TW202225185A - 再摺疊的人類血清白蛋白及其用於抗腫瘤的用途 - Google Patents
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Abstract
本公開揭露再折疊的人類血清白蛋白(rfHSA)及其用於抗腫瘤的用途,該rfHSA包含天然人類血清白蛋白的一級胺基酸序列,其中,溶液中的該rfHSA為橢圓形,非纖維狀,且該天然HSA為球狀。rfHSA係用於治療有需要的個體的癌症或腫瘤,該rfHSA還可用作檢測腫瘤樣本中是否存在與整合素β1或絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶Akt和細胞外訊號調節激酶1/2(ERK1/2)相關的癌細胞的試劑,或用作抑制癌細胞樣本中Akt和ERK1/2磷酸化的試劑。另揭露以rfHSA處理的癌細胞的細胞裂解物、包含該癌細胞裂解物的疫苗組成物及其用途,以及一種用於製備rfHSA的方法。
Description
本發明大體上有關於與具有抗腫瘤活性的再折疊的人類血清白蛋白。
美國專利號8357652和9226951揭露纖維狀人類血清白蛋白,其可藉由調節Akt訊息傳遞路徑在多種類型的癌細胞中引起細胞凋亡,其內容整體藉由引用併入本文。儘管可以證明從天然人類血清白蛋白(naïve human serum albumin)形成纖維狀人類血清白蛋白,但是使用其中揭露的方法將這兩種白蛋白分開以驗證各個生產批次中纖維狀人類血清白蛋白的純度和一致性是不可行的。已知纖維狀蛋白質更具抗原性,因此,纖維狀人類血清白蛋白可能對某些個體更具抗原性,並在臨床使用過程中引起不良副作用。
在一態樣中,本發明係關於一種再折疊的人類血清白蛋白(rfHSA)分子,其包含天然人類血清白蛋白(naïve HSA)的一級胺基酸序列,其中,溶液中的該rfHSA分子為橢圓形,非纖維狀,且該天然HSA為球狀。
在另一態樣中,本發明係關於本發明的rfHSA分子、醫藥組成物或疫苗組成物在製備用於在有需要的個體中治療癌症或治療腫瘤的藥物的用途。
在另一態樣中,本發明係關於本發明的rfHSA分子在製備用於檢測在腫瘤細胞或腫瘤樣本中是否存在與整合素β1或絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶Akt和細胞外訊號調節激酶1/2(ERK1/2)相關的癌細胞的試劑的用途。
另一態樣中,本發明係關於本發明的rfHSA分子在製備用於在包含癌細胞的樣本中抑制Akt和ERK1/2磷酸化的試劑的用途。
在另一態樣中,本發明係關於包含本發明的rfHSA分子的套組,用於檢測腫瘤樣本中與整合素β1或Akt和ERK1/2相關的癌細胞的存在。
復在另一態樣中,本發明係關於以本發明的rfHSA分子處理的癌細胞的細胞裂解物。
復在另一態樣中,本發明係關於包含本發明的細胞裂解物的疫苗組成物。
又在另一態樣中,本發明係關於製備本發明的rfHSA分子的方法,該方法包括:
(a)將人類血清白蛋白(HSA)溶解在包含清潔劑的緩衝溶液中以獲得經清潔劑處理的HSA溶液;
(b)將該經清潔劑處理的HSA溶液進行超音波處理以獲得經超音波處理、清潔劑處理的HSA溶液;
(c)將該經超音波處理、清潔劑處理的HSA溶液置於分子量範圍在10,000和600,000道爾頓(Da)之間的粒徑篩析層析法管柱;
(d)以包含清潔劑的沖提液沖提該管柱;
(e)收集包含經清潔劑處理的HSA的管柱沖提部分;
(f)合併該管柱沖提液部分以獲得合併的管柱沖提液;
(g)以截留分子量(MWCO)為12,000至14,000Da的透析膜,將該合併的管柱沖提液對不含清潔劑的透析物進行透析;
(h)收集透析膜沖提液;
(i)將該透析膜沖提液濃縮並對該不含清潔劑的透析物進行透析以獲得濃縮的透析膜沖提液;以及
(j)重複該濃縮和透析步驟(i)以獲得包含本發明的rfHSA的最終濃縮的透析膜沖提液,其中,步驟(j)中的該最終濃縮的透析膜沖提液不包含或幾乎不包含清潔劑。
圖1A、圖1B是嵌合模型,分別顯示藉由生物小角度X光散射分析的溶液中的rfHSA(圖1A)和天然HSA(naïve HSA)(圖1B)的結構。圖1A為SUPCOMB對1e78.pdb晶體結構與rfHSA套膜的模型嵌合,顯示rfHSA的形狀為橢圓形;圖1B為SUPCOMB對1e78.pdb晶體結構和天然HSA套膜的模型嵌合,顯示天然HSA的形狀為球狀。
圖2A、圖2B分別是天然HSA(球狀HSA或gHSA)(圖2A)和rfHSA(圖2B)的質譜圖,在還原條件下有限的蛋白水解後,使用液相層析法-串聯質譜法(LC-MS-MS)進行分析。
圖3A、圖3B分別是天然HSA(圖3A)和rfHSA(圖3B)的質譜圖,在非還原條件下有限的蛋白水解後,使用LC-MS-MS進行分析。
圖4A顯示對應於質荷比(m/z)4559的質譜片段離子的41個胺基酸的肽的序列(SEQ ID NO:2),其存在於天然HSA中但不存在於rfHSA中。
圖4B顯示天然HSA(SEQ ID NO:1)和分子內二硫鍵Cys124-Cys168和Cys169-Cys177的序列。
