SK17762000A3 - Farmaceutický prípravok obsahujúci rekombinantný ľudský interferón beta-1a - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka farmaceutického prípravku v tekutej forme, ktorý obsahuje rekombinantný ľudský interferón β-1-a.

Doterajší stav techniky

Interferóny predstavujú rodinu proteínov, ktoré majú antivírusový účinok, inhibujú bunkovú proliferáciu a modulujú prirodzenú imunitnú reakciu (1). Ľudský interferón β (IFN-β), člen tejto rodiny, je glykoproteín so 166 aminokyselinami, ktorý sa tvorí vo fibroblastoch, ale aj v ďalších bunkách, po indukcii vírusovou infekciou alebo infekciou dvojreťazcovou RNA. V uplynulých dvadsiatich rokoch sa klinicky testovali pre široké spektrum ochorení u ľudí nasledujúce tri formy IFN-β (2): prírodný ľudský IFN-β produkovaný fibroblastami predkožky (n-IFN-β), rekombinantný ľudský IFN-β produkovaný v E.coli (ΙΕΝ-β-lb, obsahujúci substitúciu serínu za cysteín v polohe 17 vnesenú metódami génového inžinierstva), a rekombinantný ľudský IFN-β produkovaný v bunkách vaječníkov čínskeho škrečka (IFN^-la, obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu prírodného ľudského IFN-β) . Ako n-IFN-β tak aj ΙΕΝ-β-la sú glykozylované raz N-viazanou komplexnou sacharidovou skupinou, zatiaľ čo ΙΕΝ-β-lb nie je vôbec glykozylovaný.

Jeden komerčne dostupný prípravok ΙΕΝ-β-la (dostupný pod označením Avonex®, vyrábaný firmou Biogen, Inc., Cambridge, MA, ďalej označovaný v texte tejto prihlášky ako variant 1) preukázal liečebné účinky v spomalení akumulujúcich sa fyzických ťažkostí a znížení frekvencie klinických exacerbácií u pacientov s relapsujúcou sclerosis multiplex (roztrúsenou sklerózou

·· ·· • · · · • · ·· • · · • · · ·· ·· ·· •

mozgovo-miechovou), ak sa podávala intramuskulárne (IM) dávka 6 miliónov jednotiek (MU) raz týždenne (3). Druhý prípravok IFN-β-la (komerčne dostupný pod označením Rebif™ od firmy Serono, Inc., ďalej v tejto prihláške označovaný ako variant 2) je v súčasnosti v klinických testoch fázy III podávaný subkutánne (SC) na liečenie sclerosis multiplex. Predchádzajúce štúdie viedli k znepokojeniu, lebo obidva prípravky, aj keď sú obidva zhodne deklarované ako ΙΓΝ-β-la, nemusia mať zhodnú farmakokinetiku a následne ani farmakodynamické profily (4-7).

Podstata vynálezu

Aby sa mohlo posúdiť, či je možné tieto prípravky IFN-β-Ιβ používať zamenitelne, uskutočnilo sa farmakokineticé a farmakodynamické intra-subjektové porovnanie týchto dvoch prípravkov u zdravých žien a mužov - dobrovoľníkov. Výsledky uvedené ďalej v tejto prihláške priniesli prekvapujúce zistenie, a to, že tieto formy nie sú ekvivalentné, ak sú podávané intramuskulárne. ΙΓΝ-β-la variant 1 je prípravok formulovaný v roztoku s vyšším obsahom albumínu (15 mg/ml po rekonštitúcii, v porovnaní s ΙΓΝ-β-la variantom 2 s 9 mg/ml), s odlišnou hodnotou pH (7,2 oproti 5,5) a v odlišnom pufri (fosfátový oproti acetátovému). Okrem toho prípravok variantu 2 IFN-β-Ιβ obsahuje manitol, zatial čo variant 1 ho neobsahuje. Tieto rozdiely vo formulácii obidvoch prípravkov môžu spôsobovať neočakávanú, zmenenú absorpciu IFN-β po IM injekcii tým, že ovplyvňujú väzbu na svalovú extracelulárnu matrix a/alebo inaktiváciu pH-dependentnými proteázami (17).

Na ďalšie posúdenie vplyvu IM injekcií je ďalším cielom vyhodnotiť farmakokinetiku a farmakodynamiku ΙΕΝ-β-la variantu 1 po intravenóznom (IV), subkutánnom (SC) alebo intramuskulárnom (IM) podaní zdravým dobrovolníkom. Tri skupiny, každá zložená z ôsmich zdravých žien a mužov, dostali jednu dávku 60 pg (to • · · ·· ·· • · · · • · ·0 • · · · • · · · ·· ·· znamená 12 miliónov jednotiek) ΙΕΝ-β-la variantu 1 buď 30 minútovou intravenóznou (IV) infúziou alebo subkutánnou (SC) alebo intramuskulárnou (IM) injekciou. Ukázalo sa, že aktivita interferónu v sére vzrástla bezprostredne po skončení IV infúzie a potom zodpovedala biexponenciálnemu modelu poklesu hladiny. Aktivita interferónu je konzistentne detegovatelná v sére po IM injekcii, ale nie po SC injekcii. Farmakodynamická odpoveď, meraná zmenami koncentrácie neopterínu a p₂-mikroglobulínu v sére je tiež najväčšia po IM injekcii, po nej nasledovala SC injekcia a až potom IV podanie. Tieto výsledky ukázali, že optimálna farmakokinetická a farmakodynamická odpoveď vzniká po IM injekcii skôr ako po SC injekcii alebo IV podaní pri prípravku IFN-p-la variantu 1.

