CN109071614A - 肺炎球菌溶血素胜肽作为对抗类铎受体第四型的拮抗剂的用途及治疗类铎受体第四型相关疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是关于来自肺炎球菌溶血素(PLY)的分离的胜肽及其作为类铎受体第四型(toll‑like receptor 4，TLR‑4)拮抗剂的用途。该等胜肽的结合导致降低的TLR‑4活性。具体而言，本发明提供一种来自PLY C端的分离的胜肽，其是有效治疗TLR‑4活化相关的病症，如糖尿病与动脉粥状硬化。

Description

肺炎球菌溶血素胜肽作为对抗类铎受体第四型的拮抗剂的用 途及治疗类铎受体第四型相关疾病的方法

相关申请案

本申请案主张于2016年3月8日提交的美国临时申请案号62/305,164的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明是关于使用类铎受体第四型(toll-like receptor 4，TLR-4)调节剂治疗糖尿病与其它疾病/病症。具体而言，本发明提供一种来自肺炎球菌溶血素的分离的胜肽(PLY peptide)，其是有效调节TLR-4活性与治疗糖尿病，以及与TLR-4活化相关的其它疾病或病症。

背景技术

糖尿病是由于胰腺产生之胰岛素的缺乏或所产生之胰岛素的无效所引起的糖代谢障碍。该疾病导致血液中葡萄糖含量增加，并导致身体的许多组织或器官(如血管及神经)的损伤。

糖尿病有第一型糖尿病和第二型糖尿病两种形式。第一型糖尿病，亦称为胰岛素依赖性糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)，通常发生于儿童，且患者终生必须施打胰岛素。第二型糖尿病，亦称为非胰岛素依赖性糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus，NIDDM)，与高脂肪饮食及肥胖症高度相关。有许多用于治疗第二型糖尿病的药物，包括通过排尿降低葡萄糖的药物，如Invokana(canagliflozin)，为一种钠-葡萄糖共转运蛋白2(sodium-glucose co-transporter 2，SGLT2)抑制剂，是通过排尿释放身体中过量的葡萄糖；增加胰岛素敏感性的药物，如Glucophage(二甲双胍)、Actos(吡格列酮)，以及Avandia(罗格列酮)；刺激胰腺产生胰岛素的药物，如磺酰脲与非磺酰脲促分泌素；以及缓慢消化碳水化合物的药物，如α-葡萄糖苷酶抑制剂与淀粉素类似物和二肽基胜肽酶-4抑制剂(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)。Byetta(艾塞那肽)是一种新开发的可注射药物，其为类升糖素胜肽-1(glucagon-like-peptide-1，GLP-1)类似物，且通过增加胰岛素从胰腺的释放而降低血糖。然而，这些抗糖尿病药物仍然存在一些局限性以及可能的副作用，例如低血糖、体重增加、心血管问题、恶心和肠胃气胀。因此，仍然需要用于治疗糖尿病的替代药物。迄今为止，还没有公开使用TLR-4拮抗剂治疗糖尿病的报告。

TLR-4是类铎受体(Toll-like receptor，TLR)家族的成员。它是一种细胞表面跨膜受体，其主要识别细菌脂多醣，并且在活化时在炎症途径的诱导中具有重要作用。

有越来越多的证据显示血管细胞中促发炎因子的产生和分泌在动脉粥状硬化中具有重要作用。细胞间黏附分子1(Intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、血管黏附分子1(vascular adhesion molecule 1，VCAM-1)，以及E-选择蛋白是主要的生物标志物，且内皮细胞(endothelial cell，EC)黏附分子，其调节白血球从血流到发炎部位的结合和外渗(Sato J.等人，PLoS One 9:e107236)。当ECs对细胞激素反应而被活化时，细胞黏附分子在其表面上的表现显着增加。循环中可溶性细胞黏附分子的出现被认为是从因为增加表现量而活化的ECs表面释放所造成的结果(Tesfamariam B.等人，Vascul Pharmacol 46:229-237)。几个报告已经证明可溶形式的黏附分子在第二型糖尿病患者中可能出现的微血管和大血管并发症中的重要性(Herder C.等人，PLoS One6:e19852；Kalofoutis C.等人，Exp Clin Cardiol 12:17-28)。一些报告显示，糖尿病(diabetes mellitus，DM)与动脉粥状硬化和发炎性疾病有关(Kim JA等人，Circulation 113:1888-1904；Orasanu G.等人，JAm Coll Cardiol53:S35-42)。在糖尿病文件记录的心血管危险因子中，高血糖似乎是糖尿病血管并发症的独立危险因子(Monnier L.等人，JAMA295:1681-1687；Wright RJ等人，Diabetes Metab Res Rev 24:353-363)。

一些报告显示TLR4功能的丧失部分保护了长期高脂肪饮食中末梢和心脏葡萄糖的代谢紊乱，且TLR4拮抗剂可防止醛固酮诱发的心脏和肾脏损伤(Jackson EE等人，PLoSOne 10:e0142077；Zhang Y.等人，PLoS One 10:e0142456)。一些报告还显示，TLR-4与直肠癌的进展和转移、胃癌的进展、牙周病和尿道感染有关(Chen TC等人，Cell Microbiol 13：1703-1713；Chrzeszczyk D等人，Adv Clin Exp Med24:1059-1070)。Lu等人公开了做为TLR4拮抗剂的Rs-LPS对高脂肪饮食所引起的葡萄糖和脂质变化没有影响，显示Rs-LPS通过独立于代谢控制的机制来抑制糖尿病LDLR-/-小鼠的动脉粥状硬化(Lu Z.等人，Immunobiology 220(11):1246-1254)。

肺炎球菌溶血素(Pneumolysin)，一种细胞内巯基活化的毒素，具有溶解细胞和活化补体的特性，是所有肺炎链球菌(Streptococcus.pneumoniae)中含有的主要毒力因子之一(Rabes A.等人，Curr Top Microbiol Immunol 397:215-227)。肺炎链球菌感染负责诱导由肺炎球菌溶血素造成的炎症，其损害肺部的血管并造成肺部气腔出血。此外，最近的研究显示，肺炎球菌溶血素可能是肺炎模型中嗜中性粒细胞跨内皮迁移的化学引诱物(Moreland JG等人，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 290:L833-840)。

发明内容

本发明基于不可预期的发现，即来自肺炎球菌溶血素(pneumolysin，PLY)的截短胜肽移除对细胞的毒性并显示抗糖尿病活性，包括降低血糖含量与增加胰岛素含量。因此，本发明的PLY胜肽可用于治疗糖尿病及其并发症。在本发明中进一步发现，截短的PLY胜肽做为类铎受体第四型(TLR-4)拮抗剂，因此可用于治疗与TLR-4活化相关的疾病或病症，例如由于TLR-4活化引起的发炎性疾病，例如动脉粥状硬化。本发明还提供了以TLR-4拮抗剂治疗糖尿病。

于一些方面，本文提供了一种分离的胜肽，包含：(i)包含QDLTA(SEQ ID NO:9)的胺基酸模体之第一片段；以及(ii)包含与SEQ ID NO:10至少85％相同的胺基酸序列之第二片段。该第一片段的C端连接至该第二片段的N端；且其中该分离的胜肽之长度最多达150个胺基酸。

于一些具体实施例中，该第二片段可包含与SEQ ID NO:10至少90％相同的胺基酸序列，例如与SEQ ID NO:10至少95％相同的胺基酸序列。于一些具体实施例中，该第二片段可包括在SEQ ID NO:10中最多5个胺基酸残基处的突变。例如，该第二片段可包括在SEQ IDNO:10的位置19与20中的一个或多个处有一个或多个胺基酸取代。在一些特定实施例中，该第二片段如SEQ ID NO:10、12、13或14所示。

于一些具体实施例中，该第一片段如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:9所示。

于一些具体实施例中，本文所述之分离的胜肽包含选自由SEQ ID NOs:3-7所组成之群组的胺基酸序列。

于另一方面，本案提供包含编码本文所述之任何胜肽的核苷酸序列的重组核酸。这样的核酸可以是包含本文所述之编码序列的载体。在一些实施例中，载体为表现载体。

于另一方面，本文提供了包含本文所述之任何重组核酸的宿主细胞。

可以将任何胜肽或核酸配制成形成组合物，例如医药组合物，其进一步包含生理上可接受之载体。

本文还提供了在有需要的个体中治疗糖尿病(例如第二型糖尿病)或糖尿病并发症的方法，包含向个体施用有效量的任何胜肽或任何编码如本文所述之核酸，或包含这些的组合物。于一些情况下，胜肽或核酸的有效量足以降低个体的血糖含量或增加胰岛素含量。于一些情况下，个体可能患有更多糖尿病的并发症之一，包括糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病性肾病变、糖尿病性神经病变、糖尿病性心血管疾病(例如动脉粥状硬化)，以及糖尿病性皮肤病。

此外，本文提供了一种用于抑制个体中TLR-4活性的方法，其包含向有需要的个体施用有效量的TLR-4拮抗剂，例如本文所述之任何胜肽。于一些情况下，TLR-4拮抗剂阻断MD2蛋白与TLR-4的结合。于一些情况下，TLR-4拮抗剂为抗TLR-4抗体。于其他情况下，TLR-4拮抗剂为TLR-4目标的干扰核酸或抑制TLR-4的小分子。

待本文所述方法治疗的个体可以是患有或疑似患有与TLR-4活化相关的疾病或病症的人类患者。这种疾病或病症可能是由于TLR4活化引起的发炎性疾病，具体而言是动脉粥状硬化。于某些情况下，该个体患有糖尿病。于其他情况下，该个体不患有糖尿病。或者或此外，该个体可以是患有或疑似患有糖尿病(例如第二型糖尿病)或其并发症的人类患者。

TLR-4拮抗剂的有效量足以降低个体的血糖含量或增加胰岛素含量。

也包含在本案之范围内的还有，用于治疗与TLR-4有关的疾病之医药组合物，该组合物包含如本文所述之任何胜肽或编码该胜肽的核酸，以及医药上可接受之载体。这些疾病可能是第二型糖尿病或动脉粥状硬化。此外，本文描述的是如本文所述之胜肽或编码该胜肽的核酸用于制备用于治疗与TLR-4相关的疾病之药物的用途。

在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个具体实施例的细节。本发明的其它特征或优点将从以下几个具体实施例的详细描述以及来自所附之申请专利范围变得显而易见。

附图说明

当结合图式阅读时，将更好地理解上述概述以及本发明的以下详细描述。为了说明本发明之目的，在附图中示出了目前较佳的具体实施例。然而，应当理解的是，本发明不限于所示的精确排列与手段。

在图式中：

图1显示了(1)全长肺炎球菌的肺炎球菌溶血素(PLY，1-471个胺基酸残基)，(2)结构域1-3的片段(PLY123，1-359个胺基酸残基)，(3)结构域4的片段(PLY4，360-471个胺基酸残基)，(4)C端70个胺基酸片段(C70PLY4，402-471个胺基酸残基)，(5)C70PLY4的N端35个胺基酸片段(N35PLY4，402-436个胺基酸残基)，(6)在胺基酸位置25处具有一个点突变的N35PLY4，其参考SEQ ID NO:5，自精胺酸(R)变为离胺酸(K)(N35PLY4m25K)，(7)N35PLY4具有双重突变，参考SEQ ID NO:5在胺基酸位置24处有一个突变，从异白胺酸(I)变为白胺酸(L)，另一个突变参考SEQ ID NO:5在胺基酸位置25处，从精胺酸(R)变为离胺酸(K)(N35PLY4m24L25K)，以及(8)M50PLY4(407-456个胺基酸残基)，为C70PLY4的第6至第55个胺基酸残基的胜肽(SEQ ID NO:9)，缺乏QDLTA的N端模体的图解。

图2显示PLY4、C70PLY4、N35PLY4、N35PLY4m25K、N35PLY4m24L25K以及M50PLY4的胺基酸序列。

图3显示通过以C70PLY4处理的STZ注射的HFD喂养的大鼠中血糖含量降低。

图4显示通过以C70PLY4处理的STZ注射的HFD喂养的大鼠中胰岛素含量升高。

图5显示以C70PLY4处理的C57BL/KsJ-db/db小鼠中血糖含量降低。

图6显示以C70PLY4处理的C57BL/KsJ-db/db小鼠体重降低。

图7包括通过以C70PLY4处理的STZ注射的HFD喂养的大鼠中血清可溶性ICAM-1含量降低的图表(图(A))；通过以C70PLY4处理的STZ注射的HFD喂养的大鼠中血清可溶性VCAM-1含量降低(图(B))；以及以C70PLY4处理的STZ注射的HFD喂养的大鼠中血清可溶性E-选择蛋白含量降低(图(C))。