圖5A顯示對應於m/z 5729的質譜片段離子的53個胺基酸的多肽的序列(SEQ ID NO:3),其存在於天然HSA中但不存在於rfHSA中。
圖5B顯示天然HSA(SEQ ID NO:1)和分子內二硫鍵Cys62-Cys361和Cys75-Cys567的序列。
圖6A顯示對應於m/z 7223的質譜片段離子的65個胺基酸的多肽的序列(SEQ ID NO:4),其存在於天然HSA中但不存在於rfHSA中。
圖6B顯示天然HSA(SEQ ID NO:1)和分子內二硫鍵Cys62-Cys361和Cys360-Cys487的序列。
圖7顯示rfHSA對多種癌細胞的細胞毒性作用;
圖8顯示rfHSA對臨床相關的卵巢癌細胞類型的細胞毒性作用。
圖9A顯示在攜帶卵巢癌細胞的小鼠中的治療方案的示意圖。
圖9B是一組螢光影像,顯示對照組(左圖)和rfHSA治療組(右圖)中的腫瘤大小。Ms1、Ms2、Ms3分別指小鼠1、2、3
圖9C是一對曲線圖,顯示攜帶卵巢癌細胞的小鼠的體重(左圖)和生物冷光影像(bioluminescence imaging,BLI)等級(右圖)。
圖10是顯示rfHSA對人胰臟癌細胞株BxPC-3、MIAPaCa-2和PANC-1的細胞毒性作用的圖。
圖11是西方墨點法的圖,顯示rfHSA抑制Akt和ERK的磷酸化及rfHSA的抑制作用被BxPC-3中的抗整合素抗體逆轉。
圖12是顯示rfHSA不影響正常細胞人類原始周邊血液單核細胞的存活率的圖。
圖13是顯示rfHSA對B16F10黑色素瘤細胞的細胞毒性作用的長條圖。
圖14A是顯示小鼠的疫苗接種方案和黑色素瘤癌細胞毒攻的示意圖,使用經rfHSA處理的B16F10黑色素瘤細胞的裂解物接種小鼠。
圖14B是顯示圖14A中小鼠的腫瘤大小的圖。
圖14C是顯示圖14A中小鼠的存活率的圖。
圖14D是顯示圖14A中無腫瘤小鼠百分比的圖。
[定義]
除非另有定義,本文所使用的所有技術和科學術語與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的含義相同。在發生衝突的情況下,以本文件包含定義為準。
術語「球狀(globular)」是指球形的(spherical);具有球體或球的形狀。
術語「橢圓(oval)」是指具有如雞蛋的大略形式、形狀或輪廓;蛋形。
術語「原纖(fibrillar)」是指與原纖維(fibril)有關。原纖維是小的或細的纖維或絲狀體(filament);或類絲狀結構或絲狀體。絲狀體是非常細的絲狀或類絲狀結構。
術語「多肽或肽片段」是指具有胺基末端或羧基末端缺失的多肽或肽,但其中剩餘的胺基酸序列與例如來自全長cDNA序列的經推斷的天然存在序列中的相應位置相同。片段通常至少有5、6、8或10個胺基酸長,較佳為至少14個胺基酸長,更佳為至少20個胺基酸長,通常至少50個胺基酸長,甚至更佳為至少70個胺基酸長。
rfHSA可與另外的活性劑和藥學上可接受的載體、載劑(vehicle)、賦形劑(excipient)或輔助劑一起包含在醫藥組成物中。
術語「藥學上可接受的載體」包括與藥物施用途徑相容的溶劑、分散介質、包衣、抗菌和抗真菌劑、等滲透和吸收延遲劑等。亦可將輔助的活性化合物摻入組成物中。
醫藥組成物被配製為與其預期的給藥途徑相容。給藥途徑的實例包括腸胃外,例如靜脈內、皮內、皮下、口服(例如吸入)、經皮(局部)、經黏膜、腹膜內、動脈內、肌肉內、病灶內和直腸給藥。
如本文所用,「個體」是指人和非人動物。
如本文所用,術語「天然人類血清白蛋白」、「球狀人類血清白蛋白」可互換。
精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸(RGD)基序是細胞黏附基序,最初被確定為纖連蛋白(fibronectin)內介導細胞附著的序列。稱為整合素的膜蛋白家族藉由RGD基序作為這些細胞黏附分子的受體。
「Akt」一詞是指「絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶Akt(蛋白激酶B)」。Akt訊息傳遞路徑或PI3K-Akt訊息傳遞路徑是回應細胞外訊號以促進存活和生長的訊息傳導路徑,所涉及的關鍵蛋白質是PI3K(磷脂酸肌醇3-激酶)和Akt(蛋白激酶B)。
包含本發明的rfHSA分子的組成物可以與載體一起製備,以保護活性成分免於從身體被快速排除,例如控制釋放劑型,包括植入物和微囊化遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物,例如乙烯乙酸乙烯酯、酐聚合體、聚乙醇酸、膠原蛋白、原酸酯聚合體和聚乳酸。製備此等劑型的方法對所屬技術領域中具有通常知識者來說是顯而易見的。這些材料也可以從Alza Corporation 和Nova Pharmaceuticals,Inc.商業上獲得。脂質體懸浮液(包括以針對細胞特異性抗原的單株抗體靶向感染細胞的脂質體)也可以用作藥學上可接受的載體。
