CN114409733B - 靶向抑制mlkl乙酰化的多肽和/或其衍生物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种能与KAT5特异性结合进而靶向抑制MLKL乙酰化的多肽和/或其多肽衍生物和它们的应用。本发明公开多肽M2的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述多肽M2能够特异性地与KAT5结合，从而阻断KAT5乙酰化MLKL蛋白；本发明还公开了多肽衍生物为多肽M2和细胞穿膜肽结合形成的嵌合肽PM2，其中，细胞穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的多肽和/或其多肽衍生物治疗肺纤维化疾病疗效显著，毒副作用小，使用安全。

Description

靶向抑制MLKL乙酰化的多肽和/或其衍生物及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种能与KAT5特异性结合从而靶向抑制MLKL乙酰化的多肽和/或其衍生物和它们的应用。
背景技术
肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，是呼吸病四大病种之一，是肺部最为严重的一种病理状态。其病理改变大多表现为最初的下呼吸道炎症，以及肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤，伴有成纤维母细胞和II型肺泡细胞增殖、细胞因子释放，细胞外基质蛋白和胶原沉积，最终引起肺部改变。肺纤维化患者肺部肺泡逐渐被纤维性物质取代，导致肺组织变硬变厚，肺脏气体交换能力逐步丧失，导致患者不同程度缺氧而出现呼吸困难，最后因呼吸衰竭而死亡。肺纤维化病因复杂，发病机制不明，目前已有的治疗肺纤维化的药物和方法十分有限，且疗效差强人意，预后极差，5年生存率仅为50％。
赖氨酸乙酰转移酶5(Lysine acetyltransferase 5，KAT5)，又叫做乙酰基转移酶Tip60，属于MYST乙酰基转移酶家族，同时也是进化上非常保守的Nu A4蛋白复合体的重要组成成分。KAT5可以乙酰化一系列蛋白来调控其活性及稳定性，进而调控DNA损伤修复、细胞周期、细胞凋亡、细胞自噬等过程。但KAT5在肺纤维化中的研究还尚未见报道。
本发明前期结果显示，持续反复的肺损伤促进肺泡巨噬细胞中KAT5的高表达，高表达的KAT5会跟MLKL结合，促进MLKL的乙酰化，进而促进肺泡巨噬细胞产生细胞外囊泡。而细胞外囊泡中富含的miR-148a-3p进一步抑制Ⅱ型肺泡上皮中Wnt10b的表达，进而抑制Ⅱ型肺泡上皮的增殖与分化，促进肺纤维的发生发展。这些结果提示阻碍KAT5乙酰化MLKL，抑制肺泡巨噬细胞产生细胞外囊泡是治疗肺纤维化的一个潜在靶点。因此，研究和开发阻断KAT5乙酰化MLKL蛋白(混合谱系激酶结构域样蛋白)的物质，具有很好的治疗肺上皮细胞纤维化的成药前景。
发明内容
因为肺纤维化发病机制复杂，所以目前缺乏有效的治疗药物，本发明的目的是提供一种通过抑制KAT5乙酰化MLKL进而抑制巨噬细胞产生细胞外囊泡的多肽和/或其多肽衍生物在制备治疗肺纤维化的产品中的应用，所述多肽M2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的氨基酸序列还包括在其他位置出现氨基酸替换，缺失或添加，且能与KAT5特异性结合的寡肽序列。本发明的多肽和/或其衍生物用于靶向治疗与KAT5相关的疾病。
为解决本发明的技术问题，本发明提供下述的技术方案。
本发明技术方案的第一方面是提供一种能与KAT5特异性结合靶向抑制MLKL乙酰化，从而抑制巨噬细胞产生细胞外囊泡的多肽和/或其多肽衍生物，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列，或其任何位置进行氨基酸替换、缺失或添加得到的有相同功能的序列；所述的多肽衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽(细胞穿膜肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用)连接所形成的嵌合肽。