图8显示C70PLY4对HFD喂养的大鼠以STZ诱导的新内膜形成和动脉粥状硬化状态的减弱作用。

图9表明C70PLY4可以阻断低剪切应力引起的形态变化(A)以及细胞骨架重塑(B)。细胞(a)在没有PLY胜肽的静态培养基中培养，(b)在没有PLY胜肽的静态培养基中培养，然后暴露于剪切应力6小时，或(c)在C70PLY4存在下在静态培养基中培养1小时，然后暴露于剪切应力6小时。

图10显示脂多醣刺激后野生型(WT)小鼠C3H/HeN与类铎受体第四型(TLR4)缺陷小鼠C3H/HeJ的多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte，PMNs)的迁移差异。

图11显示以PLY、PLY4、C70PLY4或N35PLY4处理的野生型(WT)小鼠模型对PMNs迁移的抑制。

图12显示以N35PLY4、N35PLY4m25K，或N35PLY4m24L25K处理对PMNs迁移的抑制。

图13包括在体外蛋白结合测定(图(A))中显示MD2与TLR4的高结合亲和力(K_d值)，以及通过C70PLY4与TLR4的MD2结合模体有效竞争的图表(图(B))。

图14包括显示西方墨点分析结果的照片(图(A))，表明LPS诱导的ERK1/2与NFκB-p65次单位活化中C70PLY4的剂量依赖性抑制，以及图表(图(B))显示基于上图所示结果的磷酸化含量(对照组的百分比)，表明C70PLY4在LPS诱导的ERK1/2与NFκB-p65次单位活化中的剂量依赖性抑制。

图15显示全长PLY对细胞具有毒性，而高浓度的PLY4对细胞具有轻微毒性。通过以C70PLY4和N35PLY4处理则未发现细胞毒性。

图16显示C70PLY4不影响HUVEC的细胞形态，(a)以C70PLY4处理1小时的细胞，(b)以C70PLY4处理4小时的细胞，以及(c)以C70PLY4处理7小时的细胞。

图17包括显示C70PLY4在TUNEL测定中没有细胞凋亡潜力(图(A))，且C70PLY4在半胱天冬酶-3活性测定中没有细胞凋亡潜力(图(B))的照片。(a)对照组细胞，(b)以C70PLY4处理的细胞，以及(c)以喜树碱(已知的细胞毒性植物生物碱)处理的细胞。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。

如本文所用，定冠词“一(a)”与“一(an)”是指物品的语法对象中的一个或多于一个(即至少一个)。作为示例，“一元素”是指一个元素或多于一个元素。

“包含(comprise)”或“包含(comprising)”等词通常被用在包括(include)/包括(including)的意义上，其是表示允许存在一个或多个特征、成分或组分。“包含(comprise)”或“包含(comprising)”等词包括“组成(consists)”或“由...组成(consisting of)”。

如本文所用，“多胜肽”乙词是指由通过胜肽键连接的胺基酸残基组成之聚合物。“胜肽”乙词是指由连接的胺基酸组成的相对短的多胜肽，例如150个胺基酸或更少，例如，长度为140个或更少、130个或更少、120个或更少、110个或更少、100个或更少、90个或更少、80个或更少、70个或更少、60个或更少、50个或更少、40个或更少的胺基酸。

PLY胜肽和含有该胜肽之医药组合物

本文所述之PLY胜肽是指衍生自肺炎球菌溶血素的非天然存在的截短片段或其功能变体。这些胜肽与天然存在的全长PLY不同，至少在于这样的胜肽与其全长对应物相比具有显着降低的细胞毒性。此外，PLY胜肽显示TLR-4拮抗的活性，其在全长天然配对物中未观察到。因此，PLY胜肽是可用于抑制TLR-4调节的信号传导途径的TLR-4拮抗剂，因此有利于治疗与异常TLR-4活化相关的疾病和病症。

细菌性肺炎球菌溶血素为具有471个胺基酸长度的多胜肽，其含有四个结构域。示例性的肺炎球菌溶血素的胺基酸序列提供于下表1中(SEQ ID NO:1)。结构域1-3(“肺炎球菌溶血素123；”SEQ ID NO:2)对应于SEQ ID NO:1中的胺基酸残基1-359。结构域4(“Ply4；”SEQ ID NO:3)对应于SEQ ID NO:1中的胺基酸残基360-471。

本文所述之PLY胜肽可能缺少肺炎球菌溶血素分子的结构域1-3。于一些具体实施例中，如本文所述之PLY胜肽可以包含QDLTA(SEQ ID NO:9)的胺基酸模体，其C端连接到包含与SEQ ID NO:10序列至少有85％(例如，至少90％、95％或97％)相似的胺基酸序列的胜肽片段。于一些情况下，任何PLY胜肽可以具有最多150个胺基酸，例如含有35-150个胺基酸残基、35-120个胺基酸残基、35-100个胺基酸残基、35-80个胺基酸残基或35-60个胺基酸残基。

为了确定两个胺基酸序列的相似度百分比，为了优化比较之目的进行序列比对(例如，可以在第一个胺基酸序列的序列中引入间隙以与第二个胺基酸序列进行最佳比对)。在计算相似度百分比时，通常会精确计算配对。可以使用本领域已知的数学算法(例如BLAST和Gapped BLAST程序、NBLAST和XBLAST程序，或ALIGN程序)来确定两个序列之间的同源性或相似度的百分比。

于一些具体实施例中，本文所述之PLY胜肽可以是天然存在的肺炎球菌溶血素的片段，例如细菌性肺炎球菌溶血素。这样的PLY胜肽可以含有QDLTA(SEQ ID NO:9)，接着SEQID NO:10的片段。除了SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的区段之外，PLY胜肽还可以含有在SEQID NO:9的N端的亲本肺炎球菌溶血素的区段、在SEQ ID NO:10的C端的亲本肺炎球菌溶血素的区段，或两者皆有。PLY胜肽的长度可以在35-150个胺基酸的范围内。衍生自天然存在的肺炎球菌溶血素的示例性PLY胜肽包括但不限于PLY4(SEQ ID NO:3)、C70PLY4(SEQ IDNO:4)，以及N35PLY4(SEQ ID NO:5)。见下表1。

在其它具体实施例中，本文所述之PLY胜肽可以是包含一个或多个突变的肺炎球菌溶血素片段的变体。可以理解的是，多胜肽可以具有有限数量的变化或修饰，其可以在与其活性或功能无关的多胜肽的某一部分内进行，且仍然导致具有可接受程度的等同或类似的生物活性或功能的变体。具体而言，本发明的PLY胜肽表现出减弱TLR-4活化的活性。因此，可以鉴定出对于本发明的PLY胜肽的减弱TLR-4活化的活性必需或非必需的胺基酸位置，例如SEQ ID NO:10的C端序列。TLR-4活化的分析通常通过在体内将LPS与嗜中性粒细胞结合，或通过体外蛋白竞争结合测定法来进行。将LPS与嗜中性粒细胞结合导致TLR-4活化，例如，其含量可以通过嗜中性粒细胞的迁移百分比来测量。与不具有测试胜肽者相比，如果该测试胜肽存在时TLR-4活化含量会降低的话，则该测试胜肽被确定为能有效减弱TLR-4活化。

在一些实施例中，PLY胜肽可以在对应于SEQ ID NO:10的区域中在多达5个胺基酸位置(例如，1、2、3、4或5)处含有突变(例如，胺基酸残基取代)。例如，PLY胜肽可以在SEQ IDNO:10的位置19及/或位置20(分别对应于SEQ ID NO:5中的位置24和25)含有突变(例如，胺基酸残基取代)。如本文所示，这两个位置的突变不影响PLY胜肽的TLR-4抑制活性。实例包括但不限于N35PLY4m25K(SEQ ID NO:6)以及N35PLY4m24L25K(SEQ ID NO:7)。

于一些情况下，胺基酸残基突变为保守胺基酸残基取代，其如本领域已知的，不太可能影响所得胜肽的活性。如本文所用，“保守胺基酸取代”是指不改变其中进行胺基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特征的胺基酸取代。可以根据改变本领域普通技术人员已知的多胜肽序列的方法来制备变体，例如在编译这些方法的参考文献中找到的，如MolecularCloning:ALaboratory Manual，J.Sambrook等人编辑，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989年，或Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons公司，纽约。胺基酸的保守取代包括在以下组中的胺基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及(g)E、D。

表1显示了本发明的一些具体实施例中全长肺炎球菌的肺炎球菌溶血素的胺基酸序列、其片段和具有突变的片段。

表1

本发明的PLY胜肽可以通过使用蛋白质化学中熟知的技术，例如固相合成或在均匀溶液中合成以进行化学合成而制备。

或者，本发明的PLY胜肽可以使用重组技术制备。在这方面，提供了包含编码本发明的胜肽的核苷酸序列的重组核酸，以及包含这种重组核酸的宿主细胞。可以在合适的条件下培养宿主细胞以表现目标多胜肽。多胜肽的表现可以是组成型的，使得它们连续产生或可诱导，需要刺激以启动表现。在可诱导表现的情况下，当需要时可以通过于培养基中加入诱导剂物质，例如异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)或甲醇，以开始产生蛋白质。多胜肽可以通过本领域已知的多种技术例如色层分析法，例如HPLC或亲和管柱，以从宿主细胞中回收和纯化。

“多核苷酸”或“核酸”等词是指由核苷酸单元组成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，“DNA”)以及核糖核酸(ribonucleic acid，“RNA”)以及核酸类似物，包括具有非天然存在的核苷酸的核酸类似物。可以例如使用自动化DNA合成仪来合成多核苷酸。“核酸”乙词通常是指大的多核苷酸。应当理解的是，当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括其中由“U”代替“T”的RNA序列(即A、U、G、C)。“cDNA”乙词是指与单链或双链形式的mRNA互补或相同的DNA。

“互补”乙词是指拓扑兼容性或两个多核苷酸的相互作用表面的配对。因此，这两个分子可以被描述为互补的，此外，接触表面特性彼此互补。如果第一多核苷酸的核苷酸序列与第二多核苷酸的多核苷酸结合配偶体的核苷酸序列相同，则第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。因此，序列为5’-TATAC-3’的多核苷酸与序列为5’-GTATA-3’的多核苷酸互补。

“编码”乙词是指多核苷酸(例如，基因、cDNA或mRNA)中特定的核苷酸序列的固有性质，用于做为生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板，其具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的胺基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果由一基因产生的mRNA的转录和转译在细胞或其他生物是统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。本领域技术人员可以理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可编码相同的多胜肽。还应当理解，技术人员可以使用常规技术进行核苷酸取代，该取代不影响其中所述之多核苷酸编码的多胜肽序列，以反映任何特定宿主生物体的密码子使用，其中该多胜肽将在该宿主生物体中被表现。因此，除非另有说明，否则“编码胺基酸序列的核苷酸序列”包括彼此简并形式并编码相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可能包括内含子。

“重组核酸”乙词是指具有不是天然连接在一起的序列的多核苷酸或核酸。重组核酸可以以载体的形式存在。“载体”可以含有给定的目标核苷酸序列与调节序列。载体可以用于表现给定的核苷酸序列(表现载体)或维持给定的核苷酸序列，以用于复制、操纵，或在不同位置之间(例如在不同的生物体之间)转移该核苷酸序列。为了上述目的，可将载体引入合适的宿主细胞。“重组细胞”是指已经在其中引入重组核酸的宿主细胞。

载体的实例包括但不限于质体、黏质体、噬菌体，YACs或PACs。通常，在载体中，给定的核苷酸序列可操作地与调节序列连接，使得当载体被引入宿主细胞时，给定的核苷酸序列可以在调节序列的控制下在宿主细胞中表现。调控序列可以包含，例如但不限于启动子序列(例如，巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、T7启动子，以及醇氧化酶基因(AOX1)启动子)、起始密码子、复制起点、增强子、操纵子序列、分泌信号序列(例如，α交配因子信号)以及其他控制序列(例如Shine-Dalgarno序列和终止序列)。优选地，载体可以进一步含有用于随后筛选程序的标记序列(例如，抗生素抗性标记序列)。为了蛋白质生产的目的，在载体中，给定的目标核苷酸序列可以连接到除了上述调节序列之外的另一个核苷酸序列，而产生融合的多胜肽并有益于随后的纯化程序。所述融合多胜肽包括但不限于His标签融合多胜肽和GST融合多胜肽。因此，于一些具体实施例中，如本文所述之本发明的胜肽可以是具有用于纯化的标签的融合多胜肽。

