MXPA06013308A - Formulaciones de hidrogel que contienen interferon. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a formulaciones farmaceuticas de hidrogel de poloxamero que contienen un interferon; en particular, la invencion se refiere a formulaciones de hidrogel de interferon-beta de liberacion sostenida, metodo de preparacion y uso de las mismas.

Description

FORMULACIONES DE HIPROGEL QUE CONTIENEN 1NTERFERON CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas de hidrogel que contienen un interferón. En particular, la invención se refiere a formulaciones de hidrogel de interferón-beta de liberación sostenida, método de preparación y uso de las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los agentes farmacéuticos de proteína recombínante ya han provisto terapias únicas para varias enfermedades previamente no tratadas, y se están desarrollando numerosos fármacos de proteína nuevos. Usualmente, las proteínas se administran parenteralmente, lo cual puede llevar a una eliminación rápida de la proteína de la circulación. Para mantener niveles terapéuticamente efectivos en la sangre, con frecuencia es necesario administrar dosis grandes o frecuentes. La inconveniencia y los efectos secundarios adversos potenciales de este procedimiento, podrían evitarse usando sistemas que provean el suministro sostenido o controlado de la proteína. Los sistemas de suministro sostenido pueden lograr niveles de agentes terapéuticos de proteína en sangre más constantes que los obtenidos con las dosis de bolo, llevando a eficacia mejorada del fármaco y menos efectos secundarios adversos. Dichos sistemas de suministro de fármacos incluyen aceites inyectables, emulsiones, suspensiones, liposomas, materia en micropartículas (microcápsulas o microesferas), implantes o sistemas de gel. Entre los sistemas de gel usados en el suministro de fármacos, los geles de poloxámero se usan por su propiedad única como materiales formadores de gel termoestables in situ. Los poloxámeros son copolímeros de bloque de óxido de poli(etileno) y óxido de poli(propileno) bien conocidos como agentes tensioactivos no iónicos que forman geles acuosos que sufren transiciones de un bajo estado viscoso a un alto estado viscoso como consecuencia de un incremento en temperatura, denominado "gelificación térmica". Además, los poloxámeros poseen buenas propiedades mojantes, antiespumantes y de solubilización, y se usan comúnmente para propósitos farmacéuticos y médicos como vehículos de suministro de fármacos (Guzmán et al., 1992, International Journal of Pharmaceutics, 80, 119-127; Gander er al., 1986, Drug Dev. and Indust. Pharmacy, 12 (11-13), 1613-1623). Los poloxámeros, referidos por el nombre de fábrica Pluronics®, son copolímeros de bloque triple que tienen la fórmula (I) siguiente: ( en donde (a) y (c) son estadísticamente iguales, (b) es igual o mayor que 15, y (a+c) forman 20 a 90% de la masa de la molécula. Las dos cadenas de óxido de polietileno (PEG) son hidrofílicas, mientras que la cadena de polipropileno (PPO) es hídrofóbica, dando a los copolímeros de bloque de PEO-PPO-PEO propiedades anfifílicas que pueden modularse haciendo variar los números de unidades (a) y (b). Debido a su naturaleza anfifílica, los copolímeros de bloque de PEO-PPO-PEO son capaces de autoagregarse para formar una variedad de estructuras asociadas tales como micelas y fases cristalinas líquidas, así como mícroemulsiones. Entre los Pluronics®, el poloxámero 407 (Lutrol® F127 o Pluronic® F127), un poloxámero de fórmula (I) en donde (a)=(c)=99 y (b)=65, y el poloxámero 338 (Lutrol® F108 o Pluronic® F108), un poloxámero de fórmula (I) en donde (a)=(c)=16 y (b)=46, son conocidos por sus propiedades de gelificación térmica de sus soluciones acuosas a la concentración de 20 a 35% (Guzmán er al., 1992, citado anteriormente). En particular, una solución polimérica de poloxámero 407 a 22 a 25% (en p/p) es líquida a temperaturas relativamente bajas, es decir, 4 a 10°C, pero forma rápidamente un gel firme altamente viscoso tras calentamiento arriba de una temperatura de transición característica, es decir, 18 a 20°C. Estos geles se han usado, por ejemplo, para formulaciones de hidrogel líquidas para inyecciones subcutáneas, aplicaciones tópicas y aerosoles que forman un gel conforme se calientan a temperatura ambiente (Guzmán er a/., 1992, citado anteriormente). Se ha encontrado que los geles de poloxámero 407 mejoran la estabilidad de proteínas cargadas en la matriz de gel (Stratton et al., 1997, Journal of Pharmaceutical Sciences, 86, 9, 1006-1010), y se han usado para varias formulaciones que incluyen lidocaína (Chen-Chow et al., 1981 , International Journal of Pharmaceutics, 8, 89-99), indometacína (Miyazaki et al., 1986, Chem. Pharm. Bull. 34(4), 1801-1808) e IL-2 (Johnston et al., 1992, Pharmaceutical Research, 9(3), 425-434). Los ¡nterferones son citocinas, es decir, proteínas solubles que transmiten mensajes entre células, y desempeñan una función esencial en el sistema inmune, ayudando a destruir microorganismos que causan infección, y reparando cualquier daño resultante. Los interferones son secretados naturalmente por células infectadas, y fueron identificados por primera vez en 1957. Su nombre se deriva del hecho de que "interfieren" con la replicación y producción virales. Los interferones exhiben actividad antiviral y antiproliferativa. Sobre la base de propiedades bioquímicas e inmunológicas, los interferones humanos de ocurrencia natural se agrupan en tres clases principales: interferón-alfa (de leucocitos), interferón-beta (de fibroblastos) e interferón-gamma (del sistema inmune). El interferón alfa está aprobado actualmente en los Estados Unidos y otros países para el tratamiento de leucemia de células pilosas, verrugas venéreas, sarcoma de Kaposi (un cáncer que afecta comúnmente a pacientes que sufren de síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA)), y hepatitis crónica no A, no B. Además, los interferones (IFNs) son glucoproteínas producidas por el cuerpo en respuesta a una infección viral. Inhiben la multiplicación de virus en células protegidas. Consistiendo de una proteína de peso molecular inferior, los IFNs son remarcablemente no específicos en su acción, es decir, el IFN inducido por un virus es efectivo contra una amplia gama de otros virus. Sin embargo, son específicos de la especie, es decir, el IFN producido por una especie sólo estimulará la actividad antiviral en células de la misma especie o una especie estrechamente relacionada. Los IFNs fueron el primer grupo de citocinas en ser explotadas por sus actividades antitumorales y antivirales potenciales. Los tres IFNs principales son referidos como IFN-a, IFN-ß e IFN-?. Dichos tipos principales de IFNs se clasificaron inicialmente de acuerdo a sus células de origen (leucocito, fibroblasto o célula T). Sin embargo, llegó a ser claro que varios tipos podrían ser producidos por una célula. Por consiguiente, el IFN de leucocitos es denominado ahora IFN-a, el IFN de fibroblastos es IFN-ß y el IFN de células T es IFN-?. Existe también un cuarto tipo de IFN, el IFN linfoblastoide, producido en la línea de células "Namalwa" (derivada del linfoma de Burkitt), que parece producir una mezcla de IFN de leucocitos y fibroblastos.

La unidad de ¡nterferón o unidad internacional para interferón (U o Ul, para unidad internacional) se ha reportado como una medida de la actividad del IFN, definida como la cantidad necesaria para proteger á 50% de las células contra el daño viral. La prueba que puede usarse para medir la bioactividad, es la prueba de inhibición del efecto citopático, según se describe (Rubinstein, et al. 1981 , J. Virol., 37, 755-758; Familletti et al., 1981 , Methods in Enzymology, 78, Pestka Ed., Academic Press, New York 387-394). En esta prueba antiviral para interferón, aproximadamente 1 unidad/ml de interferón es la cantidad necesaria para producir un efecto citopático de 50%. Las unidades se determinan con respecto al estándar de referencia internacional para Hu-IFN-beta provisto por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (National Institutes of Health) (Pestka, 1986, Methods in Enzymology, 78, Pestka Ed., Academic Press, New York 119, 14-23). Cada clase de IFN contiene varios tipos distintos. El IFN-ß y el IFN-? son cada uno el producto de un solo gen. Las proteínas clasificadas como IFNs-a son el grupo más diverso, conteniendo aproximadamente 15 tipos. Existe un grupo de genes de IFN-a en el cromosoma 9, que contiene por lo menos 23 miembros, de los cuales 15 son activos y transcritos. Los IFNs-a maduros no están glucosilados. Los IFNs-a y el IFN-ß son de la misma longitud (165 ó 166 aminoácidos), con actividades biológicas similares. Los IFNs-? tienen 146 aminoácidos de longitud, y se asemejan menos estrechamente a las clases a y ß. Sólo los IFNs-? pueden activar a los macrófagos o inducir la maduración de células T asesinas. Estos nuevos tipos de agentes terapéuticos pueden denominarse a veces modificadores de respuesta biológica (BRMs), debido a que tienen un efecto sobre la respuesta del organismo al tumor, afectando el reconocimiento por medio de inmunomodulación. El interferón de fibroblastos (IFN-ß) humano tiene actividad antiviral, y puede estimular también a células asesinas naturales contra células neoplásicas. Es un polipéptido de aproximadamente 20,000 Da inducido por virus y moléculas de ARN de doble cadena. A partir de la secuencia de nucleótidos del gen para interferón de fibroblastos, clonado por medio de tecnología de ADN recombinante (Derynk ef al., 1980, Nature, 285, 542-547), se dedujo la secuencia de aminoácidos completa de la proteína. Tiene 166 aminoácidos de longitud. Shepard et al., 1981 , Nature, 294, 563-565 describen una mutación en la base 842 (Cys ? Tyr en la posición 141 ) que suprimió su actividad antiviral, y un clon variante con una deleción de los nucleótidos 1 119-1121. Mark ef al., 1984, Proc. Nati., Acad. Sci. U.S.A., 81(18), 5662- 5666, insertaron una mutación artificial reemplazando la base 469 (T) con (A), causando el cambio de aminoácido Cys?Ser en la posición 17. Se reportó que el IFN-ß resultante es tan activo como el IFN-ß "nativo", y estable durante el almacenamiento a largo plazo (-70°C). Rebif® (Serono - interferón-ß recombinante), el último desarrollo en la terapia con interferón para esclerosis múltiple (MS), es interferón (IFN)-beta-1a producido a partir de líneas de células de mamífero. Su nombre no patentado internacional recomendado (INN), es "interferón beta-1a". Varias formulaciones de IFNs con copolímeros se han desarrollado en las pasadas décadas. Entre ellas, se han descrito formulaciones en inyección de IFN alfa que contienen formulaciones combinadas de políoxietileno polioxipropilenglicol (JP 2003 342193), ciclaradina-IFN alfa (EP 0177153), equipos para geles de poloxámero de interferón-alfa a temperatura ambiente para administración tópica (US 4,469,228), formulaciones de micropartículas de IFN-ß (WO 01/58474), composiciones que comprenden glucoproteínas acopladas químicamente con copolímero de polioxíetileno-polioxipropíleno (EP 0098110) y formulaciones de IFN-ß para suministro en mucosas, especialmente por la vía intranasal (WO 2004/002404). Como con todos los agentes farmacéuticos basados en proteínas, un desafío importante en el uso de un interferón como un agente terapéutico, es mantener una dosis terapéuticamente efectiva al nivel de la sangre por un cierto tiempo, sin que se incremente la dosis inyectada y los efectos secundarios asociados potenciales. En consecuencia, existe la necesidad de composiciones farmacéuticas de IFN que sustenten niveles de IFN en plasma por un período más largo que las formulaciones líquidas, y/o que provean una mayor exposición del IFN en plasma, manteniendo o mejorando de esta manera la actividad biológica del IFN.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a composiciones farmacéuticas de hidrogel de poloxámero o composiciones farmacéuticas de gel de poloxámero que se forman in vivo, que comprenden un interferón (IFN), en particular h-IFNß1a recombinante, y métodos para su preparación. Estas composiciones farmacéuticas son hidrogeles preparados con poloxámeros, especialmente poloxámero 407. Dichas composiciones farmacéuticas son referidas en la presente como "hidrogeles" de IFN, y comprenden un interferón (IFN) o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional o fracción activa de las mismas. Las formulaciones de hidrogel de poloxámero de IFN de la invención, tienen la ventaja de ser un gel que se forma in vivo que puede manejarse fácilmente, y que exhibe un perfil de liberación sostenida y/o mayor biodisponibilidad en comparación con las formulaciones de IFN globales. De conformidad con una modalidad de la presente invención, los hidrogeles comprenden además por lo menos un agente de estabilización. De conformidad con otra modalidad de la invención, los hidrogeles comprenden además por lo menos un modificador de transición de temperatura de solución a gel como excipiente. En un primer aspecto, la invención provee una composición farmacéutica que comprende un interferón (IFN), o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional o fracción activa de la misma, en donde dicha formulación es un hidrogel de poloxámero. En un segundo aspecto, la invención provee un método para la preparación de una formulación de hidrogel de IFN de conformidad con la invención, en donde dicho método comprende añadir una cantidad calculada de poloxámero a una solución regulada en su pH a una temperatura en donde se forma una solución polimérica homogénea, y añadir entonces el interferón, o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional o fracción activa de la misma. En un tercer aspecto, la invención provee un uso de una formulación de hidrogel de IFN-beta de conformidad con la invención, en la preparación de una preparación farmacéutica para el tratamiento de esclerosis múltiple. En un cuarto aspecto, la invención provee un método para el tratamiento de esclerosis múltiple, que comprende la administración de una formulación de IFN-beta de liberación sostenida de conformidad con la invención, a un paciente que necesita de la misma.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los siguientes párrafos proveen definiciones de las varias porciones químicas que constituyen los compuestos de conformidad con la invención, y se pretende que se apliquen uniformemente a lo largo de la especificación y en las reivindicaciones, a menos que una definición de otra manera expresamente expuesta, provea una definición más amplia. Se pretende que un "interferón" o "IFN", como se usa en la presente, incluya cualquier molécula definida como tal en la literatura que comprenda, por ejemplo, cualquier tipo de IFN mencionado en la sección de "antecedentes de la invención" anterior. En particular, se incluyen IFN-a, IFN-ß e IFN-? en la definición anterior. El IFN-ß es el IFN preferido de conformidad con la presente invención. El IFN-ß adecuado de conformidad con la presente invención, está disponible comercialmente, por ejemplo, como Rebif® (Serano), Avonex® (Biogen) o Betaferon® (Schering). Se pretende que el término "interferón-beta (IFN-beta o IFN-ß)", como se usa en la presente, incluya interferón de fibroblastos, en particular de origen humano, obtenido por aislamiento de fluidos biológicos, u obtenido por medio de técnicas de ADN recombinante de células hospederas procaríóticas o eucariótícas, así como sus sales, derivados funcionales, variantes, análogos y fragmentos activos. De preferencia, se pretende que el IFN-beta signifique interferón beta-1a recombinante. Un IFN-ß adecuado de conformidad con la presente invención está disponible comercialmente, por ejemplo, como Rebif® (Serano), Avonex® (Biogen) o Betaferon® (Schering). El uso de interferones de origen humano se prefiere también de conformidad con la presente invención. Se pretende que el término interferón, como se usa en la presente, abarque sales, derivados funcionales, variantes, análogos y fragmentos activos del mismo.

