KR100421625B1

KR100421625B1 - 개오동나무의 표피로부터 분리한 카탈포사이드를유효성분으로서 함유하는 항염증제 조성물

Info

Publication number: KR100421625B1
Application number: KR10-2001-0077053A
Authority: KR
Inventors: 배현옥; 장선일; 오현철; 권태오; 정헌택
Original assignee: 정헌택
Priority date: 2001-12-06
Filing date: 2001-12-06
Publication date: 2004-03-11
Also published as: KR20030046796A; AU2002304195A1; WO2003047599A1

Abstract

본 발명은 개오동나무(학명:Catalpa ovata)의 표피로부터 분리한 이리도이드 글리코시드(iridoid glycoside) 계열의 화합물인 카탈포사이드(catalposide)를 유효 성분으로 함유하는 항염증제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 염증반응을 매개하는 물질로서 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxygen synthase; iNOS), NF-κB, TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 억제하여 항염증반응을 나타내는 항염증제 조성물에 관한 것이다.

Description

개오동나무의 표피로부터 분리한 카탈포사이드를 유효성분으로서 함유하는 항염증제 조성물{A antiinflammatory compoisition containing catalposide isolated from stem bark of Catalpa ovata}

본 발명은 개오동나무(학명:Catalpa ovata)의 표피로부터 분리한 이리도이드 글리코시드(iridoid glycoside) 계열의 화합물인 카탈포사이드(catalposide)를 유효성분으로 함유하는 항염증제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 염증반응을 매개하는 물질로서 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxygen synthase; iNOS), NF-κB, TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 억제하여 항염증반응을 나타내는 항염증제 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 매우 복잡한 생화학적 반응에 의해 일어나며, 프로스타글란딘(prostaglandins), 루코트린(leukotrienes) 및 혈소판 활성화 인자(platelet activating factor) 등의 다양한 매개물질이 염증반응에 관여하여, 염증성 질병을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 종래에는 상기 염증반응의 다양한 매개인자의 생성량을 억제하거나 활성을 줄일 수 있는 물질을 스크리닝함으로써 항염증제를 찾아내었다. 이에, 항염증제 시험약제의 평가를 위한 생체 및 시험관 모델이 잘 정립되어 있다.

또한, 당업계에서는, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)으로 알려진 대식세포 유래의 매개물질이 염증반응 및 면역반응의 중심역할을 하는 것으로 알려졌다. 특히, 상기 프로-염증성 사이토카인들은 관절 부위의 체액에서 다량 발견되기 때문에, 과도한 염증반응에 의해 유발되는 류마티스 관절염 증상의 발현에 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각된다.

즉, 류마티스 관절염은, 관절주위의 림프구에 면역유도 및 Th 세포(CD4⁺T 세포)가 과다하게 침입하여, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 여러 가지 프로-염증성 사이토카인 및 인터페론을 과다하게 분비함으로써, 과다한 면역반응이 유도되어 뼈와 연골이 파괴되는 자기면역질환으로 알려져 있다. 예를 들면, 당업계에는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인이 관절 주위에 높은 수준으로 발견되면 류마티스 관절질환으로 판정될 수 있다고 보고되어 있으며, 최근에는 류마티스 관절염이 유도된 실험동물에 항-TNF-α을 전처리하면 관절염이 발달되지 않는다는 보고도 있다. 또한, 토끼를 대상으로 관절에 IL-1β를 주입하면 연골의 파괴가 가속되는 반면, IL-1β에 대한 항체를 주입하면 콜라겐으로 유도되는 관절염은 개선되고 연골의 파괴를 감소시키는 것으로 알려졌다. 또한, IL-6에 대한 수용체에 대한 항체는 콜라겐-유도 관절염 마우스에 치료 효과가 현저하다는 사실도 알려졌다. 이러한 결과를 살펴보면, 프로-염증성 사이토카인의 생성 및 활성을 억제하는 물질의 스크리닝은, 새로운 항염증제 및 항류마티스제의 탐색 및 그의 효능 평가에 중요하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

한편, 염증반응은 상기 프로-염증성 프로-염증성 사이토카인 이외에도, 전사인자로서 알려진 NF-κB에 의해 매개된다. NF-κB는 류마티스 관절염, 천식의 발병에 관련된 많은 종류의 세포 내에 편재해 있는 전사 인자(transcription factor)로서 알려져 있다. 정상적인 세포상태 하에서, NF-κB는 p50, p65 및 IκBα등의 서브유닛으로 구성된 복합체 단백질로서 세포질 내에 존재한다. 그러나, 외부환경의 변화에 의해 NF-κB가 활성화되면, IκBα는 인산화되어 붕괴되고, 이로 인해 p50과 p65의 헤테로이합체(heterodimers)가 형성되어 핵으로 전이된다. 상기와 같은 과정에 의해서, NF-κB가 핵으로 전이되면, 이에 의해 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들 및 염증반응 매개인자 등을 코딩하는 다양한 유전자의 발현이 유도되며, 이러한 염증반응 매개인자들은 염증반응세포를 활성화시키거나, 직접적으로 염증반응에 관여하여 염증반응을 일으키게된다.

따라서, NF-κB의 활성을 억제하는 물질 또한 새로운 항염증제로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 당업계에는 NF-κB의 경로 선택적인 저해제의 투여는 만성 염증의 동물모델에서 IL-1β와 TNF-α의 생산을 정지시키며, 아스피린과 인도메타신(indomethacin) 등의 비스테로이드계 소염제들은 NF-κB의 핵으로의 전이를 저해한다는 것이 밝혀졌다(Hackstein H., et al., J Immunol 2001 Jun 15;166(12):7053-62; Weber C. et al., Circulation 1995 Apr 1;91(7):1914-7)

한편, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 내독성 물질을 포함한 여러 가지 염증유발 물질은 상기 NF-κB의 활성화를 유도하여 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있다.

