CN107324999A

CN107324999A - 萘醌二聚体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107324999A
Application number: CN201710565107.4A
Authority: CN
Inventors: 谭宁华; 汪哲; 赵思蒙; 宋立华; 陈小强
Original assignee: China Pharmaceutical University; Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: China Pharmaceutical University; Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2017-11-07
Anticipated expiration: 2037-07-12
Also published as: CN107324999B

Abstract

本发明公开了一种茜草属(Rubia)植物中分离得到的萘醌二聚体，以其为活性成分的药物组合物，以其为活性成分的NF‑κB信号通路抑制剂，其制备方法及其在治疗与预防NF‑κB信号通路异常激活的相关炎症疾病和癌症的药物中的应用，属于药物技术领域。本发明的Rubioncolin C(1)为从柄花茜草(Rubiapodantha D.)分离得到的萘醌二聚体，具有体内外抗肿瘤和NF‑κB信号通路抑制活性。本发明能作为制备抗肿瘤药物制剂和前体药物的应用，具有制备成本低、毒性小、抗肿瘤效果好等优点。

Description

萘醌二聚体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及一类萘醌二聚体，以及其作为NF-κB信号通路抑制剂或抗肿瘤药物的应用，以及以其作为有效成分的药物组合物，其制备方法及在制备治疗与预防NF-κB信号通路相关的炎症疾病与癌症的药物中的应用。

背景技术

1986年，Sen和Baltimore在成熟B细胞中首次发现核转录因子NF-κB，其为能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异性结合的蛋白因子。NF-κB广泛参与多种生物学效应，包括细胞增殖、细胞凋亡、炎症反应、免疫应答及肿瘤发生发展等重要的生理病理过程，是高等生物细胞中最重要的信号通路之一，其在细胞中的活动受到严格的调控。研究表明，在哺乳动物中，NF-κB家族成员主要有五种，分别是RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50/p105(NF-κB1)和p52/p100(NF-κB2)，且能形成同或异二聚体，其中p65/p50是最主要的形式。NF-κB信号通路的激活主要分为两类：经典途径和非经典途径，IKK的激活及IκBα的降解是该通路激活的关键。经典途径中，TNF-α与TNFR1结合后，SODD(silencer of death domain)从受体中释放出来，使信号蛋白TRADD(TNFR1-associated death domain)、TRAF2、TRAF5及RIP1(receptor-interacting protein 1)等连续募集到胞膜的TNFR1受体上，随后TRAF招募Ubc13和Uev1A，使RIP1发生泛素化，继而使其与TAB2相互作用，募集TAK1激酶复合体。另一方面，RIP1通过泛素化与NEMO结合，达到对IKK复合体的募集，最终实现TAK1对IKKβ的磷酸化激活。激活的IKK使IκBα在特殊位点发生磷酸化，随后泛素化并被26S蛋白酶降解。p105亚基在GSK3β和Tpl2的作用下发生磷酸化，并随后降解，形成自由的p65/p50复合体。p65/p50入核后经过一系列的入核后修饰过程(磷酸化、乙酰化、甲基化等)后，结合相应的κB位点，并激活NF-κB靶基因。非经典途径中，NEMO是非必需的，受胞外刺激后，如CD40，LTβR，BAFF等，结合相应受体，导致TRAF相关蛋白的募集及随后的NIK和IKKα的激活。激活的IKKα导致抑制蛋白p100发生蛋白水解过程，形成p52，RelB/p52入核，结合相应的κB位点，并激活NF-κB靶基因。此途径中，上游激酶主要为NIK，它受到一个复杂的蛋白连接酶复合体的调节。在正常的静息细胞中，NIK被泛素化，并经蛋白酶体降解，不能表达发挥作用。当受到胞外刺激，阻止NIK泛素化，故其被激活。

许多研究表明，在慢性炎症导致癌症的过程中，NF-κB信号通路有着非常重要的作用，能作为潜在的药物作用靶点。该通路能调节许多基因的转录表达，涉及到免疫调节、细胞生存、炎症及肿瘤的发生发展。许多疾病的发生都和该通路异常有关，特别是在肿瘤的发生发展过程中NF-κB常处于异常激活状态。基于此，发现、设计或合成该通路的抑制剂成为热点。有多种方式能抑制该通路活性，如抑制IKK激酶活力，抑制蛋白IκBα泛素化，抑制NF-κB核转位等。目前，有多于700种NF-κB信号通路抑制剂，其种类有：抗氧化剂、肽类、小分子DNA/RNA、细菌及病毒蛋白、小分子化合物等，在这些抑制剂中，仅硼替佐米作为唯一一个被美国FDA批准的靶向NF-κB的小分子药物。因此，发展结构新颖、特异性强的NF-κB信号通路抑制剂，具有十分重要的应用价值。