Rebif® (inferón-ß recombinante) es el último desarrollo en la terapia de la esclerosis múltiple (MS) con interferón, y representa un avance significativo en el tratamiento. Rebif® es interferón (IFN)-beta 1 a, producido a partir de líneas de células de mamífero. Se estableció que el interferón beta-1 a administrado subcutáneamente tres veces por semana, es eficaz en el tratamiento de esclerosis múltiple recurrente-remitente (RRMS). El interferón beta-1a puede tener un efecto positivo sobre el curso de la MS a largo plazo, reduciendo el número y la severidad de recidivas, y reduciendo la carga de la enfermedad y la actividad de la enfermedad, medidas por MRI. La dosificación de IFN-ß en el tratamiento de MS recurrente-remitente de conformidad con la invención, depende del tipo de IFN-ß usado. De conformidad con la presente invención, en donde el IFN es IFN-ß1 b recombinante producido en E. coli, disponible comercialmente bajo la marca comercial Bataseron®, puede administrarse dicho interferón de preferencia subcutáneamente cada segundo día a una dosificación de aproximadamente 250 a 300 µg u 8 MUÍ a 9.6 MUÍ por persona. De conformidad con la presente invención, en donde el IFN es IFN-ß1 a recombinante, producido en células de ovario de hámster chino (células CHO), disponible comercialmente bajo la marca comercial Avonex®, dicho interferón puede administrarse de preferencia intramuscularmente una vez por semana a una dosificación de aproximadamente 30 µg a 33 µg o 6 MUÍ a 6.6 MUÍ por persona. De conformidad con la presente invención, en donde el IFN es IFN-ß1 a recombinante, producido en células de ovario de hámster chino (células CHO), disponible comercialmente bajo la marca comercial Rebif®, dicho interferón puede administrarse de preferencia subcutáneamente tres veces por semana (TIW) a una dosificación de 22 a 44 µg o 6 MUÍ a 12 MUÍ por persona. Como se usa en la presente, el término "muteínas" se refiere a análogos del IFN en los cuales uno o más de los residuos de aminoácido de un IFN natural son reemplazados por residuos de aminoácido diferentes, o son deletados, o uno o más residuos de aminoácido son añadidos a la secuencia natural de IFN, sin que se cambie considerablemente la actividad de los productos resultantes en comparación con el IFN de tipo silvestre. Estas muteínas se preparan por medio de técnicas conocidas de síntesis y/o mutagénesis dirigida a sitio, o cualquier otra técnica conocida adecuada para lo mismo. Muteínas preferidas incluyen, por ejemplo, las descritas por Shepard ef al., 1981 , citado anteriormente, o Mark et al., 1984, citado anteriormente. Cualquiera de dichas muteínas tiene de preferencia una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de la del IFN, de modo que tiene actividad sustancialmente similar o incluso mejor que un IFN. La función biológica del interferón es bien conocida por los expertos en la técnica, y estándares biológicos están establecidos y disponibles, por ejemplo, del National Institute for Biological Standards and Control (http://immunology.org/links/NIBSC).

Se han descrito bíoensayos para la determinación de la actividad del IFN. Una prueba del IFN puede llevarse a cabo, por ejemplo, como es descrito por Rubinstein et al., 1981 , citado anteriormente. De esta manera, puede determinarse si alguna muteína determinada tiene actividad sustancialmente similar, o incluso mejor, que el IFN por medio de experimentación de rutina. Muteínas del IFN que pueden usarse de conformidad con la presente invención, o ácidos nucleicos que codifican para las mismas, incluyen una serie finita de secuencias sustancialmente correspondientes como polinucleótidos o péptidos de sustitución que pueden ser obtenidos habitualmente por los expertos en la técnica, sin experimentación indebida, con base en las enseñanzas y la guía presentadas en la presente. Cambios preferidos para muteínas de conformidad con la presente invención, son los que se conocen como sustituciones "conservativas". Sustituciones conservativas de aminoácidos de polipéptidos o proteínas de la invención pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo, que tienen propiedades fisicoquímicas sustancialmente similares, que la sustitución entre miembros del grupo preservará la función biológica de la molécula. Es claro que pueden hacerse también inserciones y deleciones de aminoácidos en las secuencias definidas anteriormente, sin que se altere su función, en particular si las inserciones o deleciones implican sólo unos cuantos aminoácidos, por ejemplo, menos de treinta, y de preferencia menos de diez, y no remueven o desplazan aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, por ejemplo, residuos de cisteína. Proteínas y muteínas producidas por medio de dichas deleciones y/o inserciones, están dentro de la competencia de la presente invención.

De preferencia, los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos que se definen en el cuadro I. Más preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos que se definen en el cuadro II; y muy preferiblemente los grupos de aminoácidos sinónimos son aquellos que se definen en el cuadro III.

CUADRO I Grupos preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu lie, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly He Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie Phe Trp, Met, Tyr, Me, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, lie, Val, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Met Phe, lie, Val, Leu, Met Trp Trp CUADRO II Grupos más preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, lie, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Val, Met, lie Gly Gly lie Me, Met, Phe, Val, Leu Phe Met, Tyr, lie, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gln, Arg Gln Glu, Gln, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gln Met Met, Phe, lie, Val, Leu Trp Trp CUADRO III Grupos muy preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser Arg Arg Leu Leu, lie, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Gly lie lie, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, lie, Leu Trp Met Ejemplos de producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas que pueden usarse para la obtención de muteínas de IFN para su uso en la presente invención, incluyen cualquier paso de método conocido, tal como se presenta en las patentes de E.U.A. 4,959,314, 4,588,585 y 4,737,46 a Mark et al.; 5,116,943 a Koths et al.; 4,965,195 a Ñamen et al; 4,879,111 a Chong ef al; y 5,017,691 a Lee et al; y proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente de E.U.A. No. 4,904,584 a Shaw ef al. Muteínas específicas de IFN-beta han sido descritas, por ejemplo, por Mark et al., 1984, citado anteriormente. El término "proteína fusionada" se refiere a un polipéptido que comprende un IFN, o una muteína del mismo, fusionado a otra proteína la cual tiene, por ejemplo, un tiempo de residencia extendido en fluidos corporales. Un IFN puede ser fusionado de esta manera a otra proteína, polipéptido o similares, por ejemplo, una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. El término "derivados funcionales", como se usa en la presente, abarca derivados de IFN, y sus muteínas y proteínas fusionadas, que pueden prepararse a partir de los grupos funcionales que ocurren como cadenas laterales en los residuos o los grupos N- o C-terminales, por medios conocidos en la técnica, y se incluyen en la invención en tanto continúen siendo farmacéuticamente aceptables, es decir, sin destruir la actividad de la proteína que sea sustancialmente similar a la actividad del IFN, y no confieran propiedades tóxicas en las composiciones que los contienen. Estos derivados pueden incluir, por ejemplo, cadenas laterales de polietilenglicol que pueden enmascarar sitios antigénicos y extender la residencia del IFN en fluidos corporales. Otros derivados incluyen esteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reacción con amoníaco o con aminas primarias o secundarias, derivados de N-acilo de grupos amino libres de los residuos de aminoácido formados con porciones acilo (por ejemplo, grupos alcanoilo o aroilo carbocíclicos) o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, aquellos de residuos de serilo o treonilo) formados con porciones acilo. Como "fracciones activas" de IFN, o muteínas y proteínas fusionadas, la presente invención abarca cualquier fragmento o precursor de la cadena polipeptídica de la molécula de proteína sola o junto con moléculas asociadas o residuos enlazados a las mismas, por ejemplo, residuos de azúcar o fosfato, o agregados de la molécula de proteína o los residuos de azúcar por sí mismos, siempre que dicha fracción no tenga actividad significativamente reducida en comparación con el IFN correspondiente. De conformidad con la presente invención, se prefiere además particularmente el uso de IFN-beta 1 a recombinante y los compuestos de la invención. Se ha descrito recientemente un tipo especial de variante de interferón. Los denominados "¡nterferones consenso", son variantes de IFN de ocurrencia no natural (US 6,013,253). De conformidad con una modalidad preferida de la invención, los compuestos de la invención se usan en combinación con un interferón consenso.