또한, 상기의 염증반응에 관련된 매개인자 외에, 일산화질소(Nitric oxide, NO)도 염증반응에 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 일산화질소 합성효소(NO synthase), 특히 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase,iNOS)에 의해 합성된 NO 등의 반응성 물질들은 많은 염증에 관련된 병리학적 증상의 발전에 관여한다. 즉, iNOS는 LPS의 자극에서 의해서 과다발현되며, 이에 의해서 자가면역질환(autoimmune disease)이 유발된다고 보고되었다(Jang, D. and Murrell, G. A. C., Nitric oxide in arthritis, Free Radical Biology Medicine, 1998, 24: 1511-1519; Miyasaka, N. and Hirata, Y., Nitric oxide and inflammatory arthritides, 1997, 61: 2073-2081; Lafaille, J. J., The role of helper T cell subsets in autoimmune disease, 1998, 9: 139-151). 또한, 상기의 프로-염증성 사이토카인 등의 다른 자극에 의해서 iNOS의 과다발현이 유도되는 경우에는, 일부 염증질환 및 자가면역질환이 유발된다고 알려져 있다.

이상을 정리하면, 염증반응을 일으킬 수 있는 세포에 외부자극이 가해지는 경우, 세포 내에서 NF-κB가 활성화되고, 이에 의해 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들의 발현이 유도되고, 생성된 프로-염증성 사이토카인들은 iNOS를 코딩하는 유전자의 발현을 자극시켜, 염증반응에 관여하는 일산화질소의 반응성 물질을 생성하여 염증반응을 일으킨다. 이러한 기작 이외에도, NF-κB는 iNOS 유전자의 발현을 직접적으로 활성화시킬 수 있고, 이외 다른 염증에 관련된 유전자를 발현할 수 있으며, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들도 염증반응에 관련하는 다른 생물학적 반응들도 활성화시킨다. 따라서, NF-κB의 염증반응 관련 전사인자, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들, 및 iNOS의 유전자는, 폐혈증, 류마티스 관절염 등의 과다한 염증반응에 의해서 발생하는 질병들을 치료하기 위한 새로운 항염증제의 스크리닝에 있어서 표적으로이용될 수 있다고 당업계에 인식되어 왔다.

이에 본 발명자들 또한 새로운 항염증제를 탐색하는데 있어, 표적이 되는 NF-κB의 염증반응 관련 전사인자, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들, 및 iNOS 유전자를 억제할 수 있는 물질을 찾기 위해 많은 연구를 수행한 결과, 개오동나무의 표피로부터 분리한 이리도이드 글리코시드(iridoid glycoside) 계열의 화합물인 카탈포사이드(catalposide)가 NF-κB의 활성을 억제하고, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들의 유전자 발현 및 생성량을 억제하며, iNOS의 유전자의 발현을 억제하여, 상기 카탈포사이드를 유효성분으로 함유하는 조성물이 항염증제 조성물로서 이용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 항염증제 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 카탈포사이드(1a) 및 그의 활성을 갖는 C-6 치환기(1b)와, 이리도이드 계열 화합물인 스페시오사이드(1c) 및 피클로사이드(1d)의 화합구조를 나타낸 도면이다.

도 2는 LPS의 자극에 의해 유도된 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 프로-염증성 사이토카인의 생산에 대한 카탈포사이드의 억제효과를 보여주는 도면이다.

도 3은 LPS의 자극에 의해 유도된 TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 코딩하는 유전자의 mRNA로의 발현증가에 대한 카탈포사이드의 억제효과를 보여주는 도면이다.

도 4는 NF-κB의 서브유닛 단백질인 p65에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과로, 카탈포사이드는 p65가 세포질(CE)에서 핵(NE)으로 전이(translocation)되는 것을 억제함을 보여주는 도면이다.

도 5는 LPS의 자극에 의해 유도된 NO 생성량 증가 및 iNOS(inducible NO synthase) 유전자 발현이 카탈포사이드에 의해 억제됨을 보여주는 도면이다.

도 6은 LPS에 의해서 유도된 NF-κB의 활성이 카탈포사이드에서 억제됨을 EMSA법(electrophoretic mobility shift assay)을 사용하여 보여준 도면이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 조성물은 류마티스질환 등의 과다 염증반응에 의하여 발생하는 질환의 치료에 이용될 수 있는 물질로서 카탈포사이드(catalposide)를 유효성분으로써 함유함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 목적은, 카탈포사이드가 1) 항염증반응과 관련된 프로-염증성 사이토카인의 생산량 및 그의 유전자 발현을 대식세포에서 억제할 수 있고; 2) NF-κB가 활성화되어 핵내로 전이되는 것을 억제하여 염증반응과 관련된 유전자 전사(gene transcription)가 활성화되는 것을 막을 수 있으며; 및, 3) iNOS 유전자 발현을 억제하여 대식세포에서 생성되는 일산화탄소의 양을 줄일 수 있음을 발견하고, 카탈포사이드를 유효성분으로 함유하는 항염증제 조성물을 제공하는 것이다.

