CN107746374B - 一种化合物、包含其的决明子提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明实施例提供了一种化合物，其中，该化合物的化学结构式如下：

本发明实施例还提供了包含了该化合物的决明子提取物；本发明实施例还提供了一种药物组合物，其包含前述的化合物或前述的决明子提取物，及药学上可接受的载体或赋形剂。本发明所提供的化合物或含有它的决明子提取物或药物组合物能够抑制转运体的转运作用；基于此，可以预期本发明所提供的化合物或含有它的决明子提取物或药物组合物能够制备用于抑制转运体作用的药物；进一步地，所述的药物用于预防和/或治疗括以下疾病中的至少一种：高尿酸血症、痛风、病毒感染、高血压、高血脂和肾脏汞中毒。

Description

一种化合物、包含其的决明子提取物及其用途

技术领域

本发明涉及中药提取物技术领域，特别是涉及一种化合物、包含其的决明子提取物及其用途。

背景技术

决明子为豆科决明属植物决明(Cassia obtusifolia L)或小决明(Cassia toraL)的干燥成熟种子，其性微寒，味甘，苦，咸，归肝，肾，大肠经，具有清肝明目，润肠通便的功效。用于目赤涩痛，羞明多泪，头痛眩晕，目暗不明，大便秘结等症。决明子始栽于《神农本草经》，列为120种上品药之一，称之“能治诸眼疾，久服益精光，轻身”。决明子的别名有草决明、羊明、羊角豆、还瞳子、浮绿豆，千里光、野青豆、夜花生等。决明子作为国家卫生部公布的69种药食同源的中药之一被广泛应用，主要分布于安徽，广西，四川，浙江，广东等地，决明子中含有多种化学成分，主要有蒽醌类，黄酮类，萘并吡喃酮类，挥发油类，脂肪酸类，氨基酸类，多糖类及多种无机元素。且具有多种药理活性如降血压，降血脂，利尿，明目，抗菌，抗氧化，抗癌，抗衰老等。

转运体(也称为转运蛋白)广泛存在于生命体中，主要包括有机阴离子转运体(也称为有机阴离子转运蛋白，OAT)和有机阳离子转运体(也称为有机阳离子转运蛋白，OCT)。OAT属于溶质转运蛋白家族(SLC)22A的成员，对各种内源性、外源性阴离子及其代谢物在肝脏以及肾脏的代谢和清除起着重要的作用，并且介导着大量小分子底物的转运。其中，OAT1(SLC22A6)和OAT3(SLC22A8)主要表达在肾脏近端小管基底膜，在清除外源性物质，环境毒素和内源性代谢物中扮演着重要的角色。很多药物如利尿剂、抗高血压药、抗生素、抗病毒以及抗癌药物等都是OAT1和OAT3的底物。此外，其转运的底物也包括很多内源性物质(如代谢中间体、副产物和激素)和环境毒素以及毒物(例如真菌毒素和农药)。因此，OAT1和OAT3在药物代谢动力学有着重要作用，影响着一些药物的使用剂量、药效以及毒性。

OCT也属于SLC22A的重要成员之一，其中OCT1主要分布于肝脏，介导着有机阳离子从血液进入肝脏进行生物转化的第一步。OCT2主要分布于肾脏，参与有机阳离子的肾清除。临床上大约有120种以上的药物的转运与OCT相关，同时OCT也介导着内源性物质的转运。OCT1和OCT2与临床用药的相互作用已经吸引了大量的关注。

综上，近些年来药学研究领域对OAT/OCT的关注越来越多，作为一种多特异性的转运体，OAT/OCT可作用于许多大小和结构不同的药物和内源性化合物。了解天然产物对OAT/OCT的作用，将有助于预测和预防药物有害的相互作用及药物的毒副作用，可指导人们充分利用有利的药物相互作用来达到更加安全有效的治疗目的。

发明内容

发明人对决明子进行了深入的研究，制备了决明子提取物并进一步地从中提取分离出了多种化合物，其中一个化合物为新化合物；并意外地发现这些化合物具有转运体抑制活性，可以用于制备抑制转运体作用的药物。本发明基于上述发现得以完成。

