clausena anisata的茎经干燥粉碎后分别由丙酮和甲醇进行回流提取，得到的浸膏经反复硅胶柱层析及TLC制备薄层板进行分离纯化得到咔唑生物碱furanoclausamine A和furanoclausamine B。参见：Ito C, et al. gamma-Lactone carbazoles from Clausena anisata, J. Nat. Prod.,2009, 72, 1202-1204。该方法的缺点是薄层制备板只适用于微量成分，且容易吸附样品。

以上几种方法侧重于使用正相硅胶，反相硅胶几乎没有使用，容易损失样品；单一的TLC检测方法灵敏度不够，微量成分不容易检测，没有充分利用咔唑生物碱紫外吸收强的特点。

发明内容：

针对现有技术存在的上述不足之处，本发明的目的在于提供一类新的咔唑生物碱；提供制备该类化合物的方法，该提取分离方法可控性和重现性好，样品损失少，成本较低，操作方便，溶剂可以反复回收利用，也适用于工业生产；本发明的目的还在于提供以咔唑生物碱类化合物为有效成分的药物组合物；该类化合物作为肿瘤细胞生长抑制剂，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

下述结构式所述的黄皮属植物中的新咔唑生物碱lansine D（1）、lansine E（2）、lansine F（3）和lansine G（4），

。

制备所述咔唑生物碱的方法，取黄皮属植物的根茎，经干燥、粉碎后，用甲醇回流充分提取；将甲醇浸膏加水混悬后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取；乙酸乙酯部分反复用硅胶、MCI、RP-18、HPLC各种层析柱分离纯化，再结合TLC检测方法即得到咔唑生物碱类化合物。

制备所述新的咔唑生物碱lansine D（1）、lansine E（2）、lansine F（3）和lansine G（4）的方法，取黄皮的根茎，经干燥、粉碎后，用甲醇回流提取3次，时间为每次4小时，提取液经减压浓缩得甲醇浸膏；将甲醇浸膏加水混悬后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等体积各萃取三次，回收溶剂得到乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分；将乙酸乙酯部分经硅胶柱层析，用100:0, 95:5, 90:10的氯仿/甲醇梯度洗脱，薄层层析，结合TLC检测方法，根据咔唑生物碱极性的不同合并为七个组分Fr.1 - Fr.7；以下的每一步骤都须结合TLC检测方法来进行分离纯化；Fr.6经硅胶柱层析，以9:1-7:3石油醚/丙酮为洗脱剂梯度洗脱初步除去色素；然后再经中压MCI柱层析，以10%-60%甲醇/水为流动相梯度洗脱进一步除去色素；最后再经中压RP-18柱层析，以5%-70%甲醇/水为流动相梯度洗脱分为四个亚组分Fr.6-1 -Fr.6-4。Fr.6-2经硅胶柱层析，以9:1石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂等度洗脱得到三个亚组分Fr.6-2-1 - Fr.6-2-3，其中Fr.6-2-2以丙酮为溶剂重结晶得到化合物lansine G（4）；Fr.6-2-3经硅胶柱层析，以15:1氯仿/丙酮为洗脱剂等度洗脱得到含有生物碱的样品；之后再经硅胶柱层析，以6:1石油醚/丙酮为洗脱剂等度洗脱得到化合物lansine E（2）；Fr.6-4经进一步的中压RP-18柱层析，以5%-100%甲醇/水为洗脱剂梯度洗脱得到三个亚组分Fr.6-4-1 - Fr.6-4-3；Fr.6-4-2再经硅胶柱层析，以9:1石油醚/丙酮为洗脱剂等度洗脱合并含有生物碱的部分；再经硅胶柱层析，以15:1氯仿/丙酮为洗脱剂等度洗脱得到含有生物碱的样品；最后再用ODS HPLC半制备柱纯化，42%乙腈/水（含有0.6%三氟乙酸）为洗脱剂等度洗脱分离得到化合物lansine D（1）；Fr.6-4-3经硅胶柱层析，以100:1氯仿/丙酮为洗脱剂等度洗脱得到含有生物碱的样品；再经ODS HPLC半制备柱纯化，48%乙腈/水（含有0.6%三氟乙酸）为洗脱剂等度洗脱分离得到化合物lansine F（3）。