為了易於給藥和劑量一致,以劑量單位形式配製口服或腸胃外組成物是有益的。如本文所用的劑量單位形式是指適合作為待治療個體的單位劑量的形態上單獨的單位;各個單位含有預定量的活性化合物以及所需的藥物載體,經計算可產生所需的治療效果。
此類化合物的毒性和治療功效可藉由細胞培養物或實驗動物中的標準製藥程序來確定,例如,用於確定LD50(對50%的群體致死的劑量)和ED50(對50%的群體有效的治療劑量)。毒性和治療作用之間的劑量比即是治療指數,它可以表示為LD50/ED50比值,表現出高治療指數的化合物是較佳的。雖然可使用帶有毒性副作用的化合物,但應注意此類化合物靶向受影響組織部位的遞送系統的設計,以盡量減少對未感染細胞的潛在損害,進而減少副作用。
從細胞培養試驗和動物研究中獲得的數據可用於制定一系列用於人類的劑量。此類化合物的劑量較佳為涵括ED50且毒性很小或沒有毒性的循環濃度範圍內,劑量可取決於所採用的劑型和所採用的給藥途徑在此範圍內變化。對於本揭露的方法中使用的任何化合物,治療有效劑量最初可從細胞培養檢測中估計。可在動物模型中制定劑量以達到循環血漿濃度範圍,該範圍為涵括在細胞培養中檢測的IC50(即,達到症狀最大抑制的半數的測試化合物的濃度)。此類資訊可用於更準確地確定人體的有用劑量,例如,可藉由高效液相層析法測量血漿中的量。
「治療(treating)」或「治療(treatment)」一詞是指以治癒、減輕、緩解、醫治或改善疾病為目的,向有需要的個體施用有效量的治療劑,此個體可由醫療保健專業人員基於任何合適的診斷方法的結果而識別。
「有效量(effective amount)」是指對受治療的個體賦予治療效果所需的活性劑的量。正如所屬技術領域中具有通常知識者所認知的,有效劑量將根據給藥途徑、賦形劑的使用以及與其他治療性的療程共同使用的可能性而變化。
術語「化療劑」是指已知可用於治療癌症的藥劑。
美國衛生與公眾服務部食品和藥物管理局出版的「產業和審查人員預估成人健康志願者臨床試驗中的治療安全起始劑量指南(Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)」中揭露,「治療有效量」可藉由以下公式計算獲得:
HED=動物劑量(mg/kg)×(動物體重(公斤)/人體重(公斤))0.33。
下圖所示研究中使用的小鼠體重範圍為16至22克。
縮寫:天然人類血清白蛋白,naïve HSA;球狀人類血清白蛋白,gHSA;再折疊的人類血清白蛋白,rfHSA;精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸,RGD;液相層析法-串聯質譜法,LC-MS-MS;質荷比,m/z;生物冷光影像,BLI;室溫,RT。
序列表:使人類血清白蛋白(SEQ ID NO:1);
LVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKAAFTECCQAADKAACLLPK(SEQ ID NO:2;41 aa);
KGEEAFCTEKLTAVTCLKDGFLTHLSKDCNEASEDAVCTKAYCEHPDAAACCK(SEQ ID NO:3;53 aa);
VTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKTCVADESAENCDK(SEQ ID NO:4;65 aa)。
本發明提供一種抗癌的再折疊人類血清白蛋白(rfHSA)及其製備和使用方法。rfHSA是一種單體,包含與天然HSA相同的一級序列。用於製備rfHSA的方法具有易於驗證純度、生產一致性和規模化可行性等優點。
生物小角度X光散射表明rfHSA是橢圓形,而非天然HSA的球形(圖1)。rfHSA與天然HSA的區別在於,天然HSA的17個分子內二硫鍵中,至少有3個在rfHSA中被破壞,這可以藉由有限的蛋白水解,接著以液相層析法-串聯質譜法(LC-MS-MS)分析來證明。在非還原條件下的有限胰蛋白酶rfHSA蛋白水解後的LC-MS-MS分析顯示不存在幾個主要片段離子,特別是m/z 4559、5729和7223的片段離子(圖2、圖3)。
序列為LVRPEVDVMC($1)TAFHDNEETFLKAAFTEC($1)C($2)QAADKAAC($2)LLPK(SEQ ID NO:2)的41個胺基酸(aa)的肽對應於m/z
4559處的片段離子,係存在於天然HSA中,但不存在於rfHSA中。該41 aa的肽是藉由將HSA的半胱胺酸124連接到半胱胺酸168以及將半胱胺酸169連接到半胱胺酸177而形成的(圖4)。
序列為KGEEAFC($1)TEKLTAVTC($1)LKDGFLTHLSKDC($2)NEASEDAVCTKAYCEHPDAAAC($2)CK(SEQ ID NO:3)的53個胺基酸的多肽,對應於m/z 5729處的片段離子,存在於天然HSA中但在rfHSA中不存在。53 aa的肽是藉由將半胱胺酸567連接到半胱胺酸75以及將半胱胺酸62連接到半胱胺酸361而形成(圖5)。
