JP2002528412A - 分泌通路を通る不適当に折り畳まれたタンパク質のコンダクタンス - Google Patents

分泌通路を通る不適当に折り畳まれたタンパク質のコンダクタンス

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも一部タンパク質の小胞体に関連した保持の結果である病気又は臨床症状を治療するための方法論及び作用物質を提供する。すなわち、本発明の方法及び作用物質は、小胞から通常保持されるタンパク質の放出をもたらさす。本発明は、少なくとも一部ミスアセンブルドタンパク質の小胞体に関連した保持又は分解の結果であるあらゆる病気又は臨床症状を治療するために特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、少なくとも一部タンパク質の小胞体に関連した保持の結果である病
気又は臨床症状を治療するための方法論及び作用物質を提供する。すなわち、本
発明の方法及び作用物質は、小胞から通常保持されるタンパク質の放出をもたら
さす。本発明は、少なくとも一部ミスアセンブルド（ｍｉｓ−ａｓｓｅｍｂｌｅ
ｄ）又はミスフォルディド（ｍｉｓ−ｆｏｌｄｅｄ）タンパク質の小胞体に関連
した保持又は分解の結果であるあらゆる病気又は臨床症状を治療するために特に
有用である。
【０００２】 （従来技術） 本明細書中、すべての刊行物及び特許出願を、あたかも各々の個々の刊行物又
は特許出願を具体的にかつ個々に援用するように示すのと同じ程度に援用する。
【０００３】 Ａ．導入 タンパク質折り畳み及び品質制御機関を、異常に折り畳まれたタンパク質の分
泌通路を通る不完全細胞内輸送によって引き起こされるいくつものヒト病気の分
子病原論に関係してきた。典型的な病気は、ひどいプラズマα−アンチトリプシ
ン欠損から生じる肺気腫やのう胞性繊維症膜内外コンダクタンスレギュレーター
における突然変異から生じるのう胞性繊維症を含む（Ａｍａｒａ等、Ｔｒｅｎｄ
ｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１４５−１４９；Ｌｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６９：７５１４−７５１９；Ｐｉｎｄ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
９：１２７８４−１２７８８）。本発明は、そのような病気の治療及び治癒を指
向するものである。
【０００４】 のう胞性繊維症や慢性閉塞性肺疾患の治療及び治癒を、本発明を記載しかつ説
明するための代表的な病気として選んだが、本発明の組成物及び／又は方法は、
ミスフォルディドタンパク質の不完全細胞内輸送に関係する任意の病気の治療及
び治癒に適用可能である。
【０００５】 Ｂ．のう胞性繊維症−病気、タンパク質及び遺伝子の概観 のう胞性繊維症の病気。のう胞性繊維症（ＣＦ）は、エクリン及び外分泌腺機
能の遺伝性多重システム代謝障害であり、大概幼児期の間に出現し、主に膵臓、
呼吸器系及び汗腺を冒す。ＣＦによって冒された腺は、異常に粘稠な粘液を産生
し、大概慢性呼吸感染、害された膵臓及び消化機能、並びに異常に濃厚な汗を生
じる。ＣＦは、また、Ｃｌａｒｋｅ−Ｈａｄｆｉｅｌｄ症候群とも呼ばれ、膵臓
ののう胞性病及び膵線維症である。
【０００６】 ＣＦは、生産２０００又は２５００中およそ１を冒すＣａｕｃａｓｉａｎ（
白色人種）における最も一般的な致命的な常染色体性劣性病であり、２５人中１
人は、異種接合体である（Ｂｏａｔ等、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ
Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ２６４９−２６８０（ＭｃＧｒａｗ−
Ｈｉｌｌ，１９８９））。それは、主に気道、汗腺、膵臓並びにその他の器官及
び組織における上皮細胞のクロリドイオン（Ｃｌ−）を分泌する能力に影響して
、粘液中の随伴ナトリウム及び水がひどく減少するに至る複雑な障害である。こ
れより、ＣＦにおける主要な欠損は、上皮細胞の相対的なクロリドイオン（Ｃｌ − ）不透過性である。この欠損により、気道に過度に濃い、脱水されかつ粘着性
の粘液が溜まることになり、続いてバクテリア感染、粘液詰まり及び炎症を生じ
る。その病気の臨床的発現、診断、合併症及び治療の詳細な検討については、Ｉ
ｎ Ｊ．Ｃ．Ｂｅｎｎｅｔｔ等、Ｃｅｃｉｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ ４１９−４２２（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，１９９６）
中のＲ．Ｃ．Ｂｏｎｅ等、Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓを参照。
【０００７】 ＣＦタンパク質及び遺伝子。ＣＦについての遺伝子は、７染色体の長腕上に位
置される。遺伝子、機能的タンパク質としての遺伝子の発現、及び遺伝子の突然
変異がＣＦの原因となることの確認の説明については、Ｇｒｅｇｏｒｙ等、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４７：３８２−３８６（１９９０）；Ｒｉｃｈ等、Ｎａｔｕｒｅ
３４７：３５８−３６３（１９９０）；及びＷａｔｓｏｎ等、Ｒｅｃｏｍｂｉｎ
ａｎｔ ＤＮＡ，５２５−５２９頁（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｂｏｏｋｓ，１９９２）を参照。
【０００８】 ＣＦに関連する遺伝子によってコード化されるタンパク質は、のう胞性繊維症
膜内外コンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）である。ＣＦＴＲは、所定の
上皮細胞のプラズマ膜に見出される環状のＡＭＰ依存性クロリドチャンネルであ
る。ＣＦＴＲは、２つの反復される要素であって、各々は６つの膜内外セグメン
ト及びヌクレオチド結合ドメインを含むもので造られるアミノ酸およそ１４８０
を含有する。２つの反復は、複数の潜在的なリン酸化部位をを含有する大きな極
性のいわゆるＲドメインで分離される。ＣＦＴＲは、それの予測されるドメイン
構造に基づいて、Ｐ−糖タンパク質、ウシアデニルシクラーゼ、酵母ＳＴＥ６タ
ンパク質並びに幾種もの細菌性アミノ酸輸送タンパク質のマルチ薬剤耐性を含む
関連するタンパク質のクラスの内のメンバーである（Ｒｉｏｒｄａｎ等、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４５：１０６６−１０７３（１９８９）；Ｈｙｄｅ等、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４６：３６２−３６５（１９９０））。このグループ内のタンパク質は、
分子を細胞の中に又は細胞から外に送り込む際に特徴的に関与される。
【０００９】 ＣＦの原因となる遺伝子突然変異。ＣＦについての代謝べーシスは、特定のク
ロリドチャンネルにおける突然変異性欠陥から生じる。天然産の単一のアミノ酸
突然変異は、ＣＦＴＲの第一ヌクレオチド結合折り畳みに見出された。ＣＦに関
連する遺伝子において８００を越える異なる突然変異が同定されたが、最も一般
的なのは、ＣＦＴＲの５０８位にフェニルアラニン残基の損失（ΔＦ）を生じる
３つのヌクレオチドの欠失である（Ｄａｖｉｓ等、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃ
ｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５４：１２２９−１２５６（１９９６）；Ｓｈｅ
ｐｐａｒｄ及びＷｅｌｓｈ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７９：Ｓｕｐｐｌ：Ｓ２
３−Ｓ４５（１９９９））。
【００１０】 ＣＦＴＲ突然変異体の更なる例は、ＣＦＴＲのアミノ酸５５１におけるグリン
シンに代わってアスパラギン酸が置換することになるＣＦＴＲ遺伝子における突
然変異であるＧ５５１Ｄ（米国特許第５，６０２，１１０号）、及び第一ヌクレ
オチド結合折り畳みに欠陥を持っている幾種もの天然産のＣＦＴＲ突然変異体（
ＮＦＢ１）（米国特許第５，４３４，０８６号）を含む。
【００１１】 ５０８位における突然変異体は、全ＣＦケースのおよそ９０％に寄与するが、
パーセンテージは、人種及び地理的位置によって変わる（Ｋｅｒｅｍ等、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４５：１０７３−１０８０（１９８９））。この突然変異は、ｃＡ
ＭＰに応答して上皮クロリドチャンネルの破損を生じる（Ｆｒｉｚｚｅｌ等、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３３：５５８−５６０（１９８６）；Ｗｅｌｓｈ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３２：１６４８−１６５０（１９８６）；Ｌｉ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４４：１３５３−１３５６（１９８９）；Ｑｕｉｎｔｏｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ
．３５：７２６−７３０（１９８９））。ＣＦに冒された上皮細胞は、通常ｃＡ
ＭＰを増大させる作用物質に応答して先端膜Ｃｌ- 分泌をアップ調節する（ｕｐ
−ｒｅｇｕｌａｔｅ）ことができないが、それらは細胞内Ｃａ２＋の増大に応答
してＣｌ- 分泌を増大させない。
【００１２】 容積センシチブ、カルシウム依存性及びｃＡＭＰ依存性を含む、少なくとも３
つの異なるクロリドチャンネルが上皮細胞中に見出される。正常の個人では、ク
ロリドチャンネルは上皮細胞の管腔膜上に配置される。これらの膜が開口してい
る時は、クロリドイオンが気道管腔の中に移動し、浸透勾配を生じて水を管腔の
中に吸い込む。のう胞性繊維症では、これらのクロリドチャンネルＣＦＴＲの内
の少なくとも一つの不存在又は機能障害により、ｃＡＭＰ刺激に応答してクロリ
ドを分泌することができなくなり、従って上皮膜の管腔側面上に不適当な量の水
並びに過剰のナトリウム再吸収が存在する。気道細胞において、これは、不適当
な水含量により異常な粘液分泌を引き起こし、終局的に肺感染及び上皮損傷に至
る。ＣＦ患者の汗中の異常な電解質は、おそらく汗腺管上皮のクロリド不透過性
から生じる。気道細胞において、これは、不適当な水含量により異常な粘液分泌
を引き起こし、終局的に肺感染及び上皮細胞損傷に至る。
【００１３】 生理学的に、（ΔＦ５０８）突然変異体ＣＦＴＲは、誤って折り畳まれ（ｍｉ
ｓ−ｆｏｌｄｅｄ）、それの適した第三コンフォーメーションをとることができ
ず（Ｔｈｏｍａｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７；５７２７−５７３０（
１９９２））、突然変異誘発されるミスフォルディングの結果、小胞体（ＥＲ）
中に保留され、終局的に分解の的にされる（Ｃｈｅｎｇ等、Ｃｅｌｌ ６３：８
２７−８３４（１９９０）；Ｗａｒｄ等、Ｃｅｌｌ ８３：１２２−１２７（１
９９５））。ＣＦＴＲクロリドチャンネル機能障害に至る突然変異体を、括弧内
の突然変異の頻度で処理するその他の例は、ＤＩ５０７（０．５）、Ｓ５４９Ｉ
（非常にまれ）、Ｓ５４９Ｒ（０．３）、Ａ５５９Ｔ（非常にまれ）及びＮ１３
０３Ｋ（１．８）（Ｗｅｌｓｈ等、Ｃｅｌｌ ７３：１２５１−１２５４（１９
９３））を含む。Ｐ５７４Ｈ及びＡ４５５Ｅは、更なるＣＦに関連した突然変異
体で、これらもまた誤って加工されている（ｍｉｓ−ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）（Ｏ
ｓｔｅｄｇａａｄ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１２（Ｐｔ１３）：２０９１−
２０９８（１９９９））。これらの２つの突然変異体のミスフォルディドＣＦＴ
Ｒタンパク質の５〜１０％だけが先端膜に達する。
【００１４】 ＣＦ患者の内の９８％よりも多くが、最大の生理学的成熟に達する前に、呼吸
不全か又は肺合併症のいずれかから死ぬことから、治療ゴールは、歴史的に、気
道における閉塞及び感染の合併症を予防しかつ治療し、粘液クリアランスを増進
させ、及び栄養を改善することであった。ΔＦ５０８欠損（及びＣＦＴＲにおけ
るその他の突然変異）の同定は、遺伝子治療法による野生型ＣＦＴＲ遺伝子の治
療導入並びに一層在来の薬剤治療法を含む、ＣＦについての提案された治療の急
速な発達を助成してきた。
【００１５】 Ｃ．のう胞性繊維症の現行の治療及び潜在的な治療 在来の薬剤を使用するのう胞性繊維症の治療．ＣＦについての在来の治療は、
胸理学療法（例えば、打診法及び体位変換かくたん排出法）、種々の気管支拡張
薬、栄養補給（例えば、膵臓酵素及びビタミン）、運動及びリハビリテーション
、並びに慢性低酸素血症のための長期酸素治療法を含む。分泌の品質を改善し、
それによりＣＦ患者における空気流れを改善するのに、エーロゾル化されたアミ
ロリドが投与されてきた（米国特許第４，５０１，７２９号及び同第４，８６６
，０７２号）。これらの方法は、ＣＦ患者の総括的な生存及び身体的な快適を増
大させたとはいえ、在来の薬剤及び治療方法論は、苦しめられる個人を直さず、
ＣＦに苦しめられる人は、２０代半ば又は３０代初めを越えて生きることが期待
されないのがしばしばである（上記Ｒ．Ｃ．Ｂｏｎｅ）。
【００１６】 ＤＮａｓｅ治療．ＣＦのための確認された新規な薬剤治療の一つは、ヒトＤＮ
ａｓｅ１のようなＤＮａｓｅを使用することであった、これはＣＦＴＲにおける
欠損によって引き起こされる副作用の内の一つを改善する（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３３１：６３７−６４２（１
９９４））。気管支分泌物の水含量は、おそらく分泌物粘度の決定因子であるが
、溶解された細胞からのＤＮＡは、この指数を増加させ得ると考えられる。
【００１７】 上皮細胞のＣｌ−透過度の増大．米国特許第５，３８４，１２８号は、上皮細
胞クロリド透過度増進用組成物を投与することを含む、ＣＦを治療する方法を開
示しており、該組成物は、（１）臨界ミセル濃度が約１０ｍＭよりも低くかつ親
水−親油バランス価が約１０〜２０であり、及び（２）適した疎水性ポリオール
に結合によって結合される適した疎水性有機基を有する非毒性の非イオン性界面
活性剤である。そのような組成物の例は、アルキル、アリール、アラルキル、又
は脂肪酸基のような有機グルーピングによって結合されたサッカリド；有機グル
ーピングによって結合されたポリオキシエチレン；又はアルキルポリオキシエチ
レンソルビタンを含む。好適な治療方法は、エーロゾル吸入法による。
【００１８】 遺伝子治療法を用いたのう胞性繊維症の治療法．遺伝子治療法の内のいくつも
の方法が、正常なＣＦＴＲ遺伝子をＣＦ患者の中に供するために開発されてきか
つテストされてきた。例えば、正常なＣＦＴＲ遺伝子を患者の鼻上皮細胞中に移
入すると、膜内外クロリドチャンネルの機能を改善するのが示された。これらの
結果は、正常なＣＦＴＲ遺伝子を含有するレトロウイルスベクターをエーロゾル
によって直接肺上皮に送達することが、ＣＦを緩和するのを助成することになる
という希望を起こさせた。ＣＦを「直す」ために遺伝子治療方法論を実施するこ
とは、有望な結果であるにもかかわらず、依然実験段階にあるままである。その
結果、提案された遺伝子治療法治療に代わる効能のある薬剤が、一層有効にＣＦ
を治療するために必要とされる。
【００１９】 Ｄ．慢性閉塞性肺疾患：病気、タンパク質及び遺伝子の概観 病気．慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）なる表示は、広く用いられているが、不
完全な用語である、というのは、それは異なる臨床発現、異常な所見、治療法要
件、及び予後を有するいくつもの特異的な疾患を含むからである。その用語は、
慢性気管支炎及び気腫を包含する。これらの病気のほとんどに共通なのは、末梢
の（小さい）気道の慢性的な関与であり、又は一層まれには、中央（大きい）気
道の局部閉塞による。ＣＯＰＤの包括的な概観については、Ｃｅｃｉｌ Ｔｅｘ
ｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｎｎｅｔ編；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅ
ｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）第２０版、５２：３８１−３０９（１９９６）中のＭａ
ｔｔｈａｙ等、Ｃｈｒｏｎｉｃ Ａｉｒｗａｙｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓを参照。
【００２０】 活性化された好中球によって放出されるエラスターゼは、阻害因子α−アンチ
トリプシン（ＡＡＴ）によって不活性にされ、ＡＡＴの循環レベルの減少は、Ｃ
ＯＰＤの病原に関係する現象である肺エラスチンのタンパク質分解を生じること
ができる（Ｔｒａｖｉｓ等、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：６５５
−７０９（１９８３）；Ｂｅｉｔｈ，Ｆｒｏｎｔ．Ｍａｔｒｘ Ｂｉｏｌ．６：
１−４（１９７８））。
【００２１】 α−アンチトリプシン（ＡＡＴ）タンパク質及び遺伝子．ヒトＡＡＴは、３つ
の特異的なアスパラギン残基においてグリコシリル化された３９４−アミノ酸タ
ンパク質である（Ｐｒｅｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｂａｒｒｅｔ
ｔ等編；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダム）４０３−４２０（１９８３）中Ｃ
ａｒｒｅｌｌ等；Ｌｏｎｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：４８２８−４
８３７（１９８４）；ヨシダ等、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
１９５：５９１−５９５（１９７９））。ＡＡＴは、セリンプロテイナーゼ阻害
因子上科のメンバーである（Ｈｕｂｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：
８９５１−８９６６（１９８９））。それは、折り畳まれて３つのβ−シート、
９つのα螺旋及び３つの内部塩ブリッジを含有する高度に規則正しい第三構造に
なる（Ｌｏｅｂｅｒｍａｎｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１７７：５３１−５５６
（１９８４））。
【００２２】 ＣＯＰＤの原因となる遺伝子突然変異．ヒトＡＡＴ構造遺伝子は、高度に多形
性であり、いくつもの対立遺伝子が、生合成の後のコード化されたポリペプチド
の配座成熟を排除すると予想される明瞭な突然変異を示す（Ｂｒａｎｔｌｙ等、
Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．８４：１３−３１（１９８８）；Ｓｔｅｉｎ等、Ｎａｔ．Ｓ
ｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：９６−１１３（１９９５））。折り畳んで天然の構
造配座になることができないヒトＡＡＴの遺伝子変異体は、肝細胞からの分泌不
良である（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ（Ｐ