以咔唑生物碱或其药理学上容许的盐为有效成分的肿瘤细胞生长抑制剂。

药物组合物，其中含有治疗有效量的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。

抗肿瘤药物组合物，其中含有治疗有效量的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。

咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备肿瘤细胞生长抑制剂中的应用。

咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。

咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备胃癌、宫颈癌、肺癌细胞生长抑制剂中的应用。

咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备治疗胃癌、宫颈癌、肺癌的药物中的应用。

本发明对云南产的芸香科黄皮属植物黄皮进行系统的咔唑生物碱类成分研究，利用多种分离纯化手段，包括正反相硅胶柱层析、MCI、HPLC半制备等，从中获得了一系列咔唑生物碱。之后对所有咔唑生物碱类成分在三种肿瘤细胞：人胃癌细胞BGC-823、人宫颈癌细胞HeLa和人非小细胞肺癌细胞A549模型上检测细胞生长增殖情况。发现其中lansine D（1）、lansine E（2）、lansine F（3）和lansine G（4）为新的肿瘤细胞生长抑制剂，可用于制备抗肿瘤药物。

本发明的所述芸香科黄皮属植物中的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐，可以列举例如与盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸等无机酸，或者马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对-苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸、单宁酸等有机酸，锂，钠、钾等碱金属，钙、镁等碱土金属，赖氨酸等碱性氨基酸成的盐。

本发明所述的治疗抗肿瘤相关疾病的药物组合物，由黄皮属植物中的咔唑生物碱与药学上可接受的载体制备的药物剂型包括片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等。由于黄皮属植物中的咔唑生物碱可从黄皮以及同属植物中提取分离，而片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等药物剂型的制备也是本领域的常规知识。因此，由黄皮属植物中的咔唑生物碱与相应载体制备的各种药物剂型也能够由本领域技术人员实现。

上文中所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、以及聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1%～99.5%的活性成分，最优选含有重量比为0.5%～95%的活性成分。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～10 mg/kg体重，优选0.1～5 mg/kg 体重。可以一次或多次施用。

本发明黄皮属植物中的咔唑生物碱提取方法的优点在于，首先提取分离思路具有新颖性，成功利用色谱层析技术将植物根茎中色素和黄皮属植物中的咔唑生物碱分离。概括地说，先利用中压MCI离子交换树脂除去样品中大部分色素，使样品颜色变浅，然后再利用中压RP-18反相柱将样品根据极性不同分段，之后再利用硅胶柱层析进一步分离纯化，最后利用咔唑生物碱苯环共轭系统紫外吸收强的特点用HPLC半制备柱纯化，也可利用部分咔唑生物碱容易结晶的特点通过重结晶进行分离纯化。因此该提取分离方法可控性和重现性好，样品损失少，成本较低，操作方便，溶剂可以反复回收利用，也适用于工业生产。

附图说明：

图1为本发明的黄皮属植物中的新咔唑生物碱的制备方法流程图。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的改进都属于本发明的范围。