序列為VTKCCTESLVNRRPC($1)FSALEVDETYVPKLAKTYETTLEKC($1)C($2)AAADPHECYAKTCVADESAENC($2)DK(SEQ ID NO:4)的65個胺基酸的多肽,對應於m/z7223處的片段離子,存在於天然HSA中,但rfHSA中不存在。65 aa是藉由將半胱胺酸487連接到半胱胺酸360以及將半胱胺酸361連接到半胱胺酸62而形成的(圖6)。
在製造纖維狀人類血清白蛋白(HSA)的過程中全面去除SDS(較佳為0.18mg SDS/mg rfHSA的等級)後,天然HSA意外地轉化為rfHSA。製造纖維狀HSA的方法揭露於美國專利第9226951號中,其全部內容以引用方式併入本文。
在本發明的一實施例中,將天然HSA溶解於1% SDS溶液中,通過SUPERDEX®-200凝膠過濾管柱,並以含有25mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.1M NaCl和0.05% SDS的透析液沖提來產生rfHSA。以透析液透析後,收集透析管內的沖提液,濃縮並再次對透析液進行透析。多次重複相同的程序以
盡可能徹底地去除SDS。結果發現不同於纖維狀HSA,該rfHSA不形成纖維狀形態。
rfHSA對多種癌細胞具有細胞毒性作用,其效力與纖維狀HSA大致相同。使用rfHSA代替纖維狀HSA作為抗癌劑的優勢在於rfHSA不是纖維狀蛋白質。纖維狀HSA可能對某些個體更具抗原性,並可能在臨床使用過程中引起不良副作用。此外,rfHSA的純度和一致性比纖維狀HSA更可驗證。
在一實施例中,rfHSA用於治療腎癌、乳癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、黑色素瘤或卵巢癌(圖7)。
rfHSA在臨床上卵巢相關的(TOV21G、KURAMOCHI、OVSAHO)、胰臟的(BxPC3、MIA-paca2和Panc1)和黑色素瘤(B16F10)癌細胞的細胞毒性作用和IC50分別顯示在圖8、10和13中。圖9示出rfHSA對帶有卵巢癌的小鼠的體內抗癌作用。
rfHSA以整合素依賴性方式抑制胰臟癌細胞(BxPC3)中Akt和ERK的磷酸化(圖11)。當rfHSA可與細胞表面諸如整合素的受體結合而球狀血清白蛋白無法時,相信血清白蛋白從球狀變為再折疊形式的結構變化使蛋白質可選擇性地靶向比正常細胞表達更多整合素α5β1的癌細胞。
正常細胞(人類周邊血液單核細胞)經rfHSA(0至1.6μM)處理24至72小時,僅偵測到其對正常細胞存活率的微小影響(圖12)。
經rfHSA處理的癌細胞的裂解物可作為患有癌症的個體的疫苗。該癌細胞可為B16F10黑色素瘤。
可基於疾病的嚴重程度和對癌細胞的所需細胞毒性來選擇用於治療癌症的rfHSA蛋白、變體、衍生物、異種同源物,或與人類血清白蛋白具有實質一致性的其他蛋白。
選擇具有RGD基序或更大分子量的蛋白質以對癌細胞具有更大的細胞毒性。RGD基序是整合素的配體。已表明再折疊的蛋白質藉由調節整合素/Akt訊息傳遞路徑誘導細胞死亡。已發現如rVP1-S200和FN-S200等具有RGD基序的再折疊蛋白質,比沒有RGD基序的蛋白質,如牛血清白蛋白,更具細胞毒性。
在一態樣中,本發明提供一種再折疊的人類血清白蛋白(rfHSA),其包含天然人類血清白蛋白(naïve HSA)的一級胺基酸序列,其中,溶液中的該rfHSA呈橢圓形,而非纖維狀,並且天然HSA是球形的。
在一實施例中,本發明的rfHSA缺少兩個或更多個選自由(i)C124-C168和C169-C177;(ii)C567-C75和C62-C361;(iii)C487-C360和C361-C62;及(iv)其任何組合的分子內二硫鍵所組成的群組。
在另一實施例中,本發明的rfHSA缺乏分子內二硫鍵C124-C168、C169-C177、C567-C75、C62-C361和C487-C360。
在另一實施例中,本發明的rfHSA在非還原條件下有限的胰蛋白酶蛋白水解後,缺少存在於天然HSA中的質荷比(m/z)為4559、5729和7223的質譜片段離子。
在另一實施例中,本發明的rfHSA在非還原條件下有限的胰蛋白酶蛋白水解後,缺少質荷比(m/z)為4559、5729和7223的質譜片段離子,其
中,在天然HSA的有限胰蛋白酶蛋白水解後,存在m/z為4559、5729和7223t的片段離子。
在另一實施例中,本發明的rfHSA在非還原條件下有限胰蛋白酶蛋白水解後產生肽片段,該產生的片段缺少一個或多個選自SEQ ID NO:2、3、4及其任何組合的肽片段,其中,該缺少的一個或多個肽片段在天然HSA的有限胰蛋白酶蛋白水解後存在。
在另一實施例中,本發明的rfHSA在非還原條件下有限的胰蛋白酶蛋白水解後產生肽片段,該產生的片段缺乏包含SEQ ID NO:2、3和4的胺基酸序列的肽片段,其中,該包含SEQ ID NO:2、3和4的肽片段缺少在天然HAS的有限胰蛋白酶蛋白水解後存在。
本發明還提供醫藥組成物,其包含本發明的rfHSA和藥學上可接受的載體、賦形劑(excipient)或載劑(vehicle)。
本發明復提供經本發明的rfHSA處理的癌細胞的細胞裂解物。