本发明第一方面提供了一种化合物，其中该化合物的化学结构式如下：

本文中，该化合物命名为：1,7,8-三甲氧基-2-羟基-3-甲基-蒽醌。

在本发明第一方面的一种具体实施方式中，其中该化合物(1,7,8-三甲氧基-2-羟基-3-甲基-蒽醌)可以从决明子中提取得到。

本发明第二方面提供了包含本发明第一方面提供的化合物的决明子提取物。

在本发明第二方面的一种具体实施方式中，其还包含至少一种选自以下的化合物：

大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、钝叶素、橙黄决明素、决明素、甲基钝叶决明素、1,2,7-三羟基-8-甲氧基-6-甲基-蒽醌、橙黄决明素葡萄糖苷、钝叶素-2-O-β-D-葡萄糖苷、1,6,7-三甲氧基-8-羟基-3-甲基-蒽醌-2-O-β-D-葡萄糖苷及6'-O-乙酰基-钝叶素-2-O-β-D-葡萄糖苷。

本发明第三方面提供了前述决明子提取物的制备方法，其包括：

1)将决明子用乙醇水溶液提取；浓缩后获得粗浸膏；

2)将所得粗浸膏溶散于水中后用乙酸乙酯及正丁醇萃取，分别得乙酸乙酯萃取部分浸膏、正丁醇萃取部分浸膏及水层浸膏；

3)将步骤2)中获得的各部分浸膏合并、干燥后即得决明子提取物。

本发明第三方面的一种具体实施方式中，前述决明子提取物的制备方法，其包括：

1)将决明子用乙醇水溶液热回流提取；浓缩至无醇后获得粗浸膏；其中，乙醇水溶液优选采用体积百分数为50-100％，更优选采用70-95％，最优选采用95％的乙醇水溶液；乙醇水溶液的用量优选为决明子的2-15倍量，更优选为4-10倍量，最优选为6倍量。提取时间优选为1-4小时，更优选为2小时；提取次数优选为1-6次，更优选为2-4次，最优选为3次；

2)将所得粗浸膏溶散于水中(水量为粗浸膏的3-10倍量，更优选为4-6倍量，最优选为4倍量。)后用乙酸乙酯和正丁醇萃取，去溶剂后分别得乙酸乙酯萃取部分浸膏、正丁醇萃取部分浸膏及水层浸膏；其中，优选用乙酸乙酯和正丁醇分别萃取1-6次，更优选为2-4次，最优选为3次；去溶剂可以通过减压蒸馏等本领域常用的方式实现，本发明在此不进行限定。

3)将步骤2)中获得的各部分浸膏合并、干燥后即得决明子提取物。干燥可以采用本领域常用的方式，本发明在此不进行限定。

本发明第四方面提供了一种药物组合物，其包含前述的化合物或前述的决明子提取物，及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明第五方面提供了第一方面的化合物、第二方面的决明子提取物或第四方面的药物组合物在制备用于抑制转运体作用的药物中的用途。

在本发明第五方面的一种具体实施方式中，所述转运体为有机阴离子转运体和/或有机阳离子转运体。

在本发明第五方面的另一种具体实施方式中，所述有机阴离子转运体为OAT1和/或OAT3；所述有机阳离子转运体为OCT1和/或OCT2。

本发明第五方面的再一种具体实施方式中，其中所述的药物用于预防和/或治疗以下疾病中的至少一种：高尿酸血症、痛风、病毒感染、高血压、高血脂和肾脏汞中毒。

如本文使用的，术语“治疗”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对已经罹患本发明所述与抑制转运体功能相关的疾病的哺乳动物个体(优选为人)采用本发明的药物进行处理，以期对所述疾病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地，如本文使用的，术语“预防”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对可能罹患本发明所述与抑制转运体功能相关的疾病或者对本发明所述与抑制转运体功能相关的疾病具有罹患风险的哺乳动物个体采用本发明的药物进行处理，以期对所述疾病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。

如本文所用的，“药学上可接受的”表示当以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用，从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物，更特别地用于人，或者被登录在药典上。

本发明药物组合物中可用的“药学上可接受的载体或赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的载体，特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的载体包括药学领域常规的溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂、和抗氧化剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。

如本文使用的，术语“药物组合物”具有其一般含义。此外，本发明的“药物组合物”还可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本发明的药物组合物的原料的有效成分，任选地与一种或更多种药学可接受的载体混合，然后形成所需的剂型，来制备本发明的药物组合物。根据本发明的药物组合物，其为可以适用于口服给药、胃肠外给药或局部给药、外用给药的药物制剂。本发明的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。具体地说，根据本发明的药物组合物，所述的药物剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射液、注射用粉剂、透皮贴剂、软膏剂、凝胶剂、栓剂、口服溶液、口服混悬液、注射用乳剂、口服乳剂等、缓释片剂、控释片剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