Como se usa en la presente, el interferón consenso (IFN-con) humano significará un polipéptido de ocurrencia no natural, que incluye predominantemente aquellos residuos de aminoácido que son comunes a un subgrupo de moléculas de IFN-alfa representativas de la mayoría de las secuencias del subtipo de interferón de leucocitos humano de ocurrencia natural y que incluye, en una o más de esas posiciones en donde no existe aminoácido común a todos los subtipos, un aminoácido que ocurre predominantemente en esa posición y en ningún caso incluye algún residuo de aminoácido que no exista en esta posición en por lo menos un subtipo de ocurrencia natural. El IFN-con abarca, pero no está limitado a, las secuencias de aminoácidos designadas como IFN-con1 , IFN-con2 e IFN-con3 que se describen en las patentes de E.U.A. 4,695,623, 4,897,471 y 5,541 ,293. Pueden producirse secuencias de ADN que codifican para IFN-con como se describe en las patentes mencionadas anteriormente, y por medio de otros métodos estándar. En otra modalidad preferida, la proteína de fusión comprende una fusión de Ig. La fusión puede ser directa, o por medio de un péptido enlazador corto que puede ser tan corto como de 1 a 3 residuos de aminoácido de longitud, o más largo, por ejemplo, de 13 residuos de aminoácido de longitud. Dicho enlazador puede ser un tripéptido de la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una secuencia de enlazador de 13 aminoácidos que comprenda Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introducida entre la secuencia del IFN y la secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante puede tener propiedades mejoradas, tales como un tiempo de residencia extendido en fluidos corporales (vida media), actividad específica incrementada, nivel de expresión incrementado, o facilitación de la purificación de la proteína de fusión. En otra modalidad preferida, el IFN es fusionado a la región constante de una molécula de Ig. De preferencia, es fusionado a regiones de la cadena pesada, tales como los dominios CH2 y CH3 de la IgG-i humana, por ejemplo. Otras isoformas de moléculas de Ig son también adecuadas para la generación de proteínas de fusión de conformidad con la presente invención, tales como las isoformas lgG2, lgG3 o lgG4, u otras clases de Ig, tales como IgM o IgA, por ejemplo. Las proteínas de fusión pueden ser monoméricas o multiméricas, heteromultiméricas u homomultiméricas. En una modalidad preferida, el derivado funcional comprende por lo menos una porción unida a uno o más grupos funcionales, que ocurren como una o más cadenas laterales en los residuos de aminoácido. De preferencia, la porción es una porción de polietileno (PEG). Puede llevarse a cabo pegilación por medio de métodos conocidos, tales como los descritos en el documento WO 99/55377, por ejemplo. La dosificación administrada a un individuo variará, dependiendo de una variedad de factores, que incluyen propiedades farmacocinéticas, la vía de administración, condiciones y características del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud y estatura), grado de los síntomas, tratamientos concurrentes, frecuencia del tratamiento, y el efecto deseado.

Las dosificaciones estándar del IFN-beta 1a humano varían de 80 000 Ul/kg a 200 000 Ul/kg por día, o 6 MUÍ (millones de unidades internacionales) y 12 MUÍ por persona por día o 22 a 44 µg (microgramos) por persona. De conformidad con la presente invención, el IFN-beta 1 a puede administrarse de preferencia a una dosificación de aproximadamente 1 a 500 µg, más preferiblemente de aproximadamente 10 a 308 µg o aproximadamente 10 a 260 µg por persona, una vez por semana, o menos. La administración de los ingredientes activos de conformidad con la presente invención, puede ser por la vía intramuscular o subcutánea. La vía de administración preferida para el IFN es la vía subcutánea. El IFN puede administrarse también cada dos días, o con menos frecuencia. De preferencia, el IFN se administra una vez, dos veces o tres veces por semana. La vía de administración preferida es la administración subcutánea administrada, por ejemplo, una vez por semana, o menos. De preferencia, la concentración de IFN-beta 1a en la formulación es a o aproximadamente 10 µg/ml hasta a o aproximadamente 800 µg/ml, más preferiblemente a o aproximadamente 20 µg/ml hasta a o aproximadamente 500 µg/ml, más particularmente de preferencia a o aproximadamente 30 hasta a o aproximadamente 300, muy preferiblemente a o aproximadamente 44, 88 ó 264 µg/ml. El término "hidrogel" se refiere a una red entrelazada de polímeros hidrofílicos que poseen la capacidad para organizarse por sí mismos en una estructura tridimensional que contiene grandes cantidades de agua. Los poloxámeros son polímeros que tienen la particularidad de formar micelas en solución acuosa. A mayores concentraciones y/o temperatura elevada, los poloxámeros sufren una "gelificación" (transición de solución a gel) por asociación de las micelas para formar una fase cristalina líquida (gel) debido a interacciones intermicelares crecientes. Entonces, a temperaturas aún mayores, el gel se funde nuevo (Bromberg ef al., 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31 , 197-221 ). Las temperaturas de transición de fase dependen de la concentración del poloxámero en agua. Típicamente, ocurre transición de solución a gel a temperaturas de 5 a 30°C, y transición de gel a solución a 35 a 50°C sobre una escala de concentración del polímero de 20 a 30% en peso. Por lo tanto, el término "hidrogel de poloxámero" de conformidad con la invención, se refiere a una solución de poloxámero que tiene la propiedad de exhibir una gelificación (transición de solución a gel) a la temperatura del cuerpo humano. Por ejemplo, los hidrogeles de poloxámero de la invención contienen de 20 a 30% en peso de poloxámero, típicamente de 20 a 25% en peso. Por lo tanto, el término "hidrogel" se refiere también a un gel que se forma in vivo. El término "modificador de transición de temperatura de "solución a gel (o "sol-gel")", se refiere a un excipiente que es capaz de desplazar, de preferencia incrementar, la transición de temperatura de solución a gel del hidrogel que contiene IFN-beta. Ejemplos de dichos modificadores son azúcares tales como trehalosa, polietilenglicol, glicerina tal como glicerol 30° y ciclodextrinas, de preferencia hidroxipropil-ß-ciclodextrina. Puede usarse un modificador de transición de temperatura de sol a gel, por ejemplo, incrementando la transición de temperatura del hidrogel alrededor de temperatura ambiente, incrementando la facilidad de aplicación con jeringa y/o la temperatura de almacenamiento. El hidrogel de conformidad con la invención puede contener, por ejemplo, aproximadamente 1 a 3% en p/p de modificador de transición de temperatura de sol a gel, de preferencia aproximadamente 2.6% en p/p. El término "agente tensioactivo" se refiere a un compuesto soluble que reduce la tensión superficial de líquidos, o reduce la tensión interfacial entre dos líquidos o un líquido y un sólido, la tensión superficial siendo la fuerza que actúa sobre la superficie de un líquido, que tiende a minimizar el área de la superficie. Se han usado a veces agentes tensioactivos en formulaciones farmacéuticas, incluyendo el suministro de polipéptidos y fármacos de baja masa molecular, para modificar la absorción del fármaco o su suministro hacia los tejidos objetivo. Agentes tensioactivos bien conocidos incluyen polisorbatos (derivados de polioxietileno; Tween), así como Pluronics. De conformidad con una modalidad de la invención, los Pluronics son agentes tensíoactivos que están presentes de preferencia en la formulación líquida de IFN estabilizada usada para la preparación de hidrogeles de la invención.