另提供包含經rfHSA處理的癌細胞裂解物的疫苗組成物。疫苗組成物可進一步包含佐劑。
癌細胞可為癌症衍生的細胞株。在一實施例中,衍生自癌症的細胞株係來自與個體的癌症或與個體的癌症類型相同的癌症。
本發明亦提供本發明的rfHSA、醫藥組成物或疫苗組成物在製備於有需要的個體中治療癌症或治療腫瘤的藥物的用途。
在一實施例中,癌細胞是至少一種選自由腦癌、乳癌、子宮頸癌、結直腸癌、食道癌、腎癌、肝癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌、睾丸癌和甲狀腺癌細胞所組成的群組。
本發明進一步提供本發明的rfHSA在製備用於在腫瘤細胞或腫瘤樣本中檢測與整合素β1或絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶Akt和細胞外訊號調節激酶1/2(ERK1/2)相關的癌細胞的存在的試劑,或用於抑制包含癌細胞的樣本中的Akt和ERK1/2的磷酸化的用途。
本發明進一步提供包含本發明的rfHSA的套組,用於檢測腫瘤樣本中與整合素β1或Akt和ERK1/2相關的癌細胞的存在。
在另一實施例中,在將本發明的rfHSA製備用於治療癌症或用於治療有需要的個體的腫瘤的藥物的用途之前,該用途可進一步包括包含本發明的rfHSA的套組,用於檢測來自有需要的個體的腫瘤樣本中與Akt和ERK1/2相關的癌細胞的存在的用途。
本發明的rfHSA的製備方法包括定義如上的步驟(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)和(j)。
在一種實施方式中,沖提步驟(d)中的沖提液中清潔劑的濃度低於溶解步驟(a)中的緩衝溶液中的清潔劑濃度。
在另一實施例中,進行透析步驟(g)可進一步包括步驟(g’):用不含清潔劑的新鮮透析液替換不含清潔劑的透析液至少兩次或三次。
在另一實施例中,清潔劑可為SDS。
在另一實施例中,粒徑篩析層析法管柱具有用於分離70kDa分子量及以上的蛋白質的孔徑。
在另一實施例中,不包含清潔劑的透析液是磷酸鹽緩衝液。
根據本發明的方法,本發明方法中的重複步驟徹底去除清潔劑,並且最終濃縮的透析膜沖提液不含可偵測得到的纖維狀人類血清白蛋白。
亦提供在有需要的個體中治療癌症或腫瘤的方法,該方法包括向有需要的個體施用治療有效量的本發明的rfHSA、醫藥組成物或疫苗組成物。
在向有需要的個體施用疫苗組成物之前,治療方法可進一步包括用本發明的rfHSA治療衍生自與個體相同的癌症或相同組織類型的癌細胞株的步驟。
[實例]
材料和方法
rfHSA的製備
將20毫克臨床級人類血清白蛋白溶解於含1% SDS(w/v)的10mL PBS中,將溶液超音波震盪5分鐘,然後加到預先用沖提液(25mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、0.1M NaCl和0.05%SDS)平衡的SUPERDEXTM-200中。以1mL/分鐘的速率沖提管柱,並合併含有人類血清白蛋白的C3至C7級分。使用CELLU-SEP® T4/Nominal(MWCO:12,000至14,000Da)透析膜對合併的級分以PBS進行透析。在室溫(RT)下每兩小時更換一次新的PBS緩衝液共3次。以透析液進行透析後,收集透析管內的沖提液,濃縮並再次對透析液進行透析。重複相同的步驟數次以盡可能徹底地去除SDS以獲得本發明的rfHSA。結果發現不同於纖維狀人類血清白蛋白,rfHSA不形成纖維狀。
液相層析法-串聯質譜(LC-MS/MS)
天然HSA和rfHSA蛋白在LTQ Orbitrap XL(THERMO FISHER SCIENTIFICTM,MA)上藉由高效液相層析法-串聯質譜(LC-MS/MS)進行分析和驗證。簡而言之,蛋白質若非以胰蛋白酶有限蛋白水解,則先以三(2-羧乙基)膦(TCEP;20mM)還原劑處理,接著用過量碘乙醯胺(IAA)烷基化游離硫
氫基,然後以胰蛋白酶進行有限蛋白水解。所得肽藉由高效液相層析法分離,沖提的肽段藉由奈米噴霧電離進行電離,並在在線耦合LTQ Orbitrap XL質譜儀中進行分析,使用前五種碰撞誘導解離(CID)方法,以60,000解析度進行調查掃描,並在離子阱中以正常掃描速度檢測片段離子。
以MTT比色測定檢測細胞存活率
將呈指數生長的細胞接種在含10% FBS的培養基的96孔板中,並孵育24小時。在37℃下,於無血清培養基中以一系列的蛋白質濃度處理細胞16小時。處理後,每孔加入MTT溶液(0.5mg/mL),接著孵育4小時。活細胞數與甲臘(formazan)的產量成正比,異丙醇溶解甲臘後,可以使用ELISA盤式分析儀測量570nm分光光度值。
西方墨點法檢測rfHSA對Akt和ERK磷酸化的影響
