JPH09501922A - タンパク質が関与する異常性の検出と治療および分泌タンパク質の生産を増加するための組成物と方法 - Google Patents

タンパク質が関与する異常性の検出と治療および分泌タンパク質の生産を増加するための組成物と方法

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JPH09501922A
JPH09501922A JP7507249A JP50724995A JPH09501922A JP H09501922 A JPH09501922 A JP H09501922A JP 7507249 A JP7507249 A JP 7507249A JP 50724995 A JP50724995 A JP 50724995A JP H09501922 A JPH09501922 A JP H09501922A
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ジェイ．エム． バーグロン，ジョン
ワイ． トーマス，デビッド
ワダ，イクオ
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Abstract

(57)【要約】 この発明は分泌タンパク質の生産を増加するための組成物と方法を提供する。別の面では、この発明は、タンパク質が関与する異常性を治療および判断する方法に用いられる組成物を提供する。これらの方法は一般的にタンパク質の分泌または保持を増加するカルネキシンの活性の変更を含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質が関与する異常性の検出と治療および分泌タンパク質の生産を増加す るための組成物と方法 技術分野 この発明は、一般的には、タンパク質が関与する異常性を治療し、診断し、分 泌タンパク質の生産を変更する方法を目指している。さらに具体的には、この発 明はカルネキシンの活性を調節することによりタンパク質が関与する異常性を治 療し、診断し、分泌タンパク質の生産を変更する方法を目指している。 発明の背景 小胞体（ER）は、タンパク質のトランスロケーション、シグナルペプチドの切 断、タンパク質の折りたたみ(folding)、コアのグリコシル化、オリゴマーの集 合、誤って折りたたまれた(misfolded)分泌タンパク質の分解、細胞中のカルシ ウムの貯蔵に機能を果す。これらの活性は多数の異なった酵素および“分子シャ ペロン(molecular chaperones)”を用いることによって促進される。BiP はERの 管腔経路における既知の分子シャペロンである。しかしながら、BiP によるHep G2細胞中の分泌タンパク質の会合の追求はむだではあったが、１つよりも多い経 路が存在するという強い指針をもたらした（Lodish，J．Biol．Chem．263：2107 -2110，1988）。現在まで、“膜経路（membrane pathway）”とみなされる第２ の経路の解明は不成功に終っている。 膜経路の性質とその成分の解明はシスチン腺症(cystic fibrosis)、若年性肺 気腫（juvenile pulmonary emphysema）、テイ−サッ クス病、先天性スクラーゼイソマルターゼ欠乏症および家族遺伝性高コレステロ ール血症のような、タンパク質が関与する異常性の治療に対して、まず、重要で ある。これらのタンパク質が関与する異常性等は、トランスロケーション集合の 任意の状況の変更、または、ER中に不適当に保留せしめることになる、それと共 に会合したタンパク質によってもたらされるのかもしれないすべてのタンパク質 が関与する異常性を首尾よく調節する現行の療法がないことを考慮すると、これ らの異常性を治療する、新しい追加の治療薬や方法に対するニーズがあることは 明らかである。この発明はこれらのニーズを充足し、さらには、他のこれらに関 連する利益を提供する。 発明の概要 この発明は一般的にはタンパク質が関与する異常性を治療し、診断し、分泌タ ンパク質の生産を調節する方法を目指している。 一面では、この発明は、分泌タンパク質の生産を増加させるのに有効な量で、 生物学的調製物にカルネキシン（calnexin）抑制剤を添加することを含む、生物 学的調製物における分泌タンパク質の生産を増加する方法を含む。 別の面では、この発明は温血動物中における分泌タンパク質の生産を増加する ための医薬の製造において使用するための、カルネキシン会合を減少させる作用 剤を含む。 別の面では、この発明はカルネキシン会合の減少を要する、タンパク質が関与 する異常性に対し、温血動物を治療するための医薬の製造において使用するため のカルネキシンの活性を減少させる作用剤を含む組成物を含む。 別の面では、この発明はカルネキシン会合の刺激を要する、タンパク質が関与 する異常性に対して、温血動物を治療するための医薬 の製造のために使用するカルネキシンの活性を刺激する作用剤を含む組成物を含 む。 別の面では、この発明はタンパク質が関与する異常性に対し、温血動物を治療 するための医薬の製造において使用するための、接合体を小胞体に標的化する成 分に結合した作用剤を含む接合体を含む。 別の面では、この発明はレポーター基を含む、抗カルネキシン抗体を温血動物 のERに対して、カルネキシンへの結合を許容する条件と充分な時間さらし、カル ネキシンの量を検出し、そこから、タンパク質が関与する異常性の存在を決定す ることよりなる、温血動物におけるタンパク質が関与する異常性を診断する方法 を含む。 別の面では、この発明はレポーター基を含む、抗カルネキシン抗体を生物学的 調製物に対して、カルネキシンへの結合を許容する条件と充分な時間さらし、カ ルネキシンの量を検出し、そこからタンパク質が関与する異常性の存在を決定す ることよりなる、生物学的調製物におけるタンパク質が関与する異常性を判断す る方法を含む。 この発明のこれらのまたは他の面は次の詳細な説明と添付図面により明らかに なるであろう。それに加えて、いろいろな参考文献が示され、それにはより詳細 に正確な手順および／または組成物が記載されているが、それらは引用によりす べてこの明細書に組み入れられる。 図面の簡単な説明 第１図はHep G2細胞における、新しく合成されたタンパク質とカルネキシンと の会合。 第１ａ図はHep G2細胞を50μCi／mlのトランス35Ｓ−ラベルによ って30分間ラベルし、続いて溶解し、抗−α１−アンチトリプシン抗体（レーン １および２）とエンドＨによって処理し（レーン１）または処理せずに（レーン ２）、免疫沈殿した。細胞溶解物を変性（レーン３）又は非変性条件下（レーン ４）、抗−カルネキシン抗体で免疫沈殿した。非変性条件下の抗−カルネキシン 抗体による免疫沈殿後、共沈したタンパク質をタンパク質Ａ−アガロースビーズ から、SDS で溶出する。抗−α１−アンチトリプシン（レーン５）、抗−α１− アンチキモトリプシン（レーン６）、抗−トランスフェリン（レーン７）、抗− Ｃ３（レーン８）、抗−アポβ−100 （レーン９）、抗−α−フェトプロテイン （レーン10）および抗−アルブミン抗体（レーン11）を用いて、連続的な免疫沈 殿が行なわれた。直接に抗−アルブミン抗体で免疫沈殿された溶解物は、アルブ ミンの予想された移動度に一致する主バンドを示した（レーン12）。 第１ｂ図はHeP G2細胞を10μｇ／mlのツニカマイシンの存在下37℃で３時間加 温放置し、次いで10μｇ／mlのツニカマイシンの存在下（レーン２，４および６ ）、50μCi／mlのトラン35Ｓ−ラベルで、10分間ラベルした(Boehringer Mannhe im)。レーン１，３および５は、ツニカマイシン処理を受けなかった。細胞溶解 物は非変性条件下、抗−α１−アンチトリプシン（レーン１および２）、抗−ト ランスフェリン（レーン３および４）、および抗−カルネキシン（レーン５，６ ）で免疫沈殿した。 免疫沈殿物をSDS-PAGEで分析した。分子量マーカーの移動度（デューピング(d uping)EN）はゲルの左側に示した。 第２図はカルネキシンと会合したタンパク質の庶糖密度勾配分画。ツニカマイ シン処理をしない（ａ，ｃ，ｅおよびｇ）または３時間ツニカマイシン処理をし た（ｂ，ｄ，ｆおよびｈ）Hep G2細胞を 10分間放射能ラベルし、次いで、２％コレート／HBS 緩衝液で溶出した。遠心分 離後(100,000xg，20分間)、上澄みを、50mMのHepes-NaOH，PH7.5，0.2ＭのNaCl ，0.3％のコレートを含む５％−30％（Ｗ／Ｖ）庶糖密度勾配上に積載し、180,0 00xg で15時間遠心分離した。分画を、非変性条件下、抗−カルネキシン（ａお よびｂ）、抗−α１−アンチトリプシン（ｃおよびｄ）または抗−アルブミン抗 体（ｅおよびｆ）で免疫沈殿した。ｇおよびｈは抗−カルネキシン抗体により探 査された分画の免疫ブロットである。 第３図はHep G2細胞中で、カルネキシンと会合した新しく合成したタンパク質 の速度論。 