개오동 나무(Catalpa ovata G.Don)는 장식용 나무로서 재배되어왔다. 또한, 이 식물의 표피에는 이리도이드(iridoid)계의 이차 대사성 물질을 주로 함유하고 있으며, 그 예로, 카탈포사이드(catalposide)가 0.1% 내외로 함유되어 있고, 이외에 카타폴 데스히드록시벤조일 카탈포사이드(catapol deshydroxybenzoyl cataposide), 카탈파락톤(catalpalactone), 파라-히드로옥시 벤조산(para-hydrooxy benzoic acid) 및 KNO₃(25%)를 함유하고 있다. 한방 의약에서는, 이러한 성분을 함유한 개오동 나무의 과실, 과피 및 표피 등을 이뇨제, 병리 신장염 및 병리 부종의 치료에 사용하였다.

한편, 이리도이드계(iridoids) 화합물은 이리도이드 글리코시드계(glycoside), 비-그리코사이딕 이리도이드계(non-glycosidic iridoids), 세코이리도이드계(secoiridoids) 및 비스이리노이드계(bisridoids) 화합물 등으로 4가지 그룹으로 구분되는 사이클로펜타노이드 모노터펜(cyclopentanoid monoterpene) 유도체다.

이리도이드계 화합물 중 대부분의 화합물은 이리도이드 글리코시드계 화합물이다. 이리도이드 글리코시드계 화합물은 많은 종류의 식물에 존재하며, 쓴맛을 내고 다양한 생물학적 활성을 가지는 생리활성 물질이다. 즉, 치료효과를 갖는 중국의 천연식물들은 대부분 이리도이드계 화합물에 의해 효능이 나타남이 밝혀졌다. 사실, 이리도이드계 화합물을 생산하는 식물은 항염증제로 이용되기도 하였다.

개오동나무(Catalpa ovata G. Don. (Bignoniaceae)는 이리도이드을 생산하는 식물의 일종으로 알려져 있고, 항염증 효과를 갖고 있다고 밝혀졌으며, 한국에서는 이러한 효과를 전통적으로 류마티스 관절염 치료에 사용하였다. 그러나, 개오동나무에 함유된 이리도이계 성분들은 그 종류가 수없이 많고, 이들 성분 중에서 어떠한 성분이 정확하게 항염증 효과 및 류마티스 관절염에 효과를 갖는지는 아직 정확하게 알려지지 않았다.

본 발명에서는, 이러한 개오동나무가 함유하고 있는 이리도이드 글리코시드계 화합물 중에서, 특히 카탈포사이드가 항염증 효과를 나타냄을 밝혀내었다. 또한, 카탈포사이드가 염증반응에 관련된 대식세포에서 어떠한 작용기작을 갖는지를 명확하게 밝혀내었다. 따라서, 본원 발명에서 분리해낸 카탈포사이드는 류마티스 질환 등의 자가면역질환(autoimmune disease)에 대한 염증치료에 있어서, 보다 구체적인 처방전략을 수립하여 과다 염증반응에 의한 질병을 갖고 있는 환자의 치료에 보다 유리하게 이용될 수 있다.

한편, 카탈포사이드 성분은 당업계에 통상적으로 알려진 방법에 의해서, 개오동나무 또는 카탈포사이드를 함유하고 있는 것으로 당업계에 주지된 식물로부터 추출한 후, 분리하여 사용될 수도 있으며, 당업계에 주지된 방법에 의해서 화학적, 생화학적으로 합성하여 제조할 수 있다. 카탈포사이드의 추출방법의 예로는 메탄올을 이용한 방법이 있으며, 하기의 실시예에서 보다 구체적으로 설명되어 있다.

한편, 본 발명에 따르면, 과다한 염증반응에 의하여 일어날 수 있는 질환들은 당업계에 통상적으로 주지되어 있으며, 그러한 질환치료에 본 발명에 따른 조성물을 투여하여 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 질병, 즉 과다한 염증반응에 의해 일어날 수 있는 질환의 예로는, 류마티스 관절염, 다발성경화증(multiple sclerosis), 전신성 홍반성 낭창증(systemic lupus erythematosus, SLE), 건선(psoriasis), 염증성 대장질환(inflammatory bowel disease), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis) 등의 자가면역질환 및 패혈증(septic shock)을 포함하지만, 이에 의해 본원 발명이 한정되지는 않고, 당업계에 통상적으로 주지된 염증반응 관련 질환들도 본원 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에 의하면, 개오동나무 줄기의 표피(껍질)로부터 분리된 카탈포사이드는 RAW264.7 대식세포주에서 생산되는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 사이토카인을 농도 의존적으로 현저히 억제시킬 수 있으며, 이러한 감소는 카탈포사이드에 의한 TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 코딩하는 유전자의 발현억제에 기인한다. 또한, 카탈포사이드는 NF-κB의 서브유닛인 p65의 핵으로의 전이(translocation)를 현저히 억제시킬 수 있다. 따라서, 카탈포사이드는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 과도한 생산을 차단하기 위해서, TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 코딩하는 유전자 등의 발현을 억제하며, NF-κB의 활성에 의한 염증반응 관련 유전자의 전사를 억제할 수 있다. 그러므로, 카탈포사이드는 항염증제 및 류마티스 관절염 치료제로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명은, 카타폴사이드와 구조적으로 유사성을 갖는 두가지 이리도이드 글리코시드계 성분들을 분리하고, 이에 대해서 카탈포사이드와 동일한 실험을 수행한 결과, LPS 자극에 하여 증가된 일산화질소의 생성, iNOS 유전자 발현 및 NF-κB의 활성화를 전혀 억제하지 못함을 보여주었다. 이러한 결과는, 카타폴사이드의 C-6 치환부위가 항염증 활성을 갖는 부위임을 간접적으로 증명해준다.