于一些具体实施例中，如果本发明的胜肽基本上不含可能参与胜肽制备过程的细胞材料或化学前驱物或其它化学物质，则本发明的胜肽可以说是“分离的”或“纯化的”。应当理解的是，“分离的”或“纯化的”等词不一定反映胜肽被“绝对地”分离或纯化的程度，例如，通过除去所有其它物质(例如杂质或细胞成分)。于一些情况下，例如，分离或纯化的胜肽包括含有小于50％、40％、30％、20％或10％(重量)的其它蛋白质(例如细胞蛋白质)的胜肽的制剂，具有少于50％、40％、30％、20％或10％(体积)的培养基，或具有小于50％、40％、30％、20％或10％(重量)的化学前驱物或其他涉及合成程序的化学物质。“分离的”或“纯化的”等词也可以应用于本发明的核酸。

根据本发明，有效量的活性成分(PLY胜肽)可使用生理学上可接受的载体配制成用于递送和吸收目的的合适形式的组合物。本发明的组合物特别包含约0.1％(重量百分比)至约100％(重量百分比)的活性成分，其中基于整个组合物的重量计算重量百分比。于一些具体实施例中，本发明的组合物可以是用于治疗的医药组合物或药物。于一些具体实施例中，本发明的组合物可以是食品或补充剂。

如本文所用，“生理上可接受的”是指载体与组合物中的活性成分兼容，且优选地可稳定所述活性成分，并且对接受的个体是安全的。所述载体可以是活性成分的稀释剂、载剂、赋形剂或基质。适当赋形剂的一些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。组合物还可以包含润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，如羟基苯甲酸甲酯和丙酯；甜味剂和调味剂。本发明的组合物可以在投与患者后提供活性成分快速、持续或延迟释放的效果。

根据本发明，组合物的形式可以是片剂、丸剂、粉末、锭剂、包装、口含锭、酏剂、悬浮液、洗液、溶液、糖浆、软和硬明胶胶囊、栓剂、灭菌注射液，以及包装粉末。

本发明的组合物可以通过任何生理上可接受的途径递送，例如口服、肠胃外(如肌肉内、静脉内、皮下和腹膜内)、经皮、栓剂和鼻内方法。关于肠胃外给药，优选以无菌水溶液的形式使用，其可以包含足以使溶液与血液等渗的其它物质，例如盐或葡萄糖。可以根据需要适当地使该水溶液变为缓冲(例如pH值为3～9)。在无菌条件下制备合适的肠胃外组合物可使用本领域技术人员熟知的标准药理学技术来完成。

用于治疗与TLR-4相关的疾病的PLY胜肽的治疗用途

TLR-4是负责活化先天免疫是统的类铎受体。TLR-4可以识别并被脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)活化，脂多醣(LPS)是细菌病原体中常见的成分。其他分子，如病毒蛋白与多醣，也被发现作为TLR-4的配体。意料不到地，本文所述之PLY胜肽被发现能够抑制TLR-4活化。因此，本文所述之任何对TLR-4具有抑制活性的PLY胜肽可用于在需要这种治疗的个体中抑制TLR-4活性，从而有益于治疗与异常活化的TLR-4有关的疾病或病症。

为了实施本文公开的方法，一有效量的本文所述之组合物，例如本文所述之医药组合物，包含本文所述之一种或多种PLY4胜肽，可以被施用于需要治疗的个体(例如，人类)，经由一适当的方法进行治疗，例如静脉内给药，例如作为推注或通过连续输注一段时间，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内，鞘内腔、口服，吸入或局部途径。用于液体制剂的市售喷雾器，包括喷射式喷雾器和超音波雾化器有助于给药。液体制剂可以直接雾化，而冻干粉末可以在重建后雾化。或者，包含如本文所述之PLY4胜肽的组合物可以使用氟碳制剂和计量剂量吸入器雾化，或作为冻干和研磨的粉末吸入。

本文使用之“有效量”乙词是指在接受治疗的个体或细胞中赋予预期生物学效应的活性成分的量。有效量可以根据各种原因改变，例如给药途径和频率、体重和接受该药物的个体的物种，以及给药之目的。基于本文的公开内容、已建立的方法及其经验，本领域技术人员可以在每种情况下确定剂量。

通过本文所述方法治疗的个体可以是哺乳动物，更优选人类。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人类个体可能是患有、有风险、疑似患有目标疾病/障碍，例如糖尿病，其并发症或动脉粥状硬化。可以通过常规医疗检验，例如实验室检查、器官功能测试、CT扫描或超音波来确认具有目标疾病或病症的个体。怀疑有任何此类目标疾病/病症的个体可能显示该疾病/病症的一种或多种症状。具有患有该疾病/障碍风险的个体可以是带有该疾病/病症的一种或多种危险因素的个体。

TLR-4活化异常与不同的疾病和病症有关。在本发明中首先公开了TLR-4信号传导涉及糖尿病的发展和进展，故可以通过抑制TLR-4活化来治疗糖尿病。因此，于一实施例中，通过抑制TLR-4活化来治疗的目标疾病为糖尿病或其并发症。糖尿病并发症的实例包括糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病性肾病变、糖尿病性神经病变、糖尿病性心血管疾病，以及糖尿病性皮肤病，但不限于此，只要该并发症可由糖尿病引起即可。为了治疗糖尿病或其并发症，可以将PLY胜肽以有效降低个体血糖含量及/或增加胰岛素含量的量给予需要治疗的个体。

于具体实施例中，与TLR-4活化相关的疾病或病症是由于TLR4活化引起的发炎性疾病。于某个实施例中，与TLR-4活化相关的疾病或病症为动脉粥状硬化。在具体实施例中，该个体患有糖尿病或不患有糖尿病。

与异常TLR-4活化相关的其它疾病/病症包括但不限于动脉粥状硬化、心血管疾病、视网膜病变、肾肥大和功能障碍、直肠癌进展和转移、胃癌进展、动脉粥状硬化、牙周病、尿道感染等发炎性疾病。

于一些具体实施例中，个体或受试者可以为患有动脉粥状硬化或具有患有动脉粥状硬化风险的哺乳动物，例如，超重或肥胖者、具有高血压或高血胆固醇者，摄取高脂肪饮食者，具有心脏病家族史者，患有糖尿病或吸烟者。

本文所用之“治疗”乙词是指将包括一种或多种活性剂的组合物施用或施用于受到疾病(例如糖尿病、动脉粥状硬化和其它发炎性疾病)、该疾病的症状或病症，或该疾病的进展或倾向所苦的个体，其目的为治愈、愈合、舒缓、缓解、改变、补救、改善，增进，或影响该疾病、该疾病的症状或病症、由该疾病诱导的残疾，或该疾病的进展或倾向。因此，“治疗”乙词还可以包括，取决于待治疗对象的状况、预防疾病，包括预防该疾症发作或与之相关的任何症状，以及降低或减轻该疾病的严重性，或发病前的任何症状。

以TLR-4拮抗剂治疗糖尿病

本揭露至少部分地基于TLR-4信号传导涉及糖尿病发展和进展的发现。据此，本文还提供了以TLR-4拮抗剂通过例如抑制TLR-4途径，以治疗糖尿病及/或缓解至少一种糖尿病的症状的方法，从而降低血糖含量及/或增加胰岛素含量。本文描述的方法将不会引起某些副作用，例如体重增加与心血管问题。

如本文所用，“TLR-4拮抗剂”乙词是指一种物质或药剂，该物质或药剂可以显着降低、抑制、阻断及/或减轻TLR-4活化，包括但不限于嗜中性粒细胞的活化、促发炎性物质(如ICAM-1、VCAM-1与E-选择蛋白)的产生，以及嗜中性粒细胞跨内皮迁移。TLR4是一种被详细描述特征的细胞表面受体。TLR4是LRR(富含白胺酸重复)家族的非典型成员，由N端、中心和C端结构域所组成。中心结构域的β折迭表现出非常小的半径和大扭转角度。MD-2是一种细胞外蛋白，与该N端和中心结构域的凹槽表面结合，形成用于LPS识别的TLR-4/MD2二聚体(Ohio U等人，Science(2007)316:1632-4；KIM HM等人，Cell(2007)130:906；Park BS等人，Nat(2009)458:1191)。于一些具体实施例中，如本文所用的TLR-4拮抗剂能够抑制MD2蛋白与TLR-4之间的相互作用，例如通过竞争TLR4中MD2的结合位点，从而显着降低、抑制、阻断及/或减轻TLR-4的活化。

除了本文所述之PLY胜肽之外，用于本文所述之用于糖尿病治疗方法的TLR-4拮抗剂可以包括抗TLR-4抗体、针对TLR-4基因的反义核酸分子、针对TLR-4核酸的小干扰RNA(siRNA)，或小分子TLR-4抑制化合物。

抗体(可与多形式互换使用)是一种通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点，而能够特异性结合一目标的免疫球蛋白分子，该目标例如为一碳水化合物、多核苷酸、脂质、多胜肽等。如本文所用，“抗体”乙词不仅涵盖完整(即，全长)多株或单株抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型，其包含具有所需特异性的抗原识别位点，包括抗体的糖基化变体、抗体的胺基酸序列变体，以及共价修饰的抗体。抗体包括任何类别的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，且抗体不需要具有任何特定的类别。取决于其重链恒定结构域的抗体胺基酸序列，免疫球蛋白可以分配到不同的类别。存在五种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG，以及IgM，其中几种可进一步分为亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ，以及μ。不同类别的免疫球蛋白的次单位结构及三维构型是众所周知的。

用于本文所述方法的抗体可以是小鼠、大鼠、人类或任何其它来源(包括嵌合或人源化抗体)。于一些实施例中，抗体包含修饰的恒定区，例如免疫惰性的恒定区，例如不引发补体调节的裂解，或不刺激抗体依赖性细胞调节的细胞毒性(ADCC)。ADCC活性可以使用美国专利号5,500,362中所公开的方法来分析。于其它的具体实施例中，恒定区的修饰如Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624、PCT申请号PCT/GB99/01441，及/或英国专利申请号9809951.8所述。

本文所述之任何抗体可以是单株或多株的。“单株抗体”是指同源的抗体群体，“多株抗体”是指异源的抗体群体。这两个术语并不限制抗体的来源或其制备方式。

在一个实施例中，本文所述方法中使用的抗体为人源化抗体。人源化抗体是指非人类(例如小鼠)抗体的形式，其为含有源自于非人类免疫球蛋白的最小序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链，或其抗原结合片段。在大多数情况下，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(complementary determining region，CDR)的残基被来自非人类的物种(供体抗体)的CDR的残基替代，例如具有所需特异性、亲和力和容量的小鼠、大鼠，或兔。于一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人类残基代替。此外，人源化抗体可以包含未在受体抗体中也未在引进的CDR或框架序列中发现的残基，而是包括进一步改进和优化的抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部至少一个，通常为两个可变结构域，其中对应于非人类免疫球蛋白的所有或基本上所有的CDR区域，以及所有的或基本上所有的FR区域为人类免疫球蛋白共有序列的那些区域。人源化抗体最优还将包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常为人类免疫球蛋白的恒定区或结构域(Fc)。抗体可以具有如WO99/58572中所述修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，其也被称为一个或多个“源自”一个或多个来自原抗体的CDR。人源化抗体也可能涉及亲和力成熟。

于另一实施例中，本文所述之抗体为嵌合抗体，其可以包括来自人类抗体的重恒定区和轻恒定区。嵌合抗体是指具有来自第一物种的可变区或可变区的一部分，以及来自第二物种的恒定区的抗体。通常，在这些嵌合抗体中，轻链和重链的可变区模拟来自一种哺乳动物(例如，非人类哺乳动物，如小鼠、兔和大鼠)的抗体的可变区，而恒定部分与源自另一哺乳动物如人类的抗体中的序列同源。于一些具体实施例中，可以在可变区及/或恒定区中进行胺基酸修饰。

于一些实施例中，本文揭露的抗体特异性结合目标抗原，例如人类TLR-4。“特异性结合”(本文可互换使用)到一目标或一抗原决定位的抗体是本领域中众所周知的术语，且确定此类特异性结合的方法也是本领域熟知的。如果分子与其它目标相比更频繁地、更快速地以更长的时间及/或具有比特定目标抗原更高的亲和力反应或相关联，则表示为“特异性结合”。如果比起抗体与其他物质的结合，该抗体以更高的亲和力、结合力，更容易及/或更长的持续时间与目标抗原结合，则其“特异性结合”目标抗原。例如，特异性(或优先)结合一TLR-4抗原决定位的抗体，是以比结合其他TLR-4抗原决定位或非TLR-4抗原决定位，具有更高的亲和力、结合力、更容易及/或更长时间结合该TLR-4抗原决定位的抗体。通过阅读本定义也可以理解，例如，特异性结合第一目标抗原的抗体可以或可不特异性地或优先地结合第二目标抗原。因此，“特定结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可以包括)排他性结合。通常，但不一定是，提及结合代表优先结合。