第３ａ図はHep G2細胞を50μCi／mlトランス35Ｓ−ラベルによって10分間ラベ ルし、DMEM，１mMメチオニン、0.5mM メチオニン中で、表示された時間追跡した 。 第３ｂ図はパルス追跡に続いて、細胞溶解物を、抗−α１−アンチトリプシン （上枠）で免疫沈殿して、分子内輸送の動態を決定する。（下枠）、細胞溶解物 を、抗−カルネキシン抗体で免疫沈殿した後、カルネキシン会合タンパク質を溶 出し、抗−α１−アンチトリプシン抗体を用いて、第１図への説明文に記載した ように、連続的に免疫沈殿した。免疫沈殿物をエンドＨで37℃15時間、処理（左 ）または処理しなかった（右）。 第３ｃ図はパルス追跡後、細胞溶解物を非変性条件下、抗−カルネキシン抗体 で免疫沈殿した。カルネキシン会合タンパク質の溶出後、抗−α１−アンチトリ プシン（０−−０）、抗−トランスフェリン（Ｃ−−Ｃ）、抗−Ｃ3抗体（△− −△）で、連続的に免疫沈殿した。免疫沈殿物を、SDS-PAGEで分析し、次いでフ ルオログラフィで分析した。個々のタンパク質に対応するバンドの強さは、光学 密度計測（GS 350データシステム(Hoefer Scientific Instruments ）を用い、IBM PCとインターフェースで接続した、Zeinehソフトレーザー走査デ ンシトメーター）によって定量され、見い出された最大に対する会合のパーセン トで表わした。 図４図はAzc の存在下におけるカルネキシンと新しく合成したタンパク質の会 合の時間経過。Hep G2細胞を、５mMのアゼチジン−２−カルボン酸(Azc)(シグマ )ｎと共に、メチオニンのない10％の透析したFCSを含む媒体中で60分間、加温放 置し、次いで５mMのAzcの存在下、50μCi／mlトランス35Ｓ−ラベルで10分間、 パルスラベルし、薬剤の不在下で追跡した。表示された時間に、細胞を収集し、 溶解し、非変性条件下、第１図のように抗−カルネキシン抗体で免疫沈殿した。 免疫沈殿物を、８％SDS-PAGEゲル上で分析し、次いでフルオログラフィで分析す る。アルブミンの移動度は69KDa マーカーのものと一致するだろう。 第５図はカルネキシンと不完全に折りたたまれたトランスフェリンの会合。 第５ａ図はHep G2細胞を、50μCi／mlトランス35Ｓ−ラベルにより10分間パル スラベルし、表示された時間追跡した。 細胞溶解物から、抗−トランスフェリン抗体で、トランスフェリンを免疫沈殿 し、還元性の（上枠）または非還元性のゲル（下枠）上で、Lodish他J．Biol．C hem．266：14835-14838(1991年).に記載されているように分析した。 第５ｂ図はHep G2細胞を、パルスラベルし、表示された時間追跡した。細胞溶 解物全体を、抗−カルネキシン抗体で免疫沈殿した。カルネキシン会合タンパク 質を、タンパク質Ａ−アガロースビーズから、SDSで溶出し、第１図への説明文 中に記述したように、連続的に抗−トランスフェリン抗体で免疫沈殿した。トラ ンスフェリンの高次凝集体は、カルネキシンと会合しない（ａ，ｂ，下枠参照） 。それらは、鎖内ジスルフィド結合を示すものと推定され、折りたたみ中間体ま たは誤って折りたたまれた生成物としてのそれらの重要性は既知である(Kim他、 J．Cell Boil．118：541-549(1992年))。 第６図はカルネキシンの不完全に折りたたまれたグリコタンパク質に対する選 択性。 トランスロケーションのすぐあとに、グリコシル化タンパク質は、オリゴ糖ト ランスフェラーゼによって、カルネキシンに与えられ、トランスフェラーゼのと ころで、タンパク質折りたたみ酵素によって触媒作用を及ぼされ、タンパク質の 折りたたみが起ると同時にカルネキシンからのグリコタンパク質の分離が起こる （膜会合経路）。ツニカマイシン処理は、カルネキシンへの授与を妨げ、他のER 管腔シャペロンや分泌によって、タンパク質の誤った折りたたみ（misfolding） およびBi P会合または折りたたみに導びくのであろう。非−グリコシル化タンパ ク質、たとえばアルブミンは、ER内腔に直接与えられ、そこで、溶解性の内在シ ャペロンが、ER管腔タンパク質折りたたみ酵素により、それらの折りたたみを組 織するのであろう。 第７図はカルネキシンのDNA 配列。 発明の詳細な説明 この発明を明らかにする前に、まず、ここで用いられる特定の用語を定義する 方が有益であろう。 「タンパク質が関与する異常性（protein trafficking disorder）」とは、ER 中の分泌タンパク質のトランスロケーション、折りたたみまたは集合に作用する 異常性を指す。タンパク質が関与する異常性の代表的な例は家族遺伝性（famili al）高コレステロール血症 、シスチン腺維症、テイ−サックス病、先天性スクラーゼイソマルターゼ欠乏症 および若年性肺気腫を含む。 「分泌タンパク質」は、ERで処理されるすべてのＮ−結合グリコシル化タンパ ク質および折りたたまれていない（unfolded）タンパク質を指し、それにはすべ ての凝固因子、すべての血液因子、すべてのホルモンと成長因子受容体と例示と してはシスチン腺維症クロライドチャンネルを含むすべてのイオンチャンネルを 含み、ニコチンおよびムスカリンアセチルクロライド受容体がある。 「生物学的調製物（biological preparation）」は任意の動物細胞または組織 を指す。適当な調製物は例示として、Hep G2細胞、 COS細胞、293細胞、および ATT20細胞を含む。 「分子シャペロン(molecular chaperone)」は、折りたたまれていないまたは 部分的に折りたたまれた構造を安定化するか、不適当な鎖内または鎖間相互作用 の生成を防ぐか、またはタンパク質分子と相互に作用して、オリゴマー構造にお けるタンパク質−タンパク質相互作用の再配列を促進する類のタンパク質を指す 。 「カルネキシン会合」は、共有と非共有結合を含む、分泌タンパク質へのカル ネキシンの会合を指す。 この発明は、分泌タンパク質の生産を調整し、タンパク質が関与する異常性の 治療と診断のための方法と組成物を提供する。小胞体（ER）の膜経路は、品質調 整とトランスロケーション装置の両者を構成する。特に、この装置は、分泌タン パク質の機能の完全性を保証し、それらの膜を通っての輸送を調整するように作 られている。それは、４つの必須の膜タンパク質、すなわちホスホタンパク質（ pp90）、リングリコタンパク質(pgp35)および二つの非−ホスホリル化グリコタ ンパク質(gp25Hとgp25L)複合体を含む。最後の三つのタンパク質は、シグナル配 列受容体 SSRα(pgp)， SSRβ(gp25H) および非ホスホリル化グリコタンパク質(gp25L)と同定されている。ホスホタン パク質（pp90）はカルネキシンを表わす。（カルネキシン配列は第７図に明らか にされている。） 分泌タンパク質は、グリコシル化によって、管腔経路と膜経路の間に配分され ている。初期のタンパク質のグリコシル化は、膜経路へ与えるように導びかれる が、非グリコシル化タンパク質は明らかに管腔経路への道をたどる。（第６図） 。通常の状態では、いくつかのグリコタンパク質は、より速く、膜関連経路上で 折りたたまれ、ツニカマイシン処理は誤った折りたたみおよびタンパク質輸送速 度の抑制を導く。 カルネキシンは、新しく合成されたモノマー状グリコタンパク質と過渡的な状 態で選択的に会合する分子シャペロンであって、膜経路中で活性である。カルネ キシンは、グリコタンパク質および不完全に折りたたまれた分泌タンパク質と会 合する。カルネキシンからのグリコタンパク質の解離は、異った速度で起り、そ れらの折りたたみに必要な時間と関係する。 これは、ERからゴルジ体への輸送速度との大きな差をもたらし、律速段階はカ ルネキシンとの会合中にER中で費いやされる時間によって支配される。 膜経路における分るシャペロンとしてのカルネキシンは、そういうわけで、管 腔経路における分子シャペロンとしてのBiP と区別できる。（第１，２および６ 図）。その相違は、ストレス処理によって証明される。ヒートショックやツニカ マイシン処理のようなストレス状態は、BiP と基質タンパク質の相互反応を非常 に刺激する。しかしながら、その処理は基質とカルネキシンとの会合を刺激しな い。 それに加えて、BiP と会合したタンパク質会合BiP は、通常、凝 集体を生成するのに対し、カルネキシンと会合したタンパク質はそれを生成しな い。これは、庶糖勾配遠心分離により、観察される。 （第２図）。 鎖間ジスルフィド結合が欠けている、トランスフェリンの不完全に折りたたま れた中間体だけが、カルネキシンと会合される。ただし、成熟後には鎖間ジスル フィド結合した種が存在する。（第４ａ図）。 このような鎖間凝集体は、生体内で折りたたまれるタンパク質の研究中で観察 されており、特定の条件下では、BiP との会合を示すものである。このように、 カルネキシンは、BiP により認識されるものとは異なる特徴を認識する。 