본 발명의 항염증제 조성물에서 유효성분인 카탈포사이드의 유효량은 투여방법, 제제형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어질 수 있으며, 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 카탈포사이드를 0.001∼500㎎/㎏체중의 1회 투여분량으로 투여되도록 제형화 될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기범위를 벗어난 양일 수도 있다.

카탈포사이드를 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약, 캅셀 형태나 드링크제, 의약품 등의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여경로를 과다염증반응에 의해서 발생하는 질환의 치료를 위해 투여될 수 있으며, 투여제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해서 더욱 상세하게 설명하지만, 이에 의해서 본 발명이 한정되는 것은 아니다. 하기에서 모든 실험은 최소한 3번 이상 반복하였으며, 유의성 검증은 스튜던트 t-검사법(Student's t-test; Microcl Origin version 5.0 software, Microcal Software, USA)에 의해 실시하였고, 유의성의 한계는 p<0.05로 하였다.

실시예

[참고 실시예 1] 카탈포사이드의 분리

본 실험에서 사용된 개오동나무(Catalpa ovataG. Don(Bignoniaceae))는 2000년 7월에 대한민국 전라북도 익산시에서 수집하였다. 표본의 증명은 원광대학교 의약자원 연구센터의 식물 표본실에 보관되었으며, 증명번호는 KTO 51이다.

Naggar SF, et al., J. Nat. Prod. 1980, 43, 524-526에 기재된 방법에 따라, 개오동나무(Catalpa ovataG. Don., Bignoniaceae) (No. NOSEA-4-5-4) 줄기의 표피로부터 95%이상의 순도로 카탈포사이드를 분리했다.

즉, 개오동나무의 건조된 줄기 500 g을 분쇄하여 24시간동안 5 ℓ의 MeOH를 이용하여 추출하였다. 메탄올 추출액을 통상적인 방법으로 농축한 후, 물에 현탁하고,n-헥산, EtOAc 및 BuOH를 가지고 연속적으로 분리하였다.

제조된 건조중량 12.6g의 EtOAc-수용성 부분은 100㎍/㎖의 농도에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 NO 생산에 잠재적인 저해 효과를 보여주었고, 따라서, 상기 EtOAc-수용성 부분에 대하여 실리카 겔(silica gel; Mearch Kieselgel 60; 0.063-0.2㎜의 입자크기) 컬럼 크로마토그래피(컬럼: 2.5㎝ 직경, 40㎝ 높이)를 수행하였다.

CH₂Cl₂에 용해된 MeOH 용액을 이용하여 10% 용액 600㎖, 20% 용액 300㎖, 30% 용액 150㎖ 및 100% MeOH 300㎖의 농도구배를 통해서, 컬럼에 부착된 성분들을용리하였고, MeOH의 300㎖에서 총 8개의 분획(각 분획 당 150㎖)을 얻어내었다. 450과 600㎖ 사이에서 분리된 분획 4(5.3g)는 활성을 가지고 있었으며, 이를 세파덱스 LH-20(Sephadex LH-20) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 더 정제하였다(3㎝ 직경, 50㎝ 높이; 150㎖의 MeOH-H₂O(4:1), 150㎖의 MeOH의 농도구배; 각 분획당 50㎖의 부피). 200-250㎖ 사이에서 분리된 분획(1.15g)의 활성이 활성화 분획으로 검출되었고, 이에 대해서 준-예비적인 역상 HPLC(semi-preparative reversed-phase HPLC)를 수행하여(40분에 걸쳐서 H₂O에 용해된 CH₃CN의 30-40% 농도구배로부터 용출), 카탈포사이드[t_r24.7 min:7.8 mg: calculated 0.022% w/w: [α]²³ _D: -116.8。(c 0.13, MeOH)], 스페시오사이드[t_r27.3 min; 16.3 mg; calculated 0.047% w/w; [α]²³ _D: -155.6。(c 0.27, MeOH)] 및 피크로사이드[t_r29.0 min; 19.0 mg; calculated 0.055% w/w; [α]²³ _D: -115.6。(c 0.32, MeOH)]를 얻어내었다.

이들 화합물들에 대하여, [α]_D, MS,¹H NMR과¹³C NMR 스펙트럼 분석 결과를 상기 Naggar 등의 문헌에 기재된 스펙트럼 데이터와 비교한 결과, 카탈포사이드 임을 확인하였다. 카탈포사이드의 구조식은 도 1에서 보여지는 바와 같다.

[참고 실시예 2] 시약

리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS), RPMI-1640 배지 및 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디프-에닐테트라졸리움(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diph-enyltetrazoleum, MTT)은 시그마사(Sigma Chemical Company)로부터 구입하였다.

우태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS), 올리고(dT) 18 프라이머, 모로니 류케미아 바이러스(Moloney leukemia virus, M-MLV) 역전사 효소, dNTP 용액, RNA 억제제 및 항생제는 깁코/RBL사(Gibco/RBL)로부터 구입했다.

또한, 암플리택티멤(AmpliTag^TM) DNA 폴리머라아제(polymerase)는 타카라 테크놀러지(Takara Technologies)로부터 구입했다. PCR용 올리고뉴클레이타이드 프라이머들은 바이오니어사(Bioneer Co., Korea)로부터 구입했다.