用于口服施用的剂型可包括例如片剂、丸剂、硬或软胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、散剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、小丸剂、酏剂等，并不限于此。除了活性成分外，这些制剂还可包含稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐、钙盐和聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。必要时，其还可包含药用添加剂，例如崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等。片剂可根据常用的混合、造粒或包衣的方法制备。

用于肠道外施用的剂型可包括例如注射剂、药用滴剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、乳膏、喷雾剂、混悬剂、乳剂、栓剂、贴剂等，并不限于此。

根据本公开的药物组合物可口服或非肠道例如经直肠、经局部、经皮肤、经静脉内、经肌内、经腹膜内或经皮下施用。

如本文使用的，术语“约”其通常是指本领域允许的误差范围，例如±10％，例如±5％，例如±2％。

经研究表明，本发明所提供的化合物或含有它的决明子提取物或药物组合物能够抑制转运体的转运作用；基于此，可以预期本发明所提供的化合物或含有它的决明子提取物或药物组合物能够制备用于抑制转运体作用的药物；进一步地，所述的药物用于预防和/或治疗括以下疾病中的至少一种：高尿酸血症、痛风、病毒感染、高血压、高血脂和肾脏汞中毒。

又经研究表明，本发明从决明子中所得到的化合物具有不同程度的减肥降脂的作用，可以预期本发明所提供的化合物或含有它的决明子提取物或药物组合物可以用于治疗和/或预防与减肥降脂相关的疾病，进一步地，可以用于制备用于治疗和/或预防与减肥降脂相关的疾病的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A显示的决明子中各化合物(编号见表1)在100uM时对6-CF在HEK-OAT1(OAT1)和HEK-OAT3(OAT3)细胞中转运的影响；

图1B显示的决明子中各化合物(编号见表1)在100uM时对Asp⁺在HEK-OCT1(OCT1)和HEK-OCT2(OCT2)细胞中转运的影响；

图2显示的决明子中各化合物(编号见表1)对6-CF在HEK-OAT1(OAT1)和HEK-OAT3(OAT3)细胞中转运的浓度曲线，及对Asp⁺在HEK-OCT1(OCT1)和HEK-OCT2(OCT2)细胞中转运的浓度曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1决明子提取物的制备及各化合物的分离

取20kg决明子(产地：河北)，用120L 95％乙醇(由乙醇和水按体积比95：5配制)热回流提取，每次提取时间2小时，共提取3次。在50℃下减压蒸馏，浓缩至无醇，获得粗浸膏，质量约1.4kg。

将粗浸膏溶散于5L水中，用等量乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，分别得乙酸乙酯萃取部分浸膏550g(命名为COB-E)，正丁醇萃取部分浸膏150g(命名为COB-B)，水层浸膏600g(命名为COB-W)。

乙酸乙酯部分(COB-E)550g，以700g硅胶拌样，1.5kg硅胶装柱，进行硅胶柱层析，柱体积4L。用二氯甲烷-甲醇做洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱梯度(二氯甲烷与甲醇体积比)分别为1:0，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1，0:1。每个梯度收集三个柱体积。所得各馏分通过TLC分析检测，共5个馏分。

其中第1馏分命名为COB-E1，通过Flash中压ODS-C₁₈色谱柱层析(甲醇-水梯度洗脱,10:90→100:0)、制备液相色谱分离得到化合物1(75mg)和3(14mg)。第2馏分命名为COB-E2，通过Flash中压ODS-C₁₈色谱柱层析(甲醇-水梯度洗脱,10:90→100:0)、制备液相色谱分离得到化合物2(257mg)、化合物4(113mg)、化合物5(22mg)、化合物7(69mg)和化合物8(397mg)。第3馏分命名为COB-E3，Flash中压ODS-C₁₈色谱柱层析(甲醇-水梯度洗脱,10:90→100:0)、制备液相色谱分离得到化合物6(63mg)、化合物9(20mg)、化合物10(21mg)、化合物11(146mg)和化合物12(32mg)。第4馏分命名为COB-E4，经硅胶柱层析、Flash中压色谱柱层析(ODS-C₁₈)、制备液相色谱分离得到化合物13(50mg)。