K výhodnému uskutočneniu vynálezu, to znamená prípravku na IM podanie, patrí súprava - balíček na parenterálne podávanie tekutého prípravku podía vynálezu. Tento balíček obsahuje injekčnú striekačku vopred naplnenú tekutým prípravkom podía vynálezu, niekolko alkoholových tampónov, aspoň jednu ihlu, jednu alebo niekolko náplastí a pokyny na použitie. Výhodne sa môže tekutý farmaceutický prípravok podía vynálezu použiť s konvenčným bezihlovým injekčným systémom.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Klinická štúdia

A. Porovnanie variantu 1 s variantom 2

Ide o randomizovanú krížovú štúdiu s verejným označením, jedným stredom a dvojitým liečením, ktorá sa navrhla na porovnanie farmakokinetického a farmakodynamického profilu IFN-p-la variantu 1 a variantu 1 po IM injekcii u zdravých dobrovoľníkov. Subjekty štúdie sú dobrovoľníci, muži a ženy, vo veku 18 až 45 rokov, v rámci 15% normálnej telesnej hmotnosti ·· • · ·· ··

I · · · » · ·· » · · · > · · · ·· ··

pre danú výšku, s minimálnou hmotnosťou 50 kg, ktorí písomne potvrdili informovaný súhlas.

Celkom sa do štúdie zahrnulo 15 žien a mužov - ďalej subjektov. Subjektom sa podala IM injekciou jedna dávka 6 MU variantu 1 a jedna dávka 6 MU variantu 2, pričom medzi podaním dávok je interval dvoch týždňov. Okrem jedného všetky subjekty štúdiu dokončili. U ženy, ktorá dostala variant 2 v prvom období štúdie vznikla faryngitída a bolesti hlavy, a opustila štúdiu pred podaním variantu 1. Tento subjekt nebol teda súčasťou žiadnej farmakokinetickej ani farmakodynamickej analýzy. Intramuskulárna injekcia sa podala do anterolaterálnej oblasti stehna. Dávky sa podávali do ekvivalentných kontralaterálnych miest, to znamená, že dávky variantu 1 a variantu 2 neboli injikované do rovnakého miesta.

Subjekty boli prítomné na jednotke klinickej farmakológie 24 hodín pred každou injekciou a zostali tam až do skončenia vyhodnocovania, 24 hodín po podaní dávky. Subjekty boli na lôžku 1 hodinu po každej dávke, potom sa povolila normálna aktivita.

Po každej injekcii dostali subjekty dávku paracetamolu (acetaminofén), aby sa znížila pravdepodobnosť výskytu symptómov podobných chrípke, ktoré sú spojené s podávaním interferónov. Subjekty boli informované, aby neužívali inú medikáciu po celý čas účasti na štúdii.

Vzorky krvi na farmakokinetické meranie sa odobrali bezprostredne pred každou dávkou a potom 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36 a 48 hodín po dávke.

Farmakodynamika sa hodnotila stanovením profilu koncentrácie neopterínu v sére. Neopterín je produkt interferónom indukovanej GTP cyklohydrolázy, zvýšenie neopterínu v sére po injekcii odráža downstream biologickú odpoveď na aktiváciu receptora interferónom-β (8,9). Vzorky krvi na stanovenie neopterínu sa odobrali bezprostredne pred každou dávkou a potom 6, 12, 18, 24, 30, 36, ·· ·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· ·· ··

48, 72, 96 a 144 hodín po dávke.

Po celý čas štúdie sa zaznamenávali vedlajšie nežiaduce účinky. Rutinné hematologické a biochemické testy sa uskutočnili 144 hodín po každej injekcii. Táto štúdia sa uskutočnila v Spojenom Kráľovstve v súlade s Helsinskou deklaráciou.

B. Štúdia s jednou dávkou

Ide o štúdiu s jednou dávkou a paralelnými skupinami na porovnanie farmakokinetiky a farmakodynamiky IFN-p-la variantu 1 a variantu 2 pri troch rôznych spôsoboch podania: SC, IM a 30 minútovou IV infúziou.

Subjekty štúdie sú zdraví dobrovoľníci, muži a ženy, vo veku 18 až 45 rokov, v rámci 15% normálnej telesnej hmotnosti pre danú výšku, s minimálnou hmotnosťou 50 kg, ktorí písomne potvrdili informovaný súhlas. Subjekty sa považovali za zdravé po splnení nasledujúceho: fyzikálne vyšetrenie, elektrokardiografické vyšetrenie (EKG) a rutinné laboratórne vyšetrenie krvi a moču, vrátane testu na prítomnosť antigénov hepatitídy B, hepatitídy C a HIV. Do štúdie sa neprijali gravidné a kojace ženy.

Do štúdie sa zahrnulo celkom 24 subjektov (12 žien a 12 mužov), subjekty sa rozdelili do skupín po ôsmich a podalo sa im 60 μg IFN-p-la variantu 1 SC injekciou, IM injekciou alebo 30 minútovou IV infúziou. V každej skupine bol rovnaký počet mužov a žien.

Vzorky krvi na farmakokinetické merania sa odobrali 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24 a 48 hodín po SC alebo IM injekcii a 10, 20 a 30 minút po začiatku infúzie a potom 5, 10, 20, 45, 60 a 90 minút a 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 15, 18, 24 a 48 hodín po skončení IV infúzie.

Meranie interferónov zahŕňajúce dva markery biologickej odpovede, a síce hladinu neopterínu a p₂-mikroglobulínu (9) ·· ·· ·· • · · · · · ·· • · ·· · e · x- ······ · · b ······· • · · · ·· · · v sére, sa uskutočnili 6, 12, 24 a 48 hodín po podaní lieku.

Rutinné testy moču a krvi sa uskutočnili 48 hodín po podaní lieku. Po celý čas štúdie sa zaznamenávali vedlajšie nežiaduce účinky. Táto štúdia sa uskutočnila na jednotke klinickej farmakológie v Spojenom Kráľovstve po schválení lokálnou etickou komisiou.

Prípravok použitý v štúdii

A. Porovnanie variantu 1 a variantu 2

ΙΡΝ-β-la variantu 1 prípravku sa dodala vo forme sterilného lyofilizovaného prášku obsahujúceho ΙΡΝ-β-la, fosforečnan sodný a chlorid sodný. Pred injekciou sa obsah fiolky rekonštituoval pomocou sterilnej vody pre injekcie.