上述したように、この発明の一つの面は、生物学的調製物および温血動物のい ずれかにおける分泌タンパク質の生産を増加することに関する。この発明におい て開示するように、ERからの分泌タンパク質の遊離の増加は、カルネキシンの活 性の調整によって調節され得る。 どのタンパク質がカルネキシンと会合しているかを検出するために、引用によ って、この明細書に組み入れられるHarlowの「Antibodies：A Laboratory Mannu al」(Cold Spring Harbor Laboratory)(1988)に詳述されている任意のテクニッ クを用い得る。 例をあげると、適切な方法は、免疫沈殿、それに続く、ペプチドのマッピング 、タンパク質の配列決定を含む。（第１，２および３図）。簡単にいえば、細胞 をパルス追跡し、その後で抗−カルネキシン抗体を用いて、免疫沈殿することが 必要である。抗−カルネキシン抗体は、たとえば、Harlow（上述）に記載したよ うな、当業界において既知の任意のテクニックを用いて同定することができる。 特異的な相互作用の確認は、その後、SDS を用いて、共免疫沈殿 物を解離させ、分泌タンパク質特異性抗体で再沈殿することによって達成しても よい。このテクニックは、Harlowの「Antibodies：A Laboratory Mannual」(Col d Spring Harbor Laboratory)(1988)に詳述されている。しかしながら、このテ クニックを用いる時は、沈殿中に適切な洗剤を用いることが重要である。適切な 洗剤は、例示すると、相互作用を維持するためには、コレート、デオキシコレー ト、ディジトニン(digitonin)やCHAPS、相互作用を破壊するのに役立つ、強洗剤 、たとえばトリトンＸ−100 やSDS を含む。 カルネキシン会合は、また２官能剤による架橋により、証明または検出されて もよい。このテクニックは特に、MHClとＴ細胞受容体に興味をもつ者のためのも のであり、Ahluwalia の「J．Biol．Chem.」267：10914-10918（1992）；Degen の「J．Cell Biol．」112：1099-1115（1991）；Hochstenback の「Proc．Natl ．Acad．Sci． USA」89：4734-4738（1992）；Gravinの「Proc．Natl．Acad．Sc i．USA」89：8452-8456（1992）に詳述されている。 カルネキシン会合はまた、ミクロソームの小胞へのトランスロケーションと共 に試験管内のcDNAの転写と翻訳を用いて、これらの小胞中に内在するカルネキシ ンと会合するタンパク質を実験的に調査するために、証明または検出してもよい 。このテクニックは、分泌タンパク質を、それらのカルネキシンと会合するポテ ンシャルについてモニターするのに容易に用いることができる。 カルネキシンと過渡的な会合中の分泌タンパク質（すなわち、折りたたみ後、 遊離されるもの）は、たとえば、α１−アンチトリプシン、α１−アンチキモト リプシン、トランスフェリン、アポβ−100 、補体３（Ｃ３），gp80人補体会合 タンパク質およびα−プロテインを含む。ER中にカルネキシンによって保持され た、すなわち、管腔経路への遊離を遅延された、分泌タンパク質は、集合してい ないＴ−細胞受容体サブユニット、アセチルコリン受容体サブユニット、HMG Co A 還元酵素、ネズミのクラス１組織適合性タンパク質（MHC １）（β２ミクログ ロブリンとの会合の前に）およびアシアログリコタンパク質(asialoglycoprotei ns)受容体と任意の変異または誤って折りたたまれたグリコタンパク質のH2A サ ブユニットを含む。誤って折りたたまれたまたは変異グリコタンパク質はカルネ キシンによって保持され、最後にERに常在するプロテアーゼにより分解されるか 、分解のためにリソソームに輸送される。 カルネキシン会合の抑制は、分泌タンパク質の遊離速度を増加する。カルネキ シンと過渡的会合中の分泌タンパク質は膜を通ってもっと速みやかに移動される 。通常にはカルネキシンによって保持されるものは、管腔経路を通って直接に遊 離される。 カルネキシン会合は、「カルネキシン抑制剤」を用いて抑制することができ、 この発明においては、「カルネキシン抑制剤」は、カルシウムの枯渇、遺伝子操 作、カルネキシン遮断抗体およびアンタイセンス配列の挿入を含む任意の適切な 手段を用いることにより、分泌プロテインとカルネキシンの会合とを妨害または 阻止する機能を果す任意の作用剤を指す。特定の分泌問題のための適切なカルネ キシン抑制剤は、直接ライニングするか、ビオチニル化するかによってカルネキ シンを固定化し、カラムにストレプタヴィディン（streptavidin）を結合し、次 いで、これを試験管中で分泌タンパク質と相互作用させ、それにより、結合パラ メータやタンパク質の遊離のために必要な補因子を確立することを含む、いくつ かの手段の任意のものによって選ばれる。これらのテクニックは、Harlowの「An tibodies：A Laboratory Mannual」(Cold Spring Harbor Laboratory)(1988)に 詳述されている。代わりに、生物学的調製物中の、カルネキシン会合に基づく、 変化してゆく分泌タンパク質の存在は 、使用される特定のカルネキシン抑制剤の投与の前後の特定の分泌タンパク質の 免疫沈殿によって評価されてもよい。 この発明の一つの実施態様においては、カルネキシン抑制剤は、細胞質中の、 もっと好ましくは、ER中のカルシウムの枯渇により作用する。これは、バリノマ イシンもしくはノナクチンのようなイオノホアまたはベラパミル(verapamil)、 ニフェジピン（nifedipine）もしくはジルチアセム(diltiasem)のようなカルシ ウムチャンネル遮断剤を含む、任意の適切な薬剤を用いることによって達成でき る。 この発明の他の実施態様では、カルネキシン会合は、生物学的調製物または温 血動物に、たとえば、ツニカマイシン、カスタノスペルミン(castanospermine) 、ノジロマイシン（nojirromycin）、デオキシノジラマイシン（deoxy-nojirram ycin）またはスワイソニン（swaisonine）を含む適切なグリコシル化抑制剤を投 与することにより抑制される。 この発明の別の面では、カルネキシン会合は、約30℃に生物学的調製物の温度 を低下させることによって抑制される。たとえば、折りたたみとトランスロケー ションについてカルネキシンに依存するCFTR△F508の保持は温度感受性である。 細胞系の温度を30℃に低下させることは、多分、カルネキシンとの会合を変更 することによってCFTR△F508チャンネルがプラズマ膜へ達することを許容する。 このテクニックは、Pindの「J．Biol:Chem．」269：12784-12788(1994)に詳述さ れている。 この発明の別の面では、カルネキシン会合は、折りたたまれていない分泌タン パク質の結合を競争的に抑制するであろう、アゴニストまたはアンタゴニストを 導入することによって抑制される。適切な抑制剤は、例示すると、グリコタンパ ク質中に入れて、生体内で 折りたたまれていないタンパク質を生産する、アゼチジン−２−カルボン酸のよ うなアミノ酸類似物を含む。カルネキシンはこれらの類似物を認識し、それらと 会合し始めるか、それらが折りたたむことができないので、本質的に無能力であ り、連続的にそれらを遊離する。 この発明の別の面では、カルネキシンの抑制は、カルネキシンからの分泌タン パク質の解離を抑制するために、ジチオスレイトール(dithio-threitol)または ジアミドで細胞を処理することによって達成される。このテクニックはWadaの「 J．Biol．Chem.」269(10)：7464-72（1994）に詳述されている。 分泌タンパク質生産の増加は、それゆえに、カルネキシン抑制剤の方法の成功 は、用いられた特定のカルネキシン抑制剤の投与の前後で特定の分泌タンパク質 の免疫沈殿による生物学的調製物における変化する分泌タンパク質の存在を評価 することを含む、任意のいくつかのテクニックを用いることによりモニターでき る。このテクニックと他の適切なテクニックはHarlowの「Antibodies：A Labora tory Mannual」(Cold Spring Harbor Laboratory)（1988 ）に詳述されている。 この発明の他の面は、タンパク質が関与する異常性を治療する方法を含む。タ ンパク質が関与する異常性は、特定の異常性の病因に依存してカルネキシン活性 を抑制または刺激することによって治療されてもよい。 たとえば、タンパク質が関与する異常性にかかった温血動物は、その異常性が 、そうでなければ生物学的に活性なタンパク質がERの中に保持されているもので あれば、カルネキシン活性の抑制により利益を受けるであろう。