ｕｔｎａｍ編；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）１巻：２２９−
２６４（１９７５）中のＬａｕｒｅｌｌ等；Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ
ｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ（Ｇｌａｕｍａｎｎ等；Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）１−５（１９８３）中のＰｅｔｅｒｓ等
；Ｓｉｆｅｒｓ等、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．１２：３０１−３１２（
１９９２）；Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇ
ｙ（Ａｒｉａｓ等編；Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．、ニューヨーク）第３
版、１３５７−１３６５（１９９４）中のＳｉｆｅｒｓ等）。
【００２３】 Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２０）：１３４４
６−１３４５１（１９９７））は、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇと表示されるα−アンチ
トリプシンの分泌不全変異体ヌルに関して報告している。
【００２４】 Ｅ．発明の概観 本発明は、ＥＲ−シャペロン保持機関のＵＧＧＴ又はその他の要素の阻害がミ
スフォルディド突然変異体（ΔＦ５０８）ＣＦＴＲタンパク質や突然変異体α−
アンチトリプシン（Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）のようなミスフォルディド又はミスア
センブルドタンパク質に、分解を目標とする代わりにＥＲを出させることを可能
にするという予期されない知見に基づく。ＥＲ−シャペロン保持機関のＵＧＧＴ
又はその他の要素の正常な作用を妨げることによって、ミスフォルディドタンパ
ク質がＥＲを出しかつプラズマ膜を目標とし、そこで、それらは、突然変異にも
かかわらずに、機能することができる。本発明は、グリコシルホスファチジルイ
ノシトール結合されたタンパク質の膜内外プリカーサー、低密度リポタンパク質
レセプター、乾燥甲状腺製剤プロホルモンサイログロブリン（Ｔｇ）、多数のウ
イルス感染における腫瘍に起きるようなＣｌａｓｓ Ｉ組織適合性タンパク質、
並びにＣＦＴＲ及びα−アンチトリプシンのミスフォルディング及び／又は非放
出に関係される臨床症状を含み、これらに限定しないミスフォルディドタンパク
質から直接又は間接に生じる任意の疾患又は病気を治療する又は直す際に実用的
な用途を有する。
【００２５】 現在、多くのグループがこれらのタイプの病気及び臨床症状を遺伝子治療法を
通して克服しようと試みているが、本発明のアプローチは、内因性突然変異体タ
ンパク質を救うのに化学製剤を採用する。従って、本方法は、低い形質転換多重
度、低い発現レベル、並びに必要なウイルスベクターに応答する炎症及び免疫を
含む遺伝子治療法努力に対面する現行の挑戦によって制限されることはなさそう
である。実験的遺伝子治療法に関係する最近の死は、更に代わりの治療方法につ
いての要求を示す。本発明者等のアプローチは、また、直接ＥＲ品質制御機関を
妨げることによってミスフォルディドタンパク質のＥＲ保持を損なおうと試みる
初めてのものである。
【００２６】 本明細書中に詳細に記載する通りに、本発明は、ＵＧＧＴの活性を低減させ、
それによりＥＲからミスフォルディドタンパク質及びミスアセンブルドタンパク
質が出るのを可能にする種々の組成物及び方法を包含する。そのような組成物は
、改質されたＵＧＧＴに共有結合しかつそれの触媒機能を不可逆的に抑制する化
合物を含む。オリゴヌクレオチドであって、それらの配列がＵＧＧＴコード化配
列にアンチセンスであるものに暴露すると、また、ＵＧＧＴ発現及び活性を低減
させることにもなる。最適のＵＧＧＴ活性は、高い濃度のＣａ２＋を要する。本
発明者等の研究は、また、ＥＲ Ｃａ２＋貯蔵を、カルシウムポンプ阻害因子に
よるような種々の治療を通して枯渇させることによってＵＧＧＴ活性を妨げるこ
とが、ミスフォルディドであるが機能的なΔＦ５０８ ＣＦＴＲタンパク質をＥ
Ｒから「 逃げ」させて細胞表面に達しさせることを可能にすることも立証する
。これより、本発明者等の知見は、また、ミスアセンブルド又はミスフォルディ
ド糖タンパク質のＥＲに関連する保持又は分解から生じる病気又は臨床症状を転
換する又は予防するための新規なかつ臨床的に適用可能な治療も提供する。
【００２７】 （発明の開示） 本発明は、ＥＲからのタンパク質の放出を可能にする作用物質を投与すること
を含む、任意の病気又は臨床症状を治療する方法を提供する。一層特に、本発明
は、病気又は臨床症状が、少なくとも一部ミスアセンブルド又はミスフォルディ
ドタンパク質の小胞体に関連した保持又は分解の結果であるそのような方法を提
供する。
【００２８】 発明の一実施態様では、作用物質が小胞体からのミスアセンブルド又はミスフ
ォルディドタンパク質の放出を可能にする方法を提供する。
【００２９】 発明の別の実施態様では、放出させるタンパク質が糖タンパク質である方法を
提供する。
【００３０】 本発明の方法は、のう胞性繊維症、慢性閉塞性肺疾患、発作性夜間ヘモグロビ
ン尿症、家族性高コレステロール血症、テイ−サックス病、ウイスル疾患、腫瘍
性疾患、遺伝性ミエロペルオキシダーゼ欠損症又は先天性インシュリン抵抗性の
ような病気又は臨床症状を治療するために有用である。
【００３１】 発明の一実施態様では、方法は、カルシウムポンプ阻害因子として作用する作
用物質を使用することを含む。
【００３２】 発明の別の実施態様では、方法は、ＵＤＰグルコース：糖タンパク質グリコシ
ルトランスフェラーゼの機能的活性を低減させる又は抑制する作用物質を使用す
ることを含む。
【００３３】 発明のなお別の実施態様では、方法は、小胞体Ｃａ＋＋ ＡＴＰａｓｅの活性
を低減させる又は抑制する作用物質を使用することを含む。
【００３４】 発明の更に別の実施態様では、方法は、小胞体中のＣａ＋＋の濃度を下げる作
用物質を使用することを含む。
【００３５】 発明の別の実施態様では、方法は、小胞体からＣａ＋＋の放出を引き起こす作
用物質を使用することを含む。
【００３６】 発明の更に別の実施態様では、方法は、ＩＰ３レセプター活性を低減させる又
は抑制する作用物質を使用することを含む。
【００３７】 発明のなお別の実施態様では、方法は、カルネキシン機能的活性を低減させる
又は抑制する作用物質を使用することを含む。
【００３８】 本発明の方法において有用な作用物質の例は、サプシガルギン又はその誘導体
、シクロピアゾン酸又はその誘導体、ＤＢＨＱ又はその誘導体、及びハロタン又
はその誘導体を含み、これらに限定しない。
【００３９】 本発明の方法において有用な作用物質の更なる例は、ＵＤＰグルコース：糖タ
ンパク質グリコシルトランスフェラーゼ、カルネキシン又はＣａ＋＋ ＡＴＰａ
ｓｅにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドを含み、これらに限定しない。
【００４０】 本発明は、また、作用物質を肺系に、エーロゾルを使用することによる等して
投与する方法も提供する。
【００４１】 本発明は、ＵＤＰグルコース：糖タンパク質グリコシルトランスフェラーゼの
機能的活性を低減させる又は抑制する作用物質を投与することによって細胞の小
胞体からミスフォルディド又はミスアセンブルドタンパク質を放出する方法を提
供する。
【００４２】 本発明は、また、小胞体Ｃａ＋＋ ＡＴＰａｓｅの活性を低減させる又は抑制
する作用物質を投与することによって細胞の小胞体からミスアセンブルド又はミ
スフォルディド糖タンパク質を放出する方法も提供する。
【００４３】 本発明は、また、小胞体中のＣａ＋＋の濃度を下げる作用物質を投与すること
によって細胞の小胞体からミスアセンブルド又はミスフォルディド糖タンパク質
を放出する方法も提供する。
【００４４】 本発明は、また、カルネキシン機能的活性を低減させる又は抑制する作用物質
を投与することによって細胞の小胞体からミスアセンブルド又はミスフォルディ
ド糖タンパク質を放出する方法も提供する。
【００４５】 本発明は、また、ミスアセンブルド又はミスフォルディド糖タンパク質の細胞
内保持を低減させる又は抑制する作用物質を投与することによって気道上皮細胞
の先端面のクロリドイオン透過度を増大させる方法も提供する。
【００４６】 本発明は、更に、ＵＤＰグルコース：糖タンパク質グリコシルトランスフェラ
ーゼの活性を低減させる又は抑制する作用物質を投与することによって気道上皮
細胞の先端面のクロリドイオン透過度を増大させる方法を提供する。
【００４７】 本発明は、また、小胞体Ｃａ＋＋ ＡＴＰａｓｅの活性を低減させる又は抑制
する作用物質を投与することによって気道上皮細胞の先端面のクロリドイオン透
過度を増大させる方法も提供する。
【００４８】 本発明は、更に、小胞体中のＣａ＋＋の濃度を下げる作用物質を投与すること
によって気道上皮細胞の先端面のクロリドイオン透過度を増大させる方法を提供
する。
【００４９】 本発明は、また、カルネキシン活性を低減させる又は抑制する作用物質を投与
することによって気道上皮細胞の先端面のクロリドイオン透過度を増大させる方
法も提供する。
【００５０】 本発明は、更に、ＵＤＰグルコース：糖タンパク質グリコシルトランスフェラ
ーゼの活性を低減させる又は抑制する作用物質を投与することによってのう胞性
繊維症を治療する又はのう胞性繊維症の症状を緩和する方法を提供する。
【００５１】 本発明は、また、小胞体Ｃａ＋＋ ＡＴＰａｓｅの活性を低減させる又は抑制
する作用物質を投与することによってのう胞性繊維症を治療する又はのう胞性繊
維症の症状を緩和する方法も提供する。
【００５２】 本発明は、更に、小胞体中のＣａ＋＋の濃度を下げる作用物質を投与すること
によってのう胞性繊維症を治療する又はのう胞性繊維症の症状を緩和する方法を
提供する。
【００５３】 本発明は、更に、カルネキシン機能的活性を低減させる又は抑制する作用物質
を投与することによってのう胞性繊維症を治療する又はのう胞性繊維症の症状を
緩和する方法を提供する。
【００５４】 本発明は、下記の工程： ａ）．小胞体中のミスアセンブルド又はミスフォルディドタンパク質の細胞内
保持を示す細胞を候補化合物によって治療し：及び ｂ）．小胞体からミスアセンブルド又はミスフォルディドタンパク質が放出さ
せる場所を求め、それにより候補化合物を小胞体から奇形のミスアセンブルド又
はミスフォルディドタンパク質の放出を引き起こす作用物質として識別する を含む、ミスアセンブルド又はミスフォルディドタンパク質の小胞体に関連した
保持或は分解を抑制する作用物質を識別するための候補化合物を選別する方法を
提供する。
【００５５】 本発明は、また、下記の工程： ａ）．小胞体中のミスアセンブルド又はミスフォルディドタンパク質の細胞内
保持を示す細胞を候補化合物によって治療し：及び ｂ）．小胞体からミスアセンブルド又はミスフォルディドタンパク質が放出さ
せる場所を求め、それにより候補化合物を小胞体からミスアセンブルド又はミス
フォルディドタンパク質の放出を引き起こす作用物質として識別する を含む、ＵＤＰグルコース：糖タンパク質グリコシルトランスフェラーゼの機能
的活性を抑制する作用物質を識別するための候補化合物を選別する方法も提供す
る。
【００５６】 本発明は、サプシガルギン、ＤＢＨＱ又はシクロピアゾン酸のエーロゾル配合
物を含む組成物を提供する。
【００５７】 加えて、本発明は、下記の作用物質：１）ＵＤＰグルコース：糖タンパク質グ
リコシルトランスフェラーゼの活性を低減させる又は抑制する作用物質、２）小
胞体Ｃａ＋＋ ＡＴＰａｓｅの活性を低減させる又は抑制する作用物質、３）Ｉ
Ｐ３レセプター活性を低減させる又は抑制する作用物質、及び４）カルネキシン
機能的活性を低減させる又は抑制する作用物質の内の二種又はそれ以上含む組成
物を提供する。
【００５８】 （好ましい具体例の説明） 本明細書中で用いる技術的及び科学的用語は、他の方法で定義しない場合には
、すべて本発明が属する当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を
有する。本明細書中に記載するのと同様な又は均等な方法及び物質を本発明の実
施又はテスティングにおいて使用することができるが、好適な方法及び物質を記
載する。
【００５９】 Ａ．定義 アンチセンス．本明細書中で用いる通りの「アンチセンス」なる用語は、特異
的なＤＮＡ又はＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を言う。「アンチセンス
鎖」なる用語は、「センス鎖」に相補的な核酸を言うのに用いる。アンチセンス
分子は、関心のある遺伝子を反対の配位で相補的な鎖の合成を可能にするウイル
スプロモーターに結紮することによる合成を含む任意の方法によって製造してよ
い。この転写された鎖は、一旦細胞中に導入されると、細胞によって産生される
天然の配列と組み合わさってデュプレックスを形成する。これらのデュプレック
スは、次いでそれ以上の転写又はトランスレーションのいずれかをブロックする
。このようにして、突然変異体表現型が発生され得る。「ネガティブ」なる表示
を、時にはアンチセンス鎖に関して用い、「ポジティブ」なる表示を、時にはセ
ンス鎖に関して用いる。
【００６０】 臨床症状．任意の病気に関連される任意の症候又は疾患。
【００６１】 組合せケミストリー．本明細書中で用いる通りの「組合せケミストリー」とは
、数百又は数千の化学化合物を造るのに用いる数多くの技術を言い、化学化合物
の各々は、それらの形状、電荷、及び／又は疎水性特性のような１つ又はそれ以
上の特徴が異なる。
【００６２】 病気．種々の原因から生じる細胞、体部分、器官、組織又は系の病的症状であ
り、そのような原因は、感染、遺伝的欠陥又は環境的ストレスを含み、これらに
限定しない。
【００６３】 ミスアセンブルド．本明細書中で用いる通りの「ミスアセンブルド」とは、適
当な又は機能的に成熟した第四構造を持たない又は達成することができないヘテ
ロ−又はホモ−オリゴマー性タンパク質を言う。
【００６４】 ミスフォルディド．本明細書中で用いる通りの「ミスフォルディド」とは、適
当な又は機能的に成熟した第三構造を持たない又は達成することができないタン
パク質を言う。
【００６５】 噴霧された．本明細書中で用いる通りの「噴霧された」とは、液体を微細なス
プレーに転化させることを言う。薬用スプレーは、液体の噴霧療法の一形態であ
る。
【００６６】 核酸配列．本明細書中で用いる通りの「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド
、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びそれらの断片又は部分、並びに一
本鎖でも又は二本鎖でもよく、センス又はアンチセンス鎖を表わすゲノミック又
は合成の起始のＤＮＡ又はＲＮＡを言う。同様に、本明細書中で用いる通りの「
アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド、ペプチド、又はポリペプチド、又はタン
パク質配列、及びそれらの断片又は部分、並びに天然産又は合成分子を言う。
【００６７】 ＵＧＧＴ．本明細書中で用いる通りの「ＵＧＧＴ」とは、ＵＤＰ−Ｇｌｃ：糖
タンパク質グリコシルトランスフェラーゼ（また、ＵＤＰ糖タンパク質グリコシ
ルトランスフェラーゼ及びＵＤＰグルコース：糖タンパク質グリコシルトランス
フェラーゼとしても知られている）を言う。ＵＧＧＴは、グルコースを奇形の／
不適当に折り畳まれた糖タンパク質に結合させるが、天然の糖タンパク質に結合
させないＥＲ酵素である。
【００６８】 Ｂ．環状ＡＭＰレベルの上昇．ＣＦＴＲは、上に検討した通りに、ｃＡＭＰ依
存性クロリドチャンネルである。環状ＡＭＰは、アデノシンモノホスフェートで
構成され、ホスフェート基は内部結合されて環状分子を形成する。環状ＡＭＰ（
ｃＡＭＰ）は、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）から酵素アデニルシクラ
ーゼによって発生され、原始核細胞及び真正核細胞の両方の遺伝子発現のレギュ
レーションにおいて活性である。
【００６９】 上皮細胞のｃＡＭＰレベルを増大させる又は補う組成物の投与は、Ｃｌ−コン
ダクタンスを野生型レベル近くに活性化させようと試みて用いられた（米国特許
第５，４３４，０８６号）。ｃＡＭＰレベルを増大させるための好適な化合物は
、メチルキサンチンホスホジエステラーゼ阻害因子のようなホスホジエステラー
ゼ阻害因子である。ホスホジエステラーゼ阻害因子は、ｃＡＭＰ崩壊を抑制する
ことによってｃＡＭＰレベルを増大させる。ホスホジエステラーゼ阻害因子のそ
の他の例は、アルキルキサンチンのような非特異的阻害因子及びＲｏｌｉｐｒａ
ｍ（Ｓｈｅａｒｉｎｇ ＡＧ）のようなｃＡＭＰ特異的阻害因子を含む。好適な
アルキルキサンチンは、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）や
１，３−ジメチルキサンチン（テオフィリン）のようなメチルキサンチン並びに
パパベリン、ペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｉｆｉｌｌｉｎｅ）及びカフェ
インのようなその他のキサンチンを含む。ホスホジエステラーゼ阻害因子の検討
については、Ｎｉｃｈｏｌｘｏｎ等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ １２：１９（１９９１）及びＢｅａｖｏ等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１：１５０（１９９０）を参照。
【００７０】 ΔＦ５０８ Ｃ−１２７細胞及びヒトΔＦ５０８気道上皮をカルボン酸又はブ
チレート（例えば、ナトリウムブチレート）のようなカルボキシレートで処理す
ると、ｃＡＭＰ依存性クロリドチャンネルの発生をもたらした（米国特許第５，
６７４，８９８号）。
【００７１】 また、補足のｃＡＭＰ及びその類似体又はイソプロテレノールやアルブテロー
ルのようなベータアドレナリンレセプターアゴニストもｃＡＭＰレベルを増大さ
せるのに使用することができる。
【００７２】 グアノシンモノホスフェート（ＧＭＰ）は、３’原子と５’原子との間のホス
ホジエステル結合によって環状分子となる。環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）は、 細胞
レベルで種々の代謝プロセスのレギュレーターとして、おそらくｃＡＭＰに対す
るアンタゴニストとして作用する。
【００７３】 ｃＧＭＰ抑制されたタイプＩＩＩ ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ、アデニレ
ートシクラーゼ賦活物質及びｃＡＭＰ又はｃＡＭＰ類似体について特異的な阻害
因子を投与することを含む組合せ治療法もまたＣＦを治療するために提案された
（米国特許第５，６０２，１１０号）。ｃＧＭＰ抑制されたタイプＩＩＩ ｃＡ
ＭＰホスホジエステラーゼについて特異的な阻害因子は、アムリノン、ミルリノ
ン（ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ）、アナグレリド（ａｎａｇｒｅｌｉｄｅ）、シロスタ
ミド（ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ）及びフェノキサミン（ｆｅｎｏｘａｍｉｎｅ）