实施例1：

黄皮属植物中的新咔唑生物碱lansine D（1）、lansine E（2）、lansine F（3）和lansine G（4）的制备方法及其结构鉴定：

取黄皮的根茎27 kg，经干燥、粉碎后，用甲醇回流提取3次（100L × 3次），时间为4h，提取液经减压浓缩得甲醇浸膏800 g；将甲醇浸膏加水混悬后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等体积各萃取三次 (30 L × 3次)，回收溶剂得到乙酸乙酯部分406 g、正丁醇部分158 g和水相部分236 g；将乙酸乙酯部分经硅胶柱层析，用100:0, 95:5, 90:10的氯仿/甲醇梯度洗脱，薄层层析，结合TLC检测方法，根据咔唑生物碱极性的不同合并为七个组分Fr.1 - Fr.7；以下的每一步骤都须结合TLC检测方法来进行分离纯化。Fr.6（123 g）经硅胶柱层析，以9:1-7:3石油醚/丙酮为洗脱剂梯度洗脱初步除去色素合并生物碱部分得到样品（88.5 g）；然后再用聚酰胺拌样，经中压MCI柱层析，以10%-60%甲醇/水为流动相梯度洗脱进一步除去色素合并生物碱部分得到样品（63.4 g）；最后再用聚酰胺拌样经中压RP-18柱层析，以5%-70%甲醇/水为流动相梯度洗脱分为四个亚组分Fr.6-1 - Fr.6-4。Fr.6-2（3.91 g）经硅胶柱层析，以9:1石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂等度洗脱得到三个亚组分Fr.6-2-1 - Fr.6-2-3，其中Fr.6-2-2（29 mg）以丙酮为溶剂重结晶得到化合物lansine G（4）（6 mg）。Fr.6-2-3（1.81 g）经反复硅胶柱层析，以15:1氯仿/丙酮为洗脱剂等度洗脱之后合并生物碱部分（632 mg）；再经硅胶柱层析，以6:1石油醚/丙酮为洗脱剂反复等度洗脱得到化合物lansine E（2）（115 mg）。Fr.6-4（33 g）经进一步的中压RP-18柱层析，以5%-100%甲醇/水为洗脱机梯度洗脱得到三个亚组分Fr.6-4-1 - Fr.6-4-3。Fr.6-4-2（11 g）再经反复硅胶柱层析，以9:1石油醚/丙酮为洗脱剂等度洗脱合并含有生物碱的部分（4.9 g）；再经反复硅胶柱层析，以15:1氯仿/丙酮为洗脱剂等度洗脱得到含有生物碱的样品（121 mg）；最后再用ODS HPLC半制备柱纯化，42%乙腈/水（含有0.6%三氟乙酸）为洗脱剂等度洗脱分离得到化合物lansine D（1）（34 mg）。Fr.6-4-3（3.1 g）经反复硅胶柱层析，以100:1氯仿/丙酮为洗脱剂等度洗脱得到含有生物碱的样品（345 mg）；再经ODS HPLC半制备柱纯化，以48%乙腈/水（含有0.6%三氟乙酸）为洗脱剂等度洗脱分离得到化合物lansine F（3）（6mg）。

化合物lansine D（1）、lansine E（2）、lansine F（3）和lansine G（4）的结构式如下所示：

lansine D（1）、lansine E（2）、lansine F（3）和lansineG（4）的结构鉴定数据为：

Lansine D (1):黄色粉末；[α]23.1 D-3.4 (c 0.26, MeOH);UV (MeOH) λ_max (log ε) 204 (4.51), 224 (4.42), 250 (3.42), 255 (4.43), 276 (4.29), 329 (3.72), 339 (3.73) nm; IR (KBr) ν_max 3423, 2926, 1678, 1640, 1614, 1573, 1516, 1453, 1384, 1335, 1273, 1234 cm⁻¹; ¹HNMR (Pyriding-d₅, 600 MHz)见表1, ¹³C NMR (Pyriding-d₅,150MHz)见表2; ESI MS (pos. ion mode) m/z 390 [M+H]⁺, 412 [M+Na]⁺, 801 [2M+Na]⁺; HR EIMS m/z 389.1264 [M]⁺(calcd for C₂₃H₁₉NO₅, 389.1263).

Lansine E (2): 棕色粉末；UV (MeOH) λ_max (log ε) 212(4.32), 231 (4.34), 271 (4.22), 301 (4.36), 360 (3.98) nm; IR (KBr) ν_max 3422, 2925, 1658, 1630, 1580,1384, 1296, 1117 cm⁻¹; ¹H NMR (Pyriding-d₅, 500 MHz)见表1, ¹³C NMR (Pyriding-d₅, 125 MHz)见表2; ESI MS (pos. ion mode) m/z 316 [M+Na]⁺, 609 [2M+Na]⁺; EI MS (pos. ion mode) m/z 293 [M]⁺; HR EIMS m/z 293.1046[M]⁺ (calcd for C₁₈H₁₅NO₃, 293.1052).