모든 시약류와 조직배양에 사용된 배양액은 측색계 LAL 검사(colorimetric Limulus amoebocyte lysate assay)(측정한도, 10 pg/㎖; Whittaker Bioproducts)를 수행하여 내독소 함량을 측정하였다. 그 결과, 이들 시약 및 배양액은 내독소를 전혀 함유하지 않았다. 조직배양 플레이트와 직경 100mm 페트리접시는 넌크사(Nunc, Inc., USA))로부터 구입하여 사용했다.

[참고 실시예 3] RAW264.7 대식세포주 및 그의 배양

설치류 대식 세포주(the murine macrophage cell line, RAW264.7)는 미국의 ATCC사로부터 구입했다(American Tissue Culture Collection, ATCC).

상기 대식세포주는, 항생제 및 항균제로서 100 U/㎖의 페니실린 G 및 100 U/㎖의 스트렙타마이신(streptomycin) 및 10% 열처리 우태아혈청(heat inactivatedFBS)을 첨가한 완전한 RPMI 1640 배지에서 5% CO₂의 습한 대기, 37℃의 조건으로 배양하였다.

[참고 실시예 4] 세포 생존율

세포의 생존율은 다음과 같은 방법에 의해서 측정하였다. 즉, 상기 참고실시예 3에서 배양한 세포 현탁액(1x10⁶세포수/㎖)에 50㎍/㎖의 MTT을 첨가하고, 4시간 동안 반응시켰다. 그리하여 형성된 포르마잔(formazan)은 산성 2-프로판올(시그마사, 미국)로 용해한 후, 590㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시험약물을 처리하지 않은 대조군 세포에서의 흡광도을 100%로 하여, 시험약물이 처리된 실험군의 흡광도를 통한 상대적 세포 생존율을 계산하였다.

[실시예 1] 사이토카인 생산의 측정

대식세포 매개 프로-염증성 사이토카인로서 TNF-α IL-1β 및 IL-6 등의 생합성 또는 그들의 작용기작을 교란시킬 수 있는 물질은 염증반응 및 류마티스 관절염의 치료효과를 갖는다는 것이 당업계에 인식되어 있다. 따라서, 상기 프로-염증성 사이토카인은 류마티스제 등의 항염증제에 대한 약리학적인 효능 평가에 이용될 수 있다. 본 실시예에서도, 카탈포사이드가 활성화된 RAW264.7 대식세포주에서 생산하는 프로-염증성 사이토카인(TNF-α IL-1β 및 IL-6)을 억제시킬 수 있는지에 대하여 확인하였다.

우선, 그람-음성 박테리아 내독소인 LPS는 대식세포에서 TNF-α IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인의 생산을 유도하는 인자로서 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 실시예에서는 1㎍/㎖의 LPS를 처리하여 대식세포주에서 프로-염증성 사이토카인의 생성을 유도하였다. 이에 대한 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.

사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생산은 면역검사를 수행하여 측정하였다. 1 x 10⁶/㎖의 RAW264.7 세포를 10, 50 또는 100ng/㎖의 카탈포사이드로 1시간 동안 전처리한 후, TNF-α와 IL-6에 대해서는 1㎍/㎖의 LPS로 6시간 처리하였으며, IL-1β에 대해서는 1㎍/㎖의 LPS로 12시간 처리하였다. 그런 다음, 배양액을 원심분리하여 세포들을 침전시킨 후, 상층액을 수집하고, 상층액 내 TNF-α, IL-1β과 IL-6의 양을 퀀티카인사(QuantikineTM, USA) 및 R D 시스템사(R D Systems, USA)로부터 구입한 키트 및 키트의 사용자 매뉴얼에 기재된 방법대로 각 사이토카인의 양을 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었으며, 결과값은 3번씩 3회 반복하여 실험함으로써 평균±표준편차로 표현했다.

그 결과로, 도 2에서 보는 바와 같이, 카탈포사이드로 RAW264.7 대식세포를 전처리한 후, LPS로 프로-염증성 사이토카인의 생산을 유도하면, 농도 의존적으로 생산량이 현저하게 감소함을 알 수 있었으며, 이러한 효과는 카탈포사이트의 세포독성에 의해서 발생하는 것이 아님을 확인할 수 있었다.

[실시예 2] RNA 추출

기브코/BRL사 (GIBCO/BRL, USA)로부터 구입한 트리졸(TRIZOLTM) 시약을 이용하여, 제조자 지침서에 따라, LPS 및 카탈포사이드를 처리한 세포, 양성 대조군으로 LPS만을 단독으로 처리된 세포 및 음성 대조군으로 카탈포사이드가 처리되지 않은 세포(각각 1 x 10⁷세포수/㎖)로부터 RNA를 추출하였다. 이후의 실험을 진행하기 전에 추출된 RNA는, 전기영동을 이용하여 그 순도 확인 및 정량을 수행하였다.

[실시예 3] RT-PCR

상기 실시예 1에서 보여준 바와 같이, 카탈포사이드 그 자체는 세포독성 없이 대식세포가 생산하는 프로-염증성 사이토카인을 억제시켰다. 이러한 카탈포사이드의 작용이 TNF-α IL-1β 및 IL-6를 코딩하는 유전자들의 전사를 억제하는지를 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하여 확인하였다.

우선, 상기 실시예 1과 동일한 방법에 의해서, RAW264.7 대식세포주에 LPS 및 카탈포사이드를 처리하고, 배양액으로부터 세포들을 수집한 후, 상기 실시예 2의 방법으로 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 하기와 같은 방법에 의해서 RT-PCR을 수행하였다.