を含む。アデニレートシクラーゼ賦活物質は、フォルスコリン、コレストキシン
及びベータアドレナリンレセプターアゴニストを含む。
【００７４】 Ｃ．カルシウム−ＡＴＰａｓｅ阻害因子．細胞区画内のＣａ＋＋イオンの正確
な分布が、それらの確立した機能のために真核細胞において分子シグナルとして
要求される（Ｃｈｅｅｋ，Ｔ．Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．３：１９９−２０５（１９９１）；Ｐｉｅｔｒｏｂｏｎ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１９３：５９９−６２２（１９９０））。サイトソルからＥＲ管腔
へのＡＴＰ依存性Ｃａ２＋取込みは、レセプター媒介されるＣａ２＋放出を通し
て急速なサイトソル的信号を出すための先要条件である（Ｂｅｒｒｉｇｅ，Ｍ，
Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ ３６１：３１５−３２５（１９９３））。
【００７５】 ＥＲ管腔へのＡＴＰ不可欠の（ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ）Ｃａ＋２輸送は、ＳＥＲ
ＣＡ ＡＴＰａｓｅと呼ばれるＥＲ Ｃａ＋２ ＡＴＰａｓｅの系統群によって
行われる。Ｃａ＋２−ＡＴＰａｓｅ阻害因子は、上皮細胞においてＣｌ−分泌を
改良することによってＣＦを治療する際に治療法上有用になり得る。本発明にお
いて使用するための提案されるＣａ＋＋−ＡＴＰａｓｅ阻害因子は、サプシガル
ギン、シクロピアゾン酸（ＣＰＡ）及び２，５−ジ−（t-ブチル）−１，４−ヒ
ドロキノン（ＤＢＨＱ）（Ａ．Ｃ．Ｃｈａｏ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．
９６（４）：１７９４−１８０１（１９９５）及び米国特許第５，３８４，１２
８号）を含み、これらに限定しない。サプシガルギンについては、一層詳細に下
記に記載する。ＣＰＡは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ、Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｉｓ ｆｌａｕ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌ
ｏｒから分離されるインドール誘導体である（Ｌｕｋ等、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎ
ｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１１−２１２
（１９７７）。ＤＢＨＱは、サプシガルギンか又はＣＰＡのいずれかと化学的に
関係しない市販されている非毒性の合成化合物である。
【００７６】 上記のＣｈａｏ等は、ＣＦに由来する膵上皮系統ＣＦＰＡＣ−１を使用して、
ＤＢＨＱが１２５Ｉ外向きフラックスを刺激し、細胞内の遊離Ｃａ＋２を供与量
依存様式で稼働化させることを見出した。ＣＦＰＡＣ−１細胞の単層をＤＢＨＱ
で４〜５分を用いて前処理すると、細胞ホモジェネートにおいてアセイされるＣ
ａ＋２／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ（ＣａＭＫＩＩ）のＣａ＋２ に依存しない又は自立活性を相当に増大させた。
【００７７】 Ｄ．ＥＲ Ｃａ＋２チャンネルを開く． 本発明は、また、ＥＲ Ｃａ＋２をサプシガルギンと異なる機構によって低下
させる賦活物質も包含する。
【００７８】 親水性イノシトールホスフェートであるＩＤ−ミオ−イノシトール１，３，４
−（又は１，４，５−）トリホスフェート（ＩＰ３）は、それのＩＰ３レセプタ
ー（例えば、ＩＰ３結合部位を含有するカルシウムチャンネルタンパク質）との
特異的な相互作用により、ＥＲからのＣａ＋２貯蔵の細胞内放出を誘発する。こ
れより、本発明は、また、ＩＰ３レセプターアゴニストとして作用することによ
ってＥＲ Ｃａ＋２チャンネルを開く作用物質も包含する。ＩＰ３レセプター活
性の阻害因子は、ヘパリンである（米国特許第５，８８６，０２６号及び同第５
，１７１，２１７号）。
【００７９】 細胞エキストラクト中のＩＰ３濃度の決定は、ＩＰ３結合タンパク質であるＨ ３ −標識されたＩＰ３及び未標識のＩＰ３を使用してセンシチブ競合結合テスト
によって実施することができる（米国特許第５、９４２，４９３号）。このため
のアセイキットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ（ＴＲＫ １０００）から入手可能であり
、測定は、アセイプロトコルに記載されている通りにして実施することができる
。
【００８０】 Ｅ．突然変異体ＣＦＴＲのプラズマ膜への温度依存性送達． 一層低い温度である期間成長させた３Ｔ３線維芽細胞及びＣ１２７細胞を用い
た実験は、ΔＦ５０８ ＣＦＴＲのグリコシル化パターンにおいて一層成熟した
ＣＦＴＲタンパク質の方向へのシフトを示した。正常のＣＦＴＲタンパク質は、
一層低い温度によって影響されないようである。低い温度において、Ｇｏｌｇｉ
複合体により突然変異タンパク質のフラックスの増大が存在すると仮定された。
これより、患者の肺の上皮を通常の体温よりも低い温度にある期間暴露すると、
突然変異体ＣＦＴＲを肺上皮のプラズマ膜へ動員させ、そこで成熟したＣＦＴＲ
はクロリド輸送を媒介することができることが提案された（米国特許第５，６７
４，８９８号）。一つの仮説方法は、患者の肺に、肺の付近の温度を通常の体温
よりも低くするように下げる非毒性の非免疫性作用物質を移植することを伴う。
【００８１】 Ｆ．ピュリナージックレセプター及びＣｌ−分泌 ピュリナージックレセプターは、上皮細胞においてＣｌ−分泌を調節する際に
重要な役割を果たす。イノウエ等（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．２７２（６）：４１−４６（１９９７））は、ヒト腸上皮細胞系統
Ｃａｃｏ−２をＣｌ−分泌について短絡電流を測定することによってアセイした
。研究者等は、ピュリナージックレセプターアゴニストへの応答が、１，２−ビ
ス（アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸−アセトキシ
メチルエステル、サプシガルギン又はキニーネで前処理するすることによって抑
制されることを見出した。
【００８２】 Ｇ．ＣＦ及びＵＤＰ−グルコース：糖タンパク質グリコシルトランスフェラー
ゼ 上に検討した通りに、のう胞性繊維症における主要な障害が、気道上皮の先端
表面においてクロリドチャンネルとして機能させないＣＦＴＲをコード化する遺
伝子における突然変異に関連する。最も一般的な突然変異（ΔＦ５０８）は、の
う胞性繊維症患者の６７．２％において発生し、正確に折り畳めることができず
かつそれの適した第三コンフォーメーションをとることができないＣＦＴＲタン
パク質を合成することになる。その結果として、そのタンパク質は、ＥＲの「品
質制御」機関によってＥＲ中に保持される。幾種ものその他のＣＦＴＲ突然変異
もまたミスフォルディング及びＥＲ保持を生じる。
【００８３】 発生期のα−アンチトリプシン及び発生期のＣＦＴＲは共に、ＥＲ膜のカルシ
ウム結合タンパク質であるカルネキシン（ｐ８８又はＩＰ９０とも表示される）
と一時的な会合を形成する。カルネキシンは、糖タンパク質用分子シャペロンと
して機能しかつモノグルコシル化されたオリゴ糖と相互作用するので、再グルコ
シル化が、折り畳まれていない糖タンパク質と分子シャペロンとの間でアセンブ
リーを始める（Ｈｏｍｍｏｎｄ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
．Ｓ．Ａ．９１：９１３−９１７（１９９４））。
【００８４】 ＵＧＧＴタンパク質及び遺伝子．ＵＧＧＴは、ラット肝臓ミクロソームから分
離及び精製した後に見かけモノマー性Ｍｒ１５０ｋＤａを有するのが見出された
（Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７；９２３６−９２４
０（１９９２））。ショウジョウバエから分離された可溶性の１７０ｋＤａ Ｕ
ＧＧＴは、シグナルペプチドで始まりかつ潜在的ＥＲ検索シグナルで終わる１５
４８塩基のアミノ酸配列ＨＧＥＬを有する（Ｃ．Ｇ．Ｐａｒｋｅｒ等、ＥＭＢＯ
Ｊ．１４（７）：１２９４−１３０３（１９９５））。アミノ酸配列は、推定
の膜内外ドメインを欠くのが見出された。ｇｐｔｌと表示されるＵＧＧＴについ
ての遺伝子コード化もまたＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂ
ｅにおいて同定された（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ等、ＥＭＢＯ Ｊ．１５（４）：７
０５−１３（１９９６））。この遺伝子は、アミノ酸１８のシグナルペプチドの
後にアミノ酸１４２９が続き、膜内外ドメインをもたずかつＰＤＥＬと表示され
るＣ末端のテトラペプチドを有するポリペプチドをコードする。
【００８５】 ＵＧＧＴの機能的役割．ＵＧＧＴは、ＵＤＰ−グルコースからグルコースを高
マンノース糖タンパク質にＣａ２＋イオンの存在において加え、生成するグリコ
シル化されたオリゴ糖は、処理された中間体Ｇｌｃ１Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２と
同じ構造を有する（Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：
８１０８−８１１６（１９８９））。折り畳まれていない熱変性糖タンパク質は
、対応する天然タンパク質に比べて酵素によってグリコシル化するために実質的
に一層良好な物質である。
【００８６】 適当に折り畳めることができないタンパク質は、ＥＲ中に（又はＥＲ−Ｇｏｌ
ｇｉ中間区画内に）保持され、そこでそれらはタンパク質分解的に劣化される。
ＵＧＧＴは、ＥＲにおいて糖タンパク質フォルディングの品質制御に関与される
と提案されている（上記Ｐａｒｋｅｒ等；上記Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ等；Ｍ．Ｃ．
Ｓｏｕｓａ及びＡ．Ｊ．Ｐａｒｏｄｉ，Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ
ＵＤＰ−Ｇｌｃ：Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉ
ｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４２：
６０９−６１６（１９９６）；Ｓｏｕｓａ ＭＣ及びＰａｒｏｄｉ ＡＪ．，Ｔ
ｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｍｉｓ−ｆｏｌｄｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｔｈ
ｅ ＵＤＰ−Ｇｌｃ：Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎ
ｓｆｅｒａｓｅ，ＥＭＢＯ Ｊ １４：４１９６−４２０３（１９９５））。Ｕ
ＧＧＴは、モノグルコシル化されたオリゴ糖を認識するレクチン様シャペロンと
一緒に、制御機構であって、それにより細胞だけが適当に折り畳まれた糖タンパ
ク質がＧｏｌｇｉ装置に通過するのを可能にするものに関与する（Ｌａｂｒｉｏ
ｌａ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３０（４）：７７１−９（１９９５））。
【００８７】 ＵＧＧＴとの一時的な相互作用のサイクルであって、各々は結合されたオリゴ
糖を再グリコシル化することになるものは、折り畳まれていない糖タンパク質と
カルネキシンとの間の相互作用を助成しかつ不適当に折り畳まれた糖タンパク質
をＥＲ中に細胞内保持するのを確実にすると考えられる。カルネキシンは、膜タ
ンパク質のＮ−結合された糖鎖上に暴露されるグルコース残基に結合する。
【００８８】 本発明者等は、ＥＲからミスフォルディドΔＦ５０８ ＣＦＴＲタンパク質を
放出しかつそれを膜表面に機能的に発現させることを可能にする新規な戦略を開
発した。ＣＦ気道上皮細胞をサプシガルギンで治療すると、ＥＲ肺におけるカル
シウム濃度を減少させ、電気生理学的及び免疫蛍光測定法によって示される通り
に細胞表面においてΔＦ５０８タンパク質を機能的に発現するに至る。これらの
研究で用いたサプシガルギンの供与量は、許容できると思われ、効果であって、
それの大きさが、おそらく、のう胞性繊維症患者において気道上皮機能の臨床的
に有意な向上を生じる程であるものを誘発する。
【００８９】 ＵＧＧＴは、最適な活性のためにミリモルのカルシウム濃度を要することが示
された（Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ及びＰａｒｏｄｉ、１９９２）。野生型α１アンチ
トリプシン阻害因子を発現する細胞では、サプシガルギンで治療すると、タンパ
ク質の分泌を遅らせる又は妨げる（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ等、１９９３；Ｌｏｄｉ
ｓｈ及びＫｏｎｇ、１９９０）。これは、明らかに、ＥＲ中のカルシウムレベル
が減少される時に、小胞体において新規に合成されたα１アンチトリプシンとＵ
ＧＧＴとが安定に会合することによる（Ｃｈｏｕｎｈｕｒｙ等、１９９７）。ま
た、ＥＲカルシウムを、サプシガルギン又はカルシウムイオノファを適用するこ
とによって減少させると、ＥＲから多数の野生型タンパク質が流出するのを遅ら
せかつそれらの劣化速度を増大させることも示された（Ｗｉｌｋｓｔｒｏｍ及び
Ｌｏｄｉｓｈ、１９９３；Ｓｕｄｂｅｃｋ等、１９９７；ｖａｎ Ｗｅｅｒｉｎ
ｇ等、１９９８；Ｃｌａｒｋ等、１９９４；Ｗｏｎｇ等、１９９３；Ｗｉｌｅｍ
ａｎ等、１９９１；Ｌｏｄｉｓｈ等、１９９２；Ｌｏｄｉｓｈ及びＫｏｎｇ、１
９９０）。明らかに、ＵＧＧＴ酵素にカルシウムが与えられないならば、それは
その物質（すなわち、新規に合成された糖タンパク質）にしっかり結合するが、
それらを放出することができない、と言うのはおそらく、グルコース転移工程の
好結果の完了が、放出を行うのに要求されるからである。
【００９０】 α１アンチトリプシンの場合に、何故にサプシガルギンがＥＲからのタンパク
質の流出を遅らせるに対し、ΔＦ５０８ ＣＦＴＲの場合に、ＥＲからの流出が
この薬剤によって刺激されるのか（例１〜６を参照）に関して推測するのは興味
がある。本発明者等は、適当に折り畳めることができない突然変異タンパク質を
発現する細胞では、ミスフォルディドタンパク質がＥＲ中にＵＧＧＴの滞留量を
超える大きなモル過剰を構成する量で存在すると提案する。通常の環境下では、
ミスフォルディドタンパク質はＵＧＧＴに結合し、グルコース残基の添加を受け
、急速に放出される（Ｈａｍｍｏｎｄ及びＨｅｌｅｎｉｕｓ、１９９５）。グル
コシル化されたタンパク質は、カルネキシンとの相互作用によってＥＲ中に保持
され、ＵＧＧＴの十分なプールがそれらのグルコースタグを失ったミスフォルデ
ィドタンパク質と相互作用するのに利用できる。ＥＲカルシウムに枯渇する時に
、ＵＧＧＴの各々の分子は、ミスフォルディドタンパク質と安定に複合化される
ようになり、これよりＥＲ中の残りのミスフォルディドタンパク質と相互作用す
るのに利用できない。ミスフォルディドタンパク質は、ＵＧＧＴを超える大きな
モル過剰で存在するので、過剰のミスフォルディドタンパク質は、ＵＧＧＴ媒介
される品質制御系から自由に逃げてＥＲを出る。対照して、突然変異ミスフォル
ディドタンパク質を発現しない細胞では、本発明者等は、ＵＧＧＴがその潜在的
物質を超える大きなモル過剰で存在すると仮定する。これより、ＥＲカルシウム
に枯渇する時に、ＵＧＧＴは、それらのフォルデイングを完了していない新規に
合成されたタンパク質をくるむシンクとして作用する。その結果、新規に合成さ
れたタンパク質のバルクはＥＲ中に保持される。
【００９１】 最後に、カルシウムポンプ阻害因子がＥＲからのΔＦ５０８ ＣＦＴＲタンパ
ク質の放出を行う機構を、直接ＥＲシャペロン機関のカルシウム要求に関係させ
得ないことに留意しなければならない。例えば、ＥＲ管腔からのカルシウムの枯
渇がΔＦ５０８ ＣＦＴＲタンパク質の自発的なフォルデイングを助成してそれ
に安定なコンフォメーションを獲得させかつシャペロン保持をバイパスさせるの
に十分であることが可能である。いずれの場合でも、カルシウムポンプ阻害因子
がＥＲ保持されるΔＦ５０８ ＣＦＴＲタンパク質のコホートを細胞表面に放出
し、そこでそれが適当に機能することができるのに十分であるのが明らかである
（例１〜６を参照）。
【００９２】 Ｈ．非ＣＦタンパク質放出についての用途 ＣＦに加えて、病気状態の大きくかつ増大しているリストがＥＲ中のタンパク
質保持と関連する（Ａｍａｒａ Ｊ，Ｃｈｅｎｇ Ｓ及びＳｍｉｔｈ Ａ．，Ｔ
ｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２：１４５−１４９（１９９２）；Ｂ
ｙｃｈｋｏｖａ Ｖ及びＰｔｉｔｓｙｎ Ｏ，Ｆｏｌｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒｍｅ
ｄｉａｔｅｓ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｅａ
ｓｅｓ？，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３５９：６−８（１９９５））。いくつかを下
記に挙げて簡単に検討する。
【００９３】 α１−アンチトリプシン欠乏．α１アンチトリプシンタンパク質は、肝臓で合
成されて循環中に分泌される。それは、炎症プロセスによって誘発される肺への
損傷を防ぐ働きをする。このタンパク質が存在しないと、肺瘢痕や気腫に至る。
ヒトのα１−アンチトリプシン欠乏の最も一般的な形態では、突然変異が、適当
に折り畳めることができず、その結果分泌されずにむしろ肝細胞ＥＲ中に保持さ
れるα１−アンチトリプシン分子を合成するに至る（Ｙｕ Ｍ，Ｌｅｅ Ｋ及び
Ｋｉｍ Ｊ，Ｔｈｅ Ｚ ｔｙｐｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ
ａｌｐｈａ １−ａｎｔｉｔｒｙｐａｓｉｎ ｃａｕｓｅｓ ａ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ ２：３６３−３６７（１９９５））．
【００９４】 発作性夜間ヘモグロビン尿症．赤血球では、グリコシルホスファチジルイノシ
トール（ＧＰＩ）結合されたタンパク質のインベントリは、一対のポリペプチド
であるＤｅｃａｙ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ）及びＣ
Ｄ５９を含み、これらは、赤血球が補体媒介される細胞溶解によって偶発的に損
傷されないように助ける。ＧＰＩアンカーの合成に携わるタンパク質の内の一種
は、ＰＩＧ−Ａ遺伝子（ホスファチジルイノシトールグリカン−クラスＡ）によ
ってコード化される糖トランスフェラーゼである。この遺伝子は、Ｘクロムソム
上に配置される。発作性夜間ヘモグロビン尿症では、自発的な突然変異が、赤血
球を生じる多くのプリカーサー細胞の内の丁度一つの中のＰＩＧ−Ａ遺伝子にお
いて起きる（キノシタ等、Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓ
ｉｔｏｌ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ Ｎ
ｏｃｔｕｒｎａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ
，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ４７，１−１０（１９９６））。従って、この特別
のプリカーサーから生じる赤血球のすべては、ＧＰＩ結合されたタンパク質合成
において不足している。ＧＰＩ結合されたタンパク質の膜内外プリカーサーはＥ
Ｒ中に保持されて分解される。その結果として、これらの細胞は、ＤＡＦ及びＣ
Ｄ５９発現を欠き、補体攻撃及び溶解を受けやすい。発作性夜間ヘモグロビン尿
症を有する患者は、貧血になりそうでありかつ凝固や骨髄機能の生命を脅かす疾
患を被り得る。ＥＲからＧＰＩ結合されたタンパク質の膜内外プリカーサーを遊
離させてそれらを細胞表面に移行させた治療は、この病気の症状を防ぐ又は改善
しよう。
【００９５】 家族性高コレステロール血症．家族性高コレステロール血症（ＦＨＣ）として
知られる病気は、細胞表面からリポタンパク質（ＬＤＬ）を内在化することがで
きないレセプターを合成することになる低密度ＬＤＬレセプターをコード化する
遺伝子が欠損することによって引き起こされる（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等、Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ
Ｅｍｅｅｒｇｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＬＤＬ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｙｓｔ
ｅｍ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１，１−３９（１９８５））。機
能的ＬＤＬレセプターの不存在では、細胞は外因性コレステロールを移入するこ
とができない。たとえ血清コレステロールレベルが異常に高いレベルに上昇した
としても、細胞はそれらにＬＤＬ取り込ませることを可能にする機関を欠くので
、細胞はそれの存在に気づかない。過剰のコレステロール合成は、体全体にわた
って細胞内にコレステロールに満ちた脂質滴を蓄積することになる。動脈壁を占
める円滑筋細胞内にこれらのコレステロール封入体が蓄積すると、アテローム性
プラークを産生し、これらは血管それら自体の管腔を占めて塞ぎ続け得る。ヒト
においてＦＨＣに至るＬＤＬレセプターをコード化する遺伝子における突然変異
のサブセット（クラスＩＩ突然変異）は、適当に折り畳めることができず、ＥＲ
中に保持されるＬＤＬレセプターを合成するに至る（ヤマモト等、Ｄｅｌｅｔｉ
ｏｎ ｉｎ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＬＤＬ ｒｅ
ｃｅｐｔｏｒ ｉｍｐｅｄｅｓ ｔｒａｓｎｐｏｒｔ ｔｏ ｃｅｌｌ ｓｕｒ
ｆａｃｅ ｉｎ ＷＨＨＬ ｒａｂｂｉｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１２３０
−１２３７（１９８６）；Ｈｏｂｂｓ等、Ｔｈｅ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍ
ｉａ；ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４，１３３−１７０
（１９９０））。その結果として、それらは、プラズマＬＤＬ結合されたコレス
テロールの内在化にあずかることができない。ＥＲからこれらのミスフォルディ
ドＬＤＬレセプターを遊離させてそれらを細胞表面に進行させた薬理学的治療は
、それらをコレステロール代謝において適当に機能させてアテローム性プラーク
の形成を防ごう。
【００９６】 テイ−サックス病．多数のヒトの病気は、特異的リソソームヒドロリアーゼに
おける遺伝子的欠損まで突き止められてきた（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等、Ｔｈｅ
Ｍａｎｎｏｓｅ−６−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ
Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ，Ｃｅｌｌ ５２：３２９
−３４１（１９８８））。テイ−サックス病に悩む子供は、例えば、リソソーム
酵素ヘキソサミニダーゼＡをコード化する遺伝子において同型接合の突然変異を
持っている。その結果として、それらのリソソームは、所定の特異的糖結合を含
有する物質を分解することができない。それらは分解されないので、これらの物
質は、リソソーム中に蓄積する。それらは、経時的にリソソームを満たし、細胞
形質を膨潤させ、ぎっしり詰まらせるようになる。その結果生じる細胞機能の混
乱は、多数の細胞タイプに有毒になり、終局的にこの病気の均一な致死を初めの
数年の寿命の範囲内の下に線を引く。テイ−サックス病を誘発することを示した
少なくとも一種の突然変異は、タンパク質の最後のアミノ酸２２を欠損し、それ
の適当なフォルデイングを妨げるに至る（Ｌａｕ ＭＭＨ及びＮｅｕｆｅｌｄ
ＥＦ，Ａ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎ
ｔ ｗｉｔｈ Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｃａｕｓｅｓ ｐｒｅ
ｍａｔｕｒｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｔ
ｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｓｎｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａ−ｓｕ
ｂｕｎｉｔ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ ２６４：２１３７６−２１３８０（１９８９））。突然変異タンパク
質は、ＥＲ中に保持され、リソソームにおける機能的なレジデンスのそれの部位
に移行しない。ＥＲからこのタンパク質を放出することは、この対立遺伝子を持
つ患者においてテイ−サックス病理学を防ぐことになろう。
【００９７】 腫瘍及びウイルス感染された細胞の免疫監視．免疫系が腫瘍細胞及びウイルス
感染された細胞を検出しかつ破壊するためには、これらの標的細胞は、それらの
細胞表面における腫瘍又はウイルス抗原に由来するペプチド断片をＭＨＣクラス
Ｉ分子と共に提示しなければならない。これらのペプチド断片は、外来の抗原を
プロテアソーム媒介されて消化し、続いてこれらの断片をＥＲの管腔中へＴＡＰ
媒介されて輸送し、そこで、それらはＭＨＣクラスＩ及びβ２−ミクログロブリ
ンと共にアセンブルして熟成したＭＨＣ複合体を形成することができることに由
来する。熟成したペプチド含有ＭＨＣ複合体だけがＥＲから出て細胞表面に輸送
されることができる。ＥＲの管腔内がペプチドが存在しない場合、不完全にアセ
ンブルされたＭＨＣ Ｉ−β２−ミクログロブリン複合体がカルネキシンと相互
作用することによってＥＲ中に保持される。
【００９８】 幾種ものウイルス及び腫瘍は、熟成したＭＨＣクラスＩ複合体の表面発現をブ
ロックすることによって免疫検出を回避する。単純性疱疹ウイルスは、宿主細胞
にＩＣＰ４７タンパク質を合成させ、これは直接ＴＡＰトランスポーターを阻害
する（Ｈｕｇｈｅｓ Ｅ，Ｈａｍｍｏｎｄ Ｃ及びＣｒｅｓｓｗｅｌｌ Ｐ，Ｍ
ｉｓ−ｆｏｌｄｅｄ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃ
ｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎｓ ｔｒａｓｌｏｃａ
ｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄｅｄ
ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ，ＰＮＡＳ ９４；１８９６−１９０１（
１９９７））。多数の腫瘍において、ＴＡＰトランスポーターを構成する二種の
ポリペプチドをコード化する遺伝子の発現は失われる（Ｐｏｇａｄｏｒ等、Ｎａ
ｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｋｉｌｌ ａｕｔｏｌｏｇ
ｏｕｓ β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｌａｎ
ｏｍａ ｃｅｌｌｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍ
ｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ＰＮＡＳ ９４；１３１４０−１３１４５（１９９７
））。その結果として、免疫系は、病理学的症状に適当に応答することができな
い。免疫系がウイルス感染された細胞又は変換された細胞を認識及び破壊するの
を助けるのに、カルネキシン媒介されるＥＲ保持からペプチドの存在しないＭＨ
ＣクラスＩ−β２−ミクログロブリン複合体を放出するのが望ましいであろう。
この複合体は、次いで細胞表面に移行し、そこで特異的ペプチドと会合すること
ができ、患者に注入によって投与され、その結果生じるペプチド−ＭＨＣクラス
Ｉ−β２−ミクログロブリン複合体の免疫抗原性を最大にするように選ぶことに
なろう。これより、ＥＲからミスアセンブルドタンパク質を放出する薬剤は、種
々のウイルス性及び悪性の病気の治療において効能があるのが分かるであろう。
【００９９】 遺伝性ミエロペルオキシダーゼ欠損症．食細胞、特に好中球は、刺激に対して
どっと酸素を消費して応答する。消費される酸素は、ミエロパーオキシダーゼ（
ＭＰＯ）（好中球から放出される）によって過酸化水素に転化され、非常に種々
の物質を酸化することができ、その結果、重要な抗菌性を有する複合体が形成さ
れる（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ａｓ
ｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ，１１１（５）：３８３−３８９，１９９
９）。
【０１００】 小胞体では、ＭＰＯプリカーサーは、一時的に、カルレティクリン及びカルネ
キシン（おそらく分子シャプロロンとして）と相互作用する。ＭＰＯ欠損は、比
較的一般的な疾患であり、突然変異プリカーサーが小胞体中にカルネキシンへの
持続性結合によって保持される所で、育種ものミスセンス突然変異が同定されて
きた。ミスフォルディドタンパク質は、終局的に分解される（Ｎａｕｓｅｅｆ，
Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒ
ｅｔｉｃｕｌｕｍ：Ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｍｙｅ
ｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍ
ｅｄ．，１３４（３）２１５−２２１（１９９９））。ここで同様に、タンパク
質（タンパク質の熟成形態？）を細胞表面に達しさせるであろう治療は、ＭＰＯ
欠損に悩む個人に抗菌性の食細胞性機能を回復させることになろう。
【０１０１】 先天性インシュリン抵抗性．インシュリンレセプターのホルモン結合部位が、
タンパク質の細胞外領域に含有される。タイプＡのこの形態（糖尿病？インシュ
リン抵抗性？）では、ベータ−シート中にかつホルモン結合領域に配置される残
基の置換突然変異は、タンパク質の細胞内フォルディング及び運動を完全に分断
し、不正確な細胞位置に異常保持を生じる。
【０１０２】 ミスフォルディドレセプターは、小胞体内のカルネキシン分子に、それらが分
解されるまで結合されたままである（Ｒｏｕｎａｒｄ等、Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ
Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ
ａ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｃｏｎ
ｓｅｒｖｅｄ Ｂｅｔａ−Ｓｈｅｅｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ Ｌ１ Ｄｏｍａｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７４（２６）
：１８４８７−１８４９１（１９９９））。
【０１０３】 他の病気に関連して前に検討した通りに、突然変異レセプターの放出及び細胞
輸出をもたらす治療は、普及した治療的使用を有することができよう。
【０１０４】 Ｉ．サプシガルギン 一般的な記述．サプシガルギン及び関連するセスキテルペンラクトンは、すべ
ての哺乳動物細胞のＥＲ中に存在するＳＥＲＣＡ ＡＴＰａｓｅ、すなわちＣａ ＋２ −ポンピングＡＴＰａｓｅの系統群を選択的に阻害するのが知られている、
サブナノモル効力を有する、天然産の化合物である（Ｌｙｔｔｏｎ等，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７０６７−１７０７１（１９９１））。これらの阻
害因子は、血漿膜のＣａ＋２−ＡＴＰａｓｅ又はその他のＰ−タイプＡＴＰａｓ
ｅに対して作用を与えない。このクラスの阻害因子のメンバーは、サプシガルギ
ン及びサプシガルギシン（これらは共にＴｈａｐｓｉａ ｇａｒｇａｎｉｃａか
ら分離される）、Ｔｈａｐｓｉａ ｖｉｌｌｏｓａから分離されるサプシビロシ
ンＡ（ＴｖＡ）、Ｌａｓｅｒ ｔｒｉｌｏｂｕｍから抽出されるトリロボリド（
ｔｒｉｌｏｂｏｌｉｄｅ）を含む（Ｗｉｃｔｏｍｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３
１０：８５９−８６８（１９９５））。
【０１０５】 機能的な役割．サプシガルギンは、部分反応（例えば、Ｃａ＋２結合、Ｐｉに
よるＣａ＋２に依存しないホスホリル化、ヌクレオチド結合）の内のいくらかが
ブロックされるポンプの配座状態を誘発するようである（Ｉｎｅｓｉ等、Ａｒｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９８：３１３−３１７（１９９２））
。一連のサプシガルギン類似物を利用した研究は、化合物が、ＡＴＰａｓｅの疎
水性膜内外領域を必要とする立体的に差別する裂に適合することを示した（Ｃｈ
ｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ ３３５（３）：３４５−３４８（１
９９３））。
【０１０６】 Ｃｌａｒｋ等（Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１２（５）：６０１−６１１（１
９９４）は、「カルシウム動態化剤サプシガルギン及び２，５−ジ−（ｔ−ブチ
ル）−１，４−ベンゾヒドロキノンは、鶏胚軟骨細胞を投与量依存様式で細胞内
カルシウム濃度を著しく高めるのが示される」ことを報告した。二種の化合物が
、コラーゲン及びプロテオグリカンを含む、軟骨細胞タンパク質の分泌に及ぼす
観測される作用は、ＥＲ内に封鎖されるカルシウムの特異的欠損によると推測さ
れた。
【０１０７】 サプシガルギン処理されたＣＦＰＡＣ−１細胞にＣａ＋２２ｍモル／リットル
を加えると、Ｃｌ−及びＫ＋電流の持続した増大を生じ、これは、Ｃａ＋２を除
くことによって逆転された（Ｇａｌｉｅｔｔａ等、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ
．４２６（６）：５３４−５４１（１９９４））。研究者等は、「ＣＦＰＡＣ−
１細胞が、ヌクレオチドレセプター活性化に、Ｃａ＋２依存性Ｃｌ−及びＫ＋電
流を刺激する細胞内Ｃａ＋２濃度を一時的に増大して応答する」と結論付けた。
【０１０８】 サプシガルギンに長期に暴露すると、ＣＦＴＲの機能的発現を増大することに
なることは自明でないであろうことに留意すべきである。例えば、ＣＦＴＲ遺伝
子発現のダウンレギュレーションは、ＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞を下記に暴露し
た後の他によって観測された：（１）細胞内二価カチオン濃度を増大させる作用
物質（例えば、二価カチオンイオノファＡ２３１８７及びイオノマイシン（ｉｏ
ｎｏｍｙｃｉｎのような作用物質）；（２）サプシガルギン；及び（３）Ｃａ＋ ２ 又はＭｇ＋２を増大した細胞外濃度で含有する増殖培地（Ｂａｒｇｏｎ等、Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２（４）：１８７２−１８７８（１９９２））。
これらの研究者等は、サプシガルギンが二価カチオン濃度を一層高い細胞内レベ
ルで生じる「細胞内貯蔵からＣａ＋２を放出する作用物質」であると述べた。著
者等は、上皮細胞におけるＣａ＋２依存性Ｃｌ−チャンネル及び環状ＡＭＰ依存
性ＣＦＴＲに関連するＣｌ−チャンネルの独立性にもかかわらずに、細胞内二価
カチオン濃度の増大は、ＣＦＴＲ遺伝子の発現を転写レベルでダウンレギュレー
トし、その結果ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ及びタンパク質が減少する。」と結論付けた
。
【０１０９】 ＢＡＬＢ／Ｕｒｄマウスからの腫瘍分泌をイオノマイシン又はサプシガルギン
に暴露すると、１２５Ｉ、３６Ｃｌ及び８６Ｒｂを付随する外向きフラックスで
生じた（Ｂｏｓａｖａｐｐａら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｇｙ １０４（６）
１７９６−１８０５（１９９３））。
【０１１０】 Ｊ．組み換えＤＮＡ 上記した通りの又は下記の例において検討通りの本発明に従えば、在来の分子
生物学、微生物学及び組み換えＤＮＡ技術を用いてよい。そのような技術は、文
献に十分に説明されている。例えば、いくつか名前を挙げると、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ニューヨーク，１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１及び２巻（Ｄ．Ｎ
．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ等、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒ
ｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ等編、１９
８４）；Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ等、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ニューヨーク、１９８８）；Ｒｏｅ等、Ｄ
ＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａ
ｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨー
ク、１９９６）及びＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏ．ニューヨーク、１９９５）。
【０１１１】 のう胞性繊維症を治療することに関する組み換え手順については、例えば米国
特許第５，６０２，１１０号、同第５，６７４，８９８号及び同第５，７０７，
８５５号を参照。