以不同濃度的rffHSA或不以rfHSA處理細胞。如所指示地,將癌症樣本的細胞萃取物(40至60μg)加載至兩個SDS-聚丙烯醯胺凝膠上。進行凝膠電泳後,將凝膠上的蛋白質轉移到兩個PVDF膜上。根據它們的分子量切割兩個膜上的蛋白質以製作切碎的印跡。各個切碎的印跡都被標記以表明哪些抗體將用於染色。將切碎的印跡在室溫下用5%無脂乳封閉1小時後,用1 x Tris-緩衝鹽水和TWEEN 20(TBST)徹底清洗,並以各自的一級抗體處理,於4℃下過夜。切碎的印跡用1 x TBST徹底清洗,在室溫下用過氧化物酶標記的二級抗體處理1小時,然後用1 x TBST徹底清洗。用過氧化物酶底物處理印跡以增強化學冷光(chemiluinescence,ECL)。接著使用KODAK醫用X光處理器在BIOMAX ML膠片上檢測印跡,掃描並在電腦中組合為成品圖。
B16F10疫苗接種實驗
對rfHSA誘導的免疫原性細胞死亡(immunogenic cell death,ICD)總細胞裂解物(total cell lysates,TCL),B16F10黑色素瘤細胞以1.5μM rfHSA處理24小時以誘導ICD,刮取、離心和以PBS清洗2次後,懸浮每毫升1×107的B16F10於PBS中,接著反覆冷凍解凍(freeze-thawed)4次。離心後,收集並儲存上清液以用於接種疫苗。對於疫苗接種,將100μL來自B16F10細胞的經rfHSA誘導的ICD TCL,2週中皮下注射至C57BL/6小鼠左側一次作為初始組(primer group),以及每週注射1次持續2週作為加強組。最後一次接種後一週,右側皮下注射1×104相同的活B16F10細胞。監測腫瘤形成,在指定的日期立即記錄腫瘤體積,並根據以下公式計算:體積=(長×寬2×π)/6,直到注射活的癌細胞後32天犧牲。記錄無腫瘤小鼠的存活率和數量。在犧牲後的指定天數立即記錄腫瘤重量。
[結果]
如生物小角度X光散射所示,rfHSA在溶液中呈橢圓形且天然HSA在溶液中呈球狀。
使用小角度X光散射分析rfHSA和天然HSA的結構。圖1A、圖1B說明1e78.pdb晶體結構、rfHSA套膜(envelope)和天然HSA套膜使用SUPCOMB程式的模型嵌合(M.Kozin和D.Svergun「高和低解析度結構模型的自動匹配(Automated matching of high-and low-resolution structural models)」J Appl Cryst.2001,34:33-41)。結果表明rfHSA的形狀與天然HSA的形狀不同。rfHSA的形狀是橢圓形而並非像天然HSA的球形。
非還原條件下有限蛋白水解後的液相層析法-串聯質譜分析表明rfHSA與天然HSA不同。
如上所述製備的蛋白質主要為rfHSA,而非rfHSA和天然HSA的混合物。
在使用三(2-羧乙基)膦(TCEP;20mM)還原二硫鍵,然後用碘乙醯胺烷基化游離硫氫基的還原條件下,發現以胰蛋白酶(50μg/m)進行一分鐘的有限蛋白水解後的rfHSA質譜類似於天然HSA(圖2A、圖2B)。
在非還原條件下,以胰蛋白酶進行有限蛋白水解後的rfHSA質譜與天然HSA不同,特別是在m/z 4559、5729和7223處缺少三個主要片段離子(圖3A、圖3B)。在rfHSA中缺少這三個主要片段離子表明rfHSA可區分於天然HSA,並且本發明的rfHSA製備批次中幾乎沒有或沒有天然HSA。天然HSA的原態構形(native conformation)主要由17個分子內二硫鍵所維持。在還原條件下,以胰蛋白酶進行有限蛋白水解後的rfHSA質譜與天然HSA的質譜一樣,於m/z 3030顯示的母離子和幾個片段離子,尤其是m/z 2706、2259、2044和1148的片段離子。在非還原條件下出現的天然HSA的三個主要片段離子,在m/z 4559、5729和7223的質荷比大於3030,最有可能是具有二硫鍵的肽片段離子。
rfHSA沒有將半胱胺酸124連接到半胱胺酸168以及將半胱胺酸169連接到半胱胺酸177的二硫鍵
藉由製備型液相層析法進行分離和級分天然HSA的胰蛋白酶消化物。質譜定序用於確認m/z 4559處的片段離子對應的肽段序列,結果表明m/z 4559處的片段離子為41個胺基酸的肽段,胺基酸序列為LVRPEVDVMC($1)TAFHDNEETFLK AAFT EC($1)C($2)QAADKAA C($2)LLPK(SEQ ID NO:2)。對天然HSA的胺基酸序列的檢索發現,該肽由半胱胺酸124連接到
半胱胺酸168和半胱胺酸169連接到半胱胺酸177的二硫鍵形成(圖4A、圖4B)。由於m/z 4559的片段離子存在於天然HSA中而不存在於rfHSA中,結果表明,rfHSA不具有將半胱胺酸124連接到半胱胺酸168和將半胱胺酸169連接到半胱胺酸177的二硫鍵。
rfHSA不具有將半胱胺酸567連接到半胱胺酸75以及將半胱胺酸62連接到半胱胺酸361的二硫鍵
藉由製備型液相層析法進行分離和級分天然HSA的胰蛋白酶消化物。使用串聯質譜定序確認m/z 5729的片段離子對應的肽序列。結果表明,m/z 5729的片段離子是一個具有KGEEAFC($1)TEKLTAVTC($1)LKDGFLTHLSKDC($2)NEASEDAVCTKAYCEHPDAAAC($2)CK(SEQ ID NO:3)的序列的53個胺基酸的多肽。對天然HSA的胺基酸序列的檢索揭露該多肽由HSA序列中將半胱胺酸567連接到半胱胺酸75以及半胱胺酸62連接到半胱胺酸361的二硫鍵而形成(圖5A、圖5B)。由於m/z 5729的片段離子存在於天然HSA中並在rfHSA中被遮掩,結果表明,大部分rfHSA不具有將半胱胺酸567連接到半胱胺酸75和將半胱胺酸62連接到半胱胺酸361的二硫鍵。