抗TLR-4抗体为一种能够与TLR-4结合并抑制由TLR-4信号传导调节的TLR-4生物活性及/或下游途径的抗体。于一些实施例中，本文所述方法中使用的抗TLR-4抗体抑制该TLR-4信号传导途径至少20％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％、至少100％，或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍，或至少1000倍。

抗TLR-4抗体对TLR-4(例如人类TLR-4)的结合亲和力可以小于约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM，或约50pM至约2pM中的任一种。结合亲和力可以表现为K_D或解离常数，且增加的结合亲和力对应于降低的K_D。确定抗体对TLR-4的结合亲和力的一种方法是通过测量抗体的单功能Fab片段的结合亲和力。为了获得单功能Fab片段，可以木瓜蛋白酶切割抗体(例如，IgG)或重组表现。可以通过表面等离振子共振(BIAcore3000^TM表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)系统，BIAcore公司，Piscaway，纽泽西州)测定抗体的抗TLR-4Fab片段的亲和力。获得动力学关联速率(k_on)和解离速率(k_off)(通常在25℃测量)；且平衡解离常数(K_D)值被计算为k_off/k_on。

于一些具体实施例中，该抗体与人类TLR-4结合，且不显着结合来自另一种哺乳动物物种的TLR-4。于一些具体实施例中，该抗体与人类TLR-4结合，也与来自另一种哺乳动物物种的一种或多种TLR-4结合。

能够干扰本文所述之TLR-4信号传导途径的抗体可以通过本领域已知的任何方法制备。参见例如Harlow和Lane，(1988年)Antibodies:A Laboratory Manual，冷泉港实验室，纽约。

于一些具体实施例中，可以通过常规融合瘤技术制备对目标抗原(例如，人类TLR-4)特异性的抗体。任选与载体蛋白如KLH偶联的全长目标抗原或其片段可用于免疫宿主动物以产生结合该抗原的抗体。如本文进一步所述，宿主动物的免疫途径和时间表通常与用于已建立的抗体刺激和产生的常规技术保持一致。用于生产小鼠、人源化和人类抗体的一般技术是本领域已知的，并且在本文中进行描述。预期包括人类的任何哺乳动物个体或其产生抗体的细胞可以被操纵，以用于生产哺乳动物，包括人类融合瘤细胞株，之基础。通常，使用一定量的免疫原，包括本文所述者，以腹膜内、肌肉内、口服、皮下、眼内及/或皮内途径接种宿主动物。

融合瘤可由淋巴细胞及永生化的骨髓瘤细胞所制备，通过使用Kohler,B.与Milstein,C.(1975年)Nature 256:495-497所述的一般体细胞杂交技术，或由Buck,D.W.等人，In Vitro,18:377-381(1982年)修改的方法进行。可得之骨髓瘤细胞，包括但不限于X63-Ag8.653以及来自美国加州圣地亚哥细胞分布中心的Salk研究所的那些骨髓瘤细胞，是可用于杂交。通常，该技术涉及使用例如聚乙二醇的融合剂来融合骨髓瘤细胞与类淋巴细胞，或通过本领域技术人员熟知的电子方式进行。融合后，将细胞与融合培养基分离，并在选择性生长培养基，例如次黄嘌呤-胺基蝶呤-胸苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine，HAT)培养基中生长，以除去未杂交的亲本细胞。补充含有或不含血清的本文所述之任何培养基可用于培养分泌单株抗体的融合瘤。作为细胞融合技术的另一替代方案，EBV永生化B细胞可用于产生本发明的抗TLR-4单株抗体。如果需要，将融合瘤扩增并进行次选殖，并通过常规免疫测定方法(例如，放射免疫测定、酵素免疫测定，或荧光免疫测定)测定上清液的免疫原活性。

可以作为抗体来源的融合瘤包括产生能够干扰TLR-4信号传导途径的单株抗体的所有衍生物、母本融合瘤的后代细胞。产生这种抗体的融合瘤可以使用已知的方法在体外或体内生长。如果需要，可以通过常规的免疫球蛋白纯化方法，如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、色层分析和超过滤，从培养基或体液中分离出单株抗体。如果存在不想要的活性，可以通过，例如，在附着于固相的免疫原所制成的吸附剂上运行该制剂，并从该免疫原中洗脱或释放所需之抗体，以除去不想要的活性。以目标抗原或含有与待免疫之物种中具免疫原性的蛋白质(例如，匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合的目标胺基酸序列的片段，使用双功能或衍生的药剂(例如，马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱胺酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过离胺酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐，SOCl或R1N＝C＝NR，其中R与R1是不同的烷基)，免疫宿主动物，可产生一群抗体(如，单株抗体)。

如果需要，可以对目标(例如，由融合瘤产生)抗体(单株或多株)进行定序，然后将多核苷酸序列选殖到用于表现或繁殖的载体中。编码目标抗体的序列可以在宿主细胞内的载体中被维持，然后可以扩增及冷冻宿主细胞以备将来使用。或者，多核苷酸序列可用于遗传操作以使抗体“人源化”或提高抗体的亲和力(亲和力成熟)或其他特征。例如，如果该抗体用于人类的临床试验和治疗，则恒定区域可被设计为更类似于人类的恒定区域以避免免疫反应。可能需要遗传操纵抗体序列以获得对目标抗原的更大亲和力，并且在抑制由TLR-4调节的信号传导途径方面具有更大的功效。对于本领域技术人员显而易见的是，可以对抗体进行一种或多种多核苷酸改变，并且仍然保持其与目标抗原的结合特异性。

于其他具体实施例中，可以通过使用经遗传工程化以表现特定人类免疫球蛋白质的市售小鼠来获得完全人类抗体。设计用于产生更理想(例如完全人类抗体)或更强健的免疫反应的基因转殖动物也可用于产生人源化或人类抗体。这种技术的例子是来自Amgen公司(Fremont，加州)的Xenomouse^RTM，以及来自Medarex公司(Princeton，纽泽西州)的HuMAb-Mouse^RTM与TC Mouse^TM。于另一个替代方案中，抗体可以通过噬菌体展示技术重组制备。参见，例如，美国专利第5,565,332号；5,580,717；5,733,743；以及6,265,150；以及Winter等人(1994年)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。或者，噬菌体展示技术(McCafferty等人，(1990年)Nature 348：552-553)可用于从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库中，在体外产生人类抗体和抗体片段。

可以通过常规方法制备完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段。例如，F(ab’)2片段可以通过胃蛋白酶消化抗体分子来产生，且Fab片段可以通过还原F(ab’)2片段的二硫键来产生。

遗传工程改造的抗体，如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体，以及双特异性抗体，可以通过例如常规重组技术产生。于一实施例中，可以使用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码单株抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并定序编码针对目标抗原特异性的单株抗体的DNA。融合瘤细胞作为这种DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于一个或多个表现载体中，然后将其转染至宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞蛋白质，以获得在重组宿主细胞中单株抗体的合成。参见，例如，PCT公开号WO 87/04462。然后，该DNA可以被修饰，例如，通过以编码人类重链和轻链恒定结构域的序列来取代同源的小鼠序列，Morrison等人(1984年)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851，或通过共价连接到免疫球蛋白编码序列全部或部分非免疫球蛋白多胜肽的编码序列。以这种方式，遗传工程化抗体，例如“嵌合”或“杂合”抗体，可以制备具有目标抗原的结合特异性。

为生产“嵌合抗体”开发的技术为本领域公知的。参见，例如，Morrison等人(1984年)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81:6851；Neuberger等人(1984年)Nature 312,604；以及Takeda等人(1984年)Nature 314:452。

构建人源化抗体的方法也是本领域熟知的。参见，例如，Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989年)。于一实施例中，使用本领域已知的方法对亲本非人类抗体的V_H和V_L的可变区进行三维分子模型分析。接着，使用相同的分子模型分析来确定预测对于形成正确CDR结构重要的框架胺基酸残基。并行地，使用母体V_H和V_L序列作为搜询条件，从任何抗体基因数据库找出具有与该亲本非人类抗体同源的胺基酸序列的人类V_H和V_L链。然后选择人类V_H和V_L受体基因。

选择的人类受体基因内的CDR区可用于取代来自亲本非人类抗体或其功能变体的CDR区。必要时，预测在与该CDR区相互作用中重要的亲本链的框架区域中的残基(见上文描述)可用于取代人类受体基因中相应的残基。

可以通过重组技术通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来制备单链抗体。优选地，在两个可变区之间并入柔性接头。或者，描述用于生产单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号和第4,704,692号)可被改用以产生噬菌体scFv文库，且可以从常规程序中从文库鉴定出对TLR-4特异性的scFv选殖株。可以对阳性选殖株进行进一步筛选以鉴定出抑制TLR-4活性的那些选殖株。

可以使用本领域已知的方法来描述依照本领域已知并在本文中描述的方法所获得的抗体的特征。例如，一种方法是用来鉴定抗原结合的抗原决定位，或“绘制抗原决定位地图”。有许多本领域已知的方法可用于对蛋白质上的抗原决定位的位置绘制地图及描述特征，包括解析抗体–抗原复合物的结晶结构、竞争分析、基因片段表现分析，以及基于合成的胜肽的分析，例如在Harlow和Lane所著之Using Antibodies,a Laboratory Manual，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1999年，一书的第11章。于另一实施例中，绘制抗原决定位地图可被用于确定抗体结合的序列。抗原决定位可以是线性抗原决定位，即包含在胺基酸的单段中，或由不一定包含在单段(一级结构线性序列)中的胺基酸的三维相互作用形成的构象抗原决定位。不同长度的胜肽(例如，至少4-6个胺基酸长)可以被分离或合成(例如，重组)，并用于与抗体的结合分析。于另一实施例中，抗体结合的抗原决定位可以通过使用衍生自目标抗原序列的重迭胜肽并确定抗体的结合而在系统筛选中确定。根据基因片段表现分析法，编码目标抗原的开放阅读框架随机地或通过特异性遗传构建进行片段化，并确定抗原的表现片段与待测抗体的反应性。例如，可以通过PCR产生基因片段，然后在放射性胺基酸的存在下，在体外转录并转译为蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳测定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。也可以通过使用显示在噬菌体颗粒表面上的大量随机胜肽序列库(噬菌体文库)来鉴定某些抗原决定位。或者，可以在简单结合测定中测试明确的重迭胜肽片段文库与测试抗体的结合。于另一实施例中，可以进行抗原结合结构域的突变分析、结构域交换实验分析，以及丙胺酸扫描式突变分析，以鉴定抗原决定位结合所需的、足够的及/或必需的残基。例如，可以使用目标抗原的突变进行结构域交换实验分析，其中该TLR-4多胜肽的各种片段已由来自密切相关但抗原性不同的蛋白质(例如，神经营养蛋白家族的另一成员)的序列所替换(交换)。通过评估抗体与突变体TLR-4的结合，可以评估特定抗原片段对抗体结合的重要性。

或者，竞争分析可以使用已知结合相同抗原的其它抗体来进行，以确定抗体是否结合与其它抗体相同的抗原决定位。竞争分析是本领域技术人员所公知的。

除了能够干扰如上所述之TLR-4信号传导途径的抗体之外的TLR-4拮抗剂可用于本文所述之方法中。

于本发明的一些具体实施例中，TLR-4拮抗剂包含至少一种能够阻断或降低功能性TLR-4(例如人类TLR-4)的表现的反义核酸分子。TLR-4基因的核苷酸序列是已知的，并且可从公众可获得的数据库中轻易地获得。参见上述揭露。制备不与其他多核苷酸交叉反应而特异性结合一目标mRNA的反义寡核苷酸分子是惯常的程序。目标的示例性位点包括但不限于起始密码子、5’调节区、编码序列，以及3’非转译区。于一些具体实施例中，寡核苷酸长度为约10至100个核苷酸，长度为约15至50个核苷酸，长度为约18至25个核苷酸或更长。寡核苷酸可以包含骨架修饰，例如硫代磷酸酯键，以及本领域熟知的2’-0糖修饰。

或者，可以使用本领域所周知的基因剔除、吗啉代寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA或RNAi)、微RNA或核酶等方法降低TLR-4表现及/或释放。RNA干扰(RNAi)是dsRNA引导信使RNA的同源序列特异性降解的过程。在哺乳动物细胞中，RNAi可以通过小干扰RNA(siRNA)的21-核苷酸双链体触发而不会活化宿主干扰素反应。本文公开的方法中使用的dsRNA可以是siRNA(含有两个单独且互补的RNA链)或短发夹RNA(即，形成紧发夹结构的RNA链)，这两者都可以基于目标基因而被设计。或者，其可以是微小RNA。