【０１１２】 Ｋ．アンチセンスＲＮＡ アンチセンス分子は、指定されたｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を持つ
ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ分子である。実験室で調製されたアンチセンス分子が、
研究中の遺伝子によって転写された正常のｍＲＮＡを含有する細胞中に注入され
る時に、アンチセンス分子は、ｍＲＮＡと塩基対になり、ｍＲＮＡのタンパク質
中へのトランスレーションを防ぐことができる。その結果生じる二本鎖ＲＮＡ又
はＲＮＡ／ＤＮＡは、そのような分子に特異的に結合する酵素によって消化され
る。従って、ｍＲＮＡの欠損が起き、遺伝子生成物のトランスレーションをブロ
ックし、それでアンチセンス分子は、有害なタンパク質の生成をブロックするた
めの薬における使用を見出す。アンチセンスＲＮＡを製造及び利用する方法は、
当業者に良く知られている（例えば、Ｃ．Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ及びＷ．Ｎ
ｅｌｌｅｎ（編集者）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐ
ｒｅｓｓ（１９９７年１２月）；Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ及びＳ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ
、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍａｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ
，１３１巻）、Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ（１９９８年４月）；Ｉ．Ｇｉｂｏ
ｓｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇ
ｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌ
ｌ（１９９７年６月）；Ｊ．Ｎ．Ｍ．Ｍｏｌ及びＡ．Ｒ．Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｋｒ
ｏ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；Ｂ．Ｗｅｉｓｓ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌ
ｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮ
Ａ：Ｎｏｖｅｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９７年６月）；Ｓｔａｎｌｅ
ｙ等、、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３年６月）；Ｃ．Ａ．Ｓｔｅｉｎ及びＡ．Ｍ
．Ｋｒｉｅｇ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ（１９９８年４月）を参照）。
【０１１３】 発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、核酸分子を合成するために当分野
で知られている任意の方法によって調製してよい。これらは、固相ホスホロアミ
ダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術を含む。代
わりに、ＲＮＡ分子を、ＵＧＧＴをコード化するＤＮＡ配列をインビトロ及びイ
ンビボ転写することによって発生させてもよい。そのようなＤＮＡ配列を、Ｔ７
又はＳＰ６のような適したＲＮＡポリメラーゼプロモーターによって広範囲のベ
クターの中に組み込んでよい。代わりに、アンチセンスＲＮＡを構成的に又は誘
導的に合成するこれらのｃＤＮＡ構成体を細胞系統、細胞又は組織の中に導入す
ることができる。
【０１１４】 ＲＮＡ分子は、細胞内安定性及び半減期を増大させるために改質してよい。可
能な改質は、分子の５’及び／又は３’末端にフランキング配列を加える或は分
子の主鎖内のホスホジエステラーゼ結合よりもむしろホスホロチオエート又は２
’Ｏ−メチルを使用することを含み、これらに限定しない。この概念は、内因性
エンドヌクレアーゼによって容易に認識されない通りのイノシン、キューオシン
やウイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）、並びにアデニン、シチジン、グアニ
ン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−及び同様に改質され
た形態のような非在来の塩基を入れることによって拡大することができる。
【０１１５】 Ｌ．高処理量スクリーニング 高処理量スクリーニングの能力は、ＥＲからミスフォルディドタンパク質又は
不完全にアセンブルされたタンパク質を動態化することができ、こうしてそれら
の表面送達を可能にする新規な化合物（サプシガルギンに加えて）についての調
査に利用される。下記のプロトコルを、特許請求の範囲に記載する発明を実施す
るのに有用な多数の化合物の急速な自動スクリーニングを可能にするようにデザ
インする。サプシガルギンが、高処理量スクリーニングアセイにおいてテストさ
れる際に確実な結果を生じるという立証は、正の制御として作用しよう。高処理
量スクリーニングに関しての一般的な情報については、例えばＣｏｓｔ−Ｅｆｆ
ｅｃｔｉｖｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ａｎｄ
Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎ
ｇ，ＩＢＣＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＢＣ
Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓ（１９９６年２月）；
Ｊｏｈｎ Ｐ．Ｄｅｖｌｉｎ（編集者）、Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓ
ｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｍａｒｃｅｌ Ｋｅｄｄｅｒ（１９９８）；米国特許第５，
７６３，２６３号を参照。
【０１１６】 ＣＴＬ媒介される細胞溶解．細胞障害性Ｔ細胞は、それらの標的を、標的細胞
表面上で発現される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質と
相互作用することによって認識する。ＭＨＣクラスＩは、ＭＨＣクラスＩ重鎖（
膜内外タンパク質）及びβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）で構成される複合体
である。ＭＨＣクラスＩ重鎖は、それらの合成後にＥＲ中にある間にβ２ｍとア
センブルする。各々のＭＨＣクラスＩ重鎖は、またプロテアソームによって触媒
されるサイトソル性タンパク質分解によって産生されかつ抗原処理に関連するＡ
ＴＰ欠乏性トランスポーター（ＴＡＰ）によってＥＲの管腔中に輸送されるペプ
チドにも結合する。完全なＭＨＣクラスＩ重鎖−β２ｍ−ペプチド複合体は、十
分にアセンブルされた後に、ＥＲを出て細胞表面に送達されることができなけれ
ばならない。β２ｍ又はペプチドが存在しない場合では、ＭＨＣクラスＩはＥＲ
中に保持されてＴ細胞によって認識するために利用可能でない。
【０１１７】 主要組織適合遺伝子複合体に関しての一般的な情報については、例えばＳｒｉ
ｖａｓｔａｖａ等、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ
Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｖｃｈ Ｐｕｂ．
（１９９１年３月）；Ｂ．Ｐｅｒｎｉｓ及びＨ．Ｊ．Ｖｏｇｅｌ，Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉ
ｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９５年１０月）；
Ｔ．Ｗ．Ｍａｋ及びＪ．Ｓｉｍａｒｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｇｅｎｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．（１９９
８年２月）；Ｒ．Ｅ．Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ及びＳ．Ｋ．Ｐｉｅｒｃｅ，Ａｎｔｉ
ｇｅｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９４年８月）；Ｊ．Ｋｌｅｉｎ及びＤ．Ｋｌｅｉｎ
，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｈｉ
ｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＮＡＴＯ Ａｓｉ Ｓｅ
ｒｉｅｓ，Ｓｅｒｉｅｓ Ｈ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５９巻、Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９２年１月）；Ｌ．Ｂ．Ｓｃｈｏｏｋ及びＳ．Ｊ．
Ｌａｍｏｎｔ，Ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ
Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｍｅｓｔｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｓｐ
ｅｃｉｅｓ，ＣＲＣ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕ
ｎｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９６年９月）；米国特許第５，３６４，７
６２号、同第５，６３９，４５８号及び同第５，７３４，０２３号を参照。
【０１１８】 リンパ芽球様細胞の．１７４系統（本明細書以降、「．１７４細胞」）は、Ｔ
ＡＰトランスポーターの機能を排除する突然変異を持つ（ＤｅＭａｒｓ等、Ｍｕ
ｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｉｍｐａｉｒ ａ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎａｌ ｓｔｅｐ ｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ−Ａ ａｎ
ｄ −Ｂ ａｎｔｉｇｅｎｓ，ＰＮＡＳ ８２：８１８３−８１８７（１９８５
）；Ｈｕｇｈｅｓ Ｅ，Ｈａｍｍｏｎｄ Ｃ ａｎｄ Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ Ｐ，
Ｍｉｓ−ｆｏｌｄｅｄ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ
ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎｓ ａｒｅ ｔｒａ
ｎｓｌｏｃａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｄｅ
ｇｒａｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ，ＰＮＡＳ ９４：１８９
６−１９０１（１９９７））。その結果として、プロテアソーム処理されたペプ
チドは、これらの細胞においてＭＨＣクラスＩ分子とアセンブルするために利用
し得ない。その結果、ほとんどのＭＨＣクラスＩ分子（シグナル配列ペプチドと
アセンブルすることができるものを除いて）がＥＲ中に保持される。
【０１１９】 細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）媒介される細胞溶解に基づくアセイが、ＭＨ
ＣクラスＩ分子をＥＲから放出させかつ．１７４細胞の表面で発現させる化合物
を同定するのに使用される。特異的なＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を発現する．１
７４細胞の系統は、標準のｃＤＮＡ軽質移入技術によって調製されよう。特異的
な抗原性ペプチドをこのクラスＩ対立遺伝子と共同して認識するＣＴＬもまた、
標準の技術によって調製されよう（Ｙａｐ Ｋ及びＡｄａ Ｇ，Ｃｙｔｏｔｏｘ
ｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉ
ｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｙ ３
２：１５１−１５９（１９７７））。．１７４細胞は、９６ウエル細胞培養板の
ウエルの中にアリコートされることになる。各々のウエルは、テストすべき化合
物をある量受け入れ、その後に化合物は３７℃で９０分間インキュベートされる
ことになる。９６ウエル板は、遠心分離されて．１７４細胞を小球形にした後に
、細胞が通常の培地中でテスト化合物を何ら加えないで再懸濁されることになる
。培地は、特異的な抗原性ペプチドを含有しよう。３７℃で更に２時間インキュ
ベートした後に、ＣＴＬが各々のウエルに加えられることになる。細胞溶解が、
Ｔ細胞毒性について標準の自動蛍光アセイを使用して測定されることになる（Ｂ
ｒｅｎａｍ Ｍ及びＰａｒｉｓｈ Ｃ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｆｌｕｏｒｏｍｅ
ｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ Ｉｍｍ
ｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１２：１２１−１３１，１９８８）。不完全にアセ
ンブルされたＭＨＣクラスＩ重鎖−β２Ｍ複合体にＥＲを出させ、細胞表面に達
しさせ、培地中に存在する抗原性ペプチドを結合させる化合物を受け入れたいず
れのウエルもＣＴＬ媒介される溶解を受けやすくなる。重複する９６ウエルアセ
イ板は、同じ化学化合物を受け入れるが、ＣＴＬ細胞を受け入れない。この重複
する板上で細胞溶解を検出すると、ＭＨＣ媒介される経路を通るよりもむしろ直
接細胞を溶解する化合物を同定することになる。このアセイは、ＥＲから不完全
にアセンブルされた又はミスフォルディドタンパク質の放出を可能にする化合物
の急速なかつ信頼し得る同定を可能にすることになる。その上に、アセイは、天
然産物又は組み換え合成された化学製品からなるライブラリーの高処理量スクリ
ーニングにおいて採用するようにデザインする。
【０１２０】 免疫診断学／免疫アセイ．このグループの技術は、特異的な生化学的物質を、
通常相補的な抗原について適当に調製されかつ選択される抗体によって示される
特異性及び高い親和力に依存する、生物学的液のような複合混合物中での低い濃
度で測定するために使用される。測定すべべき物質は、必然的に、抗原性−免疫
原性マクロ分子又はハプテン性小分子のいずれかでなければならない。各々のサ
ンプルに、知られている、限られた量の特異的な抗体を加え、それと結合する抗
原のフラクション（しばしば、結合された：自由比と表現される）を、放射線同
位元素（放射線同位元素標識免疫アセイ）、蛍光性分子（フルオロ免疫アセイ）
、安定なフリーラジカル（スピン免疫アセイ）、酵素（酵素免疫アセイ）、又は
その他の容易に区別し得る標識で標識された抗原の形態をインジケーターとして
使用して、評価する。
【０１２１】 抗体は、酵素結合された免疫吸着剤アセイ（ＥＬＩＳＡ）；放射線同位元素標
識免疫アセイ（ＲＩＡ）：蛍光免疫アセイ（ＦＩＡ）：ケミルミネセント免疫ア
セイ（ＣＬＩＡ）を含み；かつ抗体をコロイド状金粒子（イムノゴールド）で標
識する種々の方法で標識することができる。
【０１２２】 一般的なアセイホーマットは、サンドイッチアセイ、競合的又は競合アセイ、
ラテックス凝集アセイ、均質アセイ、マイクロタイター板ホーマット及びマイク
ロ粒子ベースのアセイを含む。
【０１２３】 酵素結合された免疫吸着剤アセイ（ＥＬＩＳＡ）．ＥＬＩＳＡは、放射化学薬
品の危険及び蛍光検出系の費用を回避する放射化学技術である。そのアセイは、
代わりに、酵素をインジケーターとして使用する。ＥＬＩＳＡは、不溶性キャリ
ヤー表面に結合された抗体（又は抗原）を使用することに基づく定量的な免疫ア
セイの形態であり、次いでこれをテスト溶液中の関連した抗原（又は抗体）を「
捕獲」するのに使用する。次いで、抗原−抗体複合体を、あらかじめ抗原（又は
抗体）に共有結合させておいた適当な酵素の活性を測定することによって求める
。
【０１２４】 ＥＬＩＳＡ技術に関しての情報については、例えばＪ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ
，Ｅｌｉｓａ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２巻），Ｈｕｍａｎ Ｐｒ．（
１９９５）；Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ及びＫｅｍｅｎｙ，ＥＬＩＳＡ ａｎｄ
Ｏｔｈｅｒ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ；Ｔｈｅｏｒ
ｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ Ｌｔｄ．（１９９８）；Ｄ．Ｍ．Ｋｅｍｅｎｙ，Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｅｌｉｓａ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒ．（
１９９１）；並びにＥ．イシカワ、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒ
ａｐｉｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７巻），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１））を参照。
【０１２５】 酵素についての比色アセイ．測色法は、化合物の濃度又は量を、試薬を標準及
びテストの両方の量の化合物と反応させることによって生成される色を、しばし
ば比色計を使用して比較することによって求める定量的な化学分析の任意の方法
である。比色計は、色強さ又は色強さの差を、目視か又は光電的にかのいずれか
で測定する装置である。
【０１２６】 ベータ−ガラクトシダーゼ酵素の標準の比色アセイは、当業者に良く知られて
いる（例えば、Ｎｏｒｔｏｎ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ５：２８１−２９０（１９８５）を参照）。比色アセイは、Ｏ
−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ、ミズーリ、セ
ントルイス、Ｓｉｇａｍａ）を標準の比色ベータ−ガラクトシダーゼアセイにお
ける物質として使用して細胞溶解産物全体に関して行うことができる（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ等、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．（１９９０））。自動比色アセイは、