ΙΡΝ-β-la prípravok variantu 2 bol dostupný ako sterilný lyofilizovaný prášok obsahujúci ΙΡΝ-β-la variantu 2, manitol, HSA a octan sodný. Prípravok variantu 2 sa rekonštituoval pomocou roztoku chloridu sodného (0,9% NaCl) pre injekciu.

Každý z prípravkov sa pred injekciou skladoval ako lyofilizovaný prášok pri teplote 2 až 8°C. Variant 1 sa balil do fioliek po 6 mU a variant 2 do fioliek po 3 mU. Aktivita prípravku sa považovala za zhodnú s aktivitou deklarovanou na štítku.

Každá fiolka variantu 2 sa rekonštituovala podlá pokynov na použitie pomocou 1 ml dodaného vehikula. Dve fiolky sa spojili, aby sa získala dávka 6 MU asi v 2 ml roztoku. Každá fiolka variantu 1 sa tiež rekonštituovala pódia pokynov a pripravil sa 1 ml roztoku. Aby sa však injikoval zhodný objem v obidvoch prípadoch, použili sa tiež zhodné placebo fiolky obsahujúce len excipient a rekonštituovali sa pomocou 1 ml sterilnej vody. Rekonštituovaná fiolka variantu 1 sa potom spojila s týmto ·· ·· ·· ·· • •99 · • · ·· · • · · · · · ·· ·· ···

placebom a vznikli tak 2 ml injekčného roztoku so 6 MU.

B. Štúdia s jednou dávkou

IFN-p-la variantu 1 prípravku sa dodala vo forme sterilného lyofilizovaného prášku vo fiolke obsahujúcej 60 pg IFN-p-la, ľudský sérový albumín, fosforečnan sodný a chlorid sodný. Pred injekciou sa obsah fiolke rekonštituoval 1 ml sterilnej vody pre injekciu. Špecifická aktivita IFN-p-la použitého v tejto štúdii je 200 miliónov jednotiek (MU) antivírusovej (interferónovej) aktivity na 1 mg proteínu IFN-p-la variantu 1. Každá fiolka teda obsahovala 12 MU interferónovej aktivity.

Testovacie metódy

A. Porovnanie variantu 1 a variantu 2

Hladiny IFN-P v sére sa kvantifikovali pomocou biologického testu cytopatického účinku (CPE). Test CPE meral hladinu interferónom sprostredkovanej antivírusovej aktivity, ktorá bola úmerná koncentrácii aktívneho interferónu vo vzorkách séra. Historicky bol tento test štandardnou metódou na hodnotenie farmakokinetiky IFN-p (10,11).

Test CPE zisťuje schopnosť interferónu P (IFN-P) chrániť ľudské bunky pľúcneho karcinómu (A549, CCL-185, ATCC, Manassas, Virginia, USA) pred toxicitou spôsobenou vírusom encefalomyelokarditídy (EMC). Bunky sa preinkubovali 15 až 20 hodín so vzorkami séra, aby došlo k indukcii a syntéze interferónom indukovatelných proteínov, ktoré tvoria antivírusovú reakciu. Po preinkubácii sa do každej jamky pridal EMC vírus a inkubácia pokračovala ďalších 30 hodín, cytotoxicita sa potom vyhodnotila pomocou farbenia kryštálovou fialovou. Vnútorný štandard IFN-P sa testoval súčasne so vzorkami na každej z doštičiek. Tento štandard sa kalibroval proti prírodnému interferónu z ludských ·· • · · ·· o

• · ·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· ·· · ·· ·· fibroblastov, ktorý je štandardom podlá WHO (WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-902-531)(12).

Vzorky séra a štandardy sa testovali v dvoch opakovaniach na každej z dvoch replík testovacích doštičiek, takže pre každú vzorku sa získali štyri experimentálne hodnoty. Vyniesla sa hodnota geometrického priemeru koncentrácie zo 4 meraní.

Medzi-testová variabilita sa stanovila výpočtom 95% intervalu spoľahlivosti pre priemer koncentrácie štandardu IFN-β z 323 testovacích doštičiek. Variabilita je menšia ako 10% priemeru. Spodný limit kvantifikácie je všeobecne 10 U/ml. Koncentrácia neopterínu sa stanovila pomocou komerčne dostupnej RIA súpravy zo ¹²⁵I (ImmunoBiological Laboratories, Hamburg, Nemecko). Personál vykonávajúci farmakokinetickú a farmakodynamickú štúdiu nebol oboznámený s pridelením liekov.

B. Štúdia s jednou dávkou

Hladiny IFN-β v sére sa kvantifikovali pomocou biologického cytopatického účinku (CPE). Test CPE meral hladinu interferónom sprostredkovanej antivírusovej aktivity. Úroveň antivírusovej aktivity vo vzorke odráža počet molekúl aktívneho interferónu obsiahnutých vo vzorke v okamihu, keď sa vzorka krvi odobrala. Tento postup je štandardnou metódou na hodnotenie farmakokinetiky IFN-β (11) .

Test CPE zisťuje schopnosť interferónu β (IFN-β) chrániť ludské bunky plúcneho karcinómu (A549, CCL-185, ATCC, Rockville, Maryland, USA) pred toxicitou spôsobenou vírusom encefalomyelokarditídy (EMC). Bunky sa preinkubovali 15 až 20 hodín so vzorkami séra, aby došlo k indukcii a syntéze interferónom indukovateľných proteínov, ktoré tvoria antivírusovú reakciu. Po preinkubácii sa do každej jamky pridal EMC vírus a inkubácia pokračovala ďalších 30 hodín, cytotoxicita sa potom vyhodnotila pomocou farbenia kryštálovou fialovou. Vnútorný štandard IFN-β sa ·· • · · · · • · ·· · • · · · · · • · · · · ·· · ·· ·· ·· ·· • ·

testoval súčasne so vzorkami na každej z doštičiek. Tento štandard sa kalibroval proti prírodnému interferónu z ludských fibroblastov, ktorý je štandardom podía WHO (WHO Second International Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb-23-902-531) (12). Každá testovacia doštička obsahovala tiež jamku s kontrolou bunkového rastu a táto jamka neobsahovala žiadny interferón β ani EMC, a jamku s vírusovou kontrolou, ktorá obsahovala bunky a EMC, avšak neobsahovala interferón β. Kontrolné doštičky obsahujúce štandard a vzorky sa pripravili pre kontrolu účinku, ak nejaký je, vzoriek na bunkový rast. Tieto doštičky sa zafarbili bez prídavku vírusu.