간단히 설명하면, 1mM dNTPs, 1.75유닛/㎕ RNAse 억제제, 2.5유닛/㎕의 M-MLV 역전사 효소, 25유닛/㎕의 올리고(dT) 프라이머, 상기에서 추출된 25ng RNA, 5mM MgCl₂및 PCR 완충액(5mM KCl; 10mM Tris-HCl pH 8.3)을 함유하고, 전체 부피 20㎕을 갖는 역전사 반응 혼합액을 제조하였다. 그런 다음, 제조된 역전사 반응 혼합액은 상온에서 10분동안 배양한 후, 써말 사이클러(thermal cycler)를 이용하여 역전사 반응을 수행하였다. 역전사 반응조건은 42℃에서 60분, 94℃에서 3분으로 하였다. 일차 cDNA을 생성한 후, 반응 튜브는 얼음에 5분동안 방치한 후, -20℃에서 저장하거나 하기의 PCR 반응에 이용하였다.

PCR 반응 용액은 2.5유닛의 AmpliTag^TMDNA 폴리머라아제, 센스 프라이머와 안티센스 프라이머 5㎍/㎖, 상기 제조한 역전사 반응액 20㎕, 2 mM MgCl₂및 PCR 완충액, 최종 부피 100㎕를 함유한다. 본 실험에서 사용된 센스 및 안티센스는 하기 표 1과 같다.

유전자	센스/안티센스	프라이머 서열	PCR 산물의 예상크기 (bp)
TNF-α	센스안티센스	5'-ATGAGCACAGAAAGCATGATCCGC-3'5'-CCAAAGTAGACCTGCCCGGACTC-3'	692
IL-1β	센스안티센스	5'-ATGGCAATCGTTCCTGAACTCAAC-3'5'-CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT-3'	563
IL-6	센스안티센스	5'-AGTAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT-3' 5'-CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3'	638
β-actin	센스안티센스	5'-CCTCTATGCCAACACAGT-3'5'-AGCCACCAATCCACACAG-3'	153

상기 프라이머 서열들을 이용하여 각 유전자를 증폭한 결과, TNF-α의 경우에는 692bp의 단편이, IL-1β의 경우는 563bp의 단편이, IL-6의 경우에는 638bp의 단편이 얻어졌고, β-액틴(β-actin)의 경우에는 153bp의 단편이 얻어진다.

PCR은 반응은 GeneAmp PCR 시스템(Perkin Elmer)을 이용하여 수행였으며, PCR 반응은 조건은, 사이클 수행 전에 94℃에서 5분, 60℃에서 5분 및 70℃에서 90초 전처리하고; 94℃에서 변성(denaturation) 45초, 60℃에서 어닐링(anealing) 45초 및 75℃에서 확장(extension) 90초의 사이클을, 사이토카인 cDNA에 대해서는 35 사이클 수행하고, β-액틴에 대해서는 25 사이클 수행하였으며; 마지막 사이클은, 94℃에서 45초, 60℃에서 45초, 및 72℃에서 10분간 더 반응시켰다.

기대한 생산량에 따라, 약 0.05 내지 0.2 볼륨의 RT-PCR 반응 산물은 2.5% 아가로스겔에서 전기영동한 후, 에티디움 브로마이드로 염색하고, UV를 이용하여 증폭을 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, 카탈포사이드는 TNF-α IL-1β 및 IL-6의 사이토카인을 코딩하는 유전자의 mRNA로의 전사를 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다. 한편, 카탈포사이드는 RT-PCR 반응의 대조군 유전자로 사용한 β-엑틴을 코딩하는 유전자의 발현에 대해서는 어떠한 영향도 미치지 않았다.

[실시예 4] p65의 웨스턴 불롯 분석

상기에서 보여준 바와 같이, 카탈포사이드는 프로-염증성 사이토카인들을 코딩하는 유전자의 발현을 억제함을 보여주었다. 이러한 유전자의 발현 억제가 NF-κB와 같은 전사인자의 활성을 억제하여 발생하는지를 확인하기 위해서, 카탈포사이드가 NF-κB의 활성화를 억제하는지를 확인하였다. NF-κB가 활성화되면, 그의 서브유닛인 p50과 p65의 헤테로이합체(heterodimer)가 형성되고, 형성된 헤테로이합체는 핵내로 전이되어 여러 유전자의 전사를 활성화시킨다. 따라서, NF-κB의 활성화는 p65의 핵내로의 전이를 관찰함으로써 확인할 수 있으며, 본 실시예서도 핵과 세포질에서의 p65 존재량을 웨스턴 블랏 분석법을 이용하여 확인함으로써, 카탈포사이드의 NF-κB에 대한 활성화 억제효과를 확인하였다.

RAW264.7 대식세포주를 100ng/㎖의 카탈포사이드로 처리함 없이 또는 1시간 동안 전처리한 후, 1㎍/㎖의 LPS로 0, 30 또는 60분 동안 처리하였다.

그런 다음, 상기 각각의 세포로부터 핵(NE)과 세포질(CE)을 다음의 방법에의해서 각각 추출하였다.

세포질의 추출은 Wang, Y., 등(Mitochondrial Katp Channal and End Effector of Cardioprotection During Late Preconditioning: Triggering Role of Nitric Oxide., J. Mol. Cell Cardiol., 33: 2037-2046)에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 즉, 25mM Tris-HCl, 5mM EGTA, 2mM EDTA, 100mM NaF, 0.02mM 류펩틴(leupeptin), 0.01mM E64, 0.12mM 펩트타틴(peppstatin), 0.2mM PMSF 및 5mM DTT로 조성된 완충액을 이용하여 세포를 마쇄하였다. 그런 다음, 14,000g로 15분간 원심분리하고, 상층액을 취하여, 웨스턴블롯에 사용할 세포질을 제조하였다.