De conformidad con otra modalidad de la invención, los Pluronics seleccionados de Pluronic® F77 (poloxámero 217), Pluronic F87 (poloxámero 237), Pluronic® F88 (poloxámero 238) y Pluronic® F68 (poloxámero 188), en particular de preferencia Pluronic® F68 (Pluronic® F68, BASF), están presentes en la formulación líquida de IFN estabilizada usada para la preparación de hidrogeles de la invención. Los Pluronics están presentes de preferencia en la formulación líquida de IFN estabilizada, a una concentración que sea suficiente para mantener la estabilidad del interferón durante el período de almacenamiento deseado (por ejemplo, 12 a 24 meses), y también a una concentración que sea suficiente para prevenir pérdidas de proteínas debidas a la adsorción sobre superficies, tales como el vial, ampolleta o cartucho o la jeringa. Típicamente, Lutrol F68: exceso molar entre 25 y 200 veces (respecto al IFN), de preferencia exceso molar de 50 veces (aproximadamente 3 mg/mL si la carga de IFN es de aproximadamente 150 µg/mL). De preferencia, la concentración de Pluronics, en particular de Pluronic® F68 en formulaciones estabilizadas líquidas de IFN, es a o aproximadamente 0.01 mg/ml hasta a o aproximadamente 10 mg/ml, más preferiblemente a o aproximadamente 0.05 mg/ml hasta a o aproximadamente 5 mg/ml, más particularmente de preferencia a o aproximadamente 0.1 mg/ml hasta a o aproximadamente 2 mg/ml, muy preferiblemente a o aproximadamente 1 mg/ml. El término "antioxidante" se refiere a un compuesto que previene que el oxígeno o los radicales libres derivados de oxígeno interactúen con otras sustancias. Los antioxidantes están entre muchos excipientes añadidos comúnmente a sistemas farmacéuticos para mejorar la estabilidad física y química. Se añaden antioxidantes para reducir al mínimo o retardar los procesos asociativos que ocurren con algunos fármacos o excipientes tras exposición al oxígeno o en presencia de radicales libres. Estos procesos pueden ser catalizados con frecuencia por la luz, temperatura, concentración de iones hidrógeno, presencia de metales traza o peróxidos. Sulfitos, bisulfitos, tiourea, metionína, sales de ácido etilendiamínotetraacético (EDTA), hidroxitolueno butilado (BHT) e hidroxianisol butilado (BHA), se usan con frecuencia como antioxidantes en fármacos. Se ha encontrado que el EDTA sódico mejora la actividad de los antioxidantes por iones metálicos quelantes de otra manera catalizarían la reacción de oxidación. El antioxidante más preferido es la metionina. De preferencia, los antioxidantes y especialmente la metionína, son estabilizadores que están presentes en la formulación líquida de IFN estabilizada usada para la preparación de los hidrogeles de la invención. Típicamente, puede usarse metionina en exceso molar entre 100 y 800 veces (respecto al IFN), de preferencia en exceso molar de 400 veces (aproximadamente 0.4 mg/mL, si la carga de IFN es de aproximadamente 150 µg/mL). La metionina puede estar presente en su forma de base libre o en su forma de sal. Cualquier estereoisómero (es decir, isómero L, D o DL) de la metionina puede usarse en el presente método o formulación de la invención, en tanto la metionina esté presente en su forma de base libre o en su forma de sal. De preferencia, se usa el estereoisómero L. Análogos de metionina pueden usarse también en la presente formulación de la invención. El término "análogo de metionina", se refiere a un derivado de la metionina de ocurrencia natural. Los análogos de metionina pueden usarse también en la presente formulación en su forma de base libre o en su forma de sal. Ocurre estabilidad incrementada y/o mantenida con la adición de antioxidantes (por ejemplo, metionina) en una forma dependiente de la concentración. Es decir, concentraciones crecientes de antioxidantes llevan a estabilidad incrementada y/o mantenida de la formulación que contiene interferón-beta de la presente invención, cuando esa formulación que contiene interferón-beta exhibe normalmente oxidación o formación de agregados/oligómeros en ausencia del antioxidante. La determinación de la cantidad de un antioxídante (por ejemplo, metionina) que se usará en la presente formulación de la invención, para disminuir la oxidación o la formación de oligómeros/agregados, puede efectuarse fácilmente sin experimentación indebida, usando métodos conocidos en general por los expertos en la técnica. El término "bacteriostático" se refiere a un compuesto o composiciones que se añaden a una formulación y que actúan como un agente antibacteriano. Ejemplos de bacteriostáticos incluyen fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno (metil-, etil-, propil-, butil-parabeno, y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, dehidroacetato de sodio y timerosal. De preferencia, el agente bacteriostático es alcohol bencílico. Las formulaciones de hidrogel de conformidad con la invención, pueden ser de una sola dosis o de dosis múltiples. Aquellas formulaciones de interferón líquidas de la invención que están destinadas para uso de dosis múltiples, comprenden de preferencia un bacteriostático, tal como fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno (metil-, etil-, propíl-, butil-parabeno, y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, dehidroacetato de sodio y timerosal. Particularmente preferidos son fenol, alcohol bencílico y m-cresol, más preferiblemente alcohol bencílico. El agente bacteriostático se usa en una cantidad que dé una concentración que sea efectiva para mantener la formulación esencialmente libre de bacterias (adecuada para inyección) durante el período de inyección de dosis múltiples, que puede ser a o aproximadamente 12 ó 24 horas hasta a o aproximadamente 12 días, de preferencia a o aproximadamente 6 hasta a o aproximadamente 12 días. El bacteriostático está presente de preferencia a una concentración de a o aproximadamente 0.1 % (masa del bacteriostático/masa del solvente) hasta a o aproximadamente 2.0%, más preferiblemente a o aproximadamente 0.2% hasta a o aproximadamente 1.0%. En el caso de alcohol bencílico, particularmente preferidas son concentraciones de 0.2 ó 0.3%. Sin embargo, el uso de un conservador, por ejemplo, alcohol bencílico, no se limita a formulaciones de dosis múltiples, pero puede añadirse también en formulaciones de una sola dosis. Una modalidad de la presente invención consiste de formulaciones de una sola dosis que contienen alcohol bencílico. De preferencia, las formulaciones de la presente invención tienen un pH entre aproximadamente 3.0 y a o aproximadamente 5.0, más preferiblemente a o aproximadamente 3.8 a 4.0. Un regulador de pH preferido es acetato, siendo los contraiones preferidos iones sodio o potasio. Reguladores de pH de solución salina de acetato son bien conocidos en la técnica. Las concentraciones de regulador de pH en la solución total, pueden variar entre a o aproximadamente 5 mM, 9.5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM y 500 mM. De preferencia, la concentración del regulador de pH es a o aproximadamente 10 mM. Particularmente preferido es un regulador de pH a 50 mM en iones acetato con un pH de 3.8. Las "ciclodextrinas" contempladas para su uso en la presente, son derivados de hidroxipropilo, hidroxietilo, glucosilo, maltosilo y maltotriosilo de beta-ciclodextrina, y los derivados correspondientes de gamma-ciclodextrina. Las agrupaciones de hídroxialquilo pueden contener uno o más grupos hidroxilo, por ejemplo, hidroxipropilo (2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo), dihidroxipropilo, y similares. Los derivados de glucosilo, maltosilo y maltotriosilo pueden contener uno o más residuos de azúcar, por ejemplo, glucosilo o diglucosilo, maltosilo o dimaltosilo. Varias mezclas de los derivados de ciclodextrina pueden usarse también, por ejemplo, una mezcla de derivados de maltosilo y dimaltosilo. Derivados de ciclodextrina específicos para su uso en la presente, incluyen hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HPCD o HPBCD), hidroxietil-beta-ciclodextrina (HEBCD), hidroxipropil-gamma-ciclodextrina (HPGCD), hidroxietil-gamma-ciclodextrina (HEGCD), hidroxipropil-beta-ciclodextrina (2HPBCD), glucosil-beta-ciclodextrina (G beta-CD o GiBCD), diglucosil-beta-ciclodextrina (2G G beta-CD o 2 dBCD), maltosíl-beta-ciclodextrina (G2-beta-CD o G2BCD), maltosil-gamma-ciclodextrina (G2-gamma-CD o G2GCD), maltotriosil-beta-ciclodextrina (G3-beta-CD o G3BCD), maltotriosil-gamma-ciclodextrina (G3-gamma-CD o G3GCD) y dimaltosil-beta-ciclodextrina (2 G2-beta-CD o 2 G2BCD), y mezclas de los mismos, tales como maltosíl-beta-ciclodextrina/dimaltosil-beta-ciclodextrina. La hidroxipropil-beta-ciclodextrina para su uso en las composiciones de la presente invención está disponible comercialmente, y es una ciclodextrina preferida de conformidad con la invención. La escala de interferón en las formulaciones de la invención incluye concentraciones de aproximadamente 1.0 µg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, aunque concentraciones menores y mayores son operables, y dependen del vehículo de suministro o la vía de administración deseados, por ejemplo, las formulaciones en solución diferirán para los geles transmucosos (por ejemplo, composiciones de gel de IFN para vía bucal o nasal). La concentración de interferón es de preferencia a o aproximadamente 5.0 µg/ml hasta a o aproximadamente 2 mg/ml, más preferiblemente a o aproximadamente 10 µg/ml hasta a o aproximadamente 1 mg/ml, muy preferiblemente a o aproximadamente 30 µg/ml hasta a o aproximadamente 100 µg/ml. De preferencia, las formulaciones de la invención retienen por lo menos a o aproximadamente 60%, más preferiblemente por lo menos a o aproximadamente 70%, muy preferiblemente por lo menos a o aproximadamente 80%, de la actividad de interferón al momento del empacamiento durante un período de 24 horas. Las formulaciones de liberación sostenida de la presente invención pueden prepararse por medio de un procedimiento que comprenda la adición de las cantidades calculadas de la solución de interferón a la solución homogénea de poloxámero. La solución de interferón es de preferencia una solución de interferón estabilizada, por ejemplo, una solución de interferón que contenga excipientes tales como estabilizadores tipo L-metíonina, agentes tensioactivos tales como poloxámeros, tal como poloxámero 188, o una combinación de los mismos. De conformidad con una modalidad de la invención, las formulaciones de la presente invención pueden someterse además a un paso de filtración bajo condiciones estériles, por ejemplo, una filtración esterilizante usando una membrana de 0.22 µm, llevada a cabo a una temperatura en donde la viscosidad del hidrogel de poloxámero se mantenga baja, por ejemplo, a 4°C. Para mejorar la facilidad de aplicación con jeringa de las formulaciones de la presente invención a temperatura ambiente, pueden añadirse excipientes que modifiquen la temperatura de transición de solución a gel del hidrogel de poloxámero, de preferencia a la solución de regulador de pH antes de la formación de la solución de hidrogel líquida, es decir, antes de la adición del poloxámero. Ejemplos de excipientes que modifican la temperatura de transición de sol a gel del hidrogel de poloxámero, son polietilenglicol, glicerina tal como glicerol 30°, azúcares tales como trehalosa, y ciclodextrinas, tales como hídroxipropil-ß-ciclodextrina. De conformidad con una modalidad de la invención, la formulación de hidrogel tiene una viscosidad a 4°C entre la escala de viscosidad del agua y 200 mPas, de preferencia en una escala entre 100 a 150 mPas, que podría incluirse en dispositivos especiales tales como autoinyectores o jeringas prellenadas, y podrían formar un gel "in situ" después de inyección subcutánea. La solución resultante se pone entonces en viales, ampolletas, cartuchos o jeringas prellenadas. Variaciones de este procedimiento serían reconocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el orden en el cual los componentes se añaden, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH al cual la formulación se prepara, son factores que pueden optimizarse para la concentración y los medios de administración usados. Las formulaciones preservadas pueden proveerse a los pacientes como soluciones claras, ya que se lleva a cabo el almacenamiento de preferencia bajo la temperatura de transición de sol a gel del hidrogel.

El interferón en formulaciones de hidrogel descritas en la presente puede administrarse a un paciente de conformidad con la presente invención, por medio de una variedad de métodos de suministro que incluyen inyección subcutánea, por vía transmucosa, por implante, u otros medios apreciados por los expertos en la técnica, como es bien sabido en la materia. El término "vial" se refiere ampliamente a un depósito adecuado para la retención de la formulación de interferón de liberación sostenida de la invención, en forma sólida o líquida en un estado estéril contenido. Ejemplos de un vial como se usa en la presente, incluyen ampolletas, cartuchos, empaques de burbuja u otros depósitos adecuados para el suministro del interferón al paciente por medio de una jeringa o un aerosol transmucoso. Las formulaciones de conformidad con la invención pueden comercializarse también como jeringas prellenadas. Las formulaciones de la invención pueden administrarse usando dispositivos de invención reconocidos. Ejemplos que comprenden estos sistemas de vial individuales, incluyen dispositivos de autoinyector o de inyector de pluma para el suministro de una solución, tal como Rebiject®. Se seleccionan agujas para dispositivos de inyección que coincidan con el espesor del hidrogel de la invención. Por ejemplo, el hidrogel de la invención puede inyectarse con dispositivos de inyección que tengan diferentes calibres de la aguja, tales como 18/23 (diámetro interno equivalente a una aguja de calibre 18 y diámetro externo mínimo de una aguja de calibre 21 ) o 21/26 (diámetro interno equivalente a una aguja de calibre 21 y diámetro externo mínimo de una aguja de calibre 26). De preferencia, las formulaciones de la invención pueden administrarse, usando dispositivos reconocidos para hidrogeles. Por ejemplo, puede usarse la tecnología de inyección Depot One Needle (Imprint Pharmaceuticals) para la inyección de los hidrogeles de la invención. El término "tratamiento" dentro del contexto de esta invención, se refiere a cualquier efecto benéfico sobre la progresión de una enfermedad, incluyendo atenuación, reducción, decremento o disminución del desarrollo patológico después del inicio de la enfermedad. Las composiciones farmacéuticas de la invención que comprenden IFN o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal de la misma, son útiles en el diagnóstico, prevención y tratamiento (local o sistémico) de indicaciones clínicas sensibles a la terapia con este polipéptido. Dichas indicaciones clínicas incluyen, por ejemplo, trastornos o enfermedades del sistema nervioso central (SNC), cerebro y/o médula espinal, incluyendo esclerosis múltiple; enfermedades autoinmunes, que incluyen artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad de Crohn; y cánceres, que incluyen cánceres de mama, próstata, vejiga, riñon y colon. Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo artículos o resúmenes de revistas, solicitudes de patente de E.U.A. o extranjeras publicadas o no publicadas, patentes de E.U.A. o extranjeras expedidas, o cualquier otra referencia, se incorporan enteramente en la presente como referencia, incluyendo todos los datos, cuadros nexos, figuras acompañantes y texto presentados en las referencias citadas. Además, los contenidos enteros de las referencias citadas dentro de las referencias citadas en la presente, se incorporan también enteramente en la presente como referencia. La referencia a pasos de métodos conocidos, pasos de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales, de ninguna manera es una admisión de que algún aspecto, descripción o modalidad de la presente invención se describe, enseña o sugiere en la técnica relevante. La descripción anterior de las modalidades específicas revelará enteramente de esta manera la naturaleza general de la invención que otros pueden, aplicando el conocimiento dentro de la aptitud de la técnica (incluyendo los contenidos de las referencias citadas en la presente), fácilmente modificar y/o adaptar para varias aplicaciones, dichas modalidades específicas, sin experimentación indebida, sin que se aparten del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, se pretende que dichas adaptaciones y modificaciones estén dentro del significado de una gama de equivalentes de las modalidades descritas, con base en la enseñanza y guía presentadas en la presente. Se entenderá que la fraseología o terminología de la presente es con el propósito de descripción y no de limitación, de modo que la terminología o fraseología de la presente especificación sea interpretada por el experto en la técnica a la luz de las enseñanzas y guía presentadas en la presente, en combinación con el conocimiento de los expertos en la técnica. De conformidad con una modalidad, la invención provee una composición farmacéutica, en donde dicha formulación es un hidrogel de poloxámero que comprende un interferón-beta. En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica, en donde dicha composición es un hidrogel de poloxámero que comprende interferón-beta recombinante, tal como interferón-beta 1a recombinante. En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica de conformidad con la invención, en donde dicha composición comprende además un regulador de pH y un antioxidante. En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica de conformidad con la invención, en donde dicha composición comprende además un regulador de pH y un agente tensioactivo. De conformidad con otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica de conformidad con la invención, en donde dicha composición comprende además un modificador de transición de temperatura de sol a gel. De conformidad con otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica de conformidad con la invención, en donde dicha composición comprende además un modificador de transición de temperatura de sol a gel, seleccionado de trehalosa y una ciclodextrina. De conformidad con una modalidad, la invención provee una composición farmacéutica, en donde dicha formulación es un hidrogel de poloxámero 407.