实施例2：化合物1-13结构的确定

通过¹H、¹³C-NMR，确定化合物1-13结构；所确定的化合物1-13结构如表1所示。

NMR仪器的型号为：BRUKER AVANCEⅢ500超导核磁共振波谱仪(TMS为内标，瑞士Bruker公司)；

具体的：

化合物1的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2组氢：δ7.81(1H，t，J＝7.5Hz，H-6)，7.71(1H，d，J＝7.5Hz，H-5)，7.38(1H，d，J＝7.5Hz，H-7)和δ7.55(1H，br s，H-4)和7.22(1H，brs，H-2)。在高场区还可观测到1个特征的甲基峰信号：δ2.44(3H,s,3-CH₃)。¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)谱数据归属如下：δ161.4(C-1)，124.6(C-2)，149.4(C-3)，120.7(C-4)，119.5(C-5)，137.5(C-6)，124.3(C-7)，161.7(C-8)，191.7(C-9)，181.7(C-10)，133.1(C-11)，116.0(C-12)，113.9(C-13)，133.4(C-14)，21.8(3-CH₃)。

化合物2的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2组氢：δ7.40(1H，d，J＝1.0Hz，H-4)，和7.09(1H，br s，H-2)；δ7.05(1H，d，J＝2.0Hz，H-5)和6.54(1H，d，J＝2.0Hz，H-7)。在高场区还可观测到1个特征的甲基峰信号：δ2.38(3H,s,3-CH₃)。¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)谱数据归属如下：δ164.4(C-1)，107.8(C-2)，165.5(C-3)，108.8(C-4)，120.4(C-5)，148.1(C-6)，124.0(C-7)，161.3(C-8)，189.6(C-9)，181.2(C-10)，132.6(C-11)，113.2(C-12)，108.7(C-13)，134.9(C-14)，21.5(3-CH₃)。

化合物3的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2个单氢：δ7.78(1H，s，H-4)和7.29(1H，br s，H-2)；δ7.36(1H，d，J＝2.5Hz，H-5)和6.68(1H，d，J＝2.0Hz，H-7)。在高场区还可观测到1个特征的甲氧基峰信号：δ3.94(3H,s,6-OCH₃)和1个特征的甲基峰信号：δ2.45(3H,s,3-CH₃)。¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)谱数据归属如下：δ162.5(C-1)，124.5(C-2)，148.5(C-3)，121.3(C-4)，108.2(C-5)，166.5(C-6)，106.8(C-7)，165.2(C-8)，190.8(C-9)，182.0(C-10)，135.2(C-11)，110.3(C-12)，113.7(C-13)，133.2(C-14)，56.1(6-OCH₃)，22.2(3-CH₃)。

化合物4的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2组氢：δ7.79(1H，br s，H-4)和δ7.72(1H，t，J＝7.5Hz，H-6)，7.61(1H，d，J＝7.5Hz，H-5)，7.30(1H，d，J＝7.5Hz，H-7)。在高场区还可观测到1个特征的甲氧基峰信号：δ3.82(3H,s,1-OCH₃)和1个特征的甲基峰信号：δ2.30(3H,s,3-CH₃)。¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)谱数据归属如下：δ147.2(C-1)，155.6(C-2)，113.7(C-3)，125.9(C-4)，118.2(C-5)，136.4(C-6)，123.7(C-7)，161.4(C-8)，188.3(C-9)，180.8(C-10)，132.7(C-11)，116.7(C-12)，123.6(C-13)，124.9(C-14)，61.2(1-OCH₃)，16.5(3-CH₃)。

化合物5的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2组氢：δ7.71(1H，br s，H-4)和δ7.89(1H，t，J＝7.5Hz，H-5)，7.46(1H，d，J＝7.5Hz，H-6)。在高场区还可观测到3个特征的甲氧基峰信号：δ3.95(3H,s,7-OCH₃)，3.86(3H,s,8-OCH₃)，3.82(3H,s,1-OCH₃)和1个特征的甲基峰信号：δ2.28(3H,s,3-CH₃)。¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)谱数据归属如下：δ146.1(C-1)，154.9(C-2)，131.1(C-3)，124.7(C-4)，123.7(C-5)，116.4(C-6)，158.2(C-7)，147.8(C-8)，182.4(C-9)，180.6(C-10)，126.0(C-11)，128.5(C-12)，126.4(C-13)，124.5(C-14)，61.4(1-OCH₃)，60.8(8-OCH₃)，56.3(7-OCH₃)，16.4(3-CH₃)。

化合物6的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2组氢：δ7.75(1H，br s，H-4)，和7.16(1H，brs，H-5)。在高场区还可观测到2个特征的甲氧基峰信号：δ3.84(3H,s,7-OCH₃)，3.80(3H,s,1-OCH₃)，以及1个特征的甲基峰信号：δ2.28(3H,s,3-CH₃)。¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)谱数据归属如下：δ147.1(C-1)，155.4(C-2)，131.9(C-3)，125.8(C-4)，107.6(C-5)，156.5(C-6)，139.3(C-7)，156.9(C-8)，187.1(C-9)，180.3(C-10)，128.4(C-11)，111.0(C-12)，123.6(C-13)，124.8(C-14)，61.1(7-OCH₃)，59.9(1-OCH₃)，16.4(3-CH₃)。