핵의 추출은 Schreiber, E 등(Schreiber, E., et al., Rapid detection of octamer binding proteins with 'mini-extracts'. prepared from a small number of cells., Nucleic Acids Res. 1989: 17: 6419-)에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 즉, 10mM HEPES(pH 7.9), 10mM KCL, 0.1mM EDTA, 0.1mM EGTA, 1.5mM MgCl2, 1mM DTT, 10㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin), 4mM 페파블락 SC(Pefabloc SC), 50mM NaF 및 Na₃VO₄가 함유된 냉장 완충액 1㎖을 세포에 주입하였다(상기 시약의 구입은 Sigma사 USA와 Sata Cruz Biotech. INC.로부터 구입). 그런 다음, 10% 노니뎃 P-40(Nonidet P-40) 62.5㎕을 주입하고 10초간 균질하게 혼합하고, 30분동안 어름 위에 방치하였다. 4℃에서 10분 동안 5,000rpm으로 원심침전시켜 핵 침전물을 수집하여 얻었다. 20mM HEPES(pH 7.9), 0.4M NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1.5mM MgCl2, 20% (w/v) 글리세롤, 1mM DTT, 10㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin), 10㎍/㎖ 아프로니닌(aprotinin),4mM 페파블록 SC(Pefabloc SC), 50 mM NaF 및 Na₃VO₄가 함유된 냉장 완충액 150㎕을 분리된 핵 침전물에 주입하여 부유시킨 후, 30분 동안 4℃에서 방치했다. 그런 다음, 15,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 취하여, 웨스턴 블롯용 핵 추출물을 제조하였다.

추출물 세포질 및 핵 각각에서의 p65 양을 결정하기 위하여 8.5% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 실시하였다. 전기영동을 수행한 후, 단백질은 니트로셀레로오스 필터로 전기적으로 전이시킨 다음, p65에 대한 토끼 폴리클로날 항체(Santa Cruz Biotech. INC.로부터 구입)을 처리하고, ECL 키트(Amersham, USA)를 이용한 화학현광법으로 p65 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, LPS 만을 처리하는 경우, 그 처리시간에 따라 세포질 내 p65의 농도가 감소되는 반면, 핵 내 농도는 증가하였다. 그러나, 카탈포사이드 및 LPS를 동시에 처리한 경우, 핵 내에서 p65은 거의 관찰되지 않았으며, 세포질에서의 p65의 양은 거의 변화가 없었다. 이러한 결과는 카탈포사이드가 NF-κB의 활성화되어 p65가 핵으로 전이되는 것을 억제할 수 있음을 나타낸다.

[실시예 5] iNOS mRNA 발현 분석

DMSO에 용해한 0, 10, 50 또는 100ng/㎖의 카탈포사이드, 또는 0 또는 100ng/㎖의 스페시오사이드를 1시간 처리하고, 여기에 5U/㎖의 인터페론 감마(IFN-γ) 및 10ng/㎖의 LPS을 주입하고, 18시간 RAW264.7 세포를 배양하였다. 세포배양액의 최종 DMSO의 농도는 0.1%였다. 배양산물에 대하여 다음과 같이, 일산화탄소의 생성량 및 iNOS mRNA 발현량을 측정하였다.

일산화질소의 생성량은, 생성된 일산화탄소가 배지내에서 니트라이트(nitrite)의 안정된 화합물로 변화되므로, Griess의 방법을 이용하여 배지내 니트라이트 생성량을 측정함으로써 확인하였다. 즉, 배양된 대식세포의 상층액을 수집하고, 여기에 동량의 그리에스 시약(Griess reagent ; 1% 설파닐아마이드 및 2.5% 인산용액에 용해된 0.1%N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 디하이드로클로라이드)을 주입한 후, 10분간 실온에 방치하였다. 니트라이트 농도는 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 540㎚에서 그 흡광도를 측정하여 결정하였다. 세포가 없는 배양액은 니트라이트 농도가 5-8M로 나타났고, 따라서 이 값을 기준으로 여러 가지 실험군의 니트라이트 값을 측정하였다.

또한, iNOS 유전자 발현은, 우선 전체 RNA를 산-구아니디늄 이소티오시아네이트 페놀 추출법(acid-guanidinium isothiocyanate phenol chloroform; APC 방법)(Chomezynski P, et al., Analytical Biochemistry, 1987, 162, 156-9)을 이용하여 추출한 후, Choi CY, et al., International Immunolpharmacology, 2001, 1, 1141-51에 기재된 방법을 이용하여 iNOS에 대한 RT-PCR을 다음과 같이 수행하였다. 즉, RT-PCR의 수행조건 및 프라이머와 주형 RNA 이외의 반응액 조성물 내 포함되는 시약의 함량은 상기 실시예 3에 기재된 것과 동일하며, iNOS 유전자에 대한 RT-PCR용 프라이머는 5'-TTTGGAGCAGAAGTGCAAAGTCTC-3 및 5-GATCAGGAGGGATTTCAAAGACCT-3'의 서열을 이용하였으며, 대조군 유전자로서 β-엑틴에 대한 RT-PCR용 프라이머는 5'-CCTCTATGCCAACACAGT-3' 및 5'-AGCCACCAATCCACACAG-3'의 서열을 이용하였다. RT-PCR 증폭산물은 2.5% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후, EtBr로 염색한 다음, UV로 확인하였다.