このような異常 性は、Ou他、「Nature」 364：771〜776(1993)中に記載されているように、共免 疫沈殿定量 により認識される、分泌タンパク質の生産不足により同定でき、たとえば、家族 遺伝性高コレステロール血症（LDL 受容体中でクラス２の変異）、シスチン腺維 症(CFTR△F508)、テイ−サックス病、先天性スクラーゼイソマルターゼ欠乏病お よび若年性肺気腫を含む。 ERの中にカルネキシンによって保持された分泌タンパク質はそこで凝固し、分 解を受ける。これらのタンパク質は、Ou他の「Nature」364：771-776(1993)中に 記載された共免疫沈殿分析法によって同定でき、それには、たとえばアセチルコ リン受容体サブユニット、HMG CoA 還元酵素を含み、カルネキシンは、たとえば al−アンチトリプシン、LDL 受容体、ｂ−ヘキソサミニターゼ、CFTRおよびイン フルエンザハエマグルチニン（haemagglutinin）と特異的に結合し、そしてさら に具体的にはal−アンチトリプシンのヌルーホンコン変異と同様にＺ変異を含む 。CFTRの相互作用とDF508 変異タンパク質の長期の会合は説明されてきており、 この会合がER中における別な機能性チャンネルの保有の原因であるというものが １つのモデルである（Pind，「J．Biol．Chem.」269：12784-12788(1994)）。 カルネキシン活性は、前記したようにカルネキシン抑制剤を治療上有効な量で 投与することを含む、いくつかの適切な任意のテクニックにより抑制できる。治 療上有効な量は、試験管内実験、それに続く生体内研究に基づいて決定される。 カルネキシン抑制剤は、注射、点滴、経口、経直腸、経舌または経皮により投 与される。投与の方法によって化合物または分離した成分が適切な溶剤またはキ ャリアにより軟膏、クリーム、フォーム（foam）および溶液に処方され得る。 注射は、静脈注射、筋肉内注射、大脳の皮下注射または腹腔内注 射でもよい。注射または点滴のためには、化合物は溶液または懸濁液の状態であ ろう。それは生理学上適合性の溶液中に治療上有効な量で溶解または懸濁される であろう。 経口投与のためには、化合物は、カプセル、錠剤、経口懸濁液またはシロップ 状でもよい。錠剤またはカプセルは、一般的なそして以下に示す好ましい量比に 応じた適切な量を含むだろう。 カプセルは、通常のゼラチンカプセルで、三つの化合物に加えて、少量のステ アリン酸マグネシウムまたは他の賦形剤を含むだろう。 錠剤は、治療上有効な量の化合物およびゼラチン溶液、水中における殿粉ペー スト、水中におけるポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールまたは他の適 切な結合剤であってもよい結合剤を含み、典型的な砂糖コーティングがされてい るだろう。 シロップは治療上有効な量の化合物を含む。 カルネキシンの刺激により利益を受けるだろうタンパク質が関与する異常性に かかった温血動物は、Ou他の「Nature」364：771〜776(1993)で詳述されたよう に共免疫沈殿によって同定できる。そしてその病気は、たとえば、ウイルス性の がんや他のウイルス性の感染症を含むものである。機能性のウイルス粒子の集合 は、第２の通路をたどって処理されるウイルス性グリコタンパク質を必要とする 。これは、Hamond他の「Proc．Natl．Acad．Sci．USA」91 (3) ： 913〜7(1994) 中で、VSV Gタンパク質とインフルエンザHAタンパク質について、およびHIV gp1 20の場合に確認されてきている。HIV gp120はそのカルネキシンとの長い会合の ために、ER中をゆっくりと移動する。カルネキシン刺激剤は、HIV gp120の解離 を妨げ、それをER中にトラップするであろう。ウイルス粒子の生産を抑制するた めに、カルネキシン活性は、治療上有効な量のホスホリル化剤 の投与によって、刺激される。適切なホスホリル化剤は、カゼインキナーゼII， cdc 2キナーゼおよびタンパク質キナーゼＣを含む。治療上有効な量は試験管内 実験、それに続く生体内研究に基づいて決定されるだろう。 投与方法に依存して、カルネキシン刺激剤は、上記の適切な希釈剤およびキャ リアにより、適切な軟膏、クリーム、フォームの形に処方され得る。投与の方法 は、上述の概要と同様である。 この発明の明細書で用いられている「治療」という用語は、患者における症状 を減少または緩和すること、症状の悪化または進行を妨げること、原因となる作 用剤の抑制または除去、または、それにかかっていない対象における感染または 異常性を妨げることを指す。このように、たとえば、感染の治療は、感染させる 作用剤の破壊、その成長または成熟の抑制または干渉、病気によって引き起され た結果の消去およびその他同種類のものを含む。異常性は、欠乏をもたらすか、 それをもっとシビアにする欠乏を、部分的にまたは全体的に治療することによっ て「治療」される。不均衡状態の異常性は、異常性を引き起すか、それをもっと シビアにする不均衡を、部分的にまたは全体的に治療することにより「治療」さ れる。 この発明の別の面においては、ベクター構成物を温血動物または生物学的調製 物に届ける方法を提供し、ここでベクター構成物はカルネキシン、またはサイト ストリックドメインもしくはトランスドメインを欠く、カルネキシンの発現を指 示し、それによりカルネキシン抑制剤またはカルネキシン刺激剤として作用する 。 この発明の明細書で用いられる場合、「ベクター構成物」は注目の遺伝子の発 現を指示する集合を指す。ベクター構成物は、プロモーター要素と、転写時に注 目の遺伝子に作用可能に連結され、そして翻訳開始配列として働く配列を含まな ければならない。ベクター 構成物は、また、ポリアデニル化を指令するシグナル、１または複数の選択マー カー、および／または複数の制限酵素認識部位を含んでいてもよい。 カルネキシンcDNAはSambrook他の「Molecular Cloning：A Laboratory Handbo ok」（Cold Spring Harbor Press）（1989）に記載されているいくつかの方法の 任意のものを用いて、哺乳類のcDNAからクローン化された全長の、または端を切 り取って得られた、注目の遺伝子として製造されるかもしれない。この発明にお いては注目の遺伝子は、例示するなら、発現時にカルネキシンの通常の機能を崩 壊するであろう、カルネキシンをコードした遺伝子の部分からなる。このような ベクターはトランスロケーションと保持機能の両方または片方において、カルネ キシン会合を破壊するために役立つ。それは、たとえば、分泌タンパク質の会合 および折りたたみの律速段階を低下させるようにデザインされた遺伝子配列を導 入することを含む、いくつかの方法の任意のいずれかで、カルネキシン抑制剤と して機能する。このような配列は、サイトストリックドメインを欠いているもの を含むかもしれない。それは、付加的なカルネキシン配列をコードするベクター の導入によって生産を増加し、分泌タンパク質の生産速度を減少せしめることに より、カルネキシン刺激剤として機能する。 この発明のベクター構成物を、温血動物または生物学的調製物に輸送するため には、非常に多くの方法が用いられるだろう。 たとえば、この発明の一つの実施態様では、ベクター構成物はレトロウイルス 挿入され、そのレトロウイルスは直接に、温血動物または生物学的調製物に投与 されるだろう。適切なレトロウイルスベクターと方法の代表的な例は、さらに詳 細に、次の米国特許および特許出願に述べられ、引用によってそのすべてがこの 明細書に組み 入れられる。 「レトロウイルスを詰め込んだ細胞系のためのDNA 構成物」米国特許第4,871, 719 号、「アンフォトロピック(Amphotropic)およびエコトロピック(Ecotropic) ホストレインジ(Range)によるレトロウイルスの組換え」PCT 公開WO90／02806号 および「レトロウイルス詰めこみ細胞系とそれを用いる方法」PCT 公開WO89／07 150号。 ベクター構成物は、また、他の広範囲の種類のウイルスベクター、たとえば、 組換えワクチンベクター（米国特許第4,603,112 号および4,769,330 号）、組換 ポックスウイルスベクター（PCT 公開WO89／01973 号）、ポリオウイルス(Evans 他、「Nature」339：385-388，1989 、およびSabin 「J．Biol．Standardizati on」１：115-118，1973)、インフルエンザウイルス(Luytjes他、「Cell」59：11 07-1113，1989；McMichael他、「N．Eng．J．Med．」309：13-17，1983；Yap 他 、「Nature」283：238-239，1978）；アデノウイルス（Berkner 「Biotechnique s 」６：616-627，1988；Rosenfeld 他、「Science 」252：431-434，1991）； アデノ会合ウイルス(Samulski他、「J．