Vzorky séra a štandardy sa testovali v dvoch opakovaniach na každej z dvoch replík testovacích doštičiek, teda pre každú vzorku sa získali štyri experimentálne hodnoty. Vyniesla sa hodnota geometrického priemeru koncentrácie zo 4 meraní. Spodný limit kvantifikácie je všeobecne 10 U/ml.

Koncentrácia neopterínu a β2-mikroglobulínu sa stanovila pomocou komerčne dostupných testov na jednotke klinickej farmakológie. Neopterín sa nemeral pri skupine s IV dávkou, pretože v čase testovania tejto skupiny nebol test dostupný.

Farmakokinetika a štatistické metódy

A. Porovnanie variantu 1 a variantu 2

Uskutočnila sa štandardná opisná analýza aktivity interferónu v sére pre obidva ΙΕΝ-β-la prípravky. Vypočítali sa nasledujúce farmakokinetické parametre:

I, plocha pod krivkou, AUC (U x h/ml) pre interval 0 až 48 hodín po podaní dávky, použitím lichobežníkového algoritmu,

II) pozorovaný vrchol aktivity v sére C_max, (U/ml), pomocou prezerania,

III) čas do dosiahnutia pozorovaného vrcholu aktivity v sére, t_max

·· • · ·· • · · • ·

·· · ·· ··· (hod), prezeraním.

Pri výpočte AUC a C_max sa odpočítala bazálna hodnota aktivity interferónu od všetkých hodnôt meraných po podaní dávky, všetky nezistiteľné hodnoty sa považovali za zhodné s hodnotou 0 U/ml. Avšak vo výpočte relatívnej biologickej dostupnosti, nezistiteľné hodnoty po podaní dávky sa považovali za zhodné s hodnotou 5 U/ml (ktorá predstavuje polovicu spodného limitu kvantifikácie). Vykonalo sa to preto, že hodnoty aktivity interferónu v sére boli 0 U/ml po podaní variantu 2 u piatich subjektov a po podaní variantu 1 u jedného subjektu. V prípade piatich subjektov s variantom 2 nastavenie hodnoty nezistiteľnej koncentrácie na 5 U/ml umožnilo vypočítať určitú hodnotu biologickej dostupnosti.

Hodnoty AUC a C_max sa analyzovali dvojcestnou krížovou analýzou rozptylu (Anova). Faktory v analýze boli sekvencia, subjekt, pohlavie, čas a liečenie. Interakcia pohlavie-liečenie bola síce na začiatku súčasťou analýzy, ale potom sa vylúčila, lebo interakcia nebola významná. AUC a C_max sa pred analýzou logaritmický transformovali.

Vypočítali sa nasledujúce farmakodynamické parametre:

I) plocha pod krivkou normalizovaná k bazálnej hodnote, v intervale 0 až 144 hodín, E_ÄUc a log_eE_max, použitím dvojcestnej krížovej analýzy Anova opísanej skôr.

II) Určili sa tiež pomery E_AUc a log_eE_max pre variant 1 a variant 2 s 90% intervalom spoľahlivosti. Na zistenie toho, či koncentrácia neopterínu v sére 144 hodín po podaní dávky je stále zvýšená, hodnoty rozdielu medzi bazálnou hodnotou a hodnotou získanou 144 hodín po podaní dávky sa porovnali s nulou pomocou párového t-testu.

B. Štúdia s jednou dávkou ··

·· ·· • · · • · ·· • · · ·· ·· • · · · • · • · · · • · · ·· ·

Na preloženie experimentálnych dát farmakokinetickými modelmi sa použil Software Rstrip® (MicroMath, Inc., Sált Lake City, UT, USA). Pre každú skupinu sa vyniesli hodnoty geometrického priemeru koncentrácie v závislosti na čase. Pretože výsledky testov sú vyjadrené ako riedenie, geometrické priemery sa považovali za vhodnejšie parametre ako aritmetické priemery. Hladiny interferónu v sére sa upravili s ohladom na bazálnu hodnotu a nezistitelné hodnoty po podaní dávky sa považovali za zhodné s hodnotou 5 U/ml, čo predstavuje polovicu spodného limitu detekcie.

Dáta IV infúzie sa spracovali tak, že zistitelné hodnoty koncentrácie v sére sa preložili dvojkompartmentovým modelom IV infúzie pre každý subjekt, a dáta pre SC a IM injekciu sa preložili dvojkompartmentovým injekčným modelom.

Vypočítali sa nasledujúce farmakokinetické parametre (20):

I) pozorovaný vrchol aktivity v sére C_inax, (U/ml), prezeraním,

II) plocha pod krivkou, AUC (U x h/ml) pre interval 0 až 48 hodín po podaní dávky, použitím lichobežníkového algoritmu,

III) eliminačný polčas, v hodinách, a naviac z dát pre infúziu:

IV) distribučný polčas, v hodinách,

V) klírens (M/l/hod),

VI) zjavný distribučný objem, Vd (1).

Na výpočet eliminačného polčasu po SC a IM injekcii sa použil Software WinNonlin (verzia 1.0, Scientific Consulting Inc., Apex, NC, USA).

Pre každú skupinu sa vyniesli hodnoty aritmetických priemerov p₂-mikroglobulínu a neopterínu v závislosti od času. Hodnoty C_max, AUC a E_raax sa analyzovali jednocestnou analýzou variancie na porovnanie skupín s rôznym podávaním dávok. Hodnoty C_max a AUC sa • · • · ·· ·· • · · • · • · ·· ·· ·· e logaritmický transformovali pred analýzou, a uviedli sa hodnoty geometrického priemeru.