また、米国特許第５，７３３，７２０号に記載されている通りに、ベータ−ガラ
クトシダーゼ活性を検出するためにも利用可能である。
【０１２７】 免疫蛍光アセイ．免疫蛍光又は免疫蛍光鏡検法は、抗原又は抗体を蛍光色素に
結合することによって蛍光にし、次いで組織分泌又はスミアにおいて相補的な抗
体又は抗原と反応させる技術である。次いで、抗原又は抗体の位置を、鏡検法に
より紫外線下で蛍光を観測することによって求めることができる。
【０１２８】 免疫蛍光技術に関しての一般的な情報については、例えばＫｎａｐｐ等、Ｉｍ
ｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｔａｉｎｉｎ
ｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（１９７８）；Ｖ．Ｊ．Ａｌｌａｎ，Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃ
ｒｏｓｃｏｐｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｈｅ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２１８），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ
ｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｅ．Ｈ．Ｂｅｕｔｎｅｒ，Ｄｅｆｉｎｅｄ
Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｙｔｏｃ
ｈｅｍｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ（１９８３）；及びＥ．Ｏ．Ｃａｕｌ，Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）を参照。本発明に適用可能な免疫蛍光技
術の詳細な説明については、米国特許第５，９１２，１７６号；同第５，８６９
，２６４号；同第５，８６６，３１９号；及び同第５，８６１，２５９号を参照
。
【０１２９】 Ｊ．組み換え化学 本発明において有用な化合物の化学変種である化合物を生成するのに組み換え
化学を利用することができる。そのような化合物は、本発明の高処理量スクリー
ニング法を用いて評価することができる。
【０１３０】 基本的な組み換え化学概念は、化学分野の当業者に良く知られており、また、
下記に見出すこともできる：Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｋ．Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｃｏｍｂ
ｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，Ｍａｓｔｅｒｓ），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ａｎ
ｔｈｏｎｙ Ｗ．Ｃｚａｒｎｉｋ及びＳｈｅｉｌａ Ｈｏｂｂｓ Ｄｅｗｉｔｔ
（編集者），Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏ
ｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ
（１９９７）；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｒ．Ｗｉｌｓｏｎ（編集者）及びＡｎｔｈｏｎ
ｙ Ｗ．Ｃｚａｒｎｉｋ（投稿者），Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９７）；Ｅｒｉｃ Ｍ．Ｇｏｒｄｏｎ及びＪａ
ｍｅｓ Ｆ．Ｋｅｒｗｉｎ（編集者），Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｄｒｕ
ｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（１９９８）；Ｓｈｍｕｅｌ
Ｃａｂｉｌｌｙ（編集者），Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌ
ｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｊｏｈｎ Ｐ．
Ｄｅｖｌｉｎ，Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｍａｒ
ｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ（１９９８）；Ｌａｒｒｙ Ｇｏｌｄ及びＪｏｓｅｐｈ
Ａｌｐｅｒ，Ｋｅｅｐｉｎｇ ｐａｃｅ ｗｉｔｈ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｔｈｒ
ｏｕｇｈ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５，２９７（１９９７）；Ａｒｉｓ Ｐｅｒｓ
ｉｄｉｓ，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，６９１−６９３（１９９８）。
【０１３１】 Ｋ．治療効能を増大させるためにサプシガルギン、シクロピアゾン酸及びＤＢ
ＨＱを改質する サプシガルギン、シクロピアゾン酸及び２，５−ジ−（t-ブチル）−１，４−
ヒドロキノン（ＤＢＨＱ）は、ＥＲ Ｃａ−ＡＴＰａｓｅを阻害し、サイトソル
性カルシウムレベルを一時的に上昇させかつＥＲカルシウム貯蔵を枯渇させるこ
とになる。この活性は、ＣＦにおいてこれらの３つの化合物の提案される治療上
の利点をアンダーラインするが、それは、また、広範囲の細胞においてカルシウ
ム依存性プロセスを活性化することによって毒性の副作用を生じ得ることも可能
である。ＣＦにおける主要な冒される器官は肺であるので、気道上皮細胞にいて
欠乏するＣＦの補正は、この病気に関連する羅漢率を顕著に減少させよう。従っ
て、エーロゾル吸入によって気道に局部適用することができかつ気道上皮細胞か
ら外に拡散して体循環に入らないであろうこれらの化合物の誘導体を構築するこ
とは、望ましいであろう。そのような誘導体が、全身的毒性副作用を示しそうな
ことは、ずっと少ないであろう。
【０１３２】 非特異的エステラーゼ活性が、ほとんどの真核性細胞タイプの細胞形質中に存
在する。この活性は、目的が標的細胞の細胞形質に入り、引き続きそこにトラッ
プされたままになることである多数の化合物をデザインする際に利用されてきた
。これらの化合物は、細胞内イオン濃度を測定するために幾種かのインジケータ
ー色素を含み、アセトキシメチルエステルとして合成される（Ｇｒｙｎｋｉｅｗ
ｉｃｚ Ｇ，Ｐｏｅｎｉｅ Ｍ及びＴｓｉｅｎ ＲＹ，Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔｌｙ
ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３４４０−３４５０（１９８５））。それらは、こ
の形態で、膜透過性であり、膜細胞を横切って拡散して細胞形質に入ることがで
きる。細胞形質エステラーゼの作用は、メタノール基を除き、後に関心のある化
合物上に負に荷電されたカルボン酸残基を残す。化合物は、この荷電された状態
で、もはや膜透過性でなく、こうしてサイトソル中にトラップされる。
【０１３３】 サプシガルギン、シクロピアゾン酸及びＤＢＨＱを、アセトキシメチルエステ
ル基を組み込むために改質してよい。これらの改質された化合物を、次いで、エ
ーロゾル吸入によって投与する。それらは、おそらくそれらの先端プラズマ膜を
横切って拡散することによって表面気道上皮細胞に入ることになろう。それらは
、一旦気道上皮細胞に入ると、細胞形質エステラーゼの作用のための物質となろ
う。変性された化合物上でのエステラーゼ作用は、これらの化合物に負に荷電さ
れたカルボン酸残基を残し、こうしてそれらを気道上皮細胞から離脱させないで
あろう。その結果として、化合物は、単にそれらの意図する標的である気道上皮
細胞に接近して気道上皮細胞に対して作用を発揮することになろう。これより、
全身的副作用についての可能性が大きく低減されることになろう。
【０１３４】 一種又はそれ以上のカルボン酸基をサプシガルギン、シクロピアゾン酸又はＤ
ＢＨＱに加えることがＥＲ Ｃａ−ＡＴＰａｓｅに対するそれらの阻害作用を著
しく低減しさえしなければ、この戦略は好結果を得るであろう。これらの化合物
の少なくともいくつかの毒性を低減させるのに、改質は必要でないかもしれない
。動物毒性はＤＢＨＱと関連付けられなかった（Ｃｈａｏ等、Ｃａｌｃｉｕｍ−
ａｎｄ ＣａＭＫＩＩ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｓｅｃｒｅ
ｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ Ｃａ−ＡＴ
Ｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２，５−ｄｉ−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ）−１
，４−ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ ｉｎ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｐ
ａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．９６：１７９４−１８０１（１９９５））。
【０１３５】 Ｌ．製薬調剤 一般．本発明の治療組成物は、薬用調剤の形態で、例えば本発明の組成物を有
効成分として、外部、腸内又は非経口用に適した有機もしくは無機キャリヤー又
は賦形剤と混和して含有する固体、半固体又は液状形態で使用することができる
。有効成分に、例えば錠剤、ペレット、カプセル、吸入剤、座剤、溶液、溶液、
エマルション、懸濁液、及び使用するために適した任意のその他の形態のための
通常の非毒性の製薬上許容し得るキャリヤーを配合してよい。本発明の配合物は
、水、タルク、グルコース、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトー
ル、デンプンペースト、マグネシウムトリシリケート、コーンデンプン、ケラチ
ン、コロイド状シリカ、ジャガイモデンプン、尿素のようなキャリヤー、及び調
剤を製造する際に使用するために適したその他のキャリヤーを、固体、半固体又
は液状形態で含むものを包含し、加えて、助剤、安定剤、増粘剤、着色剤及び香
料を使用してもよい。
【０１３６】 固体組成物．錠剤又はカプセルのような固体組成物を調製するために、主要な
有効成分を製薬キャリヤー（例えば、コーンデンプン、ラクトース、スクロース
、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、マグネシウムステアレート、ジカルシ
ウムホスフェート又はゴムのような慣用の錠剤用成分）及びその他の製薬希釈剤
（例えば、水）と混合して本発明の組成物、又はそれの非毒性の製薬上許容し得
る塩の実質的に均質な混合物を含有する固体の予備配合組成物を形成する。予備
配合組成物を実質的に均質なと言う時には、有効成分が組成物全体にわたって一
様に分配され、それで組成物が錠剤、ピルやカプセルのような等しく有効なユニ
ット投与形態に容易にさらに分割され得るようにすることを意味する。この固体
予備配合組成物を、次いでさらに分割して適した量のユニット投与形態にさらに
分割する。
【０１３７】 新規な組成物の錠剤又はピルに被覆し又はその他の方法で配合して長期作用の
利点をもたらす投与形態にすることができる。例えば、錠剤又はピルは、内部投
与成分及び外部投与成分を含み、後者は前者の上の外被の形態にすることができ
る。２つの成分は腸層によって分離されることができ、腸層は、胃において分解
に耐えかつ内部成分を十二指腸の中に無傷で通過させ又は放出を遅らせる働きを
する。種々の物質をそのような腸層又は被覆用に使用することができ、そのよう
な物質は、多数のポリマー酸及びポリマー酸とシェラック、セチルアルコール及
びセルロースアセテートのような物質との混合物を含む。
【０１３８】 有効化合物は、座剤又は保持浣腸、例えばココアバター又はその他のグリセリ
ドのような慣用の座剤ベースを含有するもののような直腸組成物中に配合しても
よい。
【０１３９】 吸入剤．有効化合物を、鼻腔内投与又は吸入によって投与するために、患者が
圧搾する又はポンプするポンプスプレー容器から溶液又は懸濁液の形態で、或は
加圧容器又は噴霧器から、適した噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、
トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はそ
の他の適したガス）を使用することによってエーロゾルスプレープレゼンテーシ
ョンとして簡便に送達する。加圧エーロゾルの場合には、投与ユニットを、計量
された量を送達するためにバルブを設置することによって決めてもよい。加圧容
器又は噴霧器は、有効化合物の溶液又は懸濁液を収容してもよい。吸入器又は注
入器において使用するためのカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンから
造る）は、有効化合物の粉末ミックス及びラクトース又はデンプンのような適し
た粉末ベースを含有して配合してもよい。
【０１４０】 サプシガルギン治療は、広範囲の細胞タイプにおいてサイトソル性カルシウム
濃度を急性に上昇させるに至る（Ｈｏｆｅｒ及びＭａｃｈｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：２５９８−２６０２（１９９３））。細胞内貯蔵
からのカルシウムの放出は、筋収縮、ホルモン分泌及び神経コミュニケーション
を含む危険な細胞プロセスの莫大なリストを制御する第二メッセンジャーとして
作用する（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．９８：１
１９−２４（１９９４））ので、おそらく、サプシガルギンが、噴霧される形態
で投与される時に、非常に良く耐性があることは驚くべきことである。サプシガ
ルギンの化学構造は、３エステル基を含む（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等、ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔ．３３５：３４５−３４８（１９９３））。ほとんどの真核性細胞
の細胞形質は、非特異的エステラーゼ活性を豊富に付与され、これは拡散によっ
て細胞に入る生体異物化合物を急速に脱エステル化することが知られている（Ｔ
ｓｉｅｎ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９４：３２５−３３４（１９８２））。
従って、サプシガルギンは、先端膜を横切って拡散することによって気道上皮細
胞に入った後に、エステラーゼ活性によって改質される。エステル基を失うと、
カルシウムポンプ阻害因子としてのサプシガルギンの効能を少なくとも４０倍低
下する（上記Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等）。これより、サプシガルギンは、それ
の標的器官において不活性な代謝産物に転化されることの望ましい薬理学的特性
を保有し得る。
【０１４１】 これが、 事実そのとおりであるならば、サプシガルギンはエーロゾル吸入に
よって気道に局部適用することができかつ生物活性な形態で気道上皮細胞から外
に拡散して体循環に入らない。この特徴を利用する将来の誘導体は、全身的毒性
副作用を示しそうなことは、更に少ないであろう。また、毒性が、所望のサプシ
ガルギン効果に似るはずの少なくともいくつかの化合物に関連し得ないことに留
意することは興味がある。動物毒性は、ＥＲ Ｃａ−ＡＴＰａｓｅ活性を阻害す
るサプシガルギンの能力を共有する化合物であるＤＢＨＱに起因されなかった（
Ｃｈａｏ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：１７９４−１８０１（１９９
５））。
【０１４２】 最後に、カルシウムポンプ阻害因子に加えてその他のクラスの化合物もまた、
ミスフォルディドタンパク質のＥＲ保持に関連した臨床症状を治療する際に潜在
的治療効果がありそうである。これらのタンパク質が適当に機能することができ
ないようにＥＲ保持シャペロン機関の機能を直接抑制する又はＥＲ管腔の環境を
変えるいずれの化合物も、潜在的臨床価値を保有することができる。
【０１４３】 液状形態．液状形態は、それらの形態で、本発明の新規な組成物を経口で又は
注入によって投与するために組み込むことができ、水溶液、適当にフレイバー付
けされたシロップ、水性又は油懸濁液、及び綿実油、ごま油、やし油、又は落花
生油のような食用落油によるフレイバー付けされたエマルション並びにエリキシ
ル及び類似の製薬ビヒクルを含む。水性懸濁液用の適した分散剤又は懸濁剤は、
トラガカント、アカシア、アルギネート、デキストラン、ナトリウムカルボキシ
メチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン又はゼラチンのよ
うな合成天然ゴムを含む。
【０１４４】 経口投与用の液状製剤は、例えば溶液、シロップ又は懸濁液の形態を取っても
よく、或は使用する前に水又はその他の適したビヒクルで戻すために乾燥生成物
として提供してもよい。そのような液状製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトール
シロップ、メチルセルロース又は水素化された食用脂肪）；乳化剤（例えば、レ
シチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、扁桃油、油状エステル又はエ
チルアルコール）；防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピルｐ−ヒドロキシベ
ンゾエート又はソルビン酸）；並びに人工又は天然着色剤及び／又は甘味料のよ
うな製薬上許容し得る添加剤を用いて在来の手段によって調製してよい。
【０１４５】 舌下投与．組成物は、舌下投与のために、在来の様式で配合した錠剤又はロゼ
ンジンの形態を取ってもよい。
【０１４６】 有効化合物を、在来のカテテール法技術又は浸剤を使用することを含む、注入
によって非経口投与するために配合してよい。注入用配合物は、ユニット投与形
態で、例えばアンプルで、又はマルチ−ドース容器で、防腐剤を加えて提供して
よい。組成物は、油状又は水性ビヒクル中の懸濁溶液、溶液又はエマルションの
ような形態を取ってもよく、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤のような配合剤
を含有してもよい。代わりに、有効成分を、使用する前に適したビヒクル、例え
ば無菌のパイロジャート（ｐｙｒｏｇｅｒｔ）の存在しない水で戻すために粉末
形態にしてもよい。
【０１４７】 配合物．本発明の化合物の配合物は、所望の純度を有する化合物を生理学的に
許容し得るキャリヤー、賦形剤、安定剤、等と混合することによって貯蔵又は投
与用に調製し、持続放出性又は徐放性配合物で提供してもよい。治療使用用の許
容し得るキャリヤー又は希釈剤は、製薬分野において良く知られており、例えば
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、１９