En otra modalidad, la invención provee una composición farmacéutica, en donde dicha composición es un hidrogel de poloxámero 407, que comprende poloxámero 407 a aproximadamente 20 a 25% en p/p. De conformidad con una modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica, en donde dicha formulación comprende interferón-beta recombinante, tal como interferón-beta 1 a recombinante, un regulador de pH de acetato y L-metionina como antioxidante. De conformidad con otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica, en donde dicha formulación es un hidrogel de poloxámero 407 que comprende interferón-beta recombinante, dicho interferón-beta 1a recombinante, un regulador de pH de acetato, L-metionina como antioxidante y poloxámero 188 como agente tensioactivo. De conformidad con otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica, en donde dicha formulación es un hidrogel de poloxámero 407 que comprende interferón-beta recombinante, tal como ¡nterferón-beta 1a recombinante, un regulador de pH de acetato, L-metionina como antioxidante, poloxámero 188 como agente tensioactivo, y trehalosa como modificador de transición de temperatura de sol a gel. De conformidad con otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica, en donde dicha formulación es un hidrogel de poloxámero 407 que comprende ¡nterferón-beta recombinante, tal como interferón-beta 1 a recombinante, un regulador de pH de acetato, L- metionina como antioxidante y una ciclodextrina como modificador de transición de temperatura de sol a gel, de preferencia hidroxipropil beta ciclodextrina. De conformidad con otra modalidad preferida, la invención provee una composición farmacéutica seleccionada del siguiente grupo: Poloxámero 407-25% en p/p Regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8-74.7% en p/p r-h-IFNbeta 1a-0.012% en p/p L-metionina-0.03% en p/p Poloxámero 188-0.24% en p/p; Poloxámero 407-25% en p/p Regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8-72.04% en p/p r-h-IFNbeta 1a-0.012% en p/p L-metionina-0.03% en p/p Poloxámero 188-0.24% en p/p Trehalosa-2.6% en p/p; Poloxámero 407-20% en p/p Regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8-77.34% en p/p r-h-IFNbeta 1a-0.015% en p/p L-metionina-0.04% en p/p Hidroxipropil-ß-ciclodextrina-2.6% en p/p Poloxámero 407-25% en p/p Regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8-72.04% en p/p r-h-IFNbeta 1a-0.012% en p/p L-metionina-0.03% en p/p Poloxámero 188-0.24% en p/p Glicerol 30°Bé-2.6% en p/p; y Poloxámero 407-25% en p/p Regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8-72.04% en p/p r-h-IFNbeta 1a-0.012% en p/p L-metionina-0.03% en p/p Poloxámerol 88-0.24% en p/p PEG(Lutrol®E400)-2.6% en p/p. En otra modalidad, la invención provee un método para la preparación de una composición farmacéutica de hidrogel de IFN de conformidad con la invención, en donde dicho método comprende la adición de una cantidad calculada de poloxámero a una solución regulada en su pH, a una temperatura en donde se forme una solución polimérica homogénea, y añadiendo entonces el interferón o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional o fracción activa del mismo. En otra modalidad, la invención provee un método para la preparación de una composición farmacéutica de hidrogel de IFN de conformidad con la invención, en donde la solución de regulador de pH contiene un modificador de transición de temperatura de sol a gel seleccionado de trehalosa y ciclodextrina, de preferencia hidroxipropil-ß-ciclodextrina. En otra modalidad, la invención provee un método para la preparación de una composición farmacéutica de hidrogel de IFN de conformidad con la invención, en donde el interferón se añade a partir de una solución que contiene estabilizadores, seleccionados de preferencia de L-metionina y poloxámero 188, y una combinación de los mismos. En otra modalidad, la invención provee un uso de un hidrogel de IFN-beta de conformidad con la invención, en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de esclerosis múltiple. En otra modalidad, la invención provee un método para el tratamiento de esclerosis múltiple, que comprende la administración de un hidrogel de IFN-beta de conformidad con la invención, a un paciente que necesita del mismo. La invención se describirá ahora por medio de los siguientes ejemplos, los cuales de ninguna manera deberá considerarse que limitan la presente invención. Los ejemplos se referirán a los dibujos especificados aquí a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra el porcentaje de liberación de r-hIFNß 1a a partir del hidrogel (1 ) de poloxámero de r-hIFNß 1 a en PBS a pH 7.4 a 37°C, medido por SEC-CLAR/detector de fluorescencia (rombos) y prueba de ELISA (cuadros oscuros) contra tiempo, después de la inyección del hidrogel en PBS (ejemplo 1 ). La figura 2 representa la actividad antiviral de r-hIFNß 1a liberado después de 2 horas a partir del hidrogel (1 ) de poloxámero de r-hIFNß 1 a (rombos claros), en comparación con el volumen de r-hIFNß 1 a (cuadros claros) y el volumen de r-hIFNß 1a co-mezclado con gel de poloxámero sin r-hlFNß 1 a (placebo) (triángulos oscuros). La actividad antiviral se expresa por medio del porcentaje de supervivencia de células (células WISH) después de la infección con VSV como una función de la concentración de r-hIFNß 1a (ejemplo 2). La figura 3 representa la variación de la concentración de la sangre en r-hIFNß 1a contra tiempo, en monos cynomolgus no afectados después de la inyección subcutánea de una sola inyección de 3.6 µg/kg del hidrogel (1 ) de poloxámero de r-hIFNß 1 a (cuadros oscuros), una sola inyección del volumen de 3.6 µg/kg de r-hIFNß 1a (control 1 : triángulo claro), o tres inyecciones dentro de una semana, separadas por intervalos de 48 horas (t=0, 48h y 96h) de 1.223 µg/kg de cada uno (control 3: rombos claros) (ejemplo 3). La figura 4 representa la variación de la concentración de la sangre en r-hIFNß 1 a contra tiempo, en monos cynomolgus no afectados después de una sola inyección subcutánea de 3.6 µg/kg de lipogel de GMS de r-hIFNß 1 a (control 2: puntos) o tres inyecciones dentro de una semana, separadas por intervalos de 48 horas (t=0, 48h y 96h) de 1.223 µg/kg cada una (control 3: rombos claros) (ejemplo 3). La figura 5 representa los perfiles de viscosidad de la formulación de hidrogel (1 ) Lutrol -puntos- en comparación con la formulación de hidrogel Lutrol que contiene 2.6% en p/p de trehalosa (2) -cuadros oscuros-y la formulación de hidrogel Lutrol que contiene 2.6% en p/p de HPbetaCD (3) -triángulos oscuros. La figura 6 representa el porcentaje de r-hIFNß 1a liberado a partir del hidrogel (3) de poloxámero de r-hIFNß 1 a (poloxámero 407 - 20% en p/p; regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8-77.34% en p/p, r-hIFNß 1 a -0.015% en p/p, L-metionina - 0.04% en p/p, e hidroxipropil-ß-ciclodextrina -2.6% en p/p) en PBS a pH 7.4 a 37°C, medido por SEC-CLAR/detector de fluorescencia.

EJEMPLOS Las siguientes abreviaturas se refieren respectivamente a las definiciones dadas a continuación: cm (centímetros), cps (centipoises), Da (Daltons), g (gramos), µg (microgramos), min (minutos), mg (miligramos), mL (mililitros), mm (milímetros), mM (milimolar), mPas (miliPascales segundos), rpm (rotaciones por minuto), nm (nanómetros), CHO (ovario de hámster chino), IFN (interferón), Ul (unidades internacionales), i.v. (intravenoso), EMEM (medio mínimo esencial de Eagle con sales de Earle), FBS (suero de bovino fetal), GMS (monoestearato de glícerilo), MTT (ácido N-2-hídroxietilpiperazin-N'-2-etansulfónico), MS (esclerosis múltiple), PM (peso molecular), PBS (solución salina regulada en su pH con fosfato), PES (polietersulfona), PP (polipropileno), PVDF (fluoruro de polivinilideno), r-IFN beta (interferón-beta recombinante), r-hIFNß 1a (interferón beta-1a recombinante producido en células CHO), RÍA (radioinmunoensayo), s.c. (subcutáneo), TIW (tres veces por semana), Ul (unidad internacional), VSV (virus de la estomatitis vesicular). La síntesis de poloxámeros se describe en Schmolka 1977, Journal of the American Oil Chemist's Society 54, 110-116, y los mismos están disponibles comercialmente.

EJEMPL0 1 Hidrogel (1) de poloxámero 407-r-hlFNß 1a 1. Procedimiento de preparación general En un vaso de precipitado de polipropileno (baja adsorción de proteínas) puesto en un baño de hielo, se añade lentamente una cantidad ponderada de Lutrol® F127 a regulador de pH de acetato frío (2-8°C) [50 mM, pH 3.8] bajo agitación magnética [a 500-800 rpm], hasta la disolución completa del polímero.