Vir．」63：3822-3828，1989; Mendelso n他、「Virol.」166：154-165，1988)；ヘルペス(Kit「Adv．Exp．Med．Biol.」 215：219-236，1989)およびHIV（Poznansky「J．Virol．」65：532-536，1991） を含む。 さらに、ベクター構成物は温血動物または生物学的調製物に種々の物理的方法 、たとえば、リポフェクション(lipofection)（Felgner他、「Proc．Natl．Acad ．Sci．USA」84：7413-7417，1989）、直接DNA 注入(Acsadi他、「Nature」352 ：815-818，1991)、ミクロプロジェクタイルボンバードメント(microprojectile bombardment)(Williams他、「PNAS」88：2726-2730，1991)；リポソーム（Wang 他、「PNAS」84：7851-7855，1987）；CaPO4(Dubensky他「PN AS」81：7529-7533，1984)またはDNA リガンド(Wu他、「j．Biol．Chem.」264： 16985-16987，1989)によって投与されるかもしれない。 治療上の量は、試験管内実験およびそれに続く生体内研究によって決定される だろう。 さらに、この発明の別の面は、適切なカルネキシン抑制剤、カルネキシン刺激 剤、またはカルネキシン会合および分泌タンパク質生産をモニターするように作 られた任意の他の作用剤を標的化することにより、タンパク質が関与する異常性 を治療する方法に関する。この発明のこの面を説明するために、「標的化成分（ targeting moiety）」は、ジペプチドから任意のタンパク質またはタンパク質含 有化合物に至る任意のポリペプチド分子、あるいはアミノ酸を基礎にしないもの も含めて任意の機能的な同等物であって、目的とする標的部位に結合するものを 指す。この発明の好ましい実施態様においては、この方法は、ERに直接にカルシ ウム枯渇剤を輸送するのに利用される。 適切な標的化成分は、細胞表面受容体好ましくはER膜受容体に特異的に結合し 、そしてタンパク質に関係する経路に作用することができる任意の成分を含む。 適切な標的化成分は、タンパク質、ペプチドおよび非タンパク質性分子を含む。 適切な標的化成分の代表的な例は、抗体および抗体フラグメント；ボンベシン（ bombesin）、ガストリン放出ペプチド、細胞接着ペプチド、サブスタンスＰ、ノ イロメジン−Ｂ、ノイロメジン−Ｃおよびメテンケファリン(metenkephalin)の ごときペプチド類；EGF 、アルファーおよびベーターTGF 、エストラジオール、 ノイロテンシン、メラノサイト刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホル モン、人成長ホルモンを含むホルモン類；低密度リポタンパク質、トランスフェ リンおよびイ ンスリンを含む、既知細胞表面受容体のためのリガンドに相当するタンパク質； 繊維素溶解酵素を含み；そしてインターロイキン、インターフェロン、エリスロ ポイエチンおよびコロニー刺激因子を含む生物学的応答修飾剤もまたこの発明の 標的化成分を構成する。さらに、細胞表面受容体に好ましくはER膜受容体に特異 的に結合する能力を保持する上述の標的化成分の類似体も、適切な標的化成分で ある。ここで特定する標的化成分とほぼ同じ親和性を有する本質的にあらゆる類 似体は、受容体モジュレーターの合成において用いることができるであろう。 好ましい実施態様においては、標的化成分は抗体または抗体フラグメントであ る。特に好ましい抗体は、ER膜受容体に対し高特異性と、接合体のインターナリ ゼーションを触媒する能力とを有する、モノクローナル抗体を含む。適切な抗体 は、この分野で既知であり、「Cancer Treat．Res.」68：23，1993；「Leuk．Ly mp．」９：293，1993：「Anticancer Drug Des.」７：427，1992(引用によりこ の明細書に組み入れられる)中に詳述されているインターナリゼーションのため の測定法によって選択されるであろう。抗−カルネキシン抗体は、この分野でよ く知られ、またHarlow他の「Antibodies：A Laboratory Mannual」(Cold Spring Harbor Laboratory)(1988)に記載されている（引用により本明細書に組み入れ られる）方法によって生産され得る。 免疫接合体は、抗−カルネキシン抗体に、連結された少くとも１種の作用剤を 含んでなる。１つの型の作用剤の単一分子または多分子が抗体に連結されるであ ろう。代りに、１よりも多い型の作用剤が抗体に連結されるかもしれない。 標的化成分の基本的な要件は、ポリペプチドが、適用に依存して、生体内、生 体外のどちらかにおいて、所望の部位に対しての治療 薬の特異性を増加することである。このように、標的化ポリペプチドは、それら を所望の部位に対して特異的にするある種の生物学的活性を有するタンパク質を 含み得る。 適切な標的ポリペプチドは、限定されるわけではないが、受容体、ホルモン、 リンホカイン、成長因子、基質、特に表面膜受容体と結合する化合物を含む。適 切な受容体は、表面膜受容体、抗体、酵素、天然受容体、レクチンおよびその他 同種類のものを含む。特に興味深いものは免疫グロブリンとその同等物である。 標的化成分は、すみやかにラベルされ、たとえば毒素、蛍光性分子、磁性共鳴 増強剤および放射性核種を含む広い種類の分子と接合されるであろう。毒素の代 表的な例は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、ポー クウィード（pokeweed）抗ウイルスタンパク質、トリチン（tritin）、赤痢毒素 およびプサイドモナス エキソトキシンＡを含む。蛍光性分子の代表的な例は、 フルオレセイン、フイコエリスリン(phycoerythrin)、ローダミン、テキサスレ ッドおよびルシフェラーゼ（luciferase）を含む。放射能核種の代表的な例は、 Cu-64 ，Ga-67 ，Ga-68 ，Zr-89 ，Ru-97 ，Tc-99m，Rh-105，Pd-109，In-111， I-123 ，I-125 ，I-131 ，Rc-186，Re-188，Au-198，Au-199，Pb-203，Ab-211， Pb-212およびBi-212を含む。標的化成分をラベルしまたは上記した任意の化合物 または組成物と接合させる方法は、ここに提供される開示により当業者によりす ぐに達成できるだろう。「トリコセセン抗体接合体（Trichothecene Antibody C onjugate）」、米国特許第4,744,981 号；「抗体接合体」（Antibody Conjugate ）、米国特許第5,106,951号；「蛍光性物質とラベリング技術」（Fluorogenic M aterials and Labeling Techniques）、米国特許第4,018,884 号、「診断と治療 のための金属放射性核種で標識したタンパク質」(Metal Radionucl ide Labeled Proteins for Diagnosis and Therapy）、米国特許第4,897,255 号 および「改良キレート化速度論のための金属放射性核種キレート化合物」（Meta l Radionuclide Chelating Compounds for Improved Chelation Kinetics)、米 国特許第4,988,496 号をさらに参照のこと。In man他「Methods in Enzymology 」Vol.34，Affinity Techniques，Enzym Purification；Part B」，Jakoby and Wichck（eds.）「Academic Press，New York」P.30．1974を同様に参照。Wilchc k and Bayer，The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications，「 Anal．Brachem.」171；1-32，1988をさらに参照のこと。） カルネキシン抑制剤または刺激剤は、標的化成分と直接にまたは連結基を介し て結合、すなわち共有結合することができる。連結基として用いられるいろいろ の２官能性試薬は当業者に明らかである。好ましい方法は米国特許5,094,848 号 （'848特許）に記載され、引用によりこの明細書に組み入れられる。 簡単に言うと、'848特許は、分裂可能なジホスフェートまたはアミデート化ジ ホスフェート結合によって、治療剤を標的部位に対して特異的なタンパク質に結 合させ、治療薬を直接に標的部位に導びく方法を開示する。そのようにして、作 られた接合体は１以上の作用剤をERへ選択的に輸送する能力を有する。 接合体は適切な賦形剤に入れて治療上有効な量で投与される。