８５）に記載されている。そのような物質は、使用される投与量及び濃度で受容
者に非毒性であり、下記を含む：ホスフェート、シトレート、アセテート及びそ
の他の有機酸塩のような緩衝剤、アスコルビン酸のような酸化防止剤、ポリアル
ギニンのような低分子（約１０よりも少ない残基）ペプチド、血清アルブミン、
ゼラチン、又は免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのよ
うな親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアルギニン
のようなアミノ酸、単糖類、二糖類、及びセルロース又はその他の誘導体、グル
コース、マンノース又はデキストリンを含むその他の炭水化物、ＥＤＴＡのよう
なキレート試薬、マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール、ナトリ
ウムのような対イオン及び／又はＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ又はポリエチ
レングリコールのような非イオン系界面活性剤。
【０１４８】 それ以上説明しないで、当業者ならば、先の記載及び下記の具体例を用いて、
本発明の化合物を造りかつ利用し、特許請求の範囲に記載する方法を実施するこ
とができるものと信じる。
【０１４９】 例 下記の作用例は、ＵＧＧＴレギュレーションについて開示し、本発明の好適な
実施態様を詳細に指摘する。これらの例は、発明の範囲をいささかも制限すると
解釈すべきでない。ＵＧＧＴレギュレーション並びにミスフォルディドタンパク
質の細胞内ターゲティングをレギュレートするその他のタンパク質に関係するそ
の他の例は、当業者に明らかであると思う。下記に記載するのに類似したアセイ
は、ＵＧＧＴをレギュレートするその他の作用物質又はミスフォルディドタンパ
ク質をレギュレートするその他のタンパク質を調べる際に利用することができる
。
【０１５０】 組織培養／細胞系 ＩＢ３−１（Ｚｅｉｔｌｉｎ等、１９９１）及びΣＣＦＢＥ２９０−（Ｋｕｎ
ｚｅｌｍａｎ等、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：５２
２−５２９（１９９３））細胞は、ＣＦに冒された気道上皮細胞系である。ＩＢ
３−１及びΣＣＦＢＥ２９０−は共に、ＣＦ患者に由来する不死化された、十分
に特性表示されたヒト気管支上皮細胞系である。細胞系は、ＣＦに冒された上皮
細胞：ｃＡＭＰ刺激されたＰＫＡ活性化されたＣｌ−チャンネル活性の欠如の診
断上の特徴を保持する。遺伝子型的には、ＩＢ３−１は、ΔＦ５０８突然変異及
びＷ１２８２Ｘ、すなわち未熟末端シグナルを有するナンセンス突然変異を含有
する複合異型接合体である。Ｗ１２８２Ｘ突然変異は、安定なｍＲＮＡを生じず
かつタンパク質を生じない（Ｈａｍｏｓｈ等、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．１：５
４２−５４４（１９９２））。従って、ＩＢ３−１細胞において産生される唯一
の安定なＣＦＴＲは、ΔＦ５０８生成物である。
【０１５１】 ΣＣＦＢＥ２９０−細胞系は、ΔＦ５０８突然変異について同型接合の患者に
由来する。両方の細胞系は、５％ＣＯ２中で３７°で増殖させた。ＩＢ３−１細
胞は、５％ウシ胎仔血清、トブラマイシン（２０ｕｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１
００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）を補足したＬＨＣ−
８培地（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）中に保った。ΣＣＦＢＥ２９０−細胞は、１０％
ウシ胎仔血清、トブラマイシン（２０ｕｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍ
ｌ）及びストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）を補足したＤｕｌｂｅｃｃｏ
’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中に保った。
【０１５２】 ＣＦＰＡＣ−１細胞系は、ＣＦを有する２６歳の男性の肝臓における転移性病
巣からの外植体培養の識別的トリプシン処理によって誘導される腺管膵臓アデノ
カルチノーマ細胞系である（Ｓｃｈｏｕｍａｃｈｅｒ等、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：４０１２−４０１６（１９９０））。細胞系は、ΔＦ５
０８ ＣＦＴＲの発現について同型接合でありかつＣＦに冒された上皮のイオン
輸送特性を有する。ＣＦＰＡＣ−１細胞は、先端微じゅう毛を有する上皮形態学
及び分極を有する。
【０１５３】 ＣＦＰＡＣ細胞を５％ＣＯ２中で３７°で増殖させかつ１０％ウシ胎仔血清を
補足したＩｓｏｃｏｖｅの改質されたＤｕｌｂｅｃｃｏの培地中に保った。短絡
電流の測定及び免疫蛍光実験の両方について、これらの細胞をコラーゲン被覆さ
れた透過性支持体（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｓｎａｐｗｅｌｌ ｆｉｌｔｅｒ ｃ
ｕｐｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、マサチューセッツ、ケンブリッジ）上
で増殖させた。十分に特性表示されたＴ８４腸上皮細胞系を標準方法（Ｃｏｈｎ
等、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：２３４０−２３４４．（１９
９２）；Ｂｅｌｌ及びＱｕｉｎｔｏｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６２：Ｃ
５５５−Ｃ５６２．（１９９２））に従って増殖させかつまた短絡電流アセイの
ために透過性支持体上にプレートした。
【０１５４】 実験１．パッチクランプ分析 材料と方法。単一チャンネルのパッチクランプ研究を、慣用の手順を用いて、
ＣＦに冒された気管支上皮細胞株ＩＢ３−１及びΣＣＦＢＥ(Egan等、Am.J.Phys
iol.268:C243-C251(1995))について行った。細胞を、コラーゲン(１５０μｇ／
ｍｌ)、フィブロネクチン(１０μｇ／ｍｌ)及びウシ血清アルブミン(１０μｇ／
ｍｌ)で被覆したガラスチップ上の培養フラスコ中で生育させた。
【０１５５】 細胞が７５％集密になった時点で、それらを、１μＭタプシガルギン(又はビ
ヒクルのみ)と１．５時間にわたって３７℃で、次のプロトコールを用いてイン
キュベートした。先ず、ＬＨＣ−８培地又はＤＭＥＭを組織培養皿から除去して
、それらの細胞をリン酸緩衝塩溶液ですすいだ。１μＭタプシガルギンを含む新
鮮なＬＨＣ−８培地をこの細胞培養皿に加えた。１．５時間タプシガルギンにさ
らした後に、細胞を新鮮な培地ですすぎ、パッチクランピング前に２時間３７℃
でインキュベートした。パッチクランプ浴溶液は、１５０ＮａＣｌ、２ＭｇＣｌ ２ 、１ＥＧＴＡ、５ＨＥＰＥＳ及び０．５ＣａＣｌ２、ｐＨ＝７．３を含有した
(何れもｍＭ)。ピペット溶液は、１５０ＮａＣｌ、２ＭｇＣｌ２、５ＨＥＰＥＳ
及び２ＣａＣｌ２、ｐＨ＝７．３を含んだ(何れもｍＭ)。
【０１５６】 パッチクランプ研究を、２２〜２５℃で行った。データをＡｘｏｐａｔｃｈ２
００Ａパッチクランプ増幅器で増幅し、後の分析のためにビデオテープに記録し
た。データを低域通過フィルターを通して１ｋＨｚでデジタル化した。データを
Ｐクランプ６を用いて分析した。
【０１５７】 結果．ΔＦ５０８ＣＦＴＲの表面発現を、先ず、２つの異なる処理した及び未
処理のＣＦに冒された気道上皮細胞株ＩＢ３−１(Zeitlin等、Am.J.Resp.Cell.M
ol.Biol.4:313-319(1991))及びΣＣＦＢＥ２９０−(Kunzelman等、Am.J.Resp.Ce
ll.Mol.Biol.8:522-529(1993))について行うパッチクランプ分析により調べた。
【０１５８】 未処理のＣＦに冒された細胞においては、低コンダクタンスクロリドチャンネ
ルは、ＩＢＭＸとフォルスコリンを含むｃＡＭＰ刺激カクテルによって活性化さ
れなかった(図１Ａ)。これらの発見は、一次ＣＦ欠陥と一致する。対照的に、タ
プシガルギンでの処理は、ＩＢ３−１及びΣＣＦＢＥ２９０−細胞のクロリドコ
ンダクタンスを劇的に増大させた。
【０１５９】 細胞を薬物の非存在下で２時間インキュベートしてから、１μＭタプシガルギ
ン中で９０分間インキュベートした。これらの処理した細胞のパッチクランプ分
析は、それらの原形質膜が今や多量の低コンダクタンスクロリドチャンネル活性
を含むことを示した(図１Ｂ及び表１)。このチャンネル活性の生物物理的特性は
、ΔＦ５０８ＣＦＴＲタンパク質により形成されるチャンネルのものと一致した
(Dalemans等、Nature 354:526-528(1991)；Egan等、Am.J.Physiol. 268:C243-C2
51(1995)；Rubenstein等、J.Clin.Invest. 100:2457-2465(1997)；Haws等、Am.J
.Physiol.270:C1544-C1555(1996)；Hwang等、Am.J Physiol.273:C988-998(1997)
)。こうして、電流対電圧の関係は、直線的であり(図２Ａ)、１１．８ｐＳの平
均の単一チャンネルコンダクタンスを示している。その上、オープンステートヒ
ストグラム(図２Ｂ)は、計算されたＰ００．１２を生じる。チャンネル活性は、
グリベンクラミドにより阻害され得た(データは示してない)。この操作により達
成された機能的発現のレベル(表１)は、嚢胞性繊維症の欠陥を逆転させるのに必
要であると示唆された発現レベル(Johnson等、Nature Gen.2:21-25(1992))と一
致している。
【０１６０】 パッチクランプ実験を、タプシガルギン処理した細胞について、それらを単一
のタプシガルギン曝露の後に８時間又は２４時間インキュベートした後にも行っ
て、この処理のＣＦＴＲ様チャンネルの発現に対する効果がどのくらい長く持続
するかを測定した。８時間の回復期間の後に、ＣＦＴＲ様チャンネル活性が、２
０の切り出したパッチの内の７つについて認められた(３５％)。しかしながら、
２４時間の回復期間の後では、１０パッチの内の０(０％)が、如何なるＣＦＴＲ
様チャンネル活性を示さなかった。
【０１６１】 カルシウムポンプインヒビターでの処理は、細胞内カルシウム濃度の一過性の
上昇へと導き、これは、ＣＦ上皮細胞中のクロリドの流れを正確に刺激すること
が示されている(Chao等、J.Clin.Invest.96:1794-1801(1995))。ＣＦＴＲチャン
ネル活性の変化がこの短期間のタプシガルギンの効果によるものであるのかどう
かを確かめるために、細胞を短時間(１５分間)タプシガルギンにさらす処理をし
た後に、２時間回復させてからパッチクランピングを行った。このプロトコール
の後に、１０のパッチにおいてＣＦＴＲ様チャンネル活性は、刺激されなかった
が(データは示さない)、これは、タプシガルギン処理に続く細胞内カルシウム濃
度の短期的上昇が、ＣＦＴＲ様チャンネルの検出可能な長期間の増加を生じない
ことを示唆している。
【０１６２】
【表１】
【０１６３】 実験２．短絡電流の測定 材料と方法．ＣＦＰＡＣ−１又はＴ８４細胞をコラーゲン被覆した透過性支持
体(トランスウェルスナップウェルフィルターカップ、Corning Costar,マサチュ
ーセッツ、Cambridge)上で生育させた。細胞に、単層の基底外側面から１〜２日
おきに供給する一方、先端面を、加湿５％ＣＯ２環境にさらした。フィルターを
、緊密な単層が達成されるまで培養した。
【０１６４】 電気的研究の前に、単層の幾つかを下記のプロトコールを用いて１μＭタプシ
ガルギンで処理した。１μＭタプシガルギンを含む培養培地を単層の先端面に加
えて、１．５時間３７℃でインキュベートした。次いで、細胞を新鮮なタプシガ
ルギン非含有培地ですすいでから、２時間３７℃でインキュベートし、その後、
ウッシングチャンバーでの研究に用いた。ウッシングチャンバー浴溶液は、通常
重炭酸塩を含まない１４０ＮａＣｌ、１．２ＭｇＣｌ２、５Ｋ２ＨＰＯ４、０．
５ＫＨ２ＰＯ４、５ＨＥＰＥＳ、１．２ＣａＣｌ２、及び５グルコースｐＨ＝７
．４(すべてｍＭ)よりなるリンゲル液であった。
【０１６５】 ３ＭＫＣｌ寒天ブリッジに埋めたＡｇ−ＡｇＣｌワイヤーを、ウッシングチャ
ンバーシステム(World Precision Instrument, WPI)に含まれる単層の両側で電
圧及び電流電極として用いた。電圧を、デジタル電流及び電圧リードアウトを有
するＥＣ−８２５電圧クランプ増幅器(Warner Instruments)を用いてクランプし
た。上皮貫通電位差(Ｖｔｅ)を連続的に記録した。５分間隔で、Ｖｔｅを０にク
ランプし、短絡電流(Ｉｓｃ)を測定した。Ｉｓｃ条件下で、２０〜４０ｍＶの電
圧パルスを増幅し、電流の変化を利用して膜貫通抵抗(Ｒｔｅ)を計算した。
【０１６６】 細胞をウッシングチャンバーに乗せた後に、電気的パラメーターを２０〜３０
分間(対照用期間)にわたって評価した。対照用期間の後に、ｃＡＭＰ刺激カクテ
ル(１０μＭフォルスコリン及び１００μＭＩＢＭＸ)を先端チャンバーに加えた
。電気的パラメーターを、この処理に続いて２０〜３０分間モニターしてＩｓｃ 、Ｖｔｅ及びＲｔｅの変化を評価した。次いで、フロセミド(１０−４Ｍ)(クロ
リド分泌の阻害剤)を基底外側浴に２０分間加えて、そのクロリド分泌に対する
影響を評価した。フロセミドの連続的な存在下で、１０−４Ｍアミロリド(ナト
リウム吸収の阻害剤)を先端浴に１０分間にわたって加えた。これらの操作中、
電気的パラメーターを連続的にモニターした。
【０１６７】 結果．ＣＦＴＲチャンネルに対するタプシガルギンの効果が上皮の短絡電流を
増大させるのに十分な大きさのものであるかどうかを測定するために、ＣＦＰＡ
Ｃ−１細胞(Schoumacher等、Proc.Natl.Acad.Sci.87:4012-4016(1990))をコラー
ゲン被覆した透過性支持体上で生育させてウッシングチャンバー中で試験した。
未処理のＣＦＰＡＣ−１細胞の単層をｃＡＭＰ刺激にさらした場合には、短絡電
流の増加はなかった(−０．３８±１．８％、ｎ＝１２)(図３)。細胞質ｃＡＭＰ
濃度の上昇に対する応答の欠如は、ＣＦ表現型(Grubb等、Am.J.Resp.Cell.Mol.B
iol.8:454-460(1993))と一致する。
【０１６８】 対照的に、タプシガルギン処理したＣＦＰＡＣ−１単層をｃＡＭＰ刺激カクテ
ルにさらした場合には、短絡電流の１４．６±６．６％の増加(ｎ＝１２、ｐ＝
０．０２)があり、これは、フロセミドにより阻止されたが、このことは、それ
が正味のクロリド分泌の増加によるものであったことを示唆している。タプシガ
ルギン処理したＣＦＰＡＣ細胞におけるｃＡＭＰ刺激されたクロリド分泌の存在
は、ＣＦのイオン輸送欠陥の部分的修正と一致し、それは、Ｔ８４細胞単層を用
いて見られたものと大きさにおいて類似している(図３)。Ｔ８４細胞は、高レベ
ルの野生型ＣＦＴＲを発現するヒトの結腸上皮細胞株である(Cohn等、Proc.Natl
.Acad.Sci.89:2340-2344(1992)；Bell及びQuinton,Am.J.Physiol.262:C555-C562
(1992))。
【０１６９】 実験３．免疫蛍光分析 ＣＦＰＡＣ及びΣＣＦＢＥ２９０−上皮細胞を、０．４５μトランスウェルフ
ィルターインサート(Corning Coster, マサチューセッツ、Cambridge)上で、短
絡電流測定のために記載されたのと同じ条件下で集密になるまで生育させた。免
疫蛍光分析の前に、フィルターで生育させた細胞の単層を９０分間にわたって、
先端及び基底外側の培地コンパートメントの両方に存在する１μＭのタプシガル
ギンで３７℃で処理した。次いで、この培地を、タプシガルギンを含まない標準
Ｉｓｃｏｖｅ生育培地又はＤＭＥＭに変えて、細胞を２時間又は４時間３７℃で
インキュベートした。対照用細胞は、同じ培地交換を受けたが、タプシガルギン
処理にはかけられなかった。
【０１７０】 第２のインキュベートに続いて、これらのフィルター生育単層を、カルシウム
及びマグネシウム(１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＮａＰｉ、ｐＨ７．４、１ｍ
ＭＭｇＣｌ２、０．１ｍＭＣａＣｌ２)を補ったリン酸緩衝塩溶液で一回洗い、
その後、それらを、−２０℃の１００％メタノール中で１０分間固定した。免疫
蛍光標識を、それぞれＣＦＴＲタンパク質のＲドメイン及びプレヌクレオチド結
合フォールド(Crawford等、Proc.Natl.Acad.Sci.88:9262-9266(1991))に対する
十分特性決定された１６９及び１８１抗体(ジョンズホプキンス大学、W.Guggino
寄贈)並びにＮａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼのαサブユニットに対するモノクローナル
抗体(Gottardi及びCaplan,J.Cell Biol.121:283-293(1993))を用いて行った。
【０１７１】 一次抗体及びローダミン結合した二次抗体とのインキュベーションを、前に記
載された(Gottardi及びCaplan、同書)ように行った。標識した細胞を、Ｚｅｉｓ
ｓＬＳＭ４１０レーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いて調べた。すべてのイ
メージは、８重ラインの平均のプロダクトである。コントラスト及び明るさの設
定は、すべてのピクセルが直線的範囲内になるように選択した。ＸＺ断面を、０
．２μモーターステップを用いて生成した。
【０１７２】 結果．ΔＦ５０８タンパク質の細胞下分布に対するタプシガルギンの効果を更
に調べるために、我々は、ＣＦＴＲタンパク質の免疫蛍光位置測定を処理した又
は未処理のＣＦＰＡＣ細胞で行った。未処理細胞においては、ＣＦＴＲ染色は、
核の周りの散漫な細胞質パターンで僅かしか検出されない(図４)。このパターン
は、未処理細胞中のＥＲへのΔＦ５０８−ＣＦＴＲタンパク質の局在性と一致す
る。処理した細胞では、正面向きで及びＸＺ断面で見られるが、先端微絨毛の明
るい標識が、殆どの細胞において検出できた。タプシガルギン処理の後に２時間
インキュベートされた細胞は、先端染色のみを示した。これらの細胞では、細胞
内ＥＲの染色は検出できなかった。タプシガルギン処理の後に４時間インキュベ
ートされた細胞は、先端膜及びＥＲの両方でＣＦＴＲ染色を示す(データは示し
てない)。従って、タプシガルギンでの処理は、変異型ΔＦ５０８−ＣＦＴＲタ
ンパク質のＥＲから先端膜への再分布へと導く。
【０１７３】 タプシガルギンの除去後４時間インキュベートした細胞で認められたパターン
から明らかなように、この薬物の除去後に合成されたΔＦ５０８−ＣＦＴＲタン
パク質は、ＥＲ中に保持される。これらの観察は、タプシガルギン処理がミスフ
ォールデッドΔＦ５０８−ＣＦＴＲタンパク質をＥＲから放出させて先端原形質
膜での機能的滞留の適当な部位に移動させるという解釈と一致する。
【０１７４】 タプシガルギンがΔＦ５０８ＣＦＴＲタンパク質のＥＲから細胞表面への再分
布を達成する機構が、この化合物のＥＲ内腔Ｃａ＋＋濃度を減じる能力と関係し
ているということはありそうなことである。しかしながら、タプシガルギンがΔ
５０８ＣＦＴＲタンパク質と直接相互作用してその三次構造を変えるということ
も可能である。ＣＦＴＲは、ＡＢＣ輸送タンパク質のＭＤＲファミリーと関係し
ている。ＭＤＲファミリーの膜は、多様な化学化合物と相互作用し、それらを輸