Výsledky a diskusia

A. Porovnanie variantu 1 a variantu 2

Obr. 1 ukazuje pre každý prípravok priemernú hodnotu aktivity interferónu v sére v závislosti od času. V každom časovom bode po podaní dávky bola priemerná hodnota aktivity interferónu v sére u variantu 1 vyššia ako u variantu 2. Tabuľka I zahŕňa farmakokinetické parametre pre každý prípravok a tiež výsledky krížovej analýzy rozptylu. Priemer hodnoty AUC metódou najmenších štvorcov je u variantu 1 a variantu 2 824 a 403 U x h/ml v uvedenom poradí. Pomer priemerov AUC metódou najmenších štvorcov variantu 1 k variantu 2 je 204% s 90% intervalom spoľahlivosti 172 až 243% (p<0,001).

Priemerné hodnoty C_max metódou najmenších štvorcov sú

33,8 U/ml u variantu 1 a 15,2 U/ml u variantu 2. Pomer priemerných C_max metódou najmenších štvorcov variantu 1 k variantu 2 je 222% s 90% intervalom spoľahlivosti 172 až 285% (p<0,001). Priemerný čas na dosiahnutie maximálnej koncentrácie je v rozsahu 12 a 16 hodín pre variant 1 a variant 2.

Farmakodynamický účinok variantu 1 sledoval zistené farmakokinetické parametre. Obr. 2 ilustruje pre každý prípravok časový priebeh geometrického priemeru koncentrácie neopterínu, ktorá je závislá na podanom liečive. Pre obidva prípravky platí, že koncentrácia neopterínu vzrástla prvých 36 hodín po podaní prípravku, potom sa udržiavala v intervale 36 až 72 hodín po podaní na stálej hodnote a potom postupne klesala. Avšak indukcia neopterínu je väčšia u variantu 1 v porovnaní s variantom 2. Priemerné hodnoty koncentrácie pre interval 36 až 72 hodín po podaní sú 12,0 nmol/1 u variantu la 9,3 nmol/1 u variantu 2. Koncentrácie neopterínu 144 hodín po podaní sú významne vyššie ·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· ako pred podaním prípravku, a síce pre obidva spôsoby liečenia (p<0,001).

Tabulka 1

Výsledky farmakokinetickéj analýzy: farmakokinetické parametre

liek	AUC1 (U x h/ml)	Cmax 2 (U/ml)	tmax 2 (h)
variant 1	824	33, 8	15
variant 2	403	15,2	12
Pomer variant 1/variant 2	204%	222%	neurčené
90% interval spoľahlivosti	172-243%	172-285%	neurčené
p-hodnota	<0,001	<0,001	<0,05

V hodnoty sú priemery najmenších štvorcov transformované späť z logaritmického merítka, na základe analýzy rozptylu korigovanej na subjekt a čas ²/ hodnoty aritmetického priemeru

Tabuľka II zahŕňa farmakodynamické parametre E_AUC a E_max. Priemerné hodnoty E_ÄUC metódou najmenších štvorcov sú 693 nmol x h/1 u variantu 1 a 481 nmol x h/1 u variantu 2. Pomer priemerných hodnôt E_ÄUc variantu 1 k variantu 2 je 144% s 90% intervalom spoľahlivosti 131 až 159% (p<0,001). Priemerné hodnoty E_max metódou najmenších štvorcov sú 9,5 nmol/1 u variantu 1 a 6,9 nmol/1 u variantu 2 (p<0,001) . Pomer priemerných hodnôt E_max variantu 1 k variantu 2 je 138% s 90% intervalom spoľahlivosti 123 až 156%.

Všetky subjekty sú zahrnuté do analýzy bezpečnosti. Po podaní variantu 1 sa u 21 subjektov z 29 (to znamená 72%) prejavili nežiaduce vedľajšie účinky, po podaní variantu 2 sa nežiaduce účinky prejavili u 21 subjektov z 30 (to znamená 70%). Nežiaduce vedlajšie účinky typické pre interferón, podobné chrípkovému syndrómu sprevádzali obidva varianty prípravku. Najobvyklejším vedlajším príznakom bola bolesť hlavy: prejavila sa u 40% subjektov po podaní variantu 2 a 38% subjektov po ·· ·· ·· · ·· • · · · ···· ··· • · ·· ··· · · • · · ··· · ··· · podaní variantu 1. Nauzea, bolesť v krížoch a bolesti svalov sa opísali v 24%, 28% a 31% subjektov po injekcii variantu 1 a len u 10% alebo menej subjektov po podaní variantu 2. Vyšší výskyt týchto troch príznakov môže súvisieť s vyššou biologickou dostupnosťou u variantu 1. Žiadne reakcie v mieste vpichu sa neopísali ani u jedného z variantov.

Tabulka II

Výsledky farmakodynamickej analýzy: hladina neopterínu v sére, korigovaná na bazálnu hladinu

liek	AUC1 (nmolxh/ml)	Emax1 (nmol/1)	tmax (h)
variant 1	693	9,5	44,9
variant 2	481	6,9	50,3
Pomer variant 1/variant 2	144%	138%
90% interval spoľahlivosti	131-159%	123-156%
p-hodnota	<0,001	<0,001

^x/ hodnoty sú priemery najmenších štvorcov transformované späť z logaritmického merítka, na základe analýzy rozptylu korigovanej na subjekt a čas, p-hodnoty vychádzajú z porovnania modelov pre dva prípravky ²/ hodnoty aritmetického priemeru

Tieto výsledky v súhrne ukazujú, že dva proteíny, ktoré by mali byť podobné vo svojich biochemických vlastnostiach, prekvapujúco nemajú zhodné absorpčné profily ani farmakodynamické účinky po IM podaní. K potenciálnemu vysvetleniu týchto rozdielov patria: I) nedefinované štruktúrne rozdiely medzi dvoma molekulami, II) rozdiely v množstve podávaného liečiva alebo