特定の接合体の ための有効量は、試験管内の実験とそれに続く生体内研究に基づいて決定される 。投与の方法に依存し、複合体は、適切な希釈剤とキャリアと共に製剤化されて 、軟膏、クリーム、フォームおよび溶液に形成され得る。投与の方法は、上述し た概略と同様である。 この発明の別の面では、レポーター基に接合する標的化成分は、 タンパク質が関与する異常性を検出するのに用いられるだろう。温血動物または 生物学的調整物に有効量のこのような接合体（ここで作用剤は、放射能核種また は磁性的共鳴促進剤のようなレポーター基である）を投与し、レポーター基のレ ベルを検出することにより、カルネキシン活性のレベルを確かめ得る。 必要な接合体の有効量は、試験管内の実験とそれに続く生体内研究により決定 されるだろう。放射能核種を検出する段階は、典型的には、特定の放射能核種の 放射のタイプのために適切な検出機を用いる画像診断カメラで行なわれる。これ らのテクニックは、詳細にはHarlow他の「Antibodies：A Laboratory Mannual」 (Cold Spring Harbor Laboratory)(1988)に記載されており、引用によりこの細 書に組み込まれる。磁性共鳴画像診断促進剤を検出する段階はこの分野でよく知 られているものと同様である。 これらのよく知られたテクニックおよびここに開示したものを用いて、温血動 物または生物学的調整物中のカルネキシンのレベルを探査することにより、当業 者はカルネキシンのレベルを正確に測定し、タンパク質が関与する異常性または そのリスクを確認することができるだろう。 次の例は説明のためであって、限定するためのものではない。 例 例１：抗体の製造 ラビット抗体を、カルネキシンのＣ−末端すなわち555-573 残基およびカルボ キシル末端のシステイン残基に相当する合成ペプチド（多ペプチドシステム、サ ンディエゴCA）に対して生じさせた。ペプチドをサクシミジル−４−ｐ−マレイ ミドフェニルブチレート（SMPB）（Pierce）架橋剤を用いて、キーホール、リム ペット、ヘモ シアニン(Keyhole limpet hemacyanin)と接合させた。カルネキシン特異性抗体 をペプチド親和性カラムで、抗血清から精製した。Hep G2細胞を10％透析FGS を 含む、メチオニンを含まないDMEMと共に30分間前インキュベーションし、次いで メチオニンを含まない媒体中で、50μCi／ml Tran 35Ｓ−ラベル(ICN)で30分間 、ラベルした。細胞を冷PBS で２回、HBS(50mM Hepes-NaOH（PH．7.5）200mM Na Cl)で１回洗浄した。非変性免疫沈殿のために、細胞を２％ソジウムコレート、 １mM PMSF、各々５μｇ／mlのアプロチニンとロイペプチンで溶解した。細胞溶 解物を免疫前血清とパンソルビン(Pansorbin)(Calbiochem)を加えて、前もって 澄ませた。上澄液にアフィニティ精製した抗カルネキシンを２時間かけて加え、 次いでプロテインＡ−アガロース(Calibiochem)を加え（４℃）、そして４℃で １時間回転した。ビーズを 0.5％のコレートを含むHBS で３回、HBS で１回洗浄 した。非変性条件下の免疫沈殿のために、細胞を１％のSGS を含むHBS 中に溶解 し、溶解物をふっとう水中で５分間加熱し、27ゲージ針を15回通した。遠心後、 １％のトリトンＸ−100 を含む10容量倍のHBS で上澄液を希釈し、HBS 洗浄緩衝 液が１％のトリトンＸ−100 ， 0.5％のデオキシコレート(DOC)および 0.1％のS DS を含む以外は、上述したとおりに、抗カルネキシンで免疫沈殿した。連続的 な免疫沈殿の最初は、上述したように、非変性条件下に行なわれた。次いで、１ ％のSDS を含む0.2ml のHBS をプロテインＡ−アガロースビーズに加え、90℃で ３分間加熱し、その後２mlの１％のトリトンＸ−100 を含むHBS を加えた。遠心 後、上澄液は、上述したようにHep G2細胞（Calbiochem）によって分泌された特 異性抗体による、２回目の免疫沈殿に用いられた。免疫−複合体をプロテインＡ −アガロースで回収し、トリトンＸ−100 ， 0.5％のDOC および 0.1％のSDS を 含むHBS で３回洗浄した。全免疫沈殿物 を７％または８％のSDS-PAGEゲル中で分析し、次いでエンハンス(Enhance)(DuPo nt NEN)で処理した。 例２：分泌グリコタンパク質とカルネキシンとの会合 この例は分泌グリコタンパク質とカルネキシンとの会合を説明する。Ttan35Ｓ −ラベルで30分間ラベルし、次いで溶解し、α１−アンチトリプシン、α１−ア ンチトリプシンの52kDaER 型と55kDa ゴルジ型の両方、と共に加温放置すると、 Hep G2細胞はエンドＨに感受性の前者とによってのみ沈殿した。 定量により、α１−アンチトリプシンの約50％が標識期間の間にゴルジ体の末 端グリコシル化区画に達したことが明らかになった。カルネキシンの残基555-57 3(第１ａ図、レーン３)または残基487-505のいずれかに対して生じた、アフィニ ティ精製された抗体による変性条件下での細胞溶解物の免疫沈殿のみがカルネキ シンを沈殿せしめた。 しかしながら、非変性条件下でカルネキシン抗体を用いて免疫沈殿を行った時 、いくつかのタンパク質が共沈した（第１ａ図、レーン４）。主要な共沈タンパ ク質は52kDa，66kDa，74kDa，175kDa および約230kDaの移動度で移動した（カル ネキシンは90kDa で移動する）。Hep G2細胞の主要な分泌グリコタンパク質のER 型は同類の移動度に対応し、すなわち、α１−アンチトリプシン52kDa ；α１− アンチキモトリプシン52kDa ；α−フェトプロテイン66kDa；トランスフェリン7 4kDa；Ｃ3 175kDa；アポβ−100 約230kDaである。この結果から、Hep G2細胞の 主要な分泌グリコタンパク質のほとんどはカルネキシンと結合できることが予想 される。これをテストするために、我々は、図１への説明文で記載したように、 連続的な免疫沈殿の実施要綱をカルネキシン会合タンパク質を同定するように設 計した。 下記のコレート存在下の免疫沈殿では、カルネキシン会合タンパク質（第１ａ 図、レーン４）をSDS で溶出し、次いで、変性条件下、それぞれの分泌タンパク 質に対する特異性抗体で、免疫沈殿した（第１ａ図、レーン５−11）。顕著に、 α１−アンチトリプシン、α１−アンチキモトリプシン、トランスフェリン、Ｃ ３、アポβ−100 およびα−フェトプロテインはカルネキシンと共免疫沈殿する ことが分った。アルブミンはカルネキシン溶出タンパク質から免疫沈殿しなかっ たが（第１ａ図、レーン11）、抗アルブミン抗体は、明らかに全細胞溶解物から タンパク質を沈殿した（レーン12）。定量により、10分間の放射能ラベル後、25 ％の新しく合成されたα１−アンチトリプシン、30％のトランスフェリンおよび 30％のＣ３がカルネキシンと共沈したことが分かった。これらの条件下での全細 胞のカルネキシン免疫沈殿の効率は60％でしかなかったので、我々は、新しく合 成された分泌グリコタンパク質のそれぞれの少くとも50％がカルネキシンと会合 したと断定する。 しかしながら、放射能ラベルカルネキシンは、分泌グリコタンパク質に対する 抗体を用いた免疫沈殿においては検出されなかった（第１ｂ図、レーン１，３参 照）。なぜなら、カルネキシンは比較的長い半減期（ｔ1/2 ＞24時間）を有し、 短い標識期間の間に効率よく放射能ラベルされないからである。このように、こ れらの新しく合成されたグリコタンパク質はERに入り、高効率で、前もって存在 しているカルネキシンと結合する。 例３：カルネキシンの特異性 Hep G2細胞の非グリコシル化主要分泌タンパク質である、アルブミンはカルネ キシンと会合しなかったが、関連するグリコシル化タンパク質α−フェトプロテ インは会合した。これは、グリコタンパク質だけがカルネキシンと結合すること を示唆している。グリコシ ル化抑制剤、ツニカマイシンは、Ｎ結合グリコシル化のために、そのタンパク質 がカルネキシンとの会合に選ばれるかどうか評価するために用いられる。ツニカ マイシンの細胞への添加は、α１−アンチトリプシンとトランスフェリンのグリ コシル化の抑制をもたらし（第１ｂ図、レーン１，３。レーン２，４参照）、そ して、これらは、ほとんどの他のタンパク質と同様にカルネキシンと共免疫沈殿 しなかった（第１ｂ図、レーン５，６）。カルネキシンと会合する唯一のグリコ タンパク質は、カルネキシン溶出タンパク質のコンカナバリン−Ａセファローズ への吸着によっても詳明された。カルネキシンと会合する主要なポリペプチドは 、コンカナバリンＡセファローズと結合するのに対し、カルネキシン（グリコタ ンパク質でなく、それ自体）は結合しなかった。 新しく合成されたグリコタンパク質がカルネキシンと結合するかまたは、より 大きなネットワークの部分を形成するかどうか評価するために、カルネキシン会 合グリコタンパク質の沈降性を評価した。