所述的细胞穿膜肽为HLYVSPW(如序列表中SEQ ID NO:2所示)，该细胞穿膜肽被命名为pep2。进一步的，所述多肽M2的N端或C端与细胞穿膜肽连接获得所述嵌合肽(PM2)。
本发明技术方案的第二方面是提供所述的多肽和/或其多肽衍生物的DNA序列。
本发明技术方案的第三方面还提供一种治疗肺纤维化的药物组合物。所述的药物组合物含有所述的多肽和/或其多肽衍生物以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明技术方案的第四方面是提供本发明技术方案第一方面所述的多肽和/或其多肽衍生物在制备靶向阻断KAT5乙酰化MLKL作用的药物中的应用，以及在制备治疗肺纤维化药物中的应用。本发明中所述的“肺纤维化”为本领域常规的肺纤维化。所述肺纤维化较佳地是指以特发性肺纤维化病理改变为特征的，由各种不同因素所导致的肺纤维化。其中所述的肺纤维化较佳地是指人或动物的肺纤维化，所述肺纤维化的症状更佳地包括：由肺纤维化引起的肺部炎症、由肺纤维化引起的肺功能退化。所述的肺纤维化的病因较佳地为：由肺损伤引起的肺纤维化、由于粉尘引起的肺纤维化或者由于药物引起的肺纤维化，其中所述的药物较佳地为博莱霉素。
其中所述的肺纤维化较佳地是原发性(特异性)的肺纤维化，即原因不明的肺纤维化；或者是继发性的肺纤维化，即是继发于原先疾病的肺纤维化，所述肺纤维化更佳地是肺纤维化中的肺功能退化，肺部炎症和肺损伤。所述的肺纤维化的疾病较佳地包括慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化或间质性肺炎。
本发明所述“治疗”是指减轻肺纤维化的程度，或者治愈肺纤维化使之正常化，或者减缓肺纤维化的进程。
本发明所述多肽或嵌合体可以作为活性成分用于制备抗肺纤维化药物。所述的“活性成分”是指具有治疗肺纤维化功能的化合物。所述多肽或嵌合体可以和一种或多种药用载体制备抗肺纤维化药物。在该药物中，所述多肽或嵌合体可以单独作为活性成分或和其他具有抗肺纤维化活性的化合物一起作为活性成分。其中所述的药用载体为本领域常规药用载体，较佳地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂、稀释剂等。
所述的治疗肺纤维化的药物较佳地为一种药物组合物，所述药物组合物的剂型没有特别限制，为本领域常规剂型。所述药物组合物的剂型较佳地是固体、半固体或液体。所述药物组合物的剂型也可以是水溶液、非水溶液或混悬液。该药物组合物的剂型更佳地是片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂。所述药物组合物的给药途径为本领域常规的给药途径，所述给药途径较佳地为注射给药或口服给药。其中所述注射给药的方式较佳地包括：静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射途径。
本发明所述的药物组合物在治疗时的使用剂量根据患者的年龄和病情而定，使用剂量较佳地为0.1-15mg/kg，更佳地为5-10mg/kg，优选地为5mg/kg，给药次数较佳地为一天一次或数次。在治疗肺纤维化时，本发明所述的药物组合物可以单独使用或者和其他药物联合使用。
进一步的，所述肺纤维化包括原发性肺纤维化或继发性肺纤维化。
进一步的，所述肺纤维化为药物性肺纤维化。
进一步的，所述药物性肺纤维化为博来霉素引起的药物性肺纤维化。
进一步的，所述产品通过治疗肺部炎症、肺功能退化或肺损伤进行肺纤维化的治疗。
本发明的第五个方面是提供所述的多肽和/或其多肽衍生物在制备靶向阻断KAT5和MLKL的结合，抑制MLKL的乙酰化，减少M2型巨噬细胞产生细胞外囊泡，促进肺再生任一种制剂中的应用。
有益技术效果：本发明提供了可特异性结合KAT5的多肽，该多肽能够靶向阻断KAT5和MLKL的结合，抑制MLKL的乙酰化，减少M2型巨噬细胞产生细胞外囊泡，促进肺再生，从而应用于抗肺纤维化的药物的制备中。利用上述多肽所制备的药物在治疗肺纤维化疾病中，具有疗效显著，毒副作用小，使用安全的优点。
附图说明