Lansine F (3): 黄色粉末；UV (MeOH) λ_max (log ε) 204(4.23), 224 (4.34), 284 (4.69), 313 (3.64), 328 (3.61), 375 (3.48), 389 (3.44). IR (KBr) ν_max 3441, 2925, 1640, 1631, 1617, 1384, 1238. ¹H NMR (Pyriding-d₅,600 MHz)见表1, ¹³C NMR (Pyriding-d₅, 150 MHz)见表2.ESI MS (pos. ion mode) m/z 249 [M+H]⁺; EI MS (pos.ion mode) m/z 248 [M]⁺; HR EIMS m/z 248.0932 [M]⁺(calcd for C₁₆H₁₂N₂O, 248.0950).

Lansine G (4): 黄色粉末；UV (MeOH) λ_max (log ε) 204(4.27), 235 (4.17), 282 (4.19), 313 (4.26) nm; IR (KBr) ν_max 3440, 2924, 1630, 1384, 1296 cm⁻¹; ¹H NMR(Pyriding-d₅, 400 MHz)见表1, ¹³C NMR (Pyriding-d₅, 100MHz)见表2; ESI MS (pos. ion mode) m/z 318 [M+Na]⁺;EI MS (pos. ion mode) m/z 295 [M]⁺; HR EIMS m/z 295.1203 [M]⁺ (calcd for C₁₈H₁₇NO₃, 295.1208).

表1 lansine D（1）、lansine E（2）、Lansine F (3)和lansine G（4）的¹H NMR数据（pyriding-d₅，δ in ppm，J inHz）

^aData was measured at 600 MHz. ^bData was measured at 500 MHz. ^cData was measured at 400 MHz.

表2 lansine D（1）、lansine E（2）、Lansine F (3)和lansine G（4）的¹³C NMR数据（pyriding-d₅，δ in ppm）

^aData was measured at 150 MHz. ^bData was measured at 125 MHz.

^cData was measured at 100 MHz.

实施例2：

本发明lansine D（1）、lansine E（2）、lansine F（3）和lansine G（4）在肿瘤细胞BGC-823、HeLa和A549上的细胞毒性实验结果、实验原理、方法和结果如下：

实验原理：药物与细胞共培养后检测肿瘤细胞存活率。磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B，SRB）是一种水溶性蛋白染料，其分子中的磺酸基阴离子，在弱酸性环境下与细胞内蛋白质的碱性氨基酸结合，用碱性溶液溶解细胞内的SRB并测其吸光值，由SRB的含量即可得知细胞内的蛋白质含量，并以此代表细胞存活率。

实验方法：（1）接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液将以上三种肿瘤细胞配成单个细胞悬浮液，以每孔5×10³个细胞接种到96孔板上。（2）化合物处理：细胞贴壁后，加入待测化合物溶液，继续培养48或72小时。（3）固定、染色与测定：加入预冷的三氯乙酸溶液固定细胞，之后用SRB溶液染色活细胞，最后加入Tris溶液溶解SRB，560nm检测吸光值。（4）记录结果，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制曲线，应用Reed and Muench法计算化合物的IC₅₀值。

实验结果：

表3咔唑生物碱1-4对三种肿瘤细胞生长的半数抑制浓度

实验结果表明，化合物1-4均具有肿瘤细胞毒活性，其中化合物lansine F（3）的活性在Hela细胞上的活性与阳性对照紫杉醇活性相当。

实施例3：

实施例1所得任一化合物1-4，加入4%的硫酸乙醇溶液，PH = 4，过滤，干燥，制成硫酸盐化合物1-4。

实施例4：

实施例1所得任一化合物1-4，加入4%的盐酸溶液，PH = 4，过滤，干燥，制成盐酸盐化合物1-4。

实施例5：

实施例1所得任一化合物1-4，加入4%的酒石酸溶液，PH = 4，过滤，干燥，制成酒石酸盐化合物1-4。

实施例6：

实施例1所得任一化合物1-4，加入4%的柠檬酸溶液，PH = 4，过滤，干燥，制成柠檬酸盐化合物1-4。

实施例7：

片剂：实施例1所得任一化合物1-4或实施例3-6所得的盐10 mg，乳糖180 mg，淀粉 55 mg，硬脂酸镁 5 mg。

制备方法：将任一化合物1-4或其盐、乳糖和淀粉混和，用水均匀湿润、把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250 mg，化合物含量为10 mg。