rfHSA沒有連接半胱胺酸487和半胱胺酸360以及半胱胺酸361和半胱胺酸62的二硫鍵。
天然HSA的胰蛋白酶消化物藉由製備型液相層析法進行分離和級分。使用串聯質譜定序確認m/z 7223的片段離子對應的肽序列。結果表明,m/z 7223的片段離子是一個具有VTKCCTESLVNRRPC($1)FSALEVDETYVPKLAKTYETTLEKC($1)C($2)AAADPHECYAKTCVADESAENC($2)DK(SEQ ID NO:4)的序列的65個胺基酸的多肽。對天然HSA的胺基酸序列的檢索揭
露該肽藉由將半胱胺酸487連接到半胱胺酸360以及將半胱胺酸361連接到半胱胺酸62的二硫鍵而形成(圖6A、圖6B)。由於m/z 7223的片段離子存在於天然HSA中且不存在於rfHSA中,結果表明,rfHSA不具有將半胱胺酸487連接到半胱胺酸360和將半胱胺酸361連接到半胱胺酸62的二硫鍵。
rfHSA對多種癌細胞具有細胞毒性
在無血清培養基中以多種濃度的rfHSA處理各種細胞類型16小時,藉由MTT細胞增殖測試檢視細胞存活率,並測定rfHSA對每個癌細胞株存活率的IC50。圖7說明rfHSA對多種癌細胞最大抑制濃度的半數(IC50)。
rfHSA對臨床相關的卵巢癌細胞株具有細胞毒性作用
研究rfHSA對卵巢腺癌細胞株TOV-21G、OVSAHO和卵巢癌KURAMOCHI細胞株的細胞毒性(圖8,上圖)。以rfHSA處理細胞,並藉由MTT細胞增殖測試檢視細胞存活率,並繪製細胞存活率相對於rfHSA濃度的圖(圖8,下圖)。
rfHSA抑制體內卵巢癌的生長
圖9顯示rfHSA在腹膜內(I.P.)卵巢鼠模型中有效抑制腫瘤細胞增殖。以綠色螢光蛋白和螢火蟲螢光素酶(SKOV3-GL)預先標記的卵巢癌SKOV3細胞I.P.注射到裸鼠體內,然後如圖所示,每週注射一次對照組載劑或rfHSA(15mg/kg)(圖9A)。生物冷光影像(BLI)和體重測量顯示rfHSA顯著降低腫瘤細胞的增殖而不影響小鼠體重(圖9B、圖9C)。
rfHSA對胰臟癌細胞株具有細胞毒性作用。
圖10顯示rfHSA在體外分別抑制胰臟癌細胞株BxPC3、MIA-paca2和Panc1。以rfHSA處理細胞,並如前所述藉由MTT細胞增殖測試檢視細胞存活率,並繪製細胞存活率相對於rfHSA濃度的圖。
rfHSA以整合素β1依賴性方式抑制胰臟癌細胞Akt和ERK1/2磷酸化
圖11顯示抗整合素β1抗體逆轉rfHSA對Akt和ERK1/2磷酸化的抑製作用。BxPC3細胞用對照組IgG或抗整合素β1抗體(2μg/mL)預處理30分鐘,接著在0.1% FBS培養基中以IL17B(50ng/mL)或/和rfHSA(0.2μM)處理24小時。藉由西方墨點法檢測磷酸-Akt、總Akt、磷酸-ERK1/2和總ERK1/2的表現量,使用β-肌動蛋白作為用量對照組,印跡結果為三個獨立實驗的代表。
rfHSA對正常細胞沒有細胞毒性
圖12顯示rfHSA不會誘導人類原始周邊血液單核細胞(PBMC)的細胞死亡。如圖所示,人類PBMC以一系列的rfHSA濃度處理24、48和72小時。以MTT細胞增殖測試檢視細胞存活率,並繪製細胞存活率相對於rfHSA濃度的圖。
rfHSA誘導對B16F10黑色素瘤癌細胞的細胞毒性作用
使用不同rfHSA量處理B16F10黑色素瘤細胞24小時。收集細胞以藉由台酚藍(trypan blue)染色計數活細胞的百分比,以測量細胞存活率。圖13顯示rfHSA以劑量依賴性方式抑制細胞存活率。
以fHSA處理的B16F10細胞裂解物接種疫苗可在體內引發抗腫瘤免疫反應和腫瘤清除
以rfHSA處理癌細胞24小時,並將細胞溶質裂解物接種到小鼠體內,並在一週後再次加強。接著替小鼠注射活的B16F10黑色素瘤細胞(1×104個細胞/小鼠)。圖14A至圖14D顯示經rfHSA處理的B16F10細胞裂解物進行疫苗接種在體內引發抗腫瘤免疫反應和腫瘤清除。圖14A為本研究的疫苗接種方案示意圖,以rfHSA(1.5μM)進行24小時的處理。攻毒後,監測腫瘤生長率(圖14B)、小鼠存活率(圖14C)和無腫瘤結果(圖14D)。發現曾接種細胞溶質裂解物的小鼠的腫瘤體積和存活率結果,小鼠的腫瘤減少且存活時間明顯更長。
<110> 中央研究院(ACADEMIA SINICA)
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<211> 53
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
<210> 4
<211> 65
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Claims (20)