图1为实施例3中免疫共沉淀验证肺泡巨噬细胞内KAT5与蛋白MLKL结合的结果；其中，A为初始肺泡巨噬细胞裂解液所含MLKL蛋白与KAT5蛋白的蛋白含量；B为肺泡巨噬细胞裂解液经过MLKL抗体或对照抗体IgG沉淀之后所含KAT5蛋白与MLKL蛋白的蛋白含量。
图2为实施例5中免疫共沉淀方法验证嵌合肽PM2可以竞争KAT5与MLKL蛋白的结合的结果；其中A为HEK293T细胞裂解液中MLKL蛋白与KAT5蛋白的蛋白含量；B显示HEK293T细胞裂解液经过DDK抗体或对照抗体IgG沉淀之后所含KAT5蛋白与MLKL蛋白的蛋白量。
图3为实施例6中马松染色的病理图片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例中所述的PBS，指浓度为0.1M，pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。
实施例中所述的室温为本领域常规的室温，较佳地为15-30℃。
实验结果用均值±标准误表示，经参数或者非参数方差检验，经比较p<0.05认为有显著性差异，p<0.01认为有极其显著性差异。
实施例1制备肺纤维化动物模型
1.1主要试剂及实验动物
实验所用博莱霉素购自日本化药，批号X81040。
实验中所使用的化合物若无特别说明，均购买自Sigma公司。
实验所用的SPF级C57BL/6小鼠(雄性，6-8周龄，16-18g)，购买自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
1.2肺纤维化动物模型的制备
雄性C57BL/6(周龄6-8周)小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥钠(45mg/kg，i.p.)麻醉，气管内注射博莱霉素(1U/kg)，共给药6次，每次时间间隔为14天。
具体方案为：将小鼠麻醉后俯卧位固定，用冷光灯源照射小鼠颈部位置，右手执镊将小鼠舌头往外牵引，左手执镊尽可能的将口腔打开，直至暴露声门，然后在导丝的介导下将20G套管针插入小鼠气管，之后使用微量进样针向气管内注入约50μL博莱霉素，迅速地旋转并直立5分钟，以便使博莱霉素均匀地进入左右肺叶。整个操作在约60℃左右的手术操作台进行。假手术组气管内注射等量的注射用生理盐水。
实施例2实时荧光定量PCR方法检测肺纤维化小鼠肺组织中KAT5的表达
1.分离正常组及模型组小鼠肺组织，提取RNA。采用Trizol法提取组织总RNA，步骤如下：
(1)将组织称重，并剪成小块，置于1.5mL EP管中。
(2)加入1mL的Trizol溶液，混匀，使用组织匀浆机以充分研磨组织并裂解裂解细胞。
(3)向裂解液中加入200μL氯仿，充分涡旋30秒后室温下静置15分钟。
(4)12000×g，4℃离心15分钟，吸取400μL上层无色水相置于新的EP管中。
(5)加入400μL异丙醇，上下颠倒，室温静置10分钟。
(6)12000×g，4℃离心10分钟，此时可见沉淀，弃掉液体。
(7)加入无核酸酶水稀释的75％乙醇，混匀，室温静置5分钟。
(8)12000×g，4℃离心5分钟。
(9)弃掉液体，置于通风处晾干，待沉淀变透明时加入50μL无核酸酶水溶解RNA。
2.然后将提取的RNA反转录成为cDNA，采用快速逆转录试剂盒(上海奕杉生物)步骤如下：
(1)取100ng-2μg总RNA，加入2μLDNA酶，加水至16μL，用移液枪轻柔的吹打5-10次混匀。
(2)室温反应5分钟，至于冰上待用。
(3)然后在上述体系中加入4μL的5×RT Mix。
(4)用移液枪吹打10次，充分混匀。
(5)42℃反应15分钟。稀释5-10倍作为模板进行qPCR。
qPCR引物：
GAPDH
Forward:5'-CAGTGGCAAAGTGGAGATTGTTG-3'；
Reverse:5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3
KAT5
Forward:5'-TGAGCGTGAAGGACATCAGTGG-3'；
Reverse:5'-TTAAGTCCAGCCGCTCGTGAGT-3
设计小鼠GAPDH和KAT5的qPCR引物，以逆转录得到的cDNA作为模板进行qPCR。qPCR采用体系是：KAPA酶10μL，引物200nM，模板50ng，水8μL。