III) rozdiely vo formulácii lieku. Ak ide o prvú možnosť, keďže obidve molekuly sú pripravované pomocou expresie prírodného ľudského génu pre IFN-β v bunkách CHO, je nepravdepodobné , že by existovali velké štruktúrne rozdiely v aktívnych skupinách liečiva obsiahnutého vo variantu 1 a variantu 2. Namiesto toho by skôr menšia hmotnosť liečiva v príslušných fiolkách mohla ·· ·· ·· · ·· • · · · ···· ··· • · ·· · · e ·· • ·· ··· · · ·· · • · · · ··· · · ·· ·· ·· ··· ·· · vysvetliť nižšie absorbované dávky prípravku. Avšak špecifická aktivita TFN-β proteínu sa uviedla ako 3 x 10⁸ jednotiek/mg (to znamená 300 MU antivírusovej aktivity na 1 mg proteínu), zatial čo u variantu 1 je uvedená špecifická aktivita 2 x 10⁸ jednotiek/mg (14). To by ukazovalo, že fiolkách so 6 MU variantu 2 obsahuje 20 pg proteínu IFN-p-la, zatial čo fiolka so 6 MU variantu 1 obsahuje 30 μg IFN-p-la. Priame potvrdenie tohto rozdielu sa však nepodarilo získať, pretože obidva prípravky sa formulovali s viac ako 300 násobným nadbytkom HSA, čo neumožnilo presne stanoviť koncentráciu IFN-Q-la.

Avšak ani tieto zjavné rozdiely v hmotnosti dávky celkom nevysvetľujú dvojnásobný rozdiel vo farmakokinetických hodnotách. Ako je diskutované ešte ďalej, ďalším známym rozdielom, ktorý by mohol poskytnúť vysvetlenie, je rozdielna formulácia prípravkov.

Najdôležitejšie však je, že rozdiely vo formulácii a pozorované rozdiely vo farmakokinetických a farmakodynamických parametroch neumožňujú výsledný výrok o klinickej účinnosti IM podávaní prípravku variantu 2 pacientom so sclerosis multiplex, bez toho aby sa uskutočnila klinická štúdia s týmto spôsobom podávania. Ak nebudú takéto údaje k dispozícii, dáta uvedené v tejto štúdii ukazujú, že jednoduchá náhrada variantu 1 variantom 2 pri rovnakých deklarovaných dávkach pre IM podanie, nevedie k rovnakému terapeutickému účinku ako u variantu 1.

B. Štúdia s jednou dávkou

Demografické údaje

Tabulka III zahŕňa základné demografické údaje pre každú skupinu. Vek, výška a hmotnosť sú medzi skupinami podobné.

Tabulka III

Zhrnutie demografických údajov ·· ·· ·· · ·· • · · · · · ·· ·· • · ·· · · · ·· ® ® · · 9 9 9 9 9 9 9 • •99 9 9 9 9 9 ·· ·· 99 999 99

	Spôsob podávania
parameter	intravenózne	intramuskulárne	subkutánne
vek (roky)	27,9 (± 6,7)	27,6 (± 3,7)	31,5 (± 8,4)
výška (cm)	171,5 (± 10,3)	168,6 (± 8,6)	166,1 (± 4,8)
hmotnosť (kg)	68,4 (± 10,6)	63,1 (± 8,9)	65,9 (± 6,9)

Hodnoty v tabulke predstavujú priemer (± stredná chyba)

Farmakokinetiká

Obr. 3 ukazuje priemerné hodnoty aktivity interferónu od začiatku IV infúzie. Maximálne hodnoty C_max sa zisťovali buď po 20 minútach (jeden subjekt) alebo po 30 minútach, to znamená pri skončení infúzie (u všetkých ostatných subjektoch). Hodnota C_max kolísala od 160 do 640 U/ml. Dáta sú velmi dobre opísané dvojkompartmentovým modelom. Na základe tohto modelu sa stanovil priemerný distribučný polčas a eliminačný polčas na 4 minúty a 4 hodiny, v uvedenom poradí. Priemerný distribučný objem je

61.6 1 a priemerný celkový klírens je 334 ml/h/kg.

Obr. 4 ukazuje priemerné hodnoty aktivity interferónu v sére v závislosti od času po SC a IM injekcii. Vrchol aktivity interferónu po IM injekcii je 40 U/ml u všetkých subjektov, až na jeden, u ktorého je vrcholová hodnota 80 U/ml. Priemerná hodnota C_max po SC podaní je 20 U/ml. Avšak aktivita interferónu v sére zostala pod detekčným limitom vo všetkých časových bodoch po injekcii u 4 z 8 subjektov v skupine s SC dávkou. Po IM podaní * sú hodnoty AUC a C_max štatisticky významne vyššie ako po SC podaní (p<0,001 a p=0,033).

Priemerný eliminačný polčas je 10,0 hodín po IM injekcii a

8.6 hodín po SC injekcii, obidva sú teda vyššie ako u skupiny po IV infúzii. Keďže mechanizmy klírensu sú zrejme zhodné ako po IV infúzii, výpočty eliminačného polčasu ukazujú, že ide o predĺženú absorpciu z miesta IM alebo IM injekcie.

Hodnota AUCi_M vyššia ako AUC_IV je neočakávaným výsledkom, ale

• · «· • · • · · • ·· • · · • · · ·· • · · • · • ·· je možné ju pripočítať predĺženej absorpčnej fáze, ktorá môže viesť k zvýšenej expozícii séra (pozri diskusia). Biologická dostupnosť sa nevypočítala, lebo sú k dispozícii len nedostatočné dáta na to, aby umožnila spoľahlivé určenie AUC pre predĺžený absorpčný čas. Tabulka II (uvedená skôr) zahŕňa farmakokinetické výsledky.

Farmakodynamika

Priemerné hodnoty koncentrácie P2-mikroglobulínu a neopterínu v závislosti od času sú ukázané na obr. 5 a 6. Vrcholové hodnoty u obidvoch markerov sú pozorované buď 24 alebo 48 hodín po podaní. Priemerná hodnota E_max pre p₂ ^-mikroglobulín v sére je 796 μg/l po IM injekcii a 628 pg/l po SC injekcii a 559 pg/l po IV infúzii (p=0,050 pre porovnanie IM so SC, p=0,008 pre porovnanie IM s IV) . Priemerná hodnota E_max pre neopterín v sére je 16,0 nmol/1 po IM injekcii a 12,4 nmol/1 po SC injekcii (p=0,18). Hodnoty E_max sú zhrnuté v tabulke IV.