ツニカマイシンを用いまたは用いない で10分間ラベルした細胞の溶解物の庶糖密度勾配物を平衡近くまで遠心した。分 画を集め、抗−カルネキシン（第２ａ，ｂ図）、抗−α１−アンチトリプシン（ 第２ｃ，ｄ図）および抗−アルブミン抗体（第２ｄ，ｆ図）と免疫沈殿した。放 射能ラベルしたカルネキシン会合タンパク質の分布を、分画の免疫ブロット分析 によって決定されたカルネキシンのそれと比較した（第２ｇ，ｈ図）。対照細胞 （ツニカマイシン無し）においては、ほとんどのカルネキシン（第２図）は分画 ３，４（これらの分画は大部分のカルネキシンと会合した放射能ラベルしたタン パク質を含むのである）に見い出された（第２ａ図、レーン３，４）。カルネキ シンと会合したα１−アンチトリプシン（52kDa 、第２ａ，ｃ図）は、分画２， ３に見い出されたのに対し、トランスフ ェリン（74kDa 、第２ａ図）は、主として分画３，４中に、Ｃ３（ 中に見い出された。だから、カルネキシン会合した分子量の大きいグリコタンパ ク質は、分子量の小さいものから分離された。これはそれらが大きな複合体を生 成することを示し、それぞれのグリコタンパク質との個々の会合に対して予期さ れるものであった（例外がある。たとえば、我々が同定しなかった28，30，35kD a のグリコタンパク質が第２ａ図のレーン３−５に見い出された）。 分画２（第２ａ図）に見い出される新しく合成された放射能ラベルされたカル ネキシンの大部分は、免疫ブロットにより決定された場合、大部分のカルネキシ ンの沈降と一致しなかった（分画、第２ｇ図）。これは、新しく合成されたタン パク質が、放射能ラベルされていない前から存在していたカルネキシンと会合し たことを示している。ツニカマイシン処理後、ほとんどのカルネキシン会合は廃 止され、カルネキシン自体の沈降は少々影響を受け（ｇ，ｈ参照）、今や、新し く合成したカルネキシンに対応する配分を有している（ｂ，ｈ参照）。カルネキ シンと共沈した52kDa バンドの沈降（第２ａ図）は、α１−アンチトリプシンの それと一致し（第２ｃ図）、α１−アンチトリプシン自体は、タンパク質の分子 量が低いにもかかわらず、ツニカマイシン処理細胞からの溶解物の庶糖勾配中に おける増加した沈降を示した(48kDa、第２ｄ図)。対照してみると、新しく合成 されたアルブミン（カルネキシンと会合していない）は、対照（第２ｅ図）また はツニカマイシン処理細胞（第２ｆ図）と同様な沈降性を示した。だから、ERタ ンパク質の大きなネットワークがカルネキシン会合の原因ではない。 例４：エンドＨ抵抗に比較しての、新しく合成されたグリコタンパク質とカル ネキシンの会合速度論 パルス追跡研究（第３ａ図）は、新しく合成されたタンパク質とカルネキシン との過渡的な会合を説明している。しかしながら、いくつかのタンパク質は、他 よりも速みやかに、カルネキシンから分離する。連続的な免疫沈殿によって（第 １図への説明を参照のこと）、α１−アンチトリプシンのカルネキシンとの会合 (52kDa)のｔ1/2 は５分間（第２ａ図、下枠）であると決定した。トランスフェ リンはカルネキシンと約35分のｔ1/2 で会合するのに対し、Ｃ３は、アポβ−10 0 （ｔ1/2 約25分）と同じく、25分のｔ1/2 でカルネキシンと会合した。試験し たすべてのタンパク質に対して、カルネキシンへの最大の結合はパルスの直後に は現われず、２−20分の追跡後に現われた。大きなタンパク質（たとえば、Ｃ３ ，175kDa）はα１−アンチトリプシンのような小さいタンパク質よりも完結する のに時間が長くかかるので、この遅延は、初期のポリペプチド鎖（14）の翻訳を 完結するのに必要な時間によって説明できる。 エンドＨ抵抗の獲得は、分泌タンパク質のERからゴルジへの輸送にかかる時間 の測定値として用いられる。α１−アンチトリプシンはゴルジ末端グリコシル化 区画に、10分という速さで入り、約20分のｔ1/2 が認められた（第３ｂ図、上枠 ）。Ｃ３に対しては、60分、トランスフェリンに対しては30分という速さである が、エンドＨ抵抗のｔ1/2 の獲得は非常に長く、すなわち120分より大であった 。だから、これらのグリコタンパク質のカルネキシンからの解離と、エンドＨ抵 抗の獲得の間には特異のラグ期間があった。 例５：誤って折りたたまれたまたは不完全に折りたたまれたグリコタンパク質 とカルネキシンの会合 グリコタンパク質とカルネキシンの会合時間の差は、ER中でのそれらの折りた たみのための時間が異なることに関連づけて説明されるだろう。カルネキシンが それに会合しているかどうか決定するた めに、不完全に折りたたまれたタンパク質のみをテストした。二つの実験的なア プローチが続いた。最初に、プロリン類似体、アゼチジン−２−カルボン酸(Azc )のタンパク質への導入がタンパク質の折りたたみを妨げるために用いられた。 これは、以前からサイトストリックシャペロンHSP72 とタンパク質の安定な会合 を説明するために用いられたきた(Beckman他、「Science 248 」：850-854)。Az c の存在下パルスラベルし、他の類似体の不存在下、時間を変えて追跡されたHe p G2細胞中では、新しく合成したタンパク質はカルネキシンとの結合を保持して いた（第４図）。Azc で処理した細胞中のアルブミンはカルネキシンといまだ会 合しなかった。このように新しく合成されたタンパク質とカルネキシンとの会合 は、それらのグリコシル化によるが、一旦、結合した、誤って折りたたまれたグ リコタンパク質はさらに非常に遅く遊離される。 第２のアプローチは、通常のタンパク質の成熟の間に、カルネキシンは不完全 に折りたたまれたグリコタンパク質だけと会合するかどうか直接に調べた。ロー ディシュとコング(「J．Biol．Chem.」266 ：14835-14838(1991))は、Hep G2細 胞のER中で、トランスフェリン成熟の間に、不完全に折りたたまれた中間体を見 分ける条件を定義した。彼等はジスルフイド結合の再配列の間のトランスフェリ ンの移動度の差異を測定するために、非還元性ゲルを用いた（トランスフェリン 中に19のジスルフイド結合がある(Morgan他「J．Biol．Chem.」260：14739-1480 1(1985))。パルスラベル化および追跡の後、トランスフェリン免疫沈殿物は、還 元性ゲル中で、エンドＨ感受性を示す、74kDa の鋭いバンド（第５ａ図、上部） を示した。非還元性ゲル上で（第５ａ図、下部）、大部分のトランスフェリンは 追跡の初期（２−20分）には巾の広い、拡散した、一連のバンドとして移動した 。これは、トランスフェリンが不完全に折りたたま れた型を表している（Ｃ．これらの広いバンドは徐々にジスルフイド結合の均一 な種を有するトランスフェリンのER折りたたみ形に対応する、より速く移動する 、よりシャープなバンドの後を追った(Lodish他、「J．Biol．Chem.」266：1483 5-14838(1991))。定量により約50％のパルスラベルしたトランスフェリンが追跡 30分後に折りたたまれたことが明らかになった。カルネキシンと会合中であるト ランスフェリンの型は連続的な免疫沈殿により決定された。カルネキシンと会合 したトランスフェリンは、還元性ゲル上を１本の鋭いバンドとして移動するが（ 第５ｂ図、上部）、非還元性ゲル中においては（第５ｂ図、下部）、不完全に折 りたたまれたトランスフェリンを示す広いバンドのみが見られる。30分の追跡の 後ですら、カルネキシンと会合している、完全に折りたたまれたトランスフェリ ンはみつからなかった。いくつかのトランスフェリンの凝集体が、また、追跡の 時間の経過の間、認められた（第１ａ図、下部）。したがってカルネキシンは、 成熟の間、不完全に折りたたまれたトランスフェリンの中間体とだけ会合するが 、凝集した分子とは会合しなかった。 ここにこの発明の特定の実施態様を説明のために記載したが、発明の精神と範 囲から逸脱することなく、種々の変更をしてもよいことは、先の記載からして明 らかであろう。