化合物7的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2组氢：δ7.62(1H，br s，H-4)，和7.08(1H，brs，H-5)。在高场区还可观测到3个特征的甲氧基峰信号：δ3.98(3H,s,6-OCH₃)，3.83(3H,s,7-OCH₃)，3.81(3H,s,1-OCH₃)，以及1个特征的甲基峰信号：δ2.29(3H,s,3-CH₃)。¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)谱数据归属如下：δ147.2(C-1)，155.5(C-2)，132.3(C-3)，125.9(C-4)，102.8(C-5)，155.8(C-6)，140.6(C-7)，157.6(C-8)，187.5(C-9)，180.2(C-10)，128.4(C-11)，112.5(C-12)，123.5(C-13)，124.7(C-14)，61.2(7-OCH₃)，60.2(1-OCH₃)，56.2(6-OCH₃)，16.5(3-CH₃)。

化合物8的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2组氢：δ7.71(1H，br s，H-4)，和7.48(1H，brs，H-5)。在高场区还可观测到4个特征的甲氧基峰信号：δ3.98(3H,s,6-OCH₃)，3.88(3H,s,8-OCH₃)，3.86(3H,s,7-OCH₃)，3.81(3H,s,1-OCH₃)，以及1个特征的甲基峰信号：δ2.27(3H,s,3-CH₃)。¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)谱数据归属如下：δ147.5(C-1)，155.2(C-2)，130.7(C-3)，126.0(C-4)，105.3(C-5)，156.6(C-6)，146.2(C-7)，153.4(C-8)，181.1(C-9)，180.8(C-10)，129.7(C-11)，112.5(C-12)，124.1(C-13)，124.9(C-14)，61.5(7-OCH₃)，61.3(8-OCH₃)，60.8(1-OCH₃)，56.2(6-OCH₃)，16.4(3-CH₃)。

化合物9的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2组氢：δ7.78(1H，br s，H-4)和δ7.55(1H，t，J＝7.5Hz，H-5)，7.16(1H，d，J＝7.5Hz，H-6)。在高场区还可观测到1个特征的甲氧基峰信号：δ3.83(3H,s,7-OCH₃)和1个特征的甲基峰信号：δ2.30(3H,s,3-CH₃)。¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)谱数据归属如下：δ147.2(C-1)，154.9(C-2)，132.7(C-3)，125.6(C-4)，120.0(C-5)，120.2(C-6)，152.4(C-7)，150.6(C-8)，188.9(C-9)，179.8(C-10)，123.4(C-11)，117.0(C-12)，123.7(C-13)，125.5(C-14)，61.1(1-OCH₃)，16.6(3-CH₃)。

化合物10的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2组氢：δ7.81(1H，br s，H-4)，和7.44(1H，brs，H-5)。在中低场区可以观测到一组葡萄糖质子信号：δ5.16(1H，d，J＝7.5Hz，H-1')，3.33-3.70(6H，H-2'～6')，在高场区还可观测到2个特征的甲氧基峰信号：δ3.88(3H,s,7-OCH₃)，3.82(3H,s,1-OCH₃)，以及1个特征的甲基峰信号：δ2.31(3H,s,3-CH₃)。¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)谱数据归属如下：δ147.3(C-1)，155.6(C-2)，132.5(C-3)，126.0(C-4)，106.3(C-5)，155.6(C-6)，141.5(C-7)，156.3(C-8)，187.6(C-9)，180.2(C-10)，128.2(C-11)，113.1(C-12)，123.7(C-13)，124.9(C-14)，61.3(7-OCH₃)，60.4(1-OCH₃)，16.6(3-CH₃)，100.3(glc-1')，73.3(glc-2')，76.5(glc-3')，69.4(glc-4')，77.4(glc-5')，60.6(glc-6')。