En un vaso diferente, se añade una pequeña cantidad de regulador de pH de acetato, que contiene agentes de estabilización (por ejemplo, Lutrol® F68 y L-metionina), a una solución global de r-IFN-beta concentrada (2 mg/mL). Este regulador de pH formulado se añade en la solución polimérica, reduciendo la agitación hasta 100 a 200 rpm, para reducir al mínimo la tensión mecánica de la proteína. La formulación final se llena en jeringas de polipropileno a 2 a 8°C. La solución global de r-IFN-beta es una solución de regulador de pH de acetato, concentrada a partir de 0.348 mg/mL a 2 mg/mL por centrifugación ultra-filtrante (Sartorius VivaSpin 20 mL, limitación de peso molecular de 5000 Da, 2500 rpm). La solución global concentrada se analiza siempre por el método común de SEC-CLAR para prueba y pureza (% de monómero), como se describe en el ejemplo 1 y en el ejemplo 5 más adelante. 2. r-hIFN-beta Se usó un volumen de 0.348 mg/mL de Rebif®, y se preparó una solución estabilizada de r-hIFN-beta 1a de acuerdo al procedimiento general bajo el número 1 anterior, por la adición de una combinación de estabilizadores, por ejemplo, Lutrol® F68/L-metionina. 3. Excipientes 3.1. Lutrol F127® (Poloxámero, Pluronic, Svnperonic) Lutrol F127 (copolímero de bloque triple de polioxietileno-polioxipropileno-políoxietileno) BASF, es un copolímero de bloque de óxido de polietileno y óxido de polipropileno. Se incluye en la guía de ingredientes inactivos de la FDA (inyecciones i.v., inhalaciones, preparaciones oftálmicas, polvo oral, soluciones, suspensiones y jarabe, también preparaciones tópicas). Se incluye también en medicamentos no parenterales autorizados en la farmacopea europea del Reino Unido 4, p. 1777; USP 24 NF19 p 2492-2493. En Pluronic® F127, el porcentaje de polioxietileno (hidrofílico) es de 73% (un poloxámero de fórmula (I), en donde (a)=(c)=67 y (b)=98). Las propiedades típicas de Pluronic® F127 se enlistan a continuación: Peso molecular promedio: 12600 g/mol Punto de fusión: 56°C Forma física a 20°C: sólido Viscosidad a 77°C: 3100 cps Tensión superficial a 25°C, concentración de 0.1 %: 41 dinas/cm Humedecimiento de Draves (gancho de 3 gm, concentración de 0.1 % a 25°C: más de 360s Altura de la espuma (Ross Miles, 0.1 %, acuoso a 50°C: 40 mm Punto de turbiedad en solución acuosa, concentración de 1 %: más de 100°C HLB (balance hidrofílico-lipofílico) en agua a 25°C: 18-23 Solubilidad en agua a 25°C: más de 10%. 3.2. Acido acético glacial, Siqma 3.3. Lutrol® F68 (Poloxámero, Pluronic, Svnperonic) Lutrol F68 (copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno) BASF, es un copolímero de bloque de óxido de polietileno y óxido de polipropileno. Se incluye en la guía de ingredientes inactivos de la FDA (inyecciones i.v., inhalaciones, preparaciones oftálmicas, polvo oral, soluciones, suspensiones y jarabe, también preparaciones tópicas). Se incluye también en medicamentos no parenterales autorizados en la farmacopea europea del Reino Unido 4, p. 1777; USP 24 NF19 p 2492-2493. En Pluronic® F68, el porcentaje de polioxietileno (hidrofílico) es de 80%, y el peso molecular del polioxipropileno (hidrofóbico) es de aproximadamente 1 ,967 Da (un poloxámero de fórmula (I), en donde (a)=(c)=79 y (b)=28). Las propiedades típicas de Pluronic F68 se enlistan a continuación: Peso molecular promedio: 8400 Punto de fusión/fluidez: 52°C Forma física a 20°C: sólido Viscosidad (Brookfield) cps: 1000 [líquidos a 25°C, pastas a s a 77°C] Tensión superficial, dinas/cm a 25°C Concentración de 0.1%: 50.3 Concentración de 0.01 %: 51.2 Concentración de 0.001 %: 53.6 Tensión interfacial, dinas/cm a 25°C contra Nujol Concentración de 0.01 %: 19.8 Concentración de 0.01 %: 24.0 Concentración de 0.01 %: 26.0 Humedecimiento de Draves, segundos, 25°C Concentración de 1.0%: más de 360 Concentración de 0.1 %: más de 360 Altura de la espuma Ross Miles, 0.1 %, mm a 50°C: 35 Ross Miles, 0.1 %, mm a 26°C: 40 Dinámica, 0.1 %, mm a 400 ml/min: más de 600 Punto de turbiedad en solución acuosa, °C Concentración de 1 %: más de 100 Concentración de 10%: más de 100 HLB (balance hidrofílico-lipofílico): 29. 3.4. L-metionina, Siqma Se incluye L-metionina (L-met) en la formulación a un nivel de 0.03% para limitar la oxidación, y por lo tanto la estabilidad del IFN-beta en solución. 4. Composición de hidrogel (1 ) Se preparó un hidrogel (1 ) que contenía 120 µg/ml de r-hlFN-beta 1 a, teniendo la siguiente composición: Lutrol® F127 25.0% en p/p Regulador de pH de acetato [50 mM/pH 3.8] 74.7% en p/p r-hIFN-beta 1a 0.012% en p/p L-metionína 0.03% en p/p Lutrol® F-68 0.24% en p/p El hidrogel (1 ) se fabricó de acuerdo al procedimiento general del ejemplo 1 , y en donde se usaron 25 g de solución de Lutrol® F127 y 3 mg de r-hIFN-beta 1a. 5. Características fisicoquímicas - Viscosidad Se realizaron estudios de viscosidad dinámica para caracterizar dicho hidrogel, y para sustentar un protocolo de inyectabilidad adecuado; se usó un viscosímetro rotacional viscoStar L Fungilab, obteniendo una lectura directa de viscosidad en mPas (centipoises). Se preparó un lote de 50 g del hidrogel (1 ), y se introdujo en un vial de polipropileno mantenido en un baño de hielo (T = 5 ± 2°C) durante el análisis de la viscosidad. Los valores reportados de la viscosidad variaron entre 100 y 140 mPas (huso número 2, velocidad del huso de 100 rpm y 3 minutos de tiempo al equilibrio).

- Liberación de proteínas Para simular condiciones subcutáneas fisiológicas, se investigó la liberación de IFN-beta del hidrogel (1 ) en PBS. Se realizaron pruebas de liberación de fármaco usando 1 g de la formulación (1 ) (dispensada usando jeringas prellenadas) en 4 mL de PBS pH 7.4 a 37 ± 2°C (velocidad del baño de agitación = 100 rpm). Las muestras se colectaron a 5, 15, 30 minutos, 1 y 2 horas. Cada muestra se analizó por SEC-CLAR con detector de fluorescencia (fluorescencia de Trp), y se confirmó por el método de ELISA (equipo Toray). Estos métodos se detallan a continuación: La cantidad de IFN-beta que se detectó en el medio se expresó como un porcentaje de la proteína total liberada. Los perfiles de liberación obtenidos con los dos métodos, indican un patrón de liberación bifásico, con una fase de inicio rápido seguida de una velocidad de liberación de fármaco más lenta (figura 1 ).

Procedimiento de extracción y análisis por SEC-CLAR Se realizaron pruebas para optimizar el método de extracción de IFN-beta incorporado en los sistemas de hidrogeles, y para medir la recuperación de fármaco. Se estableció un procedimiento de extracción de la manera siguiente, con base en una mezcla de solvente orgánico/agua formada de agua y acetona: - Se disolvieron 500 mg de la formulación de hidrogel (1 ) en 1.0 mL de acetona en un tubo de centrífuga, y se sonicaron por 2 minutos en un baño ultrasónico a menos de 10°C - Se añadió agua hasta 3 mL como volumen final - La muestra obtenida se centrifugó (5 minutos a 100,000 rpm, a +4°C) - La fase líquida se recogió y se analizó. Después del procedimiento de extracción, las muestras se analizaron por SEC-CLAR con las siguientes condiciones operativas: - Columna de CLAR TSK G2000 SWXL código 08540 (ID de 7.8 mm x 30 cm, 5 µ) - Volumen de inyección, 100 µL - Temperatura de la columna, temperatura ambiente - Temperatura de la muestra, temperatura ambiente - Magnitud de flujo: 0.5 mL/min (¡socrático) - Fase móvil: agua purificada a 70% en v/v (MILLIQ-Millipore)- acetonitrilo a 30% en v/v-TFA a 0.2% en v/v - Tiempo de operación: 27 min - Tiempo al equilibrio: 3 min - Longitudes de onda del detector de fluorescencia: excitación 280 nm, emisión 348 nm.

Prueba de ELISA Se usó un inmunoensayo de ELISA (equipo Toray), para evaluar la concentración de IFN-beta liberado por el hidrogel (1 ) de IFN. Esta prueba usa el método de sandwich de un paso, y se basa en las microplacas de 96 cavidades revestidas con anticuerpo policlonal para r-hIFN-beta. Un anticuerpo monoclonal enlazado a enzimas específico para r-hIFN-beta se añade a las cavidades, y entonces se pipetean estándares y muestras en las cavidades; cualquier r-hIFN-beta presente es unido por el anticuerpo inmovilizado. Después de un lavado para remover cualquier reactivo de enzima-anticuerpo no unido, se añade una solución de substrato a las cavidades, y se desarrolla color en proporción a la cantidad de r-hIFN-beta que se une en el paso inicial. Se detiene el desarrollo de color, y se mide la intensidad del color. La prueba se llevó a cabo de acuerdo al folleto, con la diferencia de que la incubación de la muestra se realiza durante la noche a +4°C. La microplaca revestida de anticuerpo se lavó con 400 µL de la solución de lavado, y se secó sobre un papel. Entonces, se añadieron 50 µL/cavidad del anticuerpo marcado con enzima a la microplaca que se llenó previamente con 100 µL de muestra proveniente de experimentos de liberación de fármaco del hidrogel (1 ), o con la curva de concentración de referencia de r-hIFN-beta (global) (0-200 UI/mL). La microplaca se cubrió y se agitó por completo mientras se incubaba por 120 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, las muestras se removieron, la microplaca se lavó tres veces, y se secó sobre un papel. Se añadieron 100 µL de solución reveladora de color en cada cavidad; después de 30 minutos de incubación, se añadieron 100 µL de reacción de detención, y se leyó la absorbancia a longitudes de onda dobles de 450 nm y 650 nm (figura 1 ).

- Estabilidad preliminar Se monitoreó la estabilidad del hidrogel (1 ) de IFN a t=0, 24 h, 1 semana, 1 y 2 meses a 4°C. Los análisis realizados fueron: carga de fármaco por inspección visual, y viscosidad (huso número 2, 100 rpm, T=6 ± 2°C. La formulación de hidrogel (1 ) fue estable durante por lo menos 2 meses.

EJEMPLO 2 Bioactividad del hidrogel (1) de poloxámero 407-r-hlFN-beta 1a La actividad biológica del hidrogel (1 ) se mide a través de la actividad antiviral de r-hIFN-beta 1 a liberado de la formulación de hidrogel (1 ), en comparación con la actividad antivíral observada con IFN-beta global. El virus de la estomatitis vesicular (VSV), un virus que causa una enfermedad de pezuñas y boca en el ganado, se eligió para su uso en este estudio, debido a su sensibilidad a los interferones. La prueba antiviral usada se basa en la inhibición, inducida por IFN-beta, del efecto citopático por virus en las líneas de células WISH sembradas en EMEM que contenía FBS a 5% a 4x104 células/cavidad (50 µL/cavidad) de una placa de microtítulo de 96 cavidades llenada previamente con dilución gradual (dilución 1 :1.5) de muestra de hidrogel de r-hIFN-beta o referencia de r-hIFN-beta 1a (global). Las células se incubaron por 18 a 22 horas a 37°C y CO2 a 5%, antes de la adición de 50 µl/cavidad de una suspensión de virus de la estomatitis vesicular (VSV) preparada en EMEM que contenía FBS a 2.5%. Las cavidades de células control recibieron medio solo y ninguna suspensión del virus, mientras que las cavidades de virus control recibieron solamente suspensión de VSV. Las células infectadas se incubaron por otras 20 a 24 horas a 37°C y CO2 a 5%, y se tiñeron entonces con solución de MTT a 5% por 2 horas. Al final del experimento se desecharon los sobrenadantes, y se disolvieron sales de formazán por la adición de 200 µL/cavidad de etanol a 96%. Las placas se leyeron a 595 nm en el lector de placa del espectrofotómetro. Los resultados se expresaron como el porcentaje de inhibición del efecto citopático contra células control. Se evaluó la actividad biológica in vitro de r-hIFN-beta 1a liberado de la formulación de hidrogel (1 ) después de 2 horas, usando la prueba de células WISH descrita anteriormente, en dos grupos diferentes de experimentos. La concentración de r-hIFN-beta 1 a fue de 37.7 µg/mL. Cualquier interferencia posible del hidrogel Lutrol sin r-hIFN-beta 1 a (placebo) que se usó para la preparación del hidrogel, se verificó también introduciendo el volumen de r-hIFN-beta 1a en el placebo. El r-hIFN-beta 1a liberado después de 2 horas de ambos lotes, mostró que la bioactividad se mantuvo y que la recuperación fue completa, en comparación con el volumen de r-hIFN-beta 1 a introducido en placebo (figura 2). Por lo tanto, parece ser que los hidrogeles de poloxámero son capaces de retener la actividad biológica completa del r-hIFN-beta 1a tras la liberación del fármaco.