【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年８月２１日 【補正内容】 請求の範囲 １．生体外の生物学的調製物に、分泌タンパク質の生産を増加させるのに有効 な量のカルネキシン抑制剤を投与することを含む、生体外の生物学的調製物にお ける分泌タンパク質の生産を増加させる方法。 ２．前記抑制剤がカルシウム枯渇によって作用する請求項１の方法。 ３．前記抑制剤が、サイトストリック(cytostlic)ドメインおよびトランスメ ンブランドメインをコードする配列を欠く修飾カルネキシン遺伝子を発現するこ とができるベクター構成物である請求項１の方法。 ４．抑制剤が、凝固因子、血液因子、ホルモン受容体およびイオンチャンネル からなる群より選ばれる分泌タンパク質の生産を増加させる請求項１の方法。 ５．抑制剤が、α１−アンチトリプシン、α１−アンチキモトリプシン、α− フェトプロテイン、トランスフェリン、補体３（Ｃ３）およびアポβ−100から なる群より選ばれる分泌タンパク質の生産を増加させる請求項１の方法。 ６．温血動物における分泌タンパク質の生産を増加させるための医薬の製造に おいて使用するためのカルネキシン抑制剤の使用。 ７．抑制剤がカルシウムの枯渇によって作用する請求項６の使用。 ８．抑制剤がサイトストリックドメインおよびトランスメンブランドメインを コードする配列を欠くカルネキシン遺伝子の発現を指示するベクター構成物であ る請求項６の使用。 ９．抑制剤が、凝固因子、血液因子、ホルモン受容体およびイオ ンチャンネルよりなる群より選ばれる分泌タンパク質の生産を増加させる請求項 ６の使用。 10．抑制剤が、α１−アンチトリプシン、α１−アンチキモトリプシン、α− フェトプロテイン、トランスフェリン、補体３（Ｃ３）およびアポβ−100から なる群より選ばれる分泌タンパク質の生産を増加させる請求項６の使用。 11．カルネキシン会合の減少を要するタンパク質が関与する異常性に対し、温 血動物を治療するための医薬の製造に用いるためのカルネキシンの活性を減少さ せるカルネキシン抑制剤を含有する組成物の使用。 12．カルシウム枯渇によりカルネキシンの活性を減少させる抑制剤を含有する 組成物である請求項11の使用。 13．抑制剤がサイトストリックドメインおよびトランスメンブランドメインを コードする配列を欠くカルネキシン遺伝子の発現を指示するベクター構成物であ る請求項11の使用。 14．タンパク質が関与する異常性が、シスチン腺維症、若年性肺気腫、ティ− サックス病、先天性スクラーゼイソマルターゼ欠乏症および家族遺伝性高コレス テロール血症から本質的になる群より選ばれる請求項11の使用。 15．カルネキシン会合の刺激を要するタンパク質が関与する異常性に対し、温 血動物を治療するための医薬の製造に用いるためのカルネキシンの活性を刺激す るカルネキシン抑制剤を含有する組成物の使用。 16．組成物がカルネキシンのホスホリル化によってカルネキシンの活性を刺激 する組成物である請求項15の使用。 17．抑制剤が、カルネキシン遺伝子を発現することができるベクター構成物で ある請求項15の使用。 18 タンパク質が関与する異常性に対して、温血動物を治療するための医薬の 製造に用いるための、接合体を小胞体に標的化する成分に結合したカルネキシン 抑制剤を含む接合体の使用。 19．標的化する成分が、小胞体に特異的に結合する抗体である請求項18の使用 。 20．該抑制剤が、放射性ヌクレオチド、医薬、磁性共鳴エンハンサーおよび毒 からなる群より選ばれる請求項19の使用。 21．タンパク質が関与する異常性が、シスチン腺維症、若年性肺気腫、ティー サックス病、先天性スクラーゼイソマルターゼ欠乏症および家族遺伝性高コレス テロール血症から本質的になる群より選ばれる請求項19の使用。 22．レポーター基を含有する抗カルネキシン抗体を、カルネキシンとの結合を 許容するに十分な条件下および時間、温血動物のERにさらし、カルネキシンの量 を検出し、そこからタンパク質が関与する異常性の存在を決定することを含む、 温血動物におけるタンパク質が関与する異常性を診断する方法。 23．レポーター基を含有する抗カルネキシン抗体を、カルネキシンとの結合を 許容するに十分な条件下および時間、生物学的調製物にさらし、カルネキシンの 量を検出し、そこからタンパク質が関与する異常性の存在を決定することを含む 、生体外の生物学的調製物におけるタンパク質が関与する異常性を判断する方法 。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 8415−4Ｃ Ａ６１Ｋ 43/00 ＡＥＤ Ｇ０１Ｎ 33/50 9051−4Ｃ 37/02 33/53 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ (72)発明者 バーグロン，ジョン ジェイ．エム. カナダ国，ケベック エイチ９アール ５ ブイ６，ホワント―クレール，コンプトン クレセント 22 (72)発明者 トーマス，デビッド ワイ. カナダ国，ケベック エイチ４エックス ２イー９，モントリオール ウエスト，ブ ロック アベニュ ノース 76 (72)発明者 ワダ，イクオ アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02199，ボストン，ボイルストン ストリ ート 790，アパートメント ３イー.

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的調整物に、分泌タンパク質の生産を増加するのに有効な量のカル ネキシン抑制剤を投与することを含む生物学的調製物における分泌タンパク質の 生産を増加させる方法。 ２．該抑制剤がカルシウム枯渇によって作用する請求項１の方法。 ３．該抑制剤がサイトストリック（cytostolic）ドメインおよびトランスメン ブランドメインをコードする配列を欠く、修飾カルネキシン遺伝子を発現するこ とができるベクター構成物である請求項１の方法。 ４．該抑制剤が、凝固因子、血液因子、ホルモン受容体およびイオンチャンル からなる群より選ばれる分泌タンパク質の生産を増加させる請求項１の方法。 ５．該抑制剤が、α１−アンチトリプシン、α１−アンチキモトリプシン、α −フェトプロテイン、トランスフェリン、補体３（Ｃ３）およびアポβ−100か らなる群より選ばれる分泌タンパク質の生産を増加させる請求項１の方法。 ６．温血動物における分泌タンパク質の生産を増加させるための医薬の製造に 使用するためのカルネキシン会合を減少させる作用剤。 ７．作用剤が、カルシウム枯渇によって作用する請求項６の作用剤。 ８．作用剤がサイトストリックドメインおよびトランスメンブランドメインを コードする配列を欠く、カルネキシン遺伝子の発現を指示するベクター構成物で ある請求項６の作用剤。 ９．凝固因子、血液因子、ホルモン受容体およびイオンチャンネ ルよりなる群より選ばれる分泌タンパク質の生産を増加させる作用剤である請求 項６の作用剤。 10．α１−アンチトリプシン、α１−アンチキモトリプシン、α−フェトプロ テイン、トランスフェリン、補体３（Ｃ３）およびアポβ−100よりなる群より 選ばれる分泌タンパク質の生産を増加させる作用剤である請求項６の作用剤。 11．カルネキシン会合の減少を要する、タンパク質が関与する異常性に対し、 温血動物を治療するための医薬の製造に用いるためのカルネキシンの活性を減少 させる作用剤を含む組成物。 12．組成物がカルシウム枯渇によってカルネキシン活性を減少させる作用剤を 含む請求項11の組成物。 13．作用剤がサイトストリックドメインおよびトランスメンブランドメインを コードする配列を欠く、カルネキシン遺伝子の発現を指示するベクター構成物で ある請求項11の組成物。 14．タンパク質が関与する異常性が、シスチン腺症、若年性肺気腫、テイ−サ ックス病、先天性スクラーゼイソマルターゼ欠乏症および家族遺伝性高コレステ ロール血症から本質的になる群より選ばれる請求項11の組成物。 15．カルネキシン会合の刺激を要するタンパク質が関与する異常性に対し、温 血動物を治療するための医薬の製造に用いるためのカルネキシン活性を促進する 作用剤を含む組成物。 16．組成物がカルネキシンのホスホリル化によってカルネキシン活性を刺激す る請求項15の組成物。 17．作用剤がカルネキシン遺伝子を発現できるベクター構成物である請求項15 の組成物。 18．タンパク質が関与する異常性に対し、温血動物を治療するための医薬の製 造に用いるための、接合体を小胞体に標的化する成分 に結合した作用剤を含む接合体。 19．標的化する成分が、小胞体と特異的に結合する抗体である請求項18の接合 体。 20．該作用剤が放射性ヌクレオチド、医薬、磁性共鳴エンハンサーおよび毒よ りなる群より選ばれる請求項19の接合体。 21．タンパク質が関与する異常性が、シスチン腺維症、若年性肺気腫、ティー サックス病、先天性スクラーゼイソマルターゼ欠乏症および家族遺伝性高コレス テロール血症から本質的になる群より選ばれる請求項19の接合体。 22．レポーター基を含む、抗カルネキシン抗体を、カルネキシンへの結合が可 能となるのに十分な条件下および時間、温血動物のERにさらし、カルネキシンの 量を検出し、そこからタンパク質が関与する異常性の存在を決定することを含む 、温血動物におけるタンパク質が関与する異常性を診断する方法。 23．レポーター基を含む、抗カルネキシン抗体をカルネキシンとの結合が可能 となるのに十分な条件下および時間、生物学的調製物にさらし、カルネキシンの 量を検出し、そこからタンパク質が関与する異常性の存在を決定することを含む 、生物学的調製物におけるタンパク質が関与する異常性を判断する方法。
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