化合物11的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2组氢：δ7.75(1H，t，J＝7.5Hz，H-6)，7.64(1H，d，J＝7.5Hz，H-5)，7.34(1H，d，J＝7.5Hz，H-7)和δ7.87(1H，br s，H-4)。在中低场区可以观测到一组葡萄糖质子信号：δ5.02(1H，d，J＝7.5Hz，H-1')，3.06-3.63(6H，H-2'～6')，在高场区还可观测到1个特征的甲氧基峰信号：δ3.89(3H,s,1-OCH₃)，以及1个特征的甲基峰信号：δ2.43(3H,s,3-CH₃)。¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)谱数据归属如下：δ153.2(C-1)，154.7(C-2)，132.5(C-3)，125.2(C-4)，118.4(C-5)，136.4(C-6)，141.5(C-7)，161.4(C-8)，188.0(C-9)，181.4(C-10)，129.7(C-11)，116.9(C-12)，124.1(C-13)，124.6(C-14)，60.9(1-OCH₃)，17.6(3-CH₃)，103.8(glc-1')，74.0(glc-2')，77.4(glc-3')，69.8(glc-4')，76.4(glc-5')，61.4(glc-6')。

化合物12的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2组氢：δ7.84(1H，br s，H-4)，和7.31(1H，brs，H-5)。在中低场区可以观测到一组葡萄糖质子信号：δ5.01(1H，d，J＝7.5Hz，H-1')，3.07-3.70(6H，H-2'～6')，在高场区还可观测到3个特征的甲氧基峰信号：δ3.99(3H,s,6-OCH₃)，3.88(3H,s,1-OCH₃)，3.84(3H,s,7-OCH₃)，以及1个特征的甲基峰信号：δ2.42(3H,s,3-CH₃)。¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)谱数据归属如下：δ153.2(C-1)，154.7(C-2)，141.1(C-3)，125.2(C-4)，102.9(C-5)，157.6(C-6)，140.9(C-7)，155.9(C-8)，187.2(C-9)，180.6(C-10)，128.2(C-11)，112.7(C-12)，124.5(C-13)，129.5(C-14)，61.4(7-OCH₃)，60.2(1-OCH₃)，56.3(6-OCH₃)，17.5(3-CH₃)，103.8(glc-1')，74.0(glc-2')，76.4(glc-3')，69.8(glc-4')，77.4(glc-5')，60.8(glc-6')。

化合物13的表征如下：

¹H-NMR(500MHz,DMSO-d₆)谱低场区有2组氢：δ7.75(1H，t，J＝7.5Hz，H-6)，7.64(1H，d，J＝7.5Hz，H-5)，7.34(1H，d，J＝7.5Hz，H-7)和δ7.87(1H，br s，H-4)。在中低场区可以观测到一组葡萄糖质子信号：δ5.01(1H，d，J＝7.5Hz，H-1')，3.06-4.19(6H，H-2'～6')，在高场区还可观测到1个特征的甲氧基峰信号：δ3.89(3H,s,1-OCH₃)，1个特征的甲基峰信号：δ2.39(3H,s,3-CH₃)，以及一个羰甲基信号δ1.88(3H,s,6'-COCH₃)。¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆)谱数据归属如下：δ153.2(C-1)，154.5(C-2)，132.5(C-3)，125.1(C-4)，118.4(C-5)，136.4(C-6)，141.5(C-7)，161.4(C-8)，187.9(C-9)，181.3(C-10)，129.8(C-11)，116.9(C-12)，124.1(C-13)，124.6(C-14)，61.4(1-OCH₃)，17.3(3-CH₃)，171.1(6'-COCH₃)，20.5(6'-COCH₃)，103.7(glc-1')，76.1(glc-2')，73.8(glc-3')，69.9(glc-4')，73.9(glc-5')，63.0(glc-6')。

表1化合物列表

实施例3化合物1-13对转运体功能抑制作用的筛选实验

试剂：DMEM为Cellgro公司生产；货号为R10-013-CV,规格为500ml/瓶；胎牛血清FBS为Gibco公司生产，货号为10099-141，规格为500ml/瓶；Penicillin streptomycinsolution(青霉素链霉素溶液)为索莱宝公司生产，货号为P1400，规格为100ml/瓶；PBS为索莱宝公司生产，货号为：P1210-500规格500ml；0.05％Trypsin-EDTA(胰蛋白酶-EDTA)为Gibco公司生产货号：1772640规格500ml；DMSO为索来宝公司生产,细胞培养级别，货号：D8371规格50ml/瓶；TritonX-100为索莱宝公司生产货号T8200规格100ml/瓶；BCA试剂盒为康为公司生产货号：CW0014S；Probenecid(丙磺舒)为SIGMA公司生产货号：P8761规格100mg；6-羰基荧光素(6-CF)为Aladdin公司生产货号：C105327规格100mg；4-(4-(dimethylamino)styryl)-N-methylpyridinium iodide(Asp⁺)为SIGMA公司生产货号：280135规格100mg；Quinine(奎宁)为泰坦公司生产货号：19808A规格1g；潮霉素B为索莱宝公司生产货号：H8080规格100ml；多聚赖氨酸为SIGMA公司生产货号：P1024规格50mg。