现有技术中未见有茜草科植物来源的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)作为NF-κB信号通路抑制剂和抗肿瘤药物的报道。

发明内容

针对现有技术的空白，本发明的目的在于提供一类萘醌二聚体类化合物；提供该类化合物的制备方法；还提供了该类化合物的医药应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种如下述结构式所示的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)或其药用盐，

一种以所述的Rubioncolin C(1)或其药用盐为有效成分的NF-κB信号通路抑制剂。

一种以所述的Rubioncolin C(1)或其药用盐为有效成分的抗肿瘤药物。

一种药物组合物，其中含有治疗有效量的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)或其药用盐和药学上可接受的载体。

所述的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)或其药用盐在制备治疗与预防NF-κB信号通路异常激活的相关炎症疾病的药物中的应用。

所述的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)或其药用盐在制备治疗与预防癌症的药物中的应用。

如所述的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)或其药用盐在制备治疗与预防癌症的药物中的应用，其中所述的癌症为基底细胞癌、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、痣样基底细胞癌综合征、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、转移性前列腺癌、胰腺癌、软骨肉瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、肝癌、膀胱癌、血管瘤、慢性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

本发明还提供了制备所述的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)的方法，包括以下步骤：取茜草属植物的根及根茎，经干燥、粉碎，通过甲醇回流充分提取后，得甲醇总浸膏；利用硅胶和Sephadex LH-20分离材料和技术对低极性部位进行分离纯化，即得到萘醌二聚体。

更具体地，制备所述的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)的方法，包括以下步骤：取茜草属植物柄花茜草(Rubia podantha D.)的根及根茎，经干燥、粉碎后，利用甲醇回流提取2-5次，每次时间为3-4小时，提取液经减压浓缩得甲醇总浸膏；总浸膏经硅胶柱层析，以氯仿/甲醇(100:0，9:1，8:2，7:3，1:1，0:100)梯度洗脱，得六个组分Fr.1-Fr.6；其中低极性部位Fr.1再经硅胶柱层析，以石油醚/丙酮(30:1，15:1，5:1，1:1)梯度洗脱，得4个亚组分Fr.1-1-Fr.1-4；Fr.1-3亚组分经Sephadex LH-20凝胶柱层析，1:1的氯仿/甲醇为洗脱剂，得3个亚组分Fr.1-3-1-Fr.1-3-3；Fr.1-3-2经硅胶柱层析，以石油醚/丙酮(7:1)为洗脱剂，得到化合物Rubioncolin C(1)。

本发明对茜草科植物柄花茜草进行了萘醌二聚体化学成分研究，利用硅胶和Sephadex LH-20分离材料和技术，从中获得了萘醌二聚体Rubioncolin C(1)。之后利用11种肿瘤细胞株模型及人肝癌HepG2裸鼠移植瘤模型评价萘醌二聚体Rubioncolin C(1)体内外抗肿瘤活性，结果显示该萘醌二聚体具有体内外抗肿瘤活性；利用荧光素酶双报告基因系统，在HEK293T细胞中评价该萘醌二聚体对NF-κB信号通路的影响，结果显示该萘醌二聚体具有抑制该通路的活性，为一类新型的抑制剂。

本发明的所述的萘醌二聚体或其药理学上容许的盐，可以列举例如盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸等无机酸，或者马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸、单宁酸等有机酸，锂，钠、钾等碱金属，钙、镁等碱土金属，赖氨酸等碱性氨基酸成的盐。

本发明所述的治疗炎症相关疾病和癌症的药物组合物，由萘醌二聚体化合物与药学上可接受的载体制备的药物剂型包括片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等。由于萘醌二聚体可从柄花茜草以及同属植物中提取分离，而片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等药物剂型的制备也是本领域的常规知识。因此，由萘醌二聚体化合物与相应载体制备的各种药物剂型也能够由本领域技术人员实现。

上文中所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、以及聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明所述的药物组合物优选含有重量比为0.1％～99.5％的活性成分萘醌二聚体Rubioncolin C(1)，最优选含有重量比为0.5％～95％的活性成分萘醌二聚体Rubioncolin C(1)。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～10mg/kg体重，优选0.1～5mg/kg体重。可以一次或多次施用。

有益效果：本发明的Rubioncolin C(1)为从柄花茜草(Rubia podantha D.)分离得到的萘醌二聚体，具有体内外抗肿瘤和NF-κB信号通路抑制活性；所述萘醌二聚体的制备方法能快速分离纯化目标化合物Rubioncolin C(1)，效率高，目的性强，操作方便，可控性和重现性好，溶剂可以反复回收利用，成本低，适用于工业生产；所述研究对后续相关药物的优化和开发具有重要的价值。