实施例8：

安瓿剂：实施例1所得任一化合物1-4或实施例3-6所得的盐2 mg，氯化钠 10 mg。

制备方法：将任一化合物1-4或其盐和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例9：

注射用冻干剂：实施例1所得任一化合物1-4或实施例3-6所得的盐 10 mg，碳酸氢钠 2 mg，甘露醇 252 mg。

制备方法：将碳酸氢钠、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30min除热原，过滤除去活性碳，在滤液中加入化合物或其盐，超声处理使溶解，用1 N盐酸调节PH为5.0-7.0，微孔滤膜滤过，加注射用水，分装，冷冻干燥，上塞，轧盖，即得。

实施例10：

胶囊剂：实施例1所得任一化合物1-4或实施例3-6所得的盐10mg，乳糖187 mg，硬脂酸镁 3mg。

制备方法：将任一化合物1-4或其盐与助溶剂混和，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200 mg，活性成分含量为10 mg。

Claims (8)

1.下述结构式所述的黄皮属植物中的咔唑生物碱化合物1和化合物3，

2.制备权利要求1所述的咔唑生物碱化合物1和化合物3的方法，取黄皮的根茎，经干燥、粉碎后，用甲醇回流提取3次，时间为每次4小时，提取液经减压浓缩得甲醇浸膏；将甲醇浸膏加水混悬后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等体积各萃取三次，回收溶剂得到乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分；将乙酸乙酯部分经硅胶柱层析，用100:0,95:5,90:10的氯仿/甲醇梯度洗脱，薄层层析，结合TLC检测方法，根据咔唑生物碱极性的不同合并为七个组分Fr.1-Fr.7；以下的每一步骤都须结合TLC检测方法来进行分离纯化，Fr.6经硅胶柱层析，以9:1-7:3石油醚/丙酮为洗脱剂梯度洗脱初步除去色素，然后再经中压MCI柱层析，以10％-60％甲醇/水为流动相梯度洗脱进一步除去色素，最后再经中压RP-18柱层析，以5％-70％甲醇/水为流动相梯度洗脱分为四个亚组分Fr.6-1-Fr.6-4；Fr.6-4经进一步的中压RP-18柱层析，以5％-100％甲醇/水为洗脱剂梯度洗脱得到三个亚组分Fr.6-4-1-Fr.6-4-3；Fr.6-4-2再经硅胶柱层析，以9:1石油醚/丙酮为洗脱剂等度洗脱合并含有生物碱的部分，再经硅胶柱层析，以15:1氯仿/丙酮为洗脱剂等度洗脱得到含有生物碱的样品，最后再用ODS HPLC半制备柱纯化，42％乙腈/水为洗脱剂等度洗脱分离得到化合物1；Fr.6-4-3经硅胶柱层析，以100:1氯仿/丙酮为洗脱剂等度洗脱得到含有生物碱的样品，再经ODS HPLC半制备柱纯化，48％乙腈/水为洗脱剂等度洗脱分离得到化合物3。

3.以权利要求1所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐为有效成分的肿瘤细胞生长抑制剂。

4.药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。

5.权利要求1所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备肿瘤细胞生长抑制剂中的应用。

6.权利要求1所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备治疗肿瘤相关疾病的药物中的应用。

7.权利要求1所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备胃癌、宫颈癌、肺癌细胞生长抑制剂中的应用。

8.权利要求1所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备治疗胃癌、宫颈癌、肺癌的药物中的应用。