Tabulka IV

Súhrn farmakokinetických a farmakodynamických parametrov

	Spôsob podávania
parameter	intravenózne	intrámuskulárne	subkutánne
Cmax (U/ml)	262 (± 4,5)	44 (± 4)	20 (± 7)
AUC (h x U/ml)	537 (± 40)	1352 (± 111)	478 (± 119)
eliminačné Ti/2 (h)	4,0 (± 1,6)	10,0(± 0,8)	8,6 (± 1,0)
distribučné Ti/2 (h)	0,07 (± 0,02)
klírens (ml/h/kg)	334 (± 18)
Vd (1)	61,6 (± 16,7)
P2-mikroglobulín: Emax (Mg/1)	559 (± 70)	796 (± 58)	628 (± 39)
neopterín: Emax (nmol/1)	-	16,0 (± 2,0)	12,4 (± 1,5)

Hodnoty v tabulke predstavujú priemer (+ stredná chyba) ·· · ·· · ·· • · · · ···· ··· • 9 99 9 9 9 9 9 • 9 9 · · · · · ·· · • · · · · · · 9 9 ·· ·· ·· ·· ·· ·

Táto štúdia s jednou dávkou definovala farmakokinetické a farmakodynamické profily konkrétneho prípravku IFN-p-la variantu 1 po IV, SC alebo IM podaní. Po 30 minútovej IV infúzii sa ΙΓΝ-β-la variantu 1 rýchlo distribuoval v priebehu niekoľkých minút, klírens potom trval niekolko hodín. Eliminačný polčas pozorovaný v tejto štúdii je 4 hodiny v porovnaní s časom 1,5 až 5 hodín opísaným v skorších štúdiách pre IFN-p. Podobne minimálne zvýšené hodnoty aktivity interferónu v sére po SC podaní sú v súlade s inými interferónovými prípravkami. Avšak po IM podaní týchto ostatných interferónových prípravkov (pozri napríklad (15)) sa nepozorovali zistiteľné hladiny v sére. V tejto štúdii je aktivita interferónu po IM injekcii 2 až 3 vyššia ako po SC podaní.

V tejto štúdii zistená zvýšená absorpcia po IM podaní v porovnaní so SC injekciou u IFN-p-la variantu 1 nie je pravdepodobne dôsledkom vlastností molekuly účinnej látky samotnej. V inej štúdii (7) sa nenašli žiadne rozdiely vo farmakokinetike a farmakodynamike medzi IM injekciou a SC injekciou IFN-p-la variantu

2. Ako molekula IFN-p-la použitého v tejto štúdii, tak aj molekuly IFN-p-la v citovanej štúdii sú produkované expresiou prírodného génu ľudského IFN-p v bunkách ovárií čínskeho škrečka.

V dôsledku toho je nepravdepodobné, že by existovali významné štruktúrne rozdiely v aktívnych skupinách týchto dvoch liečiv. Okrem toho farmakokinetické vlastnosti po IV podaní IFN-p-la variantu 1 v tejto štúdii sú podobné tým, ktoré sú opísané v skorších štúdiách. Pretože je možné očakávať, že dopad neúčinných zložiek, to znamená excipientov, je po IV podaní minimálny, podobné IV farmakokinetické parametre pre rôzne molekuly IFN-p vedú k predpokladu, že ani vlastné farmakokinetické chovanie týchto molekúl nie je rozdielne.

Pravdepodobným vysvetlením toho, že interferón je dodávaný do krvi po injekčnom podaní variantu 1 IFN-p-la sú neúčinné zlož19 ·· ·· ·· · ·· • · · · ···· ··· • · ·· · 9 9 9 9 · · · · · · · ·· · • · · · ··· ·· ·· ·· ·· ··· ·· · ky prípravku, to znamená excipienty. Paulesu a kol. (17) predpokladali, že zlá absorpcia mnohých molekúl IFN-β po IM injekcii je dôsledkom väzby IFN-β na extracelulárny matrix v svale alebo dôsledok inaktivácie proteázami. Ďalej autori ukázali, že svalový homogenát môže inaktivovať IFN-β, avšak nie IFN-α. Inaktivácia je čiastočne blokovaná albumínom, čo vedie k predpokladu, že zmena formulácie takého prípravku by mohla zvýšiť biologickú dostupnosť interferónu po IM injekcii. Rôzne prípravky interferónu β sa odlišujú formuláciou a tieto rozdiely môžu tiež ovplyvňovať interakciu s lokálnymi faktormi v svale. Napríklad ako IFN-β-Ιό tak aj IFN-β-Ιβ použité v tejto štúdii sa formulovali pri fyziologickom pH a obsahovali 15 mg/ml ludského albumínu ako stabilizačnú prísadu (18). Avšak IFN-β-Ιό obsahuje tiež dextrózu, ktorú neobsahuje žiadny z variantov ΙΕΝ-β-la. Prípravok ΙΕΝ-β-la má po rekonštitúcii pH 5 až 5,5 a obsahuje manitol a 9 mg/ml ľudského albumínu ako stabilizátor (15) .

Absorpcia z miesta SC alebo IM injekcie je predĺžená.

V dôsledku toho sa nemohla vypočítať biologická dostupnosť pre tieto dva spôsoby podávania. Štandardným spôsobom stanovenia biologickej dostupnosti je výpočet absorbovanej frakcie (to znamená AUCim/ALJCi_V) . Podlá tohto parametra samotného, biologická dostupnosť presahovala 100%. Avšak tento prístup môže viesť k nadhodnoteniu biologickej dostupnosti, keď je absorpčný proces podstatne pomalší ako eliminačný proces (tzv. flip-flop kineti« ka) (19) . Za týchto okolností je potrebné upraviť hodnotu AUC™ pomocou vhodnej rýchlosti konštanty (to znamená, zjavná eliminačná rýchlostná konštanta k_ei by sa mala nahradiť zjavnou absorpčnou rýchlostnou konštantou k_a) . V predloženej štúdii sa nemohla taká korekcia biologickej dostupnosti vypočítať z dôvodov intersubjektovej variability v absorpčnej a eliminačnej rýchlosti.