附图说明

图1为本发明的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)的制备方法流程图；

图2为本发明的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)的体内抗肿瘤活性；

图3为本发明的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)的NF-κB信号通路抑制活性。

具体实施方式

下面结合附图，用具体实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的改进都属于本发明的范围。

实施例1

萘醌二聚体Rubioncolin C(1)的制备方法(流程见图1)，包括以下步骤：

取柄花茜草的根及根茎10kg，经干燥、粉碎后，甲醇回流提取3次(20L×3)，时间为4h、3h和3h，提取液经减压浓缩后的甲醇总浸膏1.42kg。总浸膏经硅胶柱层析，以氯仿/甲醇(100:0，9:1，8:2，7:3，1:1，0:100)梯度洗脱，得六个组分Fr.1-Fr.6；其中低极性部位Fr.1(53g)再经硅胶柱层析，以石油醚/丙酮(30:1，15:1，5:1，1:1)梯度洗脱，得4个亚组分Fr.1-1-Fr.1-4；Fr.1-3(17g)亚组分经Sephadex LH-20凝胶柱层析，1:1的氯仿/甲醇为洗脱剂，得3个亚组分Fr.1-3-1-Fr.1-3-3；Fr.1-3-2(5.2g)反复经硅胶柱层析，以石油醚/丙酮(7:1)为洗脱剂，得到化合物Rubioncolin C(1)(31mg)。

实施例2

本发明萘醌二聚体Rubioncolin C(1)利用SRB比色法评价其对人非小细胞肺癌细胞株(A549)、人肝癌细胞株(BEL-7402、HepG2和SMMC-7721)、人胃腺癌细胞株(BGC-823和SGC-7901)、人前列腺癌细胞株(DU145)、人宫颈癌细胞株(HeLa)、人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231和MCF-7)和人神经胶质瘤细胞株(U251)等11种肿瘤细胞株(所有细胞来源于中国科学院上海细胞库)的细胞毒活性，发现萘醌二聚体具有细胞毒活性。实验原理、方法和结果如下：

实验原理：SRB(磺酰罗丹明B)，为一种水溶性蛋白染料，分子中具有磺酸基阴离子，在弱酸性条件下可与细胞内蛋白质的碱性氨基酸结合，用碱性溶液Tris-base溶解细胞内的SRB并在540nm处测定其吸光值，从而反映细胞内的蛋白质含量，即可反映细胞的存活率。

实验方法：以含10％胎牛血清的DMEM培养基将细胞配制成细胞悬浮液，以每孔3000或5000个细胞接种于96孔板中，37℃培养24h后，加入不同浓度的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)处理细胞，继续培养48h。每孔加入25μL预冷的50％三氯乙酸水溶液固定细胞1h或4度过夜，洗净晾干。以每孔100μL的0.4％SRB的1％醋酸水溶液染细胞15分钟，以1％醋酸水溶液洗净。后以每孔100μL的10mM Tris-base溶液溶解细胞内SRB，并于540nm处测定其吸光值。根据结果计算抑制率及IC₅₀值。实验结果见表1：

表1 萘醌二聚体Rubioncolin C(1)的细胞毒活性(IC₅₀，μM)

实施例3

本发明的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)利用人肝癌HepG2裸鼠移植瘤模型评价其体内抗肿瘤活性，结果显示萘醌二聚体具有较好的体内抗肿瘤活性。实验方法和结果如下：

将人肝癌细胞HepG2(来源于中国科学院上海细胞库)用无血清DMEM培养基配置成浓度1×10⁵个/mL细胞悬浮液，将其接种于BABL/c裸鼠左侧腋窝皮下，生长7天后，形成荷瘤小鼠模型。取接种生长良好的荷瘤小鼠，随机分组，通过腹腔注射萘醌二聚体RubioncolinC(1)(40mg/kg，20mg/kg和10mg/kg)，隔天给药一次，给药14天后处死所有动物，剥瘤称重，计算抑瘤率，统计处理；5-氟尿嘧啶(10mg/kg)为阳性对照。实验结果如图2所示，抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％，Rubioncolin C(1)的高和中剂量组的抑瘤率为38.5％和25.7％，阳性药抑制率为64.5％。

实施例4

本发明萘醌二聚体Rubioncolin C(1)利用荧光素酶双报告基因法检测其对NF-κB信号通路的抑制活性，结果显示萘醌二聚体能较好的抑制NF-κB信号通路活性。实验原理、方法和结果如下：