可视需要地，如上所述之用于本文所述方法的核酸分子(例如，反义核酸、小干扰RNA，或微小RNA)包含非天然存在的核碱基、糖或共价核苷酸间键合(骨干)。这样的修饰的寡核苷酸赋予所需的性质，例如增强细胞吸收、改善对目标核酸的亲和力，以及增加体内稳定性。

于一实施例中，该核酸具有修饰的骨架，包括保留磷原子的骨架(参见，例如，美国专利号3,687,808；4,469,863；5,321,131；5,399,676；以及5,625,050)与不具有磷原子的骨架(参见，例如，美国专利号5,034,506；5,166,315；以及5,792,608)。含磷修饰的骨架的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基-磷酸三酯、甲基，以及其它烷基膦酸酯，包括3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯，以及手性膦酸酯、次膦酸酯，包括3’-胺基胺基磷酸酯以及胺基烷基磷酰胺化物的胺基磷酸酯、具有3’-5’键或2’-5’键的硫代磷酰胺化物、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒磷酸酯，以及硼烷化磷酸酯。这样的骨架还包括具有反转极性的那些骨架，即3’至3’、5’至5’，或2’至2’键。不包括磷原子的修饰骨架由短链烷基或环烷基核苷间键形成，混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些骨架包括那些具有吗啉键(部分由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰和硫代乙酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰乙酰骨架；核糖核心骨架；含烯烃的骨架；胺基磺酸盐骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基骨架；磺酸盐和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其他具有混合的N、O、S和CH₂组分的部分。

于另一实施例中，在所公开的方法中使用的核酸包括一个或多个取代的糖部分体。这种取代的糖部分体可以在其2’位置包括以下基团之一：OH、F、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基，以及O-烷基-O-烷基。在这些基团中，烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基和炔基。它们还可以包括在其2’位置的杂环烷基、杂环烷基芳基、胺基烷基胺基、多烷基胺基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报导子基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团，或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团。优选的取代糖部分体包括具有2’-甲氧基乙氧基、2’-二甲基胺基氧乙氧基，以及2’-二甲基胺基乙氧基乙氧基的糖部分体。参见Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995年，78,486-504。

于另一实施例中，核酸包括一个或多个修饰的天然核碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。修饰的核碱基包括在美国专利号3,687,808、The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering，第858-859页，Kroschwitz,J.I.编辑，John Wiley&Sons出版社，1990年、Englisch等人，Angewandte Chemie，国际版，1991年,30,613，以及Sanghvi,Y.S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302页，CRC出版社，1993年。核碱基特别可用于增加反义寡核苷酸与其目标核酸的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶，以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(例如2-胺基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶，以及5-丙炔基胞嘧啶)。参见Sanghvi等人编辑，AntisenseResearch and Applications，CRC出版社，Boca Raton，1993年，第276-278页)。

任何核酸可以通过本领域已知的方法合成。参见例如Caruthers等人，1992年，Methods in Enzymology 211,3-19、Wincott等人，1995年，Nucleic Acids Res.23,2677-2684、Wincott等人，1997年，Methods Mol.Bio.74,59、Brennan等人，1998年，BiotechnolBioeng.,61,33-45，以及Brennan，美国专利号6,001,311。其亦可以从表现载体转录并使用标准技术分离。

在其它具体实施例中，TLR-4拮抗剂包含至少一种TLR-4抑制化合物。如本文所用，“TLR-4抑制化合物”是指直接或间接减少、抑制、中和或消除TLR-4生物活性的抗TLR-4抗体以外的化合物。TLR-4抑制性化合物应显示以下特征中的一种或多种：(a)与TLR-4结合并抑制其生物活性及/或由TLR-4信息传递功能调节的下游途径；(b)降低个体的血糖含量，(c)增加个体的胰岛素含量，及/或(e)减轻与糖尿病相关的一种或多种并发症。本领域技术人员可以鉴定和制备这样的抑制性化合物。

于其它具体实施例中，本文所述之TLR-4抑制性化合物为小分子，其可以具有约100至20,000道尔顿、500至15,000道尔顿，或1000至10,000道尔顿中的任何一种的分子量。小分子的文库为市售可得。可以使用本领域已知的任何方法，包括吸入、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、鞘内腔、心室内、口服、肠内、肠胃外、鼻内或皮肤中的方式施用该小分子。通常，当根据本发明的TLR-4拮抗剂为小分子时，其将以0.1至300mg/kg患者体重的剂量施用，分配为一至三次或更多的剂量。对于正常体重的成年患者，可以施用的剂量范围为每剂量1mg至5g。

上述小分子可以从化合物文库获得。文库可为空间上可确定位置的平行固相文库或液相文库。参见，例如Zuckermann等人，J.Med.Chem.37,2678-2685，1994年；以及LamAnticancer Drug Des.12:145,1997年。化合物文库的合成方法是本领域熟知的，例如DeWitt等人PNAS USA90:6909,1993年；Erb等人PNAS USA 91:11422,1994年；Zuckermann等人，J.Med.Chem.37:2678,1994年；Cho等人，Science 261:1303,1993年；Carrell等人AngewChem.Int.Ed.Engl.33:2059,1994年；Carell等人Angew Chem.Int.Ed.Engl.33:2061,1994年；以及Gallop等人J.Med.Chem.37:1233,1994年。化合物的文库可以存在于溶液中(例如，Houghten Biotechniques 13:412-421,1992年)或珠子上(Lam Nature354:82-84,1991年)、芯片(Fodor Nature 364:555-556,1993年)、细菌(美国专利号5,223,409)、孢子(美国专利号5,223,409)、质粒(Cull等人，PNAS USA 89:1865-1869,1992年)或噬菌体(Scott和Smith Science249:386-390,1990年；Devlin Science 249:404-406,1990年；Cwirla等人，PNAS USA 87:6378-6382,1990年；Felici J.Mol.Biol.222:301-310,1991；以及美国专利号5,223,409)。

示例性TLR-4抑制性化合物包括，但不限于，(1)TLR4-IN-C34，其是为通过与MD2的疏水口袋对接抑制TLR4信号传导的胺基单醣(Matthew D等人，PLoS One(2013年)8:e65779)，(2)NBP2-26244，其是为通过阻断TLR4与其细胞内衔接蛋白(Mal/TIRAP和TRAM)之间的相互作用来抑制TLR4信号传导的胜肽(Lysakova-Devine T等人，J Immunol.(2010)185:4261)，以及(3)CLI-095，其是为通过阻断TLR4的细胞内结构域而不是细胞外结构域来抑制TLR4信号传导的环己烯衍生物(Li M等人，Mol.Pharmacol(2006年)69:1288-95)。

通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例是为了演示而不是为了限制目的而提供的。鉴于本案，本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施例中进行许多改变，并且仍然获得类似或相似的结果。

实施例

在本发明中，我们发现一来自肺炎链球菌的缺失结构域1-3的截短形式(合成胜肽)在高脂肪饮食模型中有效控制第二型糖尿病及其与动脉粥状硬化和肥胖相关的后果。本发明的PLY胜肽作为类铎受体第四型(TLR4)拮抗剂，而没有如全长Ply的溶血作用。没有观察到细胞凋亡和细胞毒性的触发。本发明的PLY胜肽在高饮食诱导大鼠模型和糖尿病基因剔除(db/db^-/-)小鼠模型中显示出对血糖控制的有效性和胰岛素的增加。在动物模型中观察到对照组和处理组之间ICAM-1、VCAM-1以及E-选择蛋白表现的显着变化。本发明的PLY胜肽显示在HUVAC中LPS活化的嗜中性粒细胞迁移的抑制作用，在层流低剪切应力下的细胞保护作用，并减少鼠动脉粥状硬化性炎症。

1.材料和方法

1.1肺炎球菌溶血素(PLY)、全长及其片段

全长肺炎球菌的肺炎球菌溶血素(PLY，1-471个胺基酸残基)及其片段，包括结构域4的片段(PLY4，360-471个胺基酸残基)、C-末端70个胺基酸片段(C70PLY4，402-471个胺基酸残基)、C70PLY4的N端35个胺基酸片段(N35PLY4，402-436个胺基酸残基)、具有一个突变(N35PLY4m25K)的C70PLY4的N端35个胺基酸片段、具有两个突变(N35PLY4m24L25K)的C70PLY4的N端35个胺基酸片段，以及具有前5个胺基酸残基缺失(M50PLY4)的C70PLY4的N端50个胺基酸片段(M50PLY4)，如下表1所示，产生这些片段后并随后进行测定。

1.2肺炎球菌溶血素的重组结构域4(rPly4)之选殖株、表现和产生

使用含有Nde I限制酶切位的正向引子5’-GGAATTCCATATGAACGGAGATTTACTGCTG-3’(SEQ ID NO:15)，以及与编码序列互补并含有Xho I限制酶切位的反向引子5’-CCGCTCGAGGTCATTTTCTACCTTATCTTCTAC-3’(SEQ ID NO:16)进行Ply4基因的扩增。结果，重组蛋白的C端含有另外的组胺酸标签LEHHHHHH(SEQ ID NO:17)。使用Nde I和Xho I切位将PCR产物选殖到表现载体pET-22b(+)(Novagen公司，Madison，怀俄明州，美国)中，得到质体pPly4。

在来自Novagen公司(Madison，怀俄明州，美国)的BL21(DE3)Star中表现Ply4基因。在37℃下整夜培养以1mM IPTG诱导重组Ply4(rPly4)的表现，并离心收获细胞。

诱导rPly4后，将3.6公升的细胞培养物离心(6400×g，15分钟)，并将沉淀物重新悬浮于含有10mM咪唑，pH7.6的360mL磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)中。在法式细胞破碎机(Constant Systems，Daventry，英国)中以27Kpsi破坏细胞后，通过超高速离心(10,000×g，60分钟)澄清细胞裂解物。将上清液加载到9mL Ni-NTA树脂(Qiagen公司，San Diego，加州，美国)上。首先用均质缓冲液洗涤管柱(1.1cm i.d.×9.5cm)，然后以含有40mM咪唑的相同缓冲液洗涤。再以含有500mM咪唑的匀质缓冲液洗脱rPly4。多黏菌素B琼脂糖管柱(Pierce公司，Rockfold，伊利诺伊州，美国)用于去除脂多醣(lipopplysaccharide，LPS)。通过鲎变形细胞裂解物(Limulus amebocyte lysate，LAL)测定法(Cape Cod公司，Cape Cod，麻州，美国)测定每种目标蛋白中残留LPS的量。发现LPS含量低于3EU/mg。

通过重组技术以相似的方式制备全长PLY。

1.3胜肽的合成

使用芴基-甲氧基羰基(Fmoc)基团进行α-胺基保护的自动化胜肽合成仪(来自Protein Technologies公司的PS-3型)，通过固相方法合成各种PLY片段。使用的树脂衍生自具有改质的Rink连接符(Merck公司，Darmstadt，德国)的NovaSyn TGR树脂。用叔丁氧基羰基(tBoc)保护色胺酸和离胺酸残基，以2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)组保护精胺酸残基。最后的去阻隔步骤以TFA/三异丙基硅烷/水(94:3:3)的混合物进行。通过使用乙醚作为非溶剂来沉淀回收粗胜肽，并通过分析型反相HPLC进行特征分析。在Agilent 1100系列LC/MSD高性能离子阱质谱仪上进行质谱分析，以确保获得目标胜肽。C70PLY4由英国Almac Sciences公司合成。并以这种方式合成其他PLY胜肽。

1.4高脂肪饮食(HFD)诱导的第二型糖尿病大鼠

将Sprague-Dawley大鼠分配到两种饮食方案，最初2周进行自由喂食正常饮食或高脂肪饮食(HFD)。经过2周的饮食操作后，以低剂量的STZ(35mg/kg体重)对喂食HFD的大鼠组进行腹膜内注射(i.p.)，同时以相应的剂量腹膜内注射给予对照大鼠体积为1mL/kg的柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5)载剂。STZ注射后7天，筛选大鼠的血糖含量。整夜禁食(10-12小时)的动物通过胃插管给予葡萄糖(3g/kg体重)。口服给予葡萄糖2小时后，从侧尾静脉采取血液样品，静置凝固离心；然后测量血清葡萄糖浓度。在葡萄糖摄入2小时后，血清葡萄糖≥200mg/dL的大鼠被认为是糖尿病患者，并进一步进行药物研究。允许大鼠继续喂养各自的饮食直到研究结束(16)。

将实验动物分为三组，每组包含六只大鼠，分组如下：(1)第1组作为对照组大鼠(非DM对照组)；(2)第2组作为糖尿病对照组大鼠(STZ+载剂组)；以及(3)第3组作为糖尿病治疗大鼠，以腹腔注射施用在水性悬浮液中的C70PLY4(2mg/kg/3天)共30天(STZ+C70PLY4组)。在实验结束时，牺牲动物，取得血液样品、肌肉及肝脏。