结果显示：模型组肺组织中KAT5的表达较正常对照组显著上调。结果见表1。
表1肺纤维化小鼠肺组织中KAT5的mRNA水平
基因名称 对照组 模型组 P值
KAT5 1.05±0.05 7.85±0.11 <0.0001
实施例3利用免疫共沉淀的方法验证肺泡巨噬细胞内KAT5与蛋白MLKL的结合
3.1免疫共沉淀试剂
裂解液A液：0.6057g Tris碱，1.7532g NaCl，0.1017g MgCl2·6H2O，0.0742gEDTA，10mL甘油，10mL 10％NP40，加去离子水至150mL，用HCl调pH值至7.6，定容至191mL，充分混匀，0.45μm滤膜过滤，4℃储存。
裂解液B液：200μL 2Mβ-磷酸甘油，4mL 2.5M NaF，2mL 100mM NaVO3，2mL 100mMPMSF，20μL 1M DTT，1mg/mL的Leu、Pep、Apr各200μL，总体积共9mL。母液于-20℃储存。使用前，将B液中各成分的母液解冻，分别按上述组成比例加入A液中并混匀。
Protein A/G Plus-Agarose购自美国Santa cruz公司。
3.2具体操作步骤
(1)取小鼠肺泡灌洗液中肺泡巨噬细胞。
(2)以免疫共沉淀裂解液裂解细胞，收获细胞总蛋白约4-10mg，将各组蛋白调整至相同浓度。每组蛋白各取200μg，将各组蛋白取出200μg作为细胞裂解液的输入组，并将所得输入组的细胞裂解液作为对照。
(3)剩余蛋白加入2μg MLKL抗体(购买自CST，编号为37705)或者与MLKL抗体种属相同的普通IgG抗体(购买自cell signaling，商品编号为2729)，同时加入10μL ProteinA/G Plus-Agarose充分重悬，4℃缓慢旋转摇动过夜。4℃，3000rpm离心5min，小心吸除上清，宁可留下少量上清也不能吸到Agarose。加入0.5mL免疫共沉淀裂解液，混匀，冰浴静置1min，4℃，3000rpm离心30sec，小心吸除上清。重复洗涤5次，最后一次离心前静置5min。小心吸除上清，加入50μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀，95℃变性5min，迅速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或全部进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3.3结果
结果如图1所示(其中A显示初始肺泡巨噬细胞裂解液所含MLKL蛋白与KAT5蛋白的蛋白含量；B显示肺泡巨噬细胞裂解液经过MLKL抗体或对照抗体IgG沉淀之后所含KAT5蛋白与MLKL蛋白的蛋白量)，由图1结果可见肺泡巨噬细胞内KAT5蛋白与MLKL蛋白存在相互结合的现象。其中输入的细胞裂解液制备方法如上文所示，输入代表初始肺泡巨噬细胞裂解液中KAT5与MLKL的蛋白含量，即蛋白原液在经过MLKL抗体或对照抗体IgG(由于MLKL抗体为IgG型抗体，故选择IgG抗体作为对照)沉淀之前的MLKL和KAT5蛋白含量，结果表明，输入组细胞裂解液中的MLKL蛋白及KAT5蛋白的含量一致。
其中输出代表蛋白原液经过MLKL抗体或对照抗体IgG沉淀之后所含蛋白量，由于IgG抗体作为MLKL抗体的对照抗体，不能将MLKL蛋白沉淀下来，因此IgG抗体处理的细胞裂解液中MLKL蛋白印迹泳道显示为空白，而MLKL抗体作为实验组抗体，能与MLKL蛋白结合并且将其沉淀下来，因此MLKL抗体处理后的细胞裂解液结果为KAT5蛋白印迹泳道显示为黑色。正是因为KAT5蛋白与MLKL蛋白之间存在相互作用，因此使用MLKL抗体沉淀MLKL蛋白时也能将KAT5蛋白沉淀下来，故MLKL抗体处理后的细胞裂解液的KAT5蛋白印迹泳道显示为黑色。由于IgG抗体不能将MLKL蛋白沉淀下来，因此也无法将MLKL相互作用蛋白KAT5沉淀下来，故IgG抗体处理的后的细胞裂解液的KAT5蛋白印迹泳道为空白。上述实验结果充分证明，KAT5蛋白与MLKL蛋白能相互结合。
实施例4用表面等离子共振的方法检测多肽M2与KAT5蛋白的结合能力
M2多肽的氨基酸序列为SEKIRKLVAV(SEQ ID NO:1)。