采用萤光素酶双报告基因法检测化合物对NF-κB信号通路活性的影响。将处于对数生长期的HEK293T细胞(来源于中国科学院上海细胞库)接种于24孔板中，贴壁后，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染5×κB-luciferase和pTK-Renilla，继续培养18小时，后与不同浓度的Rubioncolin C(1)孵育6小时，再以10ng/mL TNF-α作用2小时后，移出上清，细胞在室温下振荡裂解(Passsive lysis buffer，Promega)15分钟，离心收集上清，用Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega)测定双荧光素酶活力。结果如图3所示，由图可见，Rubioncolin C(1)能较好的抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路的激活，IC₅₀为2.97μM，是一类新型的NF-κB信号通路天然抑制剂。

本发明的Rubioncolin C(1)为从柄花茜草(Rubia podantha D.)分离得到的萘醌二聚体，具有体内外抗肿瘤和NF-κB信号通路抑制活性。本发明能作为制备抗肿瘤药物制剂和前体药物的应用，具有制备成本低、毒性小、抗肿瘤效果好等优点。

实施例5

实施例1所得化合物1，加入4％的硫酸乙醇溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成硫酸盐化合物1。

实施例6

实施例1所得化合物1，加入4％的盐酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成盐酸盐化合物1。

实施例7

实施例1所得化合物1，加入4％的酒石酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成酒石酸盐化合物1。

实施例8：

实施例1所得化合物1，加入4％的柠檬酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成柠檬酸盐化合物1。

实施例9

片剂：实施例1所得化合物1或实施例5-8所得的盐10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg。

制备方法：将化合物或其盐、乳糖和淀粉混和，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。

实施例10

安瓿剂：实施例1所得化合物1或实施例5-8所得的盐2mg，氯化钠10mg。

制备方法：将化合物或其盐和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例11

注射用冻干剂：实施例1所得化合物1或实施例5-8所得的盐10mg，碳酸氢钠2mg，甘露醇252mg。

制备方法：将碳酸氢钠、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30分钟除热原，过滤除去活性碳，在滤液中加入化合物或其盐，超声处理使溶解，用1N盐酸调节PH为5.0-7.0，微孔滤膜滤过，加注射用水，分装，冷冻干燥，上塞，轧盖，即得。

实施例12

胶囊剂：实施例1所得化合物1或实施例5-8所得的盐10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg。

制备方法：将化合物或其盐与助溶剂混和，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

Claims

1.一种如下述结构式所示的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)或其药用盐，

2.一种以权利要求1所述的Rubioncolin C(1)或其药用盐为有效成分的NF-κB信号通路抑制剂。

3.一种以权利要求1所述的Rubioncolin C(1)或其药用盐为有效成分的抗肿瘤药物。

4.一种药物组合物，其特征在于，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)或其药用盐和药学上可接受的载体。

5.权利要求1所述的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)或其药用盐在制备治疗与预防NF-κB信号通路异常激活的相关炎症疾病的药物中的应用。

6.权利要求1所述的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)或其药用盐在制备治疗与预防癌症的药物中的应用。

7.如权利要求6所述的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)或其药用盐在制备治疗与预防癌症的药物中的应用，其特征在于，所述的癌症为基底细胞癌、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、痣样基底细胞癌综合征、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、转移性前列腺癌、胰腺癌、软骨肉瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、肝癌、膀胱癌、血管瘤、慢性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

8.如权利要求1所述的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)或其药用盐，其特征在于，其中所述的其药用盐包括无机酸盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸，或者有机酸马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸、单宁酸，或者碱金属锂、钠、钾，或者碱土金属钙、镁，或者碱性氨基酸赖氨酸形成的盐。

9.一种制备权利要求1所述的萘醌二聚体的方法，其特征在于，包括以下步骤：取茜草属植物的根及根茎，经干燥、粉碎后，用甲醇回流充分提取，得甲醇浸膏；利用硅胶和Sephadex LH-20分离材料和技术对低极性部位进行分离纯化，得到萘醌二聚体。

10.一种制备权利要求1所述的萘醌二聚体Rubioncolin C(1)的方法，其特征在于，包括以下步骤：取茜草属植物柄花茜草的根及根茎，经干燥、粉碎后，用甲醇回流提取2-5次，每次3-4小时，提取液经减压浓缩得甲醇总浸膏；总浸膏经硅胶柱层析，以100:0，9:1，8:2，7:3，1:1，0:100的氯仿/甲醇梯度洗脱，得六个组分Fr.1-Fr.6；其中低极性部位Fr.1再经硅胶柱层析，以30:1，15:1，5:1，1:1的石油醚/丙酮梯度洗脱，得4个亚组分Fr.1-1-Fr.1-4；Fr.1-3亚组分经Sephadex LH-20凝胶柱层析，1:1的氯仿/甲醇为洗脱剂，得3个亚组分Fr.1-3-1-Fr.1-3-3；Fr.1-3-2经硅胶柱层析，以7:1的石油醚/丙酮为洗脱剂，得到化合物Rubioncolin C(1)。