또한, 상기에서 카탈포사이드 대신에 이리도이드 글리코시드계 화합물로서 분리된 스페시오사이드(Specioside) 100ng/㎖을 동일한 방법에 의해서 처리하고, 1 ㎍/㎖의 LPS를 1×10⁶세포수/㎖의 RAW 264.7 세포에 처리한 후, 상기와 동일한 방법에 의해서 NO 생성량 및 iNOS 유전자 발현을 확인하였다.

본 실시예에서 모든 실험결과들은 3번의 독립된 반복실험을 통해 얻어내었으며, 평균±표준편차로 나타냈다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

도 5에서 보는 바와 같이, 1 ㎍/㎖의 LPS만을 RAW 264.7 대식세포주에 처리하였을 때 안정한 최종 산물로서 니트라이트가 15.90±0.22μM 만큼 축적되었다. 그러나, 카탈포사이드는 이러한 니트라이트의 축적을 농도 의존적으로 감소시켰다(IC₅₀= 46±0.12ng/㎖). 반면, 동일한 이리도이드 글리코시드계 화합물인 스페시오사이드의 경우에는 전혀 니트라이트의 축적을 억제하지 못하였다.

한편, iNOS의 유전자 발현의 결과도, 상기 니트라이트 생산 결과와 동일한 결과가 얻어졌다. 즉, 카탈포사이드는, LPS의 자극에서 의해서 증가된 iNOS 유전자 발현을 억제하였지만, 스페시오사이드는 전혀 억제하지 못하였다.

또한, 본 실시예에서 결과로 나타내지 않았지만, 이리도이드계 화합물인 피크로사이드도 스페시오사이드와 마찬가지로 iNOS mRNA 발현 및 NO 생성량 증가를전혀 억제하지 못하였다.

[실시예 6] NF-κB의 DNA 결합 검사

상기 실시예 5와 동일한 방법을 수행하여, LPS, 카탈포사이드 및/또는 스페시오사이드를 처리하였다. 배양 1시간 후에, Dignam JD., et al., Nucleic Acids Research, 1983, 11, 1475-89에 기재된 방법을 이용하여, RAW 264.7 대식세포로부터 핵을 추출하였으며, 추출된 핵에 대하여 EMSA법(electrophoretic mobility shift assay)을 이용하여 NF-κB의 DNA 결합 활성에 대하여 분석하였다(Oh G-S, et al., Cancer Letter, 2001, 174, 17-24). 그 결과는 하기 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보는 바와 같이, 카탈포사이드는 NF-κB가 핵에 결합하여 나타나는 겔 쉬프트 현상이 농도 의존적으로 감소시켰지만, 스페시오사이드의 경우는 오히려 NF-κB의 겔 쉬프트 현상을 더욱 촉진시키는 것으로 확인되었다.

이러한 결과들로부터, 카탈포사이드는 iNOS 유전자 발현과 관련된 NF-κB 전사인자가 활성되는 것을 억제하며, 따라서 카탈포사이드는 NF-κB의 활성화와 관련된 상류 신호전달과정에 관련되어 있다는 것을 나타낸다.

한편, 이리도이드 글리코시드계 화합물의 일종인 스페시오사이드 및 피크로사이드가 iNOS 유전자 발현과 NF-κB활성에 전혀 억제하지 못하였다는 결과는, 카탈포사이드의 C-6 치환기가 항염증효과를 나타내는데 중요한 부분임을 보여준다. 한편, 카탈폴사이드의 C-6 치환기 및 카탈폴사이드와 유사구조를 갖는 스페시오사이드 및 피클로사이드의 구조는 하기 도 1에 나타내었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 카탈포사이드는 염증반응에 관련된 여러 매개인자, 즉 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 프로-염증성 사이토카인, iNOS 유전자 발현, NF-κB의 활성화를 억제할 수 있다. 따라서, 카탈포사이드를 함유하는 조성물은 류마티스 질환, 패혈증 등과 같은 과다한 염증반응에 의해서 유발되는 질환의 치료에 이용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 천연물에서 분리한 카탈포사이드를 함유하기 때문에, 인체에 어떠한 심각한 부작용을 유발하지 않기 때문에, 장기적으로 투여하여도 부작용을 거의 나타내지 않는다.

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Claims

유효성분으로 카탈포사이드(cataposide)를, 과다한 염증반응에 의해 유발된 질환의 치료를 위해 0.001∼500㎎/kg체중의 1회 투여분량으로 함유함을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 카탈포사이드는 개오동나무의 표피로부터 분리한 것임을 특징으로 항염증제 조성물
제 1항에 있어서, 상기 항염증제 조성물은 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 프로-염증성 사이토카인의 생산을 억제함을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 항염증제 조성물은 TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 코딩하는 유전자의 발현을 억제함을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 항염증제 조성물은 NF-κB의 활성을 억제함을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 항염증제 조성물은 NF-κB의 서브유닛(subunit)인 p65 단백질의 핵으로의 전이(translocation)를 억제함을 특징으로 하는 항염증제조성물.
제 1항에 있어서, 상기 항염증제 조성물은 일산화질소의 생성량을 억제함을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 항염증제 조성물은 iNOS(inducible NO synthase) 유전자의 발현을 억제함을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 과다 염증반응에 의해 유발된 질환은 류마티스 관절염(rheumatic disease), 다발성경화증(multiple sclerosis), 전신성 홍반성 낭창증(systemic lupus erythematosus, SLE), 건선(psoriasis), 염증성 대장질환(inflammatory bowel disease), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 자가면역질환(autoimmune disease) 및 패혈증(septic shock)에서 선택된 것임을 특징으로 하는 항염증제 조성물.