表面等离子共振实验在表面等离子共振仪Biacore T200中进行，操作步骤按照等离子共振仪Biacore T200的说明书进行。具体步骤如下：
(1)将纯化的KAT5蛋白(购自Origene公司)通过氨基偶联到CM5芯片上(购自GE公司)，按10μL/min的流速洗脱除去未结合的蛋白，并且平衡芯片表面2小时。其中，氨基偶联、洗脱和平衡的具体步骤参见GE公司CM5芯片的相关说明书。
(2)自动进样250μL不同浓度(200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、和0.19nM)的M2多肽片段，整个表面等离子共振实验在25℃进行。所使用的缓冲液为HBS-EP缓冲液[0.01MHEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA和0.005％(w/w)表面活性剂]。用Biacore T200自带分析软件模拟不同浓度多肽与KAT5的结合曲线，计算出多肽与KAT5蛋白的亲和力。结果如表2所示，表2说明，肽段M2与KAT5蛋白有较高的亲和力。
表2多肽M2与KAT5蛋白的亲和力测试
多肽名称 与KAT5蛋白的亲和力常数(KD)
M2 6.45×10-9M
实施例5免疫共沉淀方法验证嵌合肽PM2可以竞争KAT5与MLKL蛋白的结合
具体操作步骤如下：
5.1免疫共沉淀试剂
与实施例3中所述试剂一致
5.2具体操作步骤
(1)将带有KAT5-DDK(购自傲锐东源，编号NM_182710)和MLKL-GFP(购自傲锐东源，编号NM_152649)的质粒转染至HEK293T细胞，对照组加入5μM的Pcon多肽(MLKL结构域中不能结合KAT5的α-螺旋肽段)，实验组加入不同浓度(2.5μM、5μM和10μM)的PM2嵌合肽处理。
(2)以免疫共沉淀裂解液裂解细胞，收获细胞总蛋白约2-10mg，将各组蛋白调整至相同浓度。每组蛋白各取200μg，将各组蛋白取出200μg作为细胞裂解液的输入组，并将所得输入组的细胞裂解液作为对照。
(3)剩余蛋白加入2μg DDK抗体(购买自CST，编号为14793)或者与DDK抗体种属相同的普通IgG抗体(购买自cell signaling，商品编号为2729)，4℃缓慢旋转摇动过夜。4℃，3000rpm离心5min，小心吸除上清，宁可留下少量上清也不能吸到磁珠。加入0.5mL免疫共沉淀裂解液，混匀，冰浴静置1min，4℃，3000rpm离心30sec，小心吸除上清。重复洗涤5次，最后一次离心前静置5min。小心吸除上清，加入50μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀，95℃变性5min，迅速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或全部进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5.3结果
结果如图2所示(其中A显示MLKL蛋白与KAT5蛋白的蛋白含量；B显示HEK293T细胞裂解液经过DDK抗体或对照抗体IgG沉淀之后所含KAT5蛋白与MLKL蛋白的蛋白量)，由图2结果可见HEK293T细胞内KAT5蛋白与MLKL蛋白存在相互结合的现象，加入嵌合肽PM2之后，KAT5与MLKL的相互作用显著减弱。其中输入的细胞裂解液制备方法如上文所示，输入代表各组HEK293T细胞裂解液中KAT5与MLKL的蛋白含量，即蛋白原液在经过DDK抗体或对照抗体IgG沉淀之前的MLKL和KAT5蛋白含量，结果表明，输入组细胞裂解液中的MLKL蛋白及KAT5蛋白的含量一致。