- 一種再折疊的人類血清白蛋白(rfHSA)分子,該rfHSA分子包含天然人類血清白蛋白(天然HSA)分子的一級胺基酸序列,其中,溶液中的該rfHSA分子為橢圓形,非纖維狀,且該天然HSA分子為球狀。
- 如請求項1所述的rfHSA分子,其缺少兩個或更多個選自由:(i)C124-C168及C169-C177;(ii)C567-C75及C62-C361;(iii)C487-C360及C361-C62;以及(iv)其任何組合所組成的群組的分子內二硫鍵。
- 如請求項1所述的rfHSA分子,其缺少分子內二硫鍵C124-C168、C169-C177、C567-C75、C62-C361及C487-C360。
- 如請求項1所述的rfHSA分子,在非還原條件下有限的胰蛋白酶蛋白水解後,缺少質荷比(m/z)為4559、5729及7223的質譜片段離子,其中,該m/z為4559、5729及7223的片段離子在天然HSA有限的胰蛋白酶蛋白水解後存在。
- 如請求項1所述的rfHSA分子,其在非還原條件下有限的胰蛋白酶蛋白水解後產生肽片段,該產生的片段缺少一個或多個包含選自由SEQ ID NOs:2、3、4及其任何組合所組成的群組的胺基酸序列的肽片段,其中,該缺少的一個或多個肽片段在天然HSA分子的有限的胰蛋白酶蛋白水解之後存在。
- 如請求項1所述的rfHSA分子,在非還原條件下有限的胰蛋白酶蛋白水解後產生肽片段,該產生的片段缺少分別包含SEQ ID NO:2、3及4 的胺基酸序列的肽片段,其中,該缺少的肽片段在該天然HSA分子的該有限的胰蛋白酶蛋白水解後存在。
- 一種如請求項1至6中任一項所述的rfHSA分子在製備用於治療有需要的個體的癌症的藥物的用途。
- 如請求項7所述的用途,其中,該癌症為選自由腦癌、乳癌、子宮頸癌、結直腸癌、食道癌、腎癌、肝癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌、睾丸癌和甲狀腺癌所組成的群組中的至少一種。
- 一種如請求項1至6中任一項所述的rfHSA分子在製備用於檢測腫瘤細胞或腫瘤樣本中與整合素β1或絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶Akt和細胞外訊號調節激酶1/2(ERK1/2)相關的癌細胞的存在的試劑的用途。
- 一種如請求項1至6中任一項所述的rfHSA分子在製備用於抑制包含癌細胞的樣本中的Akt和ERK1/2磷酸化的試劑的用途。
- 一種套組,其包含如請求項1所述的rfHSA分子,用於檢測腫瘤樣本中與整合素β1或Akt和ERK1/2相關的癌細胞的存在。
- 如請求項7所述的用途,在該用途之前進一步包括使用包含該rfHSA的套組檢測來自有需要的個體的腫瘤樣本中與Akt和ERK1/2相關的癌細胞的存在。
- 一種使用如請求項1所述的rfHSA分子處理的癌細胞的細胞裂解物。
- 如請求項13所述的細胞裂解物,其中,該癌細胞為選自由腦癌、乳癌、子宮頸癌、結直腸癌、食道癌、腎癌、肝癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、 口腔癌、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌、睾丸癌和甲狀腺癌細胞所組成的群組中的至少一種。
- 一種疫苗組成物,其包含如請求項13所述的細胞裂解物。
- 如請求項15所述的疫苗組成物,其另包括佐劑。
- 如請求項15所述的疫苗組成物在製備用於在有需要的個體中治療腫瘤或抑制腫瘤生長的藥物的用途。
- 一種製備如請求項1所述的rfHSA分子的方法,包括:(a)將人類血清白蛋白(HSA)溶解在包含清潔劑的緩衝溶液中以獲得經清潔劑處理的HSA溶液;(b)將該經清潔劑處理的HSA溶液進行超音波處理以獲得經超音波處理、清潔劑處理的HSA溶液;(c)將該經超音波處理、清潔劑處理的HSA溶液置於分子量範圍在10,000和600,000道爾頓(Da)之間的粒徑篩析層析法管柱;(d)以包含清潔劑的沖提液沖提該管柱;(e)收集包含經清潔劑處理的HSA的管柱沖提部分;(f)合併該管柱沖提液部分以獲得合併的管柱沖提液;(g)以截留分子量(MWCO)為12,000至14,000Da的透析膜,將該合併的管柱沖提液對不含清潔劑的透析物進行透析;(h)收集透析膜沖提液;(i)將該透析膜沖提液濃縮並對該不含清潔劑的透析液進行透析以獲得濃縮的透析膜沖提液;以及(j)重複該濃縮和透析步驟(i)以獲得包含如請求項1所述的rfHSA的最終濃縮的透析膜沖提液,其中,步驟(j)中的該最終濃縮的透析膜沖提液不包含或幾乎不包含清潔劑。
- 如請求項20所述的方法,其中,該沖提步驟(d)中的沖提液中的清潔劑濃度低於溶解步驟(a)中的緩衝溶液的清潔劑濃度。
- 如請求項20所述的方法,其中,進行透析步驟(g)進一步包括(g’)以不含清潔劑的新鮮透析液替換不含清潔劑的透析液至少兩次或三次。
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