1.5糖尿病基因剔除小鼠(C57BL/KsJ-db/db)

将新到的5周龄(23g)的雄性C57BL/KsJ-db/db小鼠(糖尿病缺乏型剔除小鼠)以颗粒状的市售饲料喂食，使其适应2周。将所有小鼠保持在受控制的明暗周期(12:12小时，上午8:00亮灯)及恒温(25℃)。这些小鼠可自由摄取食物及蒸馏水，且分别于每日及每周测量食物的摄取及体重的增加。将动物随机分为两组，每组包含6只小鼠，分组如下：(1)第1组作为对照组小鼠(载剂组)；以及(2)第2组作为糖尿病小鼠，以腹腔注射存在于水性悬浮液中的C70PLY4(2mg/kg/3天)共30天(C70PLY4组)。在实验结束时，所有小鼠在禁食12小时后以氯胺酮麻醉，并自下腔静脉采集血液样品到涂布有肝素的试管中。血液在4℃下以1000g离心15分钟，以分离血浆及红血球。移除肝脏及脂肪组织、洗涤、称重，并冷冻于-70℃直到分析。

1.6葡萄糖含量的测量

使用血糖测试纸及血糖监测系统测定在上午10点及中午之间收集的尾巴上的一滴血液的全血糖值。使用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂套组比色测定葡萄糖浓度。将样品与100μl测定试剂在37℃下作用30分钟，并在波长540nm下测量。数值以mg/dL表示。

1.7ELISA分析

血清中胰岛素、sICAM-1、sVCAM-1，以及E-选择素的含量通过使用三明治ELISA(R&D)根据制造商的实验方法来测定。

1.8以苏木精和伊红(HE)染色进行小鼠主动脉的病理学分析

主动脉的上升部分取自小鼠，包括对照组健康小鼠以及有和没有C70PLY4治疗的HFD诱导的糖尿病小鼠，并将样本保持在10％甲醛中缓冲24小时。将样品以常规方式包埋在石蜡块中并以横切面(3μm)切割。载玻片以苏木精和伊红染色。用光学显微镜分析样品。

1.9TLR4缺陷型[TLR4(-/-)]C3H/HeJ小鼠及野生型C3H/HeN小鼠

为了从TLR4缺陷型[TLR4(-/-)]C3H/HeJ小鼠和野生型C3H/HeN小鼠获得小鼠嗜中性粒细胞，将0.1ml尿酸溶液注射到小鼠的腹膜腔中以诱导发炎反应。通过与盐水(10％[wt/vol])混合并以超音波处理10分钟制备尿酸溶液(非结晶形式)。在接种之前，将乳白色沉淀的尿酸溶液剧烈摇动。在以5ml冷磷酸盐缓冲盐水(PBS；总体积为10ml)注射灌洗腹腔二次后，于4、18或24小时时收集腹膜渗出液细胞。通过在4℃下以200×g离心10分钟洗涤尿酸诱导的腹膜细胞(Uric acid-induced peritoneal cells，UAPMN)。随后进行低渗裂解以消除红血球，进行离心及额外的洗涤。然后将细胞重新悬浮于Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液(KRG；pH7.3)中。分别以Türk试剂染色细胞核，并通过细胞离心，然后以May-Grünwald-Giemsa染色，来测定腹膜渗出液细胞的数量及族群。根据作用时间(4小时)，腹腔注射尿酸产生1至2×10⁷个细胞/小鼠的产量。在注射后4小时，尿酸诱导的PMN的纯度含量为95％。以台盼蓝排除法确定存活率超过95％的分离的嗜中性粒细胞。然后将TLR4(-/-)C3H/HeJ小鼠和野生型C3H/HeN小鼠的PMN用于PMN转移分析。

1.10人类脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)培养

HUVEC购自ScienCell Research Laboratories公司(加州，美国)。将沉淀物重新悬浮于补充有青霉素/链霉素以及20％胎牛血清(FBS)的M199培养基中，然后将细胞铺在细胞培养皿上。ECs在培养皿中培养3天，然后接种到预先涂有鼠尾第1型胶原蛋白的载玻片上。二次培养物在达到细胞长满后的两天内(约1-2×10⁵个细胞/cm²)用于实验。¹²

1.11人类及小鼠多形核白血球(polymorphonuclear leukocyte，PMNs)的分离

来自人类的中性粒细胞是以含有无防腐剂的肝素(最终浓度20U/ml)的注射器抽取而分离的血液，并与等体积的含有3％葡聚醣的PBS混合，然后在室温下作用20分钟。收集富含白血球的血浆(上层)，通过离心从血浆中获得沉淀的细胞，并重新悬浮于0.9％NaCl。将10ml Ficoll-Hypaque溶液分层于该细胞悬浮液下方。离心1500×g 20分钟后，吸出Ficoll-Hypaque层，留下嗜中性粒细胞/RBC颗粒。通过将每个嗜中性粒细胞/RBC沉淀物重新悬浮于冷的0.2％NaCl中30秒，对细胞进行低渗裂解。在此期间，通过加入冰冷的1.6％NaCl还原等渗透性。离心后，将细胞重新悬浮于冰冷的PBS/葡萄糖缓冲液中。如前所述，从腹膜中分离出来自小鼠的嗜中性粒细胞。参见，例如Rabes等人，Curr Top MicrobiolImmunol 397:215-227(2016年)。将细胞浓度调整至16,107个细胞/mL。分离的嗜中性粒细胞的活力超过95％，以台盼蓝排除法所确定。

1.12PMNs经内皮迁移

通过使用Transwell系统进行经内皮迁移。将Transwell过滤器以HUVEC单层预接种24小时，并转移至干净的24孔盘。将HUVEC以DPBS洗涤两次，将500μl ECM加到Transwell过滤室中，然后在上腔室中加入10⁶个嗜中性粒细胞。通过向下腔室加入LPS至1μg/ml的终浓度来刺激经内皮迁移。将细胞与内皮细胞在37℃作用1小时。在作用结束时，从下腔室收集迁移的细胞，并以血球计数器计数，进行三重复。通过将从下腔室回收的PMN的数量除以最初添加的PMN的数量来计算PMN迁移百分比。

1.13MD2和类铎受体(TLR)第四型的体外蛋白结合分析

将重组TLR4蛋白质在磷酸盐缓冲溶液(PBS)(2μg/mL)中稀释，并通过在37℃下培养以固定在96孔(100ng/孔)酵素联结免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)盘上2小时。孔盘以PBS洗涤三次，然后加入含有300μL 5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS于环境温度下整夜作用以进行阻隔作用。然后，在加入各种浓度(从133.3至0.065nM的2倍连续稀释液)的重组MD2蛋白溶液之前，孔盘以PBST(含有0.05％Tween 20溶液的PBS)清洗3次。将配体(MD2)和TLR4蛋白在37℃下培养2小时，然后孔盘以PBST洗涤3次，再加入100μL以1％BSA稀释(1:1000)的抗MD2抗体。在环境温度下作用1小时后，将孔盘以PBST洗涤3次，然后加入100μL以1％BSA稀释(1:2000)的抗小鼠IgG-HRP抗体。在环境温度下作用1小时后，将孔盘以PBST洗涤3次，然后在每个孔中加入100μL的HRP基质(即3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，TMB)。在环境温度下作用5分钟后，通过在每个孔中加入50μL终止液(2NH₂SO₄)终止反应。使用ELISA盘读取器测定每个孔中的光密度(OD₄₅₀)。使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software公司，San Diego，加州)通过非线性回归分析计算以nM为单位的结合亲和力。

1.14体外蛋白竞争结合分析(C70PLY4、N35PLY4和M50PLY4用于MD2/TLR4交互作用)

将重组TLR4蛋白质在PBS(2μg/mL)中稀释，并通过在37℃下作用2小时以将其固定在96孔(100ng/孔)ELISA盘上。将孔盘以PBS洗涤三次，然后在环境温度下加入300μL 5％BSA的PBS溶液阻隔整夜。然后，以PBST将孔盘重新洗涤三次，然后进行竞争结合分析。通过加入各种量的(50μM至3.05nM的2倍连续稀释液)C70PLY4、N35PLY4或M50PLY4胜肽来竞争MD2(50nM)与TLR4的结合，而使用以1％BSA稀释的如本文所述之抗-MD2抗体以及抗-小鼠-IgG-HRP抗体来检验残留的结合。

1.15西方墨点分析

保持细胞作为对照组，以LPS(1μg/mL)处理或以LPS(1μg/mL)与C70PLY4(100、300以及500nM)共同处理24小时，并以西方墨点分析法检测ERK1/2与NFκB-p65次单位的磷酸化。通过刮取方式收集细胞，并以含有1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS，以及蛋白酶抑制剂混合物(PMSF、抑胜肽酶，以及原钒酸钠)的RIPA缓冲液裂解。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(10％跑胶用，4％堆栈用)分离总细胞裂解物(50μg蛋白质)并转移到聚偏二氟乙烯膜(Immobilon P，孔径0.45μm)上。然后将膜与指定的抗体一起作用。使用Western-Light化学发光检测系统(Applied Biosystems公司，Foster City，加州)进行免疫检测。

1.16剪切应力实验

将HUVEC安装在平行板流动室中的载玻片上，其连接到灌注环系统(15)。将系统保持在恒定温度，通过用5％CO₂放气保持在pH 7.4。在灌注期间，培养基的渗透浓度保持在285-295mOsm/kg的范围内。流道宽度(w)为1cm，通道高度(h)为0.025cm。通过使用公式τ＝6μQ/wh₂估计对HUVECs进行的流体剪切应力(τ)，其中μ为介质的黏度，Q为流量。在本研究中施加的流体剪切应力为4dynes/cm²。将细胞安装在载玻片上，在存在或不存在100mM各种PLY胜肽的情况下，在37℃，5％CO₂下，以M199培养基作用1小时，然后暴露于4dyn/cm²的剪切应力6小时。对照组细胞与静态培养基同时作用。

1.17免疫荧光显微镜

在暴露于具有或不具有胜肽处理的剪切应力之后，洗涤HUVEC，以4％甲醛固定，并以含有1％Triton X-100的PBS在37℃下透化30分钟。然后以含有0.1％Triton X-100以及10％牛血清白蛋白(BSA)的PBS将细胞阻隔1小时。通过以鬼笔环胜肽-荧光素异硫氰酸酯(FITC)(1:1000eBioscience)在室温下染色1小时，检测细胞质内F-肌动蛋白免疫荧光，并以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在室温下进行细胞核染色10分钟。以具有CCD的荧光显微镜(OLYMPUS公司)拍摄荧光细胞。

1.18细胞存活力测定

通过甲磺酸盐(MTS)分析法检测细胞存活力。简而言之，将2×10⁴个HUVEC接种到一个48孔盘中，每孔含有100μl的内皮细胞培养基(ECM，ScienCell Research Laboratory公司，型号1001，美国)并作用24小时。去除培养基，然后将细胞与具有2％胎牛血清(FBS)的培养基一起培养，该培养基分别具有或不具有浓度为1、10，或100nM的各种胜肽，例如PLY、PLY123、PLY4、C70PLY4或N35PLY4。培养18小时后，除去培养基，将最终体积为100μl的20μlMTS试剂(20％)加入各孔中，置于培养箱中1小时。以培养盘读取器在波长490nm下测量光密度。

1.19细胞凋亡

通过使用市售末端脱氧核苷酸转移酶-dUTP切口末端标记(transferase-dUTPnick end labeling，TUNEL)与半胱天冬酶-3活性套组，即Apo-BrdU原位DNA片段化分析套组(BioVision公司)与NucView^TM488半胱天冬酶-3酵素基质(Biotium公司)检测细胞凋亡。简言之，在存在或不存在100mM各种PLY胜肽的M199培养基中，于37℃，5％CO₂下培养1小时，以PBS洗涤HUVEC并以固定缓冲液在冰上固定20分钟。然后将细胞在70％乙醇中浸泡1小时。经洗涤缓冲液清洗2次后，细胞于37℃在DNA标记溶液中作用60分钟。然后用漂洗缓冲液处理细胞，并在室温下与抗体缓冲液作用30分钟。细胞核以碘化丙啶染色30分钟。通过荧光显微镜及摄影电荷耦合装置(CCD)照相机观察样品。活细胞呈红色荧光，而凋亡细胞为绿色荧光。

关于半胱天冬酶-3活性测定，在变体胜肽处理之后，以PBS洗涤HUVEC。然后将细胞与半胱天冬酶-3基质1mM在室温下反应30分钟。然后通过荧光显微镜和CCD照相机观察细胞。具有半胱天冬酶-3活性的细胞将呈现绿色荧光。