其中输出代表蛋白原液经过DDK抗体或对照抗体IgG沉淀之后所含蛋白量，由于IgG抗体作为DDK抗体的对照抗体，不能将带有DDK标签KAT5蛋白沉淀下来，因此IgG抗体处理的细胞裂解液中KAT5和MLKL蛋白印迹泳道显示为空白，而DDK抗体作为实验组抗体，能与KAT5蛋白结合并且将其沉淀下来，因此DDK抗体处理后的细胞裂解液结果为KAT5蛋白印迹泳道显示为黑色。正是因为KAT5蛋白与MLKL蛋白之间存在相互作用，因此使用DDK抗体沉淀KAT5蛋白时也能将MLKL蛋白沉淀下来，因为加入的对照多肽Pcon不能打断KAT5与MLKL的相互作用，故DDK抗体处理后的细胞裂解液的MLKL蛋白印迹泳道也显示为黑色。而加入的嵌合肽PM2打断了KAT5与MLKL的相互作用，所以不能将MLKL蛋白沉淀下来，故其蛋白印迹泳道黑色几乎没有。由于IgG抗体不能将KAT5蛋白沉淀下来，因此也无法将KAT5相互作用蛋白MLKL沉淀下来，故IgG抗体处理的后的细胞裂解液的MLKL蛋白印迹泳道为空白。上述实验结果充分证明，嵌合肽PM2能打断KAT5蛋白与MLKL蛋白之间的结合。
实施例6利用肺纤维化动物模型验证嵌合肽PM2抗肺纤维化作用
6.1将实施例1制备的动物模型在造模10天后分组给药，分组和给药情况如表3所示(i.p.为腹腔注射给药)：
表3肺纤维化动物模型在造模后的分组给药情况
6.2肺纤维化小鼠的肺功能评价
肺功能是临床检测患者肺纤维化的金指标。肺功能的下降往往伴随着纤维化的加剧，而肺功能的改善往往也代表了肺部组织结构的恢复。
实施例1所得肺纤维化模型小鼠通过戊巴比妥钠(45mg/kg，i.p.)麻醉，通过Flexivent小动物肺功能仪进行肺功能检测，检测方法为TLC，SnapShots，(检测方法请参见：Lv X,Wang X,Li K,et al.Rupatadine Protects against Pulmonary Fibrosis byAttenuating PAF-Mediated Senescence in Rodents[J].PloS one,2013,8(7):e68631.)。
检测结果见表4-表7，其中表4为深吸气量，表5为动态阻力，表6为动态弹性，表7为动态顺应性。从表4-表7可见，与假手术组相比，博莱霉素所诱导肺纤维化小鼠深吸气量明显降低，肺部动态阻力及动态弹性上升，顺应性显著降低。经过PM2治疗后肺功能显著恢复。
表4多肽增加肺纤维化小鼠深吸气量
编号 组别 深吸气量(mL) P值
A 假手术组 0.897±0.04656
B 模型组 0.337±0.06982 0.00003(A vs B)
C PM2给药组 0.644±0.00256 0.00257(B vs C)
表5多肽降低肺纤维化小鼠肺部动态阻力
编号 组别 动态阻力(cmH2O.s/mL) P值
A 假手术组 0.848±0.0904
B 模型组 2.280±0.493 0.00258(A vs B)
C PM2给药组 1.182±0.188 0.01129(B vs C)
表6多肽降低肺纤维化小鼠肺部动态弹性
编号 组别 动态弹性(cmH2O/mL) P值
A 假手术组 21.475±4.886
B 模型组 79.550±6.367 0.00002(A vs B)
C PM2给药组 44.2±11.439 0.00341(B vs C)
表7多肽增加肺纤维化小鼠肺顺应性
编号 组别 顺应性(cmH2O/mL) P值
A 假手术组 0.039±0.00274
B 模型组 0.0223±0.00487 0.00203(A vs B)
C PM2给药组 0.0325±0.00391 0.02937(B vs C)
6.3马松染色病理影像学分析
马松染色是胶原纤维染色经典而权威的方法，染色后的肌纤维呈红色，而胶原纤维呈蓝色，主要区别肌纤维和胶原纤维。
取动物右侧下叶肺组织，4％多聚甲醛固定后石蜡包埋。在包埋肺组织的蜡块最大横截面切片，马松染色观察纤维化状况。应用高清晰素彩色病理图文分析系统SpotAdvanced 3.0获得高清晰的马松特殊染色的病理图片(100倍),结果见图3。结果显示，博来霉素给药后小鼠肺组织中的蓝色胶原纤维面积显著增加，而给予多肽治疗后，小鼠肺组织中的蓝色胶原纤维面积显著减少。
6.4肺纤维化小鼠羟脯氨酸含量测定
羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4％，在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此通过羟脯氨酸检测胶原蛋白的含量。检测动物左肺全叶羟脯氨酸的含量，评价肺纤维化的情况。具体方法如下：取实施例1制备所得模型动物的左侧全部肺叶，记录湿重，生理盐水超声匀浆制备成10％的组织匀浆，取约150μL的匀浆上清液，加500μL碱水解液，涡旋混匀后，120度0.1Kpa条件下碱水解法处理40min(方法参照南京建成生物工程技术有限公司试剂盒说明书，略有改动)，调pH值后定容，活性炭处理后取上清。按照说明书(氯胺T法)进行羟脯氨酸测定。结果见表8，从表8可见，与假手术组相比，模型组羟脯氨酸含量及其显著性增高，说明纤维化病理改变严重。PM2治疗后可以显著降低纤维化小鼠肺部羟脯氨酸的含量。
表8多肽降低肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量
编号 组别 羟脯氨酸含量(g/mg蛋白) P值
A 假手术组 0.523±0.0726
B 模型组 0.86±0.172 0.02025(A vs B)
C PM2给药组 0.588±0.054 0.03962(B vs C)
本实验中，通过病理学检查、病理影像学以及其他手段分析结果发现，PM2能显著抑制博莱霉素引起的肺纤维化；显著降低肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸、胶原含量；显著改善肺纤维化小鼠肺功能。上述实验结果证明，PM2在肺纤维化方面具有极好的治疗前景。
上述实施例结果表明，本发明的多肽具有显著的抗肺脏纤维化疾病的作用，可作为活性成份用于制备抗肺纤维化的药物。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中南大学湘雅二医院
<120> 靶向抑制MLKL乙酰化的多肽和/或其衍生物及其用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Glu Lys Ile Arg Lys Leu Val Ala Val
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His Leu Tyr Val Ser Pro Trp
1 5

Claims (11)

1.一种靶向抑制MLKL乙酰化的多肽和/或其衍生物，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示的序列；多肽衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽连接所形成的嵌合肽。
2.根据权利要求1所述的靶向抑制MLKL乙酰化的多肽和/或其衍生物，其特征在于，所述细胞穿膜肽为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的靶向抑制MLKL乙酰化的多肽和/或其衍生物，其特征在于，所述多肽的N端或C端与细胞穿膜肽连接获得所述嵌合肽。
4.权利要求1-3任一项所述的靶向抑制MLKL乙酰化的多肽和/或其衍生物的DNA序列。
5.一种治疗肺纤维化的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1-3任一项所述的靶向抑制MLKL乙酰化的多肽和/或其衍生物以及药学上可接受的载体或赋形剂。
6.权利要求1-3任一项所述的靶向抑制MLKL乙酰化的多肽和/或其衍生物在制备治疗肺纤维化药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肺纤维化包括原发性肺纤维化或继发性肺纤维化。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肺纤维化包括药物性肺纤维化。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物性肺纤维化是博来霉素引起的药物性肺纤维化。
10.根据权利要求6-9任一项所述的应用，其特征在于，所述治疗肺纤维化是通过治疗肺部炎症、肺功能退化或肺损伤进行肺纤维化的治疗。
11.权利要求1-3任一项所述的靶向抑制MLKL乙酰化的多肽和/或其衍生物在制备靶向阻断KAT5乙酰化MLKL，减少M2型巨噬细胞产生细胞外囊泡，促进肺再生任一种制剂中的应用。
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