仪器:CO₂培养箱为Thermo公司生产；可调速可定时漩涡混合器(SI-T256)；电热式恒温水浴锅为天津欧诺仪器公司生产；移液枪为Eppendorf公司生产；尼康ECLIPSE Ti-U倒置生物显微镜；1.6R台式多用离心机为Thermo公司生产；制水机为美国密理博Milli-QCentury超纯水系统；4℃海尔冰箱；-20℃海尔冰箱。

化合物1-13样品配制：用称取的样品质量m除以该样品的相对分子质量M，得到该样品的物质的量n，然后加入10*n体积的DMSO，得到10^-1mol/L的初始浓度。-20℃避光保存。

采用细胞摄取实验筛选能够抑制OAT1/3，OCT1/2转运体功能的化合物。有机阴离子转运蛋白(organ anion transport protein,OAT)OAT1与OAT3主要表达于近端肾小管上皮细胞基底侧膜，功能为介导有机阴离子转运进入细胞，从而参与药物在肾脏的分泌代谢、重吸收等。OCT1与OCT2为有机阳离子转运蛋白(organ cation transport protein,OCT)，OCT1主要表达于肝脏基底侧膜，介导其底物进入肝细胞，OCT2主要表达于近端肾小管上皮细胞基底侧膜，介导有机阳离子转运进入细胞。这四种转运体均被FDA《药物相互作用研究技术指导原则》列为创新药物研究与申报过程中药代动力学研究实验的必备研究项目。

实验方法：

1、细胞及其培养

HEK-OAT1、HEK-OAT3、HEK-OCT1和HEK-OCT2过表达细胞由本实验室构建并传代培养。这四株细胞在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中，用10％胎牛血清/DMEM，1％青霉素/链霉素，50μg/ml潮霉素B的培养液培养。

HEK-OAT1、HEK-OAT3、HEK-OCT1和HEK-OCT2过表达细胞是指分别转染了包含OAT1、OAT3、OCT1或OCT2基因的表达质粒的HEK细胞，可以采用本领域常规技术手段制备，本文不再详细描述。

2、细胞摄取实验步骤

在37℃，5％CO₂的条件下，在细胞培养箱中使用含有10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素及50μg/ml潮霉素B的DMEM培养液分别培养HEK-OAT1、HEK-OAT3、HEK-OCT1和HEK-OCT2过表达细胞。当细胞密度为80％左右时，将细胞按5*10⁴/孔的密度铺于事先用0.05mg/ml多聚赖氨酸处理的96孔细胞培养板中，培养24小时至细胞贴壁完全后进行细胞摄取实验。用摄取缓冲液(OAT1和OAT3：135mM NaCl,5mM KCl,2.5mM CaCl₂,1.2mM MgCl₂,0.8mM MgSO₄,28mM葡萄糖,13mM Hepes；OCT1和OCT2:138mM NaCl,5.33mM KCl,1.26mM CaCl₂,0.49mMMgCl₂,0.41mM MgSO₄，0.44mM KH₂PO₄，4.17mM NaHCO₃,0.34mM Na₂HPO₄,5.56mM葡萄糖)于37℃平衡培养10分钟，而后于37℃条件下进行细胞摄取实验，摄取时间为5分钟。在96孔板中，实验孔每孔用摄取缓冲液稀释配制100μl浓度为100μM的药物(本发明的各化合物)和转运体底物(OAT1和OAT3：5μM 6-羰基荧光素；OCT1和OCT2 5μM Asp⁺)的混合物；阳性对照孔为100μl转运体底物与阳性对照药(OAT1和OAT：50μM丙磺舒；OCT1和OCT2：50μM奎宁)的混合物，空白对照孔为100μl转运体底物。实验设三个复孔。摄取实验结束时，用预冷的摄取缓冲液终止实验，每孔150μl，而后用摄取缓冲液洗细胞3遍。每孔加入1％TritonX-100的细胞裂解液裂解细胞半小时后，于酶标仪读取荧光值，OAT1和OAT3的吸收发射波长分别为485和528，OCT1和OCT2为485和530。实验结果用Graphpad软件作图，ANOVA处理数据，结果如图1A和图1B所示。从图1A和图1B中可以看出，从决明子中分离出的化合物1-13，除化合物3、化合物7、化合物10、化合物12外，其它化合物均有不同程度的转运体抑制作用，证实了这些化合物具有抑制转运体功能作用。