1.20统计学分析

结果表示为平均值±标准误差(SEM)。通过使用独立的学生氏t检验对两组数据进行分析，并以方差分析(ANOVA)进行统计分析，接着以Scheffe检验进行多次比较。P值小于0.05者被认为是显着的。

2.结果

2.1高脂饮食(HFD)诱导的第二型糖尿病大鼠模型中的血糖和胰岛素含量

在STZ诱导的DM大鼠中评估C70PLY4对血糖和血液胰岛素含量的影响。

给予STZ+载体的大鼠与非糖尿病(DM)对照组相比，显示血糖含量升高且血液中胰岛素含量降低。然而，与施用载体的STZ注射的大鼠相比，施用C70PLY4的STZ注射的大鼠显示出降低的血糖及增加的血液胰岛素含量(图3与图4)。这些结果表明，C70PLY4在治疗第二型糖尿病方面具有潜在的作用。

2.2C57BL/KsJ-db/db糖尿病缺陷小鼠的血糖及体重

C57BL/KsJ-db/db小鼠已广泛用为第二型糖尿病的自发性糖尿病模型，以研究糖尿病的发病机制。C57BL/KsJ-db/db小鼠在瘦素受体基因(肥胖调节基因)中带有突变，是肥胖诱导的第二型糖尿病小鼠的良好模型(22)。在本研究中，实验开始时，所有C57BL/KsJ-db/db小鼠均为患有糖尿病，如血糖含量所示。在db/db小鼠中评估C70PLY4对血糖含量及体重的影响。结果显示，在为期二周的实验期之后，C70PLY4与对照组相比，血糖含量(图5)及体重(图6)显着降低。这些结果表明，C70PLY4有效改善了糖尿病进展。

2.3HFD诱导的第二型糖尿病大鼠模型中sICAM-1、sVCAM-1以及sE-选择蛋白的血清含量

ICAM-1、VCAM-1和E-选择蛋白的血清含量是白血球与内皮粘附的重要介质，而且与糖尿病和相关并发症的风险，特别是动脉粥状硬化，显着相关。我们进一步评估了C70PLY4对STZ诱导的糖尿病大鼠体内sICAM-1、sVCAM-1和sE-选择蛋白的血清含量的影响。给予STZ和载剂的大鼠与非糖尿病的对照组相比，显示出sICAM-1、sVCAM-1和sE-选择蛋白含量的增加。然而，与施用载剂的STZ注射的大鼠相比，在STZ注射的大鼠中施用C70PLY4的大鼠显示出降低的sICAM-1(图7A)、sVCAM-1(图7B)和sE-选择蛋白(图7C)。这些结果表明，C70PLY4有效抑制血管细胞中促发炎性因子的产生和分泌，而且可能在治疗第二型糖尿病的动脉粥状硬化中具有重要的作用。

2.4STZ大鼠模型中的抗动脉粥状硬化

本研究确定C70PLY4是否减弱HFD喂养的大鼠动脉粥状硬化的状态。将大鼠分为四组：(1)对照组(非糖尿病组)，(2)糖尿病大鼠(STZ组，STZ为能够破坏哺乳动物胰脏中胰岛素生成β细胞并导致糖尿病的化学物质)，(3)糖尿病治疗对照大鼠(STZ+N-乙酰胞嘧啶(NAC)组，NAC为可用于改善动脉粥状硬化状态的还原型硫醇)(20)，(4)糖尿病治疗大鼠(STZ+C70PLY4组)。

通过HE染色，显示STZ促进主动脉的新内膜形成并导致STZ治疗的大鼠中的动脉粥状硬化的发展。在STZ+NAC组，NAC治疗可以部分改善STZ对新内膜形成的影响。令人惊讶的是，在STZ+C70PLY4组中，C70PLY4显着减弱STZ引起的新内膜形成状态(图8)。

2.5PLY胜肽在低剪切应力实验下表现出抗动脉粥状硬化的活性

比较HUVEC处于在静态下、低剪切应力下，以及低剪切应力但预处理C70PLY1小时的情况下。细胞处于6小时低剪切应力下表现出聚集排列(图9A)以及F-肌动蛋白的重构(图9B)。然而，C70PLY4的治疗几乎阻止了低剪切应力引起的形态变化(图9A)以及细胞骨架重塑(图9B)。C70PLY4的这种作用可以在低剪切应力下保持完整的内皮。

2.6本发明的PLY胜肽作为TLR4拮抗剂

PMN跨内皮迁移在动脉粥状硬化形成的早期阶段具有重要作用。已知LPS为一种通过活化TLR4蛋白而造成血管内皮细胞发炎的发炎性刺激剂(18)。为了评估本发明的PLY胜肽是否通过抑制TLR4活化而提供抗动脉粥状硬化的活性，在从不同组小鼠分离的PMN中进行PMN迁移测定，包括(1)没有LPS诱导的C3H/HeN[野生型(WT)]小鼠，(2)以1μg LPS诱导的野生型小鼠，以及(3)有或没有LPS诱导的TLR4(-/-)小鼠C3H/HeJ。

在比较没有LPS诱导的C3H/HeN[野生型(WT)]小鼠分离的PMN中获得的结果时，从以1μg LPS诱导的野生型小鼠分离的PMN显示出显着增加的跨内皮细胞迁移，但从不论有无LPS诱导的TLR4(-/-)小鼠C3H/HeJ分离的PMNs则无此现象(图10)。该结果表明，增加的细胞迁移是经由TLR4途径，且增加的细胞迁移是由LPS所刺激，而LPS是一种TLR4配体。

全长PLY的添加不影响野生型及TLR4(-/-)小鼠模型中的PMNs迁移。然而，在野生型小鼠模型中观察到附加的PLY4及C70PLY4对PMNs细胞迁移的显着抑制，而TLR4(-/-)小鼠模型中没有发生这种现象(图10)。该结果表明PLY4及C70PLY4作为TLR4拮抗剂。

进一步研究本案的各种PLY胜肽的动脉粥状硬化活性。图11-12显示，全长PLY增强LPS引起的PMN迁移；相较之下，PLY4、C70PLY4、N35PLY4，以及突变胜肽(N35PLY4m25K与N35PLY4m24L25K)在LPS诱导的PMN迁移中具有抑制作用，其可以抑制PMN渗入血管壁。具有沉默突变的35个胺基酸片段(例如，N35PLY4m25K以及N35PLY4m24L25K)的功能变体也具有抗动脉粥状硬化的活性。结果显示N35PLY4(SEQ ID NO:5)足以具有TLR4拮抗剂的作用，且显示出抑制TLR-4配体诱导的PMNs细胞迁移的抗动脉粥状硬化活性。

2.7本发明的PLY胜肽的N端模体“QDLTA”对于作为TLR4拮抗剂的功能是极为重要的

MD2是与TLR4蛋白的细胞外结构域相关的细胞外蛋白质。已经证明MD2蛋白对于LPS与TLR4蛋白的交互作用是不可缺的。Kobayashi等人，J.Immunol.176：6211-6218(2006年)。因此，为了确定C70PLY4在TLR4蛋白诱导功能中的作用，本研究通过体外结合分析及竞争结合分析法检测C70PLY4、MD2和TLR4蛋白之间的结合能力。将TLR4蛋白(2μg/mL)包覆在96孔盘上，将MD2蛋白以不同浓度(从133.3至0.065nM的2倍连续稀释液)加入到各孔中。显示出MD2蛋白对TLR4蛋白具有高结合亲和力，其K_d值为18.4±3.9nM(K_d值为解离常数，表示一半的蛋白质结合配体时的浓度)(图13A)。在竞争结合分析中，我们确定了C70PLY4、N35PLY4或M50PLY4胜肽与MD2及TLR4蛋白相互作用的阻断能力。N35PLY4与M50PLY4胜肽分别衍生自C70PLY4胜肽的第1至第35个胺基酸以及第6至第55个胺基酸；亦即M50PLY4覆盖除了前5个胺基酸(QDLTA，SEQ ID NO:9)以外的N35PLY4的所有胺基酸。在加入包覆有TLR4蛋白(2μg/mL)的孔之前，将MD2蛋白(50nM)与各种浓度(50μM至3.05nM的2倍连续稀释液)的C70PLY4、N35PLY4或M50PLY4胜肽混合。C70PLY4在MD2和TLR4蛋白之间的交互作用中显示出剂量依赖性的阻断能力，K_i为74.8nM(图13B)。N35PLY4显示出对MD2和TLR4蛋白交互作用的部分阻隔能力，K_i为11224.0nM。然而，M50PLY4未显示出竞争能力。此外，通过6.25μMC70PLY4以及50μM N35PLY4可以完全将MD2蛋白竞争掉。因此，这表明C70PLY4在TLR4诱导功能中的调节作用是通过竞争TLR4蛋白中MD2蛋白的结合位点。此外，N35PLY4和M50PLY4胜肽的竞争结果显示，C70PLY4的第1至第5个胺基酸(QDLTA)在C70PLY4和TLR4的交互作用中具有关键作用。C70PLY4若不具有胺基酸QDLTA，则将失去与TLR4交互作用的功能。

2.8本发明的PLY胜肽的TLR4拮抗活性涉及ERK1/2以及NFκB-p65信号传导途径

本研究通过使用西方墨点分析法确定C70PLY4是否抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)中LPS诱导的信号传导，包括蛋白质ERK1/2以及NFκB-p65次单位(图14A)。将细胞保持作为对照组、仅以LPS(1μg/mL)处理24小时，或以LPS(1μg/mL)以及C70PLY4(100、300，以及500nM)共处理24小时，并检测ERK1/2与NFκB-p65次单位的蛋白质磷酸化。显示LPS诱导在HUVEC中ERK1/2与NFκB-p65次单位皆有蛋白质磷酸化(图14A)。然而，以C70PLY4与LPS共处理细胞，则以剂量依赖性方式显着抑制LPS对ERK1/2与NFκB-p65次单位磷酸化的影响(图14B)。这些结果进一步表明本发明的PLY胜肽具有作为LPS/TLR4信号传导的潜在拮抗剂的功能，并通过ERK1/2与NFκB-p65信号传导途径。

2.9细胞毒性

通过使用MTS分析法检测每种胜肽对HUVECs的毒性(图15)。结果显示肺炎球菌溶血素(全长)在浓度为100nM时对细胞具有毒性，只有30％细胞存活；当PLY4浓度高时，PLY4显示出轻微的毒性；相比之下，相同浓度的C70PLY4与N35PLY4对HUVECs不具有毒性作用(图15)。在以下试验中使用的浓度(100nM)是基于MTS测定的结果，其对细胞是安全的。

显微镜分析显示，C70PLY4不影响HUVEC的细胞形态(图16)。MTS分析亦显示，C70PLY4与PLY4在浓度为100nM或更低时，对HUVECs不具有毒性作用(如上述结果2.9所示，数据未显示)。此外，使用TUNEL和半胱天冬酶-3活性分析法检测细胞凋亡。结果显示，与对照组细胞相比，C70PLY4不具有细胞凋亡的潜能，不论是以TUNEL法(图17A)或半胱天冬酶-3活性分析法(图17B)测试的凋亡模式皆无差异，而阳性对照组(以喜树碱，已知的细胞毒性植物生物碱)则具有约60％凋亡细胞。

序列表

<110> 碁米库斯生物科技股份有限公司

<120> 肺炎球菌溶血素胜肽作为对抗类铎受体第四型的拮抗剂的用途及治疗类铎受体第四型相关疾病的方法

<130> KMB0001TW

<150> US 62/305,164

<151> 2016-03-08

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 471

<212> 蛋白质

<213> 肺炎链球菌

<400> 1

Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met Asn Tyr Asp

1 5 10 15

Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gln Gly Glu Ser Ile Glu Asn Arg Phe

20 25 30

Ile Lys Glu Gly Asn Gln Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Ile Glu Arg

35 40 45

Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr Ala

50 55 60

Thr Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Glu

65 70 75 80

Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro

85 90 95

Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe

100 105 110

Leu Gln Val Glu Asp Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn

115 120 125

Asp Leu Leu Ala Lys Trp His Gln Asp Tyr Gly Gln Val Asn Asn Val

130 135 140

Pro Ala Arg Met Gln Tyr Glu Lys Ile Thr Ala His Ser Met Glu Gln

145 150 155 160

Leu Lys Val Lys Phe Gly Ser Asp Phe Glu Lys Thr Gly Asn Ser Leu

165 170 175

Asp Ile Asp Phe Asn Ser Val His Ser Gly Glu Lys Gln Ile Gln Ile

180 185 190

Val Asn Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Thr Val Ser Val Asp Ala Val Lys