EJEMPLO 3 Perfil farmacocinético del hidrogel (1) de poloxámero 407-r-hlFN-beta 1a Para poner a prueba las características de liberación sostenida del hidrogel de poloxámero de IFN de la invención, puede compararse el perfil farmacocinético del hidrogel con el de las formulaciones de regulador de pH y otras formulaciones de gel. Se estudió el perfil farmacocinético de la formulación de hidrogel (1 ) de IFN-beta en monos cynomolgus no afectados (2 machos y 2 hembras, en cada grupo), y se comparó con el perfil farmacocinético de una formulación de lipogel de IFN-beta.

Se proveyeron muestras en jeringas prellenadas, equipadas con una aguja de calibre 19. El estudio se diseñó (cuadro IV siguiente) para comparar una inyección s.c. una vez por semana de hidrogel (1 ) de IFN-beta (120 µg/ml), con una inyección una vez por semana de formulación líquida regulada en su pH (pH 3.8) de IFN-beta global (control 1 ), o una inyección s.c. una vez por semana de lipogel de IFN-beta (120 µg/ml) (control 2). Se usó otro grupo control, en donde a los monos se les administró en una forma de tres veces por semana (TIW) (3 inyecciones s.c. separadas por intervalos de 48 horas: t=0, 48h y 96h), imitando el régimen de dosificación de Rebif® común para la terapia de la MS (control 3). La solución de IFN para el control 1 (grupo 2) consistió en una solución de 40 µg/mL de IFN en regulador de pH de acetato, 50 mM. La composición del lipogel de IFN-beta para el control 2 (grupo 3), fue la siguiente: Monoestearato de glicerina (GMS), 22.37% en p/p (RYLO™ MG20 PHARMA, Danisco Cultor) PEG400 (Lutrol E400, BASF) 63.09% en p/p Acido acético 4.03% en p/p Regulador de pH de acetato [50 mM/pH 3.8] 9.94% en p/p r-hIFN-beta 1a 0.01 % en p/p L-metionina (Sigma) 0.03% en p/p Hidroxípropil-ß-ciclodextrina 0.03% en p/p (Cavasol W7HP, Wacker) La solución de IFN para el control 3 (grupo 4), consistió de 16 µg/mL de solución de IFN en regulador de pH de acetato, 50 mM. La toma de muestras de sangre incluyó la pre-dosís, y se diseñó para que abarcara 14 días después de la inyección (336 h) para los grupos 1 y 3, y para abarcar 2 días después de la inyección para el grupo 2. La toma de muestras para el grupo 4 se diseñó para permitir el análisis de PK después de la primera y última inyección de r-hIFN-beta 1a, y análisis completo de neopterina. Se cuantificó el r-hIFN-beta 1a por medio de un inmunoensayo enzimático, ELISA (Fujirebio), como se describió anteriormente. Los niveles de neopterina se cuantificaron por medio de prueba de RÍA (ICN Biomedical).

CUADRO IV Liberación de ß-IFN Los resultados pusieron en evidencia que, después de una inyección s.c. individual, el hidrogel (1 ) de poloxámero (grupo 1 ) libera r-hlFN-beta 1 a en un patrón controlado, sustentando niveles en plasma arriba de 5 Ul/ml por aproximadamente una semana, y posiblemente más (figura 3). La biodisponibilídad de proteínas es significativamente mayor (cuadro V, siguiente) que la formulación líquida regulada en su pH (inyección s.c. individual y TIW) y la formulación de lipogel usadas como controles. La liberación de r-hIFN-beta 1 a para el hidrogel (1 ) de poloxámero muestra un patrón controlado pronunciado real en comparación con el perfil de liberación de r-hIFN-beta 1a obtenido con el lipogel basado en GMS (grupo 3), como se muestra en las figuras 3 y 4. El perfil de liberación de r-hIFN-beta 1 a a partir del lipogel (control 2) se caracteriza por un "estallido" menor y un estado estable reducido prolongado. Estos resultados muestran que la formulación de lipogel usada como control 2, no es adecuada para la liberación sostenida de r-hIFN-beta 1 a.

CUADRO V Incremento de los niveles de neopterina en suero Los resultados farmacodinámicos (PD) confirmaron la actividad biológica de r-hIFN-beta 1 a liberado de los geles. Los niveles de neopterina se incrementaron con un cambio de Tmáx de aproximadamente 24 horas para la inyección del hidrogel (1 ) contra el control (control 1 ). La dosificación repetida (TIW) de r-hIFN-beta 1 a dio un perfil PD menor pero extendido (control 3). La formulación de lipogel dio un perfil farmacodinámico menor (control 2).

Preparación de la formulación de lipoqel control En un vaso de precipitado de polipropileno (baja adsorción de proteínas), se mezclan cantidades ponderadas de GMS y PEG en regulador de pH de acetato [50 mM, pH 4-5], y se mantienen en un baño de agua (40°C) por unos cuantos minutos, para obtener una matriz lipídica fundida y homogénea. En un vaso diferente, se añade una pequeña cantidad de regulador de pH de acetato [50 mM, pH 4-5] que contiene agentes de estabilización y excipientes (es decir, ciclodextrina y L-metionína), a una solución global de r-hIFN-beta 1a concentrada (2 mg/mL). Este regulador de pH formulado se pone primero en un baño de agua (40°C) por aproximadamente 1.5 minutos, y se añade a la mezcla de lípidos. La mezcla se deja entonces en el baño de agua por aproximadamente 5 a 10 minutos, y se enfría entonces hasta temperatura ambiente bajo agitación moderada con una varilla de polipropileno.

Estos resultados muestran que el hidrogel (1 ) tiene una actividad biológica similar a la de las formulaciones líquidas control de r-hIFN-beta 1 a, y permite niveles de r-hIFN-beta 1a en plasma sostenidos por cuando menos una semana, y una biodisponibilidad mejorada.

EJEMPLO 4 Filtración esterilizante del hidrogel (1) de poloxámero 407-r-hlFN-beta 1a La solución de hidrogel monofásica que contienen IFN-beta pudo tratarse por medio de filtración esterilizante. Se preparó hidrogel (1 ) de IFN como se describe en el ejemplo 1. Se usaron dos membranas diferentes (PVDF: fluoruro de polivinilideno y PES: polietersulfona) de PALL Corporation, de diámetro de membrana de 47 mm, y limitación de 0.2 mm, a una temperatura en donde la viscosidad de la solución se mantiene baja, por ejemplo, a 4°C. La viscosidad se mide antes y después de la filtración en un reómetro (ViscoStar L Fungilab): 50 mL de hidrogel (1 ) en un vial de polipropileno, mantenido en un baño de hielo (T=5 ± 2°C), huso número 2, 100 rpm. No se observaron cambios reológicos significativos debido al procedimiento de filtración. Se analizó el contenido de monómeros de IFN y la cinética de liberación del hidrogel (1 ) cargado de IFN, antes y después de la filtración por SEC CLAR detector de fluorescencia (PBS (pH 7.4), 37°C, 100 rpm/1 g de hidrogel (1 ) en 4 mL de PBS). Los perfiles de liberación obtenidos después de la filtración son muy similares a los obtenidos antes de la filtración; por lo tanto, el procedimiento de filtración no modifica las propiedades de liberación de IFN del hidrogel.

EJEMPLO 5 Hidrogel (2) de poloxámero 407-r-hlFN-beta 1a Se preparó hidrogel (2) de IFN como se describió en el ejemplo 1 , y se añadió trehalosa (Sígma) a 2.6% en p/p a la solución de regulador de pH antes de la formación de la solución de hidrogel de poloxámero, es decir, antes de la adición del poloxámero 407.

Composición (2) de hidrogel: Poloxámero 407 25% en p/p Regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8 72.04% en p/p r-hIFN-beta 1a 0.012% en p/p L-metionina 0.03% en p/p Poloxámero 188 0.24% en p/p Trehalosa 2.6% en p/p.

- Viscosidad Se realizaron estudios de viscosidad dinámica para caracterizar el hidrogel (2), y para caracterizar sus propiedades de inyectabilidad. Se usó un viscosímetro rotacional ViscoStar L Fungilab, obteniendo una lectura directa de la viscosidad en mPas (centipoises). El hidrogel (2) se introdujo en un vial de polipropileno, y se llevaron a cabo medidas de viscosidad (SPL4, escala de velocidad de 200 a 300 rpm), mientras se hacia variar la temperatura y continuamente los valores de lectura en la pantalla del viscosímetro. Los resultados muestran un comportamiento reológico diferente del hidrogel (2), en comparación con el hidrogel (1 ). El uso de trehalosa a 2.6% en p/p en el hidrogel de la invención (2), resulta en el incremento en la temperatura de transición de sol a gel (figura 5), que mejora las condiciones de fabricación y el manejo de la matriz.

EJEMPLO 6 Hidrogel (3) de poloxámero 407-r-hlFN-beta 1a Se preparó hídrogel (3) de IFN como se describe en el ejemplo 1 , pero se añadió hidroxipropíl-ß-ciclodextrina (Cavasol W7/HP, Wacker) a 2.6% en p/p a la solución de regulador de pH bajo agitación magnética (500-700 rpm) antes de la adición del poloxámero 407. Entonces, se añadió el poloxámero 407 a la solución de regulador de pH de hidroxipropil-ß-ciclodextrina descrita en el ejemplo 1 , bajo agitación magnética.

Composición (3) de hidrogel: Poloxámero 407 20% en p/p Regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8 77.34% en p/p r-hIFN-beta 1a 0.015% en p/p L-metionina 0.04% en p/p Cavasol W7HP 2.6% en p/p.

- Viscosidad Se realizaron estudios de viscosidad dinámica para caracterizar el hidrogel (3), y para caracterizar sus propiedades de inyectabilidad. Se usó un viscosímetro rotacional ViscoStar L Fungilab, obteniendo una lectura directa de la viscosidad en mPas (centipoises). El hidrogel (3) se introdujo en un vial de polipropileno, y se llevaron a cabo medidas de viscosidad (SPL4, escala de velocidad de 200 a 300 rpm), mientras se hacia variar la temperatura y continuamente los valores de lectura en la pantalla del viscosímetro. Los resultados mostrados en la figura 5 muestran un comportamiento reológico diferente del hidrogel (3), en comparación con el hidrogel (1 ): la temperatura de transición de sol a gel del hidrogel (3) se incrementa de aproximadamente 11 °C a 23°C. En forma sorprendente, el cambio de temperatura de transición de sol a gel del hidrogel (3) se incrementa aún más significativamente en comparación con la del hídrogel que contiene trehalosa (2), a pesar de una menor concentración del poloxámero 407 formador de matriz (20% en p/p) que se usó (figura 5), lo cual mejora significativamente las condiciones de fabricación y el manejo de la matriz.

- Liberación de proteínas Para simular condiciones subcutáneas fisiológicas, se investigó la liberación de IFN-beta del hidrogel (3) en PBS como se describió previamente. Se realizaron pruebas de liberación de fármaco usando 1 g del hidrogel (3) (dispensado usando jeringas prellenadas) en 4 mL de PBS pH 7.4 a 37 ± 2°C (velocidad del baño de agitación = 100 rpm). Las muestras se colectaron a 5, 15, 30 minutos, 1 y 2 horas. Cada muestra se analizó por SEC-CLAR con detector de fluorescencia (fluorescencia de Trp). Las propiedades de liberación sostenida (perfil de liberación de IFN-beta) del hidrogel (3) que contenía ciclodextrina, son comparables a las de un hidrogel sin un modificador de transición de temperatura de sol a gel, es decir, hidrogel (1 ), a pesar del cambio en la temperatura de transición de sol a gel (figura 6). A partir de la prueba antiviral descrita en el ejemplo 2, se observó que el r-hIFNß 1a fue liberado después de 2 horas, el hidrogel (3) que contenía ciclodextrina mantuvo su bioactividad, y que la recuperación fue completa, en comparación con el volumen de r-hlFNß 1 a introducido en el placebo. Por lo tanto, parece ser que el hidrogel (3) que contiene ciclodextrina es capaz de retener la actividad biológica completa del r-hIFß 1 a tras la liberación del fármaco.