Citovaná literatúra

1. Barón,S.Tyring SK, Fleischmann, Coppenhaver WR, Niesel DH, ·· · ·· · • · · · · · ·· • · ·· · · · • ·· · · · · · • · · · · · · ·· ·· ·· ··· • · ·· ·

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

Limpel DW, Stanton GJ, Hughes TK, JAMA, 266,1375-1383(1991)

Alam, J. Curr Op Biotech 6, 688-69 (1995)

Jacobs L., et al. Ann Neur, 39, 285-294 (1996)

Alam J., Gorman B., Stannard M., Dawson A., Loynds P., Mant T., Fox I., J interferon Res. 11 (suppl 1): S246 (1991) AVONEX™ U.S.Package insert. Clinical Pharmacology

Palimisano L., Salmon P., Cotonnec JY., Samra H., Klasen E., J Interferon & Cytokine Res. 10, (Suppl 1): S125 (1990)

Salmon P., Le Cotonnec J-Y., Galazka A., Abdul-Ahad A., Darragh A., J Interferon & Cytokine Res, 16, 759-765 (1996)

Fuchs D., Weiss G., Reibnegger G., Wachter H., Crit Rev Clin Lab, 29, 307-341 (1992)

Witt PL., Storer BE., Bryan GT., Brown RR., Flashner M., Larocca AT., Colby CB., Borden EC., J immunotherapy, 13, 191-200 (1993)

Chiang J., Gloff C., Yoshizawa C., Williams G., Pharmaceutics Res, 10, 567-57 (1993)

Chiang J., Gloff CA., Soike K., Williams G., J Interferon Res., 13 111-120 (1993)

WHO Expert Committee of Biological Standization. 38^th World Health Organization Technical Report, Šerieš 771, p.36-38 (1988)

Kenward M., Jones B.: Design and Analysis of Cross-Over Trials. Chapman and Hill, 1989

Canosi U., Macia M., Gazza L., Serlupi-Crscenzi O., Donini S., Antonetti F., Galii G., J. Immunol. Methods, 199, 69-76 (1996)

Liberati A., Horisberger M., Palmisano L., Astolfi S.,

Nastari A., Mechati S., Villa A., Mancini S., Arzano S.,

Grignani F., J Interferon Res, 12, 329-336 (1992) ·· ·· ·· · ·· • · · · · · ·« · ·

9 99 9 9 9 · · • ·· · · · · · «· · • · · · ··· · · ·· ·· ·· ··· ··

16. Liberati AM., Garofani P., De Angelis V., element FD., Horisberger M., Cecchini M., Betti AR., Palmisano L., AstolEi S., Nastari A., Villa A., Villa A., Arzano S., J Interferón Res, 14, 61-69 (1994).

17. Paulesu L., Pessina GP., Bocci V, Proc Soc Exp Bio Med, 200, 414-417 (1992)

18. 1997 Physician's Desk Reference

19. Welling P.G., Pharmacokinetics, American Chemical Society, Washington, DC 1986

20. Gibaldi M., Perrier D., Pharmacokinetics, Marcel Dekker, New York, 1982

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Tekutý farmaceutický prípravok, obsahujúci pufor s pH 7,2, rekombinantný ľudský interferon β a 15 mg/ml ľudského sérového albumínu, vyznačujúci sa tým, že má zlepšený farmakokinetický profil v porovnaní s farmakokinetickým profilom

   Λ tekutého prípravku obsahujúceho interferón-β s pH 5,0 a 9 mg/ml • ludského sérového albumínu, pričom zlepšený farmakokinetický profil je definovaný v tabulke I, a ďalej má zlepšený farmakodynamický profil v porovnaní s farmakodynamickým profilom tekutého prípravku obsahujúceho interferón-β s pH 5,0 a 9 mg/ml ludského sérového albumínu, pričom zlepšený farmakodynamický profil je definovaný v tabulke II.
2. 2. Prípravok podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že je obsiahnutý v nádobke.
3. 3. Prípravok podlá nároku 2, vyznačujúci sa tým, že nádobka je injekčná striekačka.
4. 4. Tekutý farmaceutický prípravok obsiahnutý v zásobnej nádobke, vhodný na parenterálne podávanie cicavcom, obsahujúci účinné množstvo interferónu-β, pufor udržiavajúci pH na 7,2 a ľudský sérový albumín, kde interferón-β je vopred lyofilizovaný, * vyznačujúci sa tým, že má zlepšený farmakokinetický profil v porovnaní s farmakokinetickým profilom tekutého prípravku obsahujúceho interferón-β s pH 5,0 a 9 mg/ml ľudského sérového albumínu, pričom zlepšený farmakokinetický profil je definovaný v tabuľke I, a ďalej má zlepšený farmakodynamický profil v porovnaní s farmakodynamickým profilom tekutého prípravku obsahujúceho interferón-β s pH 5,0 a 9 mg/ml ludského sérového albumínu, pričom zlepšený farmakodynamický profil je definovaný v tabuľke II.

   ·· ·· ·· · ·· • · • • • • ·· • · • · ·· 9 • 9 • · • · • • 9 e 9 • · ·· ·· 99 999 ··
5. 5. Tekutý prípravok podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m, že zásobná nádobka je injekčná striekačka.

   6. c i Tekutý sa t prípravok podía nároku ý m, že je sterilný. 4, vy značujú- 7. Tekutý prípravok podía nároku 4, vy značujú- c i sa t ý m, že interferón-p je rekombinantný ľudský inter- ferón-β. 8. Súprava na parenterálne podávanie tekutého interferónového prípravku, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

   a) nádobku obsahujúcu tekutý prípravok podľa nároku 4 a b) pokyny na použitie prípravku.
6. 9. Súprava podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje: c) alkoholový tampón, d) ihlu a e) aspoň jednu náplasť.