195 200 205

Asn Pro Gly Asp Val Phe Gln Asp Thr Val Thr Val Glu Asp Leu Lys

210 215 220

Gln Arg Gly Ile Ser Ala Glu Arg Pro Leu Val Tyr Ile Ser Ser Val

225 230 235 240

Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Glu Thr Thr Ser Lys Ser

245 250 255

Asp Glu Val Glu Ala Ala Phe Glu Ala Leu Ile Lys Gly Val Lys Val

260 265 270

Ala Pro Gln Thr Glu Trp Lys Gln Ile Leu Asp Asn Thr Glu Val Lys

275 280 285

Ala Val Ile Leu Gly Gly Asp Pro Ser Ser Gly Ala Arg Val Val Thr

290 295 300

Gly Lys Val Asp Met Val Glu Asp Leu Ile Gln Glu Gly Ser Arg Phe

305 310 315 320

Thr Ala Asp His Pro Gly Leu Pro Ile Ser Tyr Thr Thr Ser Phe Leu

325 330 335

Arg Asp Asn Val Val Ala Thr Phe Gln Asn Ser Thr Asp Tyr Val Glu

340 345 350

Thr Lys Val Thr Ala Tyr Arg Asn Gly Asp Leu Leu Leu Asp His Ser

355 360 365

Gly Ala Tyr Val Ala Gln Tyr Tyr Ile Thr Trp Asn Glu Leu Ser Tyr

370 375 380

Asp His Gln Gly Lys Glu Val Leu Thr Pro Lys Ala Trp Asp Arg Asn

385 390 395 400

Gly Gln Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly

405 410 415

Asn Val Arg Asn Leu Ser Val Lys Ile Arg Glu Cys Thr Gly Leu Ala

420 425 430

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435 440 445

Arg Lys Arg Thr Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gln Val

450 455 460

Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp

465 470

<210> 2

<211> 359

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 2

Met Ala Asn Lys Ala Val Asn Asp Phe Ile Leu Ala Met Asn Tyr Asp

1 5 10 15

Lys Lys Lys Leu Leu Thr His Gln Gly Glu Ser Ile Glu Asn Arg Phe

20 25 30

Ile Lys Glu Gly Asn Gln Leu Pro Asp Glu Phe Val Val Ile Glu Arg

35 40 45

Lys Lys Arg Ser Leu Ser Thr Asn Thr Ser Asp Ile Ser Val Thr Ala

50 55 60

Thr Asn Asp Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Glu

65 70 75 80

Thr Leu Leu Glu Asn Asn Pro Thr Leu Leu Ala Val Asp Arg Ala Pro

85 90 95

Met Thr Tyr Ser Ile Asp Leu Pro Gly Leu Ala Ser Ser Asp Ser Phe

100 105 110

Leu Gln Val Glu Asp Pro Ser Asn Ser Ser Val Arg Gly Ala Val Asn

115 120 125

Asp Leu Leu Ala Lys Trp His Gln Asp Tyr Gly Gln Val Asn Asn Val

130 135 140

Pro Ala Arg Met Gln Tyr Glu Lys Ile Thr Ala His Ser Met Glu Gln

145 150 155 160

Leu Lys Val Lys Phe Gly Ser Asp Phe Glu Lys Thr Gly Asn Ser Leu

165 170 175

Asp Ile Asp Phe Asn Ser Val His Ser Gly Glu Lys Gln Ile Gln Ile

180 185 190

Val Asn Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Thr Val Ser Val Asp Ala Val Lys

195 200 205

Asn Pro Gly Asp Val Phe Gln Asp Thr Val Thr Val Glu Asp Leu Lys

210 215 220

Gln Arg Gly Ile Ser Ala Glu Arg Pro Leu Val Tyr Ile Ser Ser Val

225 230 235 240

Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Glu Thr Thr Ser Lys Ser

245 250 255

Asp Glu Val Glu Ala Ala Phe Glu Ala Leu Ile Lys Gly Val Lys Val

260 265 270

Ala Pro Gln Thr Glu Trp Lys Gln Ile Leu Asp Asn Thr Glu Val Lys

275 280 285

Ala Val Ile Leu Gly Gly Asp Pro Ser Ser Gly Ala Arg Val Val Thr

290 295 300

Gly Lys Val Asp Met Val Glu Asp Leu Ile Gln Glu Gly Ser Arg Phe

305 310 315 320

Thr Ala Asp His Pro Gly Leu Pro Ile Ser Tyr Thr Thr Ser Phe Leu

325 330 335

Arg Asp Asn Val Val Ala Thr Phe Gln Asn Ser Thr Asp Tyr Val Glu

340 345 350

Thr Lys Val Thr Ala Tyr Arg

355

<210> 3

<211> 112

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 3

Asn Gly Asp Leu Leu Leu Asp His Ser Gly Ala Tyr Val Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Tyr Ile Thr Trp Asn Glu Leu Ser Tyr Asp His Gln Gly Lys Glu Val

20 25 30

Leu Thr Pro Lys Ala Trp Asp Arg Asn Gly Gln Asp Leu Thr Ala His

35 40 45

Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly Asn Val Arg Asn Leu Ser Val

50 55 60

Lys Ile Arg Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val

65 70 75 80

Tyr Glu Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val Arg Lys Arg Thr Ile Ser Ile

85 90 95

Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gln Val Glu Asp Lys Val Glu Asn Asp

100 105 110

<210> 4

<211> 70

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 4

Gln Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly Asn

1 5 10 15

Val Arg Asn Leu Ser Val Lys Ile Arg Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp

20 25 30

Glu Trp Trp Arg Thr Val Tyr Glu Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val Arg

35 40 45

Lys Arg Thr Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gln Val Glu

50 55 60

Asp Lys Val Glu Asn Asp

65 70

<210> 5

<211> 35

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 5

Gln Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly Asn

1 5 10 15

Val Arg Asn Leu Ser Val Lys Ile Arg Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp

20 25 30

Glu Trp Trp

35

<210> 6

<211> 35

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 6

Gln Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly Asn

1 5 10 15

Val Arg Asn Leu Ser Val Lys Ile Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp

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Glu Trp Trp

35

<210> 7

<211> 35

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 7

Gln Asp Leu Thr Ala His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly Asn

1 5 10 15

Val Arg Asn Leu Ser Val Lys Leu Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp

20 25 30

Glu Trp Trp

35

<210> 8

<211> 50

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 8

His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly Asn Val Arg Asn Leu Ser

1 5 10 15

Val Lys Ile Arg Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr

20 25 30

Val Tyr Glu Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val Arg Lys Arg Thr Ile Ser

35 40 45

Ile Trp

50

<210> 9

<211> 5

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 9

Gln Asp Leu Thr Ala

1 5

<210> 10

<211> 30

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 10

His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly Asn Val Arg Asn Leu Ser

1 5 10 15

Val Lys Ile Arg Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp

20 25 30

<210> 11

<211> 47

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 11

Asn Gly Asp Leu Leu Leu Asp His Ser Gly Ala Tyr Val Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Tyr Ile Thr Trp Asn Glu Leu Ser Tyr Asp His Gln Gly Lys Glu Val

20 25 30

Leu Thr Pro Lys Ala Trp Asp Arg Asn Gly Gln Asp Leu Thr Ala

35 40 45

<210> 12

<211> 65

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 12

His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly Asn Val Arg Asn Leu Ser

1 5 10 15

Val Lys Ile Arg Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr

20 25 30

Val Tyr Glu Lys Thr Asp Leu Pro Leu Val Arg Lys Arg Thr Ile Ser

35 40 45

Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gln Val Glu Asp Lys Val Glu Asn

50 55 60

Asp

65

<210> 13

<211> 30

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 13

His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly Asn Val Arg Asn Leu Ser

1 5 10 15

Val Lys Ile Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp

20 25 30

<210> 14

<211> 30

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 14

His Phe Thr Thr Ser Ile Pro Leu Lys Gly Asn Val Arg Asn Leu Ser

1 5 10 15

Val Lys Leu Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp

20 25 30

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 15

ggaattccat atgaacggag atttactgct g 31

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 16

ccgctcgagg tcattttcta ccttatcttc tac 33

<210> 17

<211> 8

<212> 蛋白质

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多胜肽

<400> 17

Leu Glu His His His His His His

1 5

Claims (33)

1.一种分离的胜肽，包含：

(i)第一片段，其包含QDLTA(SEQ ID NO:9)的胺基酸模体；以及

(ii)第二片段，其包含与SEQ ID NO:10至少85％相同的胺基酸序列；

其中该第一片段的C端连接至该第二片段的N端；且其中该分离的胜肽之长度最多达150个胺基酸。

2.如权利要求1的分离的胜肽，其中该第二片段包含与SEQ ID NO:10至少90％相同的胺基酸序列。

3.如权利要求2的分离的胜肽，其中该第二片段包含与SEQ ID NO:10至少95％相同的胺基酸序列。

4.如权利要求1的分离的胜肽，其中该第二片段包括在SEQ ID NO:10中最多5个胺基酸残基处的突变。

5.如权利要求4的分离的胜肽，其中该第二片段包括在SEQ ID NO:10的位置19与20中的一个或多个处有一个或多个胺基酸取代。

6.如权利要求1的分离的胜肽，其中该第一片段如SEQ ID NO:11所示。

7.如权利要求1的分离的胜肽，其中该第一片段如SEQ ID NO:9所示。

8.如权利要求1的分离的胜肽，其中该第二片段如SEQ ID NO:10、12、13或14所示。

9.如权利要求1的分离的胜肽，其中该胜肽包含选自由SEQ ID NOs:3至7所组成之群组的胺基酸序列。

10.一种重组核酸，包含编码如权利要求1至9中任一项的胜肽的核苷酸序列。

11.如权利要求10的重组核酸，其为载体。

12.如权利要求11的重组核酸，其中该载体为表现载体。

13.一种宿主细胞，包含如权利要求10至12中任一项的重组核酸。

14.一种组合物，包含如权利要求1至9中任一项的胜肽或如权利要求10至12中任一项的核酸，以及生理学上可接受的载体。

15.如权利要求14的组合物，其是为医药组合物。

16.一种用于治疗有需要之个体的糖尿病或糖尿病并发症之方法，包含向该个体施用有效量的如权利要求1至9中任一项的胜肽、有效量的如权利要求10至12中任一项的核酸，或如权利要求13或14的组合物。

17.如权利要求16的方法，其中该胜肽的有效量、该核酸的有效量，或该组合物的有效量是足以降低该个体的血糖含量或增加胰岛素含量。

18.如权利要求16或17的方法，其中该糖尿病为第二型糖尿病。

19.如权利要求16至18中任一项的方法，其中该糖尿病并发症是选自于由下列所组成之群组：糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、糖尿病性肾病变、糖尿病性神经病变、糖尿病性心血管疾病，以及糖尿病性皮肤病。

20.如权利要求19的方法，其中该糖尿病性心血管疾病为动脉粥状硬化。

21.一种用于抑制个体体内类铎受体第四型(TLR-4)活性的方法，包含向有需要的个体施用有效量的TLR-4拮抗剂。

22.如权利要求21的方法，其中该TLR-4拮抗剂为如权利要求1至9中任一所述的胜肽。

23.如权利要求22的方法，其中该TLR-4拮抗剂为抗TLR-4抗体、靶向TLR-4的干扰核酸，或抑制TLR-4的小分子。

24.如权利要求21至23中任一项的方法，其中该TLR-4拮抗剂是阻断MD2蛋白与TLR-4之结合。

25.如权利要求21至24中任一项的方法，其中该个体为患有或疑似患有与TLR-4活化相关之疾病或病症的人类患者。

26.如权利要求25的方法，其中该与TLR-4活化相关之疾病或病症为由于TLR4活化所引起之发炎性疾病，特别是动脉粥状硬化。

27.如权利要求26的方法，其中该个体患有糖尿病或不患有糖尿病。

28.如权利要求27的方法，其中该个体为患有或疑似患有糖尿病或其并发症的人类患者。

29.如权利要求21至28中任一项的方法，其中该有效量的TLR-4拮抗剂是足以降低该个体的血糖含量或增加胰岛素含量。

30.如权利要求28的方法，其中该糖尿病为第二型糖尿病。

31.一种用于治疗与TLR-4有关的疾病的医药组合物，该组合物包含如权利要求1至9中任一所述的胜肽、如权利要求10至12中任一所述的核酸，或如权利要求14或15的组合物，以及医药上可接受的载体。

32.如权利要求31的医药组合物，其中该与TLR-4相关的疾病为糖尿病，可视需要为第二型糖尿病或动脉粥状硬化。

33.一种如权利要求1至9中任一项的胜肽、如权利要求10至12中任一项的核酸，或如权利要求14或15的组合物用于制备用于治疗与TLR-4相关的疾病之药物的用途。