EJEMPLO 7 Hidrogel (4) de poloxámero 407-r-hlFN-beta 1a Se preparó hidrogel (4) de IFN como se describió en el ejemplo 1 , y se añadió glicerol 30°Bé (Cario Erba) a 2.6% en p/p a la solución de regulador de pH antes de la formación de la solución de hidrogel del poloxámero, es decir, antes de la adición del poloxámero 407.

Composición (4) de hidroqel: Poloxámero 407 25% en p/p Regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8 72.04% en p/p r-hIFN-beta 1a 0.012% en p/p L-metionina 0.03% en p/p Poloxámero 188 0.24% en p/p Glicerol 30°Bé 2.6% en p/p.

EJEMPLO 8 Hidrogel (5) de poloxámero 407-r-hlFN-beta 1a Se preparó hidrogel (5) de IFN como se describió en el ejemplo 1 , y se añadió PEG (Lutrol®)E400, BASF) a 2.6% en p/p a la solución de regulador de pH antes de la formación de la solución de hidrogel del poloxámero, es decir, antes de la adición del poloxámero 407.

Composición (5) de hidrogel: Poloxámero 407 25% en p/p Regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8 72.04% en p/p r-hIFN-beta 1a 0.012% en p/p L-metionina 0.03% en p/p Poloxámero 188 0.24% en p/p PEG (Lutrol®)E400) 2.6% en p/p.

EJEMPLO 9 Prueba de aplicación por jeringa Para poner a prueba la inyectabilidad subcutánea de hidrogeles basados en poloxámero de IFN, puede llevarse a cabo una prueba de aplicación por jeringa usando diferentes tipos de agujas. En particular, la prueba de aplicación por jeringa se lleva a cabo usando una nueva tecnología de inyección, denominada Depot One (Imprint Pharmaceuticals). Agujas Depot One seleccionadas, son las siguientes: 18/23 (diámetro interno equivalente a una aguja de calibre 18 y diámetro externo mínimo de una aguja de calibre 21 ). 21/26 (diámetro interno equivalente a una aguja de calibre 21 , y diámetro externo mínimo de una aguja de calibre 26). Se cargan jeringas de polipropileno de 3 mL con 0.5 mL de hidrogel (1 ) o hidrogel (3) (mantenidos a 4°C), y después de aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente, se descargan en un vial de poliestíreno. El "desempeño de la aguja" se calcula con base en la fuerza requerida para descargar las jeringas. Las pruebas de aplicación por jeringa a temperatura ambiente, muestran que el hidrogel (3) tiene muy buenas características de aplicación por jeringa a temperatura ambiente.

EJEMPLO 10 Perfil farmacocinético del hidroqel (3) de poloxámero 407-r-hlFN-ß 1a Las características farmacocinéticas del hidrogel (3) de poloxámero 407-r-hlFN-beta 1a, pueden evaluarse en monos cynomolgus machos (raza cautiva, Macaca fascicularis) no afectados para algún tratamiento previo con r-hIFN-beta u otro tratamiento con fármacos de investigación.

Animales Escala de peso corporal: 2 a 4 kg al inicio del estudio Escala de edad: aproximadamente 5 años Número de animales por grupo: 4 Las formulaciones se administran a los animales que han sido puestos en ayuno durante la noche (es decir, por aproximadamente 16 horas), antes de la administración. Se permitirá de nuevo alimento 4 horas después del tratamiento. Se permitirá agua "a voluntad". Se prepara la formulación de hídrogel (3) de r-hlFNß1 a en jeringas prellenadas de 320 mg cada una con aguja de calibre 21 , a una concentración de 174 µg de r-hIFNß 1 a por gramo. Debido a la naturaleza termorreversible de la formulación de gel, las jeringas prellenadas deben almacenarse a 4°C, y deben mantenerse a temperatura ambiente sólo el tiempo necesario para la administración. Se inyecta una sola dosis de 44 µg de r-hIFNß 1 a por animal en el tejido subcutáneo de una de las piernas. Se administran a cada mono de 200 a 250 mg de una jeringa prellenada con la formulación de hídrogel (3) de r-hIFNß 1a (una jeringa por cada mono) en el grupo 1 (animales 1 a 4). Se pesan jeringas de vidrio prellenadas antes y después de la administración, para permitir la evaluación exacta de la dosis administrada. Se colecta sangre de una vena cefálica en tubos, de acuerdo al esquema detallado del cuadro siguiente: Se deja que las muestras de sangre se coagulen por 60 minutos, a temperatura ambiente. El coágulo se centrifuga a 2500 g (3350 rpm) a 4°C por 15 minutos. Cuando se colectan 0.5 mL de sangre, se preparan 2 alícuotas de suero, la primera con por lo menos 0.125 mL de suero, y la segunda con el suero restante. Cuando se colecta 1.0 mL de sangre, se preparan 2 alícuotas de suero, la primera con por lo menos 0.250 mL de suero, y la segunda con el suero restante. Cuando se colectan 1.5 mL de sangre, se preparan 3 alícuotas de suero, la primera y la segunda con por lo menos 0.250 mL de suero, y la tercera con el suero restante. Las muestras de suero para el análisis de r-hIFN-beta 1 a se almacenan a -80°C. Las muestras de suero para el análisis de neopterina se almacenan a -20°C. Los siguientes parámetros farmacocinéticos se obtienen a partir de las concentraciones en suero individuales de r-hIFNß 1a (como UI/mL) contra tiempo (como horas) después de cada administración: Directamente por observación: Cmáx: El valor de concentración más alto encontrado en el suero. Tmáx: El tiempo a partir de la administración en el cual se encuentra el valor de Cmáx. Tz: El último tiempo de la toma de muestras en el cual se encuentra una concentración cuantificable. Cz: El valor de concentración obtenido en el tiempo de la toma de muestras Tz.

Por medio del programa WinNonlin®: AUCz: El área bajo la curva de concentración en suero contra tiempo hasta el tiempo de la toma de muestras Tz, calculado por medio de la regla trapezoidal logarítmica lineal (lineal hasta la Cmáx, logarítmica después de la Cmáx). Tlín: El primer punto considerado para la determinación de la vida media a la eliminación. ?z: La constante de velocidad de eliminación, calculada por medio de la pendiente de la curva de regresión lineal obtenida ajustando los logaritmos naturales de los valores de concentración terminales contra tiempo (de Tlin a Tz). VA: La vida media a la eliminación, calculada por medio de la ecuación: T1/2 = (In 2)/?z AUC: El área bajo la curva de concentración en suero contra tiempo, calculada por medio de la siguiente ecuación: AUC=AUCz + Cz/?z %AUCext: El porcentaje de AUC extrapolado (es decir, obtenido por extrapolación), calculado por medio de la siguiente ecuación: %AUCext = (AUC - AUCz)/AUC. 100. Este experimento puede llevarse a cabo con un grupo 2 de animales paralelo, usando una formulación de IFNß comercializada como referencia (tal como Rebif®: una formulación en solución que contiene albúmina de suero humano (HSA), manitol y acetato de sodio como excipientes, empacados en jeringas prellenadas con aguja calibre 21 de volumen de inyección de 0.5 mL a una concentración de 44 µg de r-hIFNß 1 a (12 MUÍ). En este caso, el contenido entero (0.5 mL) de una jeringa prellenada de Rebif®, se administra a cada mono (una jeringa por animal) en el grupo 2 (animales 5 a 8).

Analito: interferón beta (r-hIFNß 1a): AUC Tmáx Cmáx T último C última última AUC(0-72) [h] [UI/mL] [hr*UI/mL] [h] [UI/mL] [hr*UI/mL] Media 12 1930 54300 96 9.64 53900 Desviación 8.0 992 16000 16 5.10 15800 estándar % de CV 67 51.3 29.4 17 52.9 29.3 Estos resultados muestran que la formulación de hidrogel (3) de r-hIFNß 1a, tiene una alta biodisponibilidad.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición farmacéutica que comprende un interferón

(IFN), en donde dicha composición es un hidrogel de poloxámero. 2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el ¡nterferón es IFN-beta.

3.- La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada además porque el interferón es IFN-beta recombinante.

4.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el interferón es IFN-beta 1 a recombinante.

5.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la composición comprende además un regulador de pH y un antíoxidante.

6.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la composición comprende además un regulador de pH y un agente tensioactivo.

7.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la composición comprende además un modificador de transición de temperatura de sólido a gel.

8.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la composición comprende además un modificador de transición de temperatura de sólido a gel seleccionado de trehalosa y ciclodextrina.

9.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el poloxámero es poloxámero 407.

10.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la composición comprende 20 a 25% en p/p de poloxámero 407.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha composición es un hidrogel de poloxámero 407 que comprende IFN-beta 1 a recombinante, y comprende además un regulador de pH y L-metionina.

12.- La composición de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque la composición comprende además poloxámero 188.

13.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la composición comprende además trehalosa.

14.- La composición de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque la composición comprende además hidroxipropil beta ciclodextrina.

15.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la composición se selecciona del siguiente grupo: poloxámero 407-25% en p/p; regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8-74.7% en p/p; r-hIFNbeta 1a-0.012% en p/p; L-metionina-0.03% en p/p; poloxámero 188-0.24% en p/p; poloxámero 407-25% en p/p; regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8-72.04% en p/p; r-hIFNbeta 1 a-0.012% en p/p; L-metionina-0.03% en p/p; poloxámero 188-0.24% en p/p; glicerol 30°Bé-2.6% en p/p; poloxámero 407-25% en p/p; regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8-72.04% en p/p; r-hIFNbeta 1 a-0.012% en p/p; L-metionina-0.03% en p/p; poloxámero 188-0.24% en p/p; PEG(Lutrol®E400)-2.6% en p/p; poloxámero 407-25% en p/p; regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8-72.04% en p/p; r-h-IFNbeta 1a-0.012% en p/p; L-metionina-0.03% en p/p; poloxámerol 88-0.24% en p/p; trehalosa-2.6% en p/p; y poloxámero 407-20% en p/p; regulador de pH de acetato 50 mM/pH 3.8-77.34% en p/p; r-h-IFNbeta 1a-0.015% en p/p; L-metionina-0.04% en p/p; hidroxipropil-ß-ciclodextrina-2.6% en p/p.

16.- Un método para la preparación de una composición de hidrogel de IFN de conformidad con las reivindicaciones 1 a 15, en donde dicho método comprende la adición de una cantidad calculada de poloxámero a una solución regulada en su pH a una temperatura en donde se forma una solución polimérica homogénea, y añadir entonces el interferón.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la solución de regulador de pH contiene un modificador de transición de temperatura de solución a gel.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la solución de regulador de pH contiene un modificador de transición de temperatura de solución a gel seleccionado de trehalosa y ciclodextrina.

19.- El método de conformidad con las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado además porque el interferón se añade a partir de una solución que contiene estabilizadores seleccionados de L-metionina y poloxámero 188, y una combinación de los mismos.

20.- El uso de una composición de hidrogel de IFN como se reclama en las reivindicaciones 1 a 15, en la preparación de una preparación farmacéutica para el tratamiento de esclerosis múltiple.