通过对抑制剂浓度和底物进入细胞的速度作图，得到对各种转运体有抑制功能的化合物的IC₅₀，如图2所示；从图2可以看出，化合物1,2,4,5,6,8,9,13在100μM时均对OAT1和OAT3的功能产生了较强的抑制作用，抑制率达到了50％以上，此外化合物11对OAT3有较强的抑制作用，而对OAT1的抑制作用较弱。化合物9在100μM时对OCT1的抑制作用超过了50％，化合物2和5在100μM时对OCT2的功能产生了较强的抑制作用。可见，决明子中存在对OAT1、OAT3、OCT1和/或OCT2抑制作用较强的蒽醌类化合物。

在众多的现有技术中已报道，转运体OAT1和OAT3在肾脏中的表达相比其他器官比较高，它们对于尿酸的肾脏排出起着关键作用(Capasso et al.,2005；So and Thorens,2010)。实际上，目前用来治疗高尿酸血症和痛风的药物丙磺舒就是OAT1和OAT3的抑制剂。OAT3的敲除小鼠血压比野生型小鼠低15％,抑制OAT3有降血压的作用(Vallon et al.,2008)。此外，OAT3的抑制可以预防流行感冒病毒(Perwitasari et al.,2013)。因此，可以预期这些化合物(对OAT1和OAT3有抑制作用的化合物)对于痛风、高尿酸血症、高血压、以及感冒病毒感染有预防和/或治疗作用。OCT1主要表达于肝脏中，OCT 1的敲除小鼠可以保护高脂饮食导致的脂肪肝的形成，而在肝脏中过表达OCT 1导致肝脏肥大，因此OCT1可以作为治疗非酒精性脂肪肝的药物靶点(Chen et al.,2014)。因此，本发明中对OCT1有抑制作用的化合物可作为治疗脂肪肝的潜在药物。OCT2主要表达与肾脏中，对有机阳离子的肾脏中的转运有着非常重要的作用。因此，本专利中对OCT1有抑制的化合物对于药物的代谢有着重要的作用。

参考文献

1、Capasso,G.,Jaeger,P.,Robertson,W.G.,Unwin,R.J.,2005.Uric acid andthe kidney:urate transport,stone disease and progressive renalfailure.Current pharmaceutical design 11,4153-4159.

2、So,A.,Thorens,B.,2010.Uric acid transport and disease.The Journalof clinical investigation 120,1791-1799.

3、Vallon,V.,Eraly,S.A.,Wikoff,W.R.,Rieg,T.,Kaler,G.,Truong,D.M.,Ahn,S.Y.,Mahapatra,N.R.,Mahata,S.K.,Gangoiti,J.A.,Wu,W.,Barshop,B.A.,Siuzdak,G.,Nigam,S.K.,2008.Organic anion transporter 3contributes to the regulation ofblood pressure.Journal of the American Society of Nephrology 19,1732-1740.

4、Perwitasari,O.,Yan,X.Z.,Johnson,S.,White,C.,Brooks,P.,Tompkins,S.M.,Tripp,R.A.,2013.Targeting Organic Anion Transporter 3with Probenecid asa Novel Anti-Influenza A Virus Strategy.Antimicrobial agents and chemotherapy57,475-483.

5、Chen,L.G.,Shu,Y.,Liang,X.M.,Chen,E.C.,Yee,S.W.,Zur,A.A.,Li,S.L.,Xu,L.,Keshari,K.R.,Lin,M.J.,Chien,H.C.,Zhang,Y.C.,Morrissey,K.M.,Liu,J.,Ostrem,J.,Younger,N.S.,Kurhanewicz,J.,Shokat,K.M.,Ashrafi,K.,Giacomini,K.M.,2014.OCT1is a high-capacity thiamine transporter that regulates hepaticsteatosis and is a target of metformin.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 111,9983-9988.

以上对本发明所提供的一种化合物、包含其的决明子提取物及其用途进行了详细介绍。本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。

Claims (2)

1.含有1,7,8-三甲氧基-2-羟基-3-甲基-蒽醌、大黄素和1,2,7-三羟基-8-甲氧基-6-甲基-蒽醌中的至少一种的决明子提取物在制备用于抑制有机阳离子转运体作用的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，所述有机阳离子转运体为OCT1和/或OCT2。

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