送することができる(Higgins,Ann.Rev.Cell Biol.8:67-113(1992))。ミスフォー
ルディング及びＥＲ保持を生じる突然変異を有するＭＤＲタンパク質は、特定の
ＭＤＲタンパク質輸送活性の基質である化合物にさらすことにより機能的にレス
キューされるということが示されている(Loo及びClarke,J.Biol.Chem.272:709-7
12(1997)；Loo及びClarke,J.Biol.Chem.273:14671-14674(1998))。おそらく、結
合基質化合物が、タンパク質コンホメーションを、それがＥＲの特質制御機構を
回避するだけ十分に安定化させるのであろう。
【０１７５】 ＣＦＴＲをＭＤＲタンパク質に関連させる相同性に照らして、タプシガルギン
が類似の機構によりΔＦ５０８−ＣＦＴＲに対するその効果を発揮するというこ
とは可能である。もしＣＦＴＲがＭＤＲ様活性を表せば、タプシガルギンは、お
そらく、基質類似体であって、そのＣＦＴＲ上の結合部位との相互作用がこのタ
ンパク質構造を安定化させて改変することができるのであろう。このモデルによ
れば、カルシウムポンプ及びＥＲ内腔カルシウム濃度に対するタプシガルギンの
効果は、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲのレスキューにおけるその作用のモードとは無関
係であろう。
【０１７６】 この可能性を試験するために、我々は、ΣＣＦＢＥ２９０−細胞をカルシウム
ポンプ阻害剤のＤＢＨＱ及びシクロピアゾン酸にさらしたが、これらは、構造的
にタプシガルギンと無関係である(Khan等、Biochem.34:14385-14393(1995)；Whi
tcome等、Biochem.J.310:859-868(1995))。免疫蛍光顕微鏡検査によりアッセイ
されたように(データは示してない)、両化合物は、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの表面
送達を誘導するタプシガルギンの能力を再現することができた。ＤＢＨＱ及びシ
クロピアゾン酸は、化学的にタプシガルギンと及び互いに全く異なるので、それ
らのΔＦ５０８−ＣＦＴＲに対する効果は、ＣＦＴＲタンパク質自身との如何な
る直接的相互作用よりもむしろカルシウムをＥＲ内腔から放出させる共通の能力
により生じるということはありそうなことである。
【０１７７】 実験４．噴霧化タプシガルギン 噴霧化チャンバーを、気密シールを生じる蓋付きの８クォートのプラスチック
容器を用いて構築した。「Ｔピース噴霧化装置」(Hudson RCI T-up Draft Nebum
ist Nebulizer)をこの容器内に側面の開口部から挿入した。この噴霧化装置を５
ｍｌの生理食塩水に溶かした１μＭタプシガルギンで満たした。ガス源(高圧空
気)をこのセットアップに取り付けて１２リットル／分以上の流量を生じさせた
。流れを調節して、薄い可視的もやを容器中に維持した。この容器の頂部には、
多数の換気用小孔があって、二酸化炭素が漏出するのを確実にした。この噴霧化
容器を実験中ヒュームフード内に維持して任意の漏出もやの分散を可能にした。
【０１７８】 マウス又は細胞を、噴霧化の開始前に、この容器内に置いた。マウスを、噴霧
化処理中、連続的に観察して、１５〜２０分ごとに記録した。肺を、前に記載さ
れた方法(Courtois-Coutry等、Cell 90:501-510(1997))に従って、組織学的分析
用に調製した。
【０１７９】 結果．タプシガルギン処理は、細胞質のカルシウムレベルの一過性の上昇及び
ＥＲカルシウム貯蔵の涸渇を生じる(Hofer及びMachen,Proc.Natl.Acad.Sci.90:2
598-2602(1993)、Montero等、J.Cell Biol.139:601-611(1997))。この活性は、
これらの化合物のＣＦにおいて提供される治療上の利益の基礎となるが、カルシ
ウム依存性プロセスを活性化することにより様々な細胞で有毒な副作用も生じ得
るということはあり得る(Berridge, Mol.Cell.Endocrin.98:119-24(1994))。Ｃ
Ｆにおいて第一次的に冒される臓器は、肺である(Davis等、Am.J.Respir.Crit.C
are Med.154:1229-1256(1996)；Pilewski及びFrizell,Physiol.Rev.79:Suppl:S2
15-S255(1999)；Rosenstein及びZeitlin,Lancet 351:277-282(1998)；Johnson等
、Nature Gen.2:21-25(1992))ので、気道上皮細胞におけるＣＦ欠陥の修正は、
この疾患と関係する病的状態を劇的に減少させる。それ故、吸入により肺に直接
適用されるタプシガルギンの治療上有効な投与量が臨床的に許容し得るかどうか
を測定することは重要である。
【０１８０】 この組織を調べるために、６匹のマウスを１４日間にわたって１日当たり３〜
４時間、普通の塩溶液中の１μＭタプシガルギンの噴霧化溶液にさらした。これ
らの動物は、処理の最中も処理の間においても明らかな病的効果を示さなかった
。２週間の試みの最後に、これらの動物を犠牲にして、４匹を肺の組織病理学的
検査用に処理した。すべての場合において、肺の細胞構造(即ち、肺胞及び細気
管支構造)は、完全に正常であった。試料の１つは中位の細気管支周囲のリンパ
球浸潤を示したが、他の３つにおいては、細気管支周囲のリンパ球の密度は、正
常範囲内であった(データは示してない)。
【０１８１】 マウスが受けるタプシガルギンの投与量が気道上皮細胞のΔＦ５０８−ＣＦＴ
Ｒをレスキューするのに十分であることを確実にするために、我々は、噴霧化タ
プシガルギンのΣＣＦＢＥ２９０−細胞に対する効果を調べた。これらの気道上
皮細胞を透過性フィルター支持体上で培養して気液界面で生育させた。こうして
、それらの先端膜を、液体の薄いフィルムのみで大気から分離し、それは、イン
・シトゥーの気道上皮細胞の先端膜である(Davis等、Am.J.Respir.Crit.Care Me
d.154:1229-1256(1996)；Pilewski及びFrizell,Physiol.Rev.79:前書:S215-S255
(1999))。フィルターで生育させたΣＣＦＢＥ２９０−細胞を、１μＭの噴霧化
タプシガルギンに３時間にわたってさらし、ΔＦ５０８−ＣＦＴＲの分布を免疫
蛍光法により評価した。
【０１８２】 図５に見られるように、噴霧化タプシガルギンでの細胞の処理は、ΔＦ５０８
−ＣＦＴＲの先端原形質膜への劇的な再分布を生じさせるのに十分であった。マ
ウスの上気道上皮細胞は培養細胞が受けたのと同様の投与量のタプシガルギンを
経験したに違いないので、臨床的効果を生じるのに十分なタプシガルギンの長期
の投与量を許容し、如何なる容易に検出できる有意の生理的な病的状態もないよ
うである。
【０１８３】 実験５．α−１アンチトリプシンの分泌不能ヌル変異肝細胞からのタプシガルギ
ン処理後の分泌 実験２を、α１アンチトリプシン保持変異を発現する細胞株例えば分泌不能変
異型、ヌル(Hong Kong){安定にトランスフェクトされたマウス肝細胞(J.Biol.Ch
em.269:7514-7519(1994))中に維持}を用いて繰り返す。細胞の表現型の変化を、
α１アンチトリプシンの分泌について細胞をアッセイすることにより評価する(J
.Biol.Chem.268:2001-2008(1993)に詳細に記載されている)。
【０１８４】 簡単にいえば、細胞単層を、[３５Ｓ]メチオニンで３０分間パルス標識し、そ
の後、放射能標識された培地を除去して過剰の未標識メチオニンを含む培地で置
き換える。チェース期間中に、単層の一のセットを１μＭタプシガルギンで３時
間処理し、他のセットを薬物を含まない培地中で３時間インキュベートする。α
１アンチトリプシンの培地中への分泌を、免疫沈降とその後の電気泳動及びオー
トラジオグラフィーにより評価する。
【０１８５】 結果．α１アンチトリプシンの分泌不能変異型、ヌル(Hong Kong)を発現する
細胞を、[３５Ｓ]メチオニンで３０分間パルス標識し、その後、それらを非放射
性培地中で、１μＭのタプシガルギンの存在下で又は非存在下で３時間インキュ
ベートした。このチェースインキュベーションの後に、培地を集めて、抗アンチ
トリプシン抗体を用いる免疫沈降法にかける。免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
とその後のオートラジオグラフィーにより分析する。
【０１８６】 放射能標識したα１アンチトリプシンタンパク質は、タプシガルギン処理した
細胞からの培地中に存在し、未処理の細胞から集めた培地には存在しない。これ
らの結果は、タプシガルギン処理がミスフォールデッドα１アンチトリプシンタ
ンパク質を小胞体から放出させ、細胞から分泌させることを示している。
【０１８７】 実験６．タプシガルギンの毒性試験 遺伝的に一様な実験用マウスに、通常の飲料水(対照)又はタプシガルギン(終
濃度１μＭ)を含む飲料水を与えた。非対照グループのマウスには、タプシガル
ギン処理した水を３〜７日間にわたって与えた。これらのタプシガルギン水を与
えられたマウスにおいて、注意される死亡も、病気も、副作用もなかった(対照
グループと同じ)。
【０１８８】 前述の詳細な記載は、単に明快な理解を与えるためのものであり、改変は当業
者には明白であるので、無用な制限と解するべきではない。
【０１８９】 この発明は、特定の具体例に関して記載してきたが、更なる変形が可能である
こと及びこの出願が一般にこの発明の原理に従うこの発明の任意の変形、利用又
は改変(この発明が属する分野における公知の又は慣用的実施に該当するような
及び前記のような本質的特徴に適用し得るような及び添付の請求の範囲内に入る
ような本願の開示からの発展を含む)をもカバーすることを意図しているという
ことは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 対照症状における又はサプシガルギンで治療した後のＣＦに冒された気道上皮
細胞から切除したパッチにおけるＣＦＴＲクロリドチャンネル活性。細胞をＩＢ
ＭＸ（１００μＭ）及びフォルスコリン（１０μＭ）で前処理した後にパッチ切
除した。初めにパッチを−５０ｍＶに保ち、次いで電圧プロトコルを通して±１
０ｍＶから±９０ｍＶにステップした。１ｍＭ ＡＴＰが、浴中にチャンネルラ
ンダウンを防ぐために存在した。 未処理のＩＢ３−１細胞から切除した膜パッチからの代表的な単一のチャンネ
ル電流トレース。低コンダクタンスクロリドチャンネル活性が見られなかった。
矢印は、密閉状態を示す。
【図１Ｂ】 図１Ａにおいて、サプシガルギンで治療した後のＩＢ３−１細胞から切除した
膜パッチからの代表的な単一のチャンネル電流。低コンダクタンスクロリドチャ
ンネル活性が電流トレースにおける下方向歪みとして見ることができる。矢印は
、密閉状態を示す。
【図２Ａ】 サプシガルギンで治療した後のＣＦに冒された気道上皮細胞におけるＣＦＴＲ
チャンネルの特性表示。 図１Ｂ中に表わされる低コンダクタンスチャンネルの電流対電圧関係。平均の
単一のチャンネルコンダクタンスは、１１．８ｐＳであった。
【図２Ｂ】 図２Ａにおいて＋８０ｍＶにおける全点ヒストグラム。最初のピークの下の面
積は密閉状態で費やされた時間を表わし、第二のピークの下の面積は開放状態で
費やされた時間を表わす。計算された開放状態確率は、０．１２である。
【図３】 サイトソルｃＡＭＰの上昇が短絡電流に与える作用。ＣＦＰＡＣ又はＴ８４細
胞の単層を１０μＭフォルスコリン及び１００μＭ ＩＢＭＸのｃＡＭＰ刺激カ
クテルに暴露した。棒は、ｃＡＭＰ刺激カクテルで処理した後に検出されるフロ
セミドセンシチブであるＩｓｃ増大％を示す。星印は、未処理のＣＦＰＡＣ細胞
（ｎ＝１２）とサプシガルギン処理されたＣＦＰＡＣ細胞（ｐ＝０．０２，＊）
（ｎ＝１２）か又はＴ８４細胞（ｐ＝０．００４，＊）（ｎ＝１２）のいずれか
との間の有意の差に印を付ける。エラー棒＝ＳＥＭ。
【図４】 未処理のＣＦ−ＰＡＣ細胞及びサプシガルギン処理されたＣＦ−ＰＡＣ細胞に
おける突然変異ΔＦ５０８ＣＦＴＲタンパク質の共焦の免疫蛍光位置測定。未処
理のＣＦ−ＰＡＣ細胞又はサプシガルギン処理しておいたＣＦ−ＰＡＣ細胞に、
ＣＦＴＲタンパク質に対して向けた抗体を使用した共焦の免疫蛍光ラベリングを
施した。 未処理細胞は、正面を向いて（Ａ）又はＸＺ断面（Ｃ）で見たときに、ＣＦＴ
Ｒタンパク質のもっぱら細胞内の位置測定に一致する染色パターンを示した。細
胞表面ラベリングは検出できなかった。対照して、正面を向いて（Ｂ）又はＸＺ
断面（Ｄ）で見たサプシガルギン処理された細胞は、先端プラズマ膜において微
じゅう毛の明るい染色を示す。細胞内シグナルは、処理された細胞において著し
く減少される。このように、サプシガルギン処理は、ΔＦ５０８突然変異ＣＦＴ
Ｒタンパク質を細胞内区画から先端細胞表面における適した機能的滞留の現場へ
の再局在化を誘発する。単層の幅は１１μである。
【図５】 噴霧されたサプシガルギンに暴露したΣＣＦＢＥ２９０− ＣＦ気道上皮細胞
中のΔＦ５０８ＣＦＴＲタンパク質の分布。ΣＣＦＢＥ２９０−気道上皮細胞を
透過質フィルター支持体上で増殖させて合流させた。細胞をそれらの先端表面（
Ａ、Ｂ）を入浴させる培地に溶解したサプシガルギン、噴霧されたサプシガルギ
ン（Ｅ、Ｆ）に暴露し又はサプシガルギン処理せず（Ｃ、Ｄ）かつ免疫蛍光のた
めに処理した。パネルＡ、Ｃ及びＥは、ΔＦ５０８ＣＦＴＲタンパク質の免疫蛍
光染色を表わし；パネルＢ、Ｄ及びＦは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ α−サブユ
ニットの基底外側の局在化を表わす。ΔＦ５０８ＣＦＴＲタンパク質は、未処理
の細胞において検出することができないが、噴霧した又は溶解したサプシガルギ
ンで処理された細胞の先端表面に同じ程度に存在する。単層の幅は９μである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/713 Ａ６１Ｋ 31/713 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 3/06 3/10 3/10 11/00 11/00 13/00 13/00 31/12 31/12 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｆターム(参考） 4C076 AA24 AA93 BB27 CC15 CC26 CC27 CC35 FF68 4C084 AA13 AA17 MA13 MA56 NA14 ZA59 ZB33 ZB35 ZC33 ZC35 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 MA13 MA57 NA10 NA14 ZA59 ZB21 ZB26 ZB33 ZC33 ZC35 4C206 AA01 AA02 CA19 MA01 MA04 MA33 MA77 NA10 NA14 ZA59 ZB21 ZB26 ZB33 ZC33 ZC35

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＥＲからのタンパク質の放出を可能にする作用物質を投与す
    ることを含む、病気又は臨床症状を治療する方法。
  2. 【請求項２】 病気又は臨床症状が、少なくとも一部ミスアセンブルド又は
    ミスフォルディドタンパク質の小胞体に関連した保持又は分解の結果である請求
    項１の方法。
  3. 【請求項３】 作用物質が小胞体からのミスアセンブルド又はミスフォルデ
    ィドタンパク質の放出を可能にする請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 タンパク質が糖タンパク質である請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 病気又は臨床症状をのう胞性繊維症、慢性閉塞性肺疾患、発
    作性夜間ヘモグロビン尿症、家族性高コレステロール血症、テイ−サックス病、
    ウイスル病、腫瘍性病、遺伝性ミエロペルオキシダーゼ欠損症及び先天性インシ
    ュリン抵抗性からなる群より選ぶ請求項１の方法。
  6. 【請求項６】 作用物質がカルシウムポンプ阻害因子である請求項１の方法
    。
  7. 【請求項７】 作用物質がＵＤＰグルコース：糖タンパク質グリコシルトラ
    ンスフェラーゼの機能的活性を低減させる又は抑制する請求項１の方法。
  8. 【請求項８】 作用物質が小胞体Ｃａ＋＋ ＡＴＰａｓｅの活性を低減させ
    る又は抑制する請求項１の方法。
  9. 【請求項９】 作用物質が小胞体中のＣａ＋＋の濃度を下げる請求項１の方
    法。
  10. 【請求項１０】 作用物質が小胞体からＣａ＋＋の放出を引き起こす請求項
    １の方法。
  11. 【請求項１１】 作用物質がＩＰ３レセプター活性を低減させる又は抑制す
    る請求項１の方法。
  12. 【請求項１２】 作用物質がカルネキシン機能的活性を低減させる又は抑制
    する請求項１の方法。
  13. 【請求項１３】 作用物質をサプシガルギン又はその誘導体、シクロピアゾ
    ン酸又はその誘導体、ＤＢＨＱ又はその誘導体、及びハロタン又はその誘導体か
    らなる群より選ぶ請求項１の方法。
  14. 【請求項１４】 作用物質がＵＤＰグルコース：糖タンパク質グリコシルト
    ランスフェラーゼ、カルネキシン及びＣａ＋＋ ＡＴＰａｓｅからなる群より選
    ぶタンパク質にアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである請求項１の方法。
  15. 【請求項１５】 作用物質を肺系に投与する請求項１の方法。
  16. 【請求項１６】 作用物質をエーロゾルとして投与する請求項１の方法。
  17. 【請求項１７】 ＵＤＰグルコース：糖タンパク質グリコシルトランスフェ
    ラーゼの機能的活性を低減させる又は抑制する作用物質を投与する工程を含む、
    細胞の小胞体からミスアセンブルド又はミスフォルディドタンパク質を放出する
    方法。
  18. 【請求項１８】 小胞体Ｃａ＋＋ ＡＴＰａｓｅの活性を低減させる又は抑
    制する作用物質を投与する工程を含む、細胞の小胞体からミスアセンブルド又は
    ミスフォルディドタンパク質を放出する方法。
  19. 【請求項１９】 小胞体中のＣａ＋＋の濃度を下げる作用物質を投与する工
    程を含む、細胞の小胞体からミスアセンブルド又はミスフォルディドタンパク質
    を放出する方法。
  20. 【請求項２０】 カルネキシン機能的活性を低減させる又は抑制する作用物
    質を投与する工程を含む、細胞の小胞体からミスアセンブルド又はミスフォルデ
    ィドタンパク質を放出する方法。
  21. 【請求項２１】 ミスアセンブルド又はミスフォルディドタンパク質の細胞
    内保持を低減させる又は抑制する作用物質を投与する工程を含む、気道上皮細胞
    の先端面のクロリドイオン透過度を増大させる方法。
  22. 【請求項２２】 ＵＤＰグルコース：糖タンパク質グリコシルトランスフェ
    ラーゼの活性を低減させる又は抑制する作用物質を投与する工程を含む、気道上
    皮細胞の先端面のクロリドイオン透過度を増大させる方法。
  23. 【請求項２３】 小胞体Ｃａ＋＋ ＡＴＰａｓｅの活性を低減させる又は抑
    制する作用物質を投与する工程を含む、気道上皮細胞の先端面のクロリドイオン
    透過度を増大させる方法。
  24. 【請求項２４】 小胞体中のＣａ＋＋の濃度を下げる作用物質を投与する工
    程を含む、気道上皮細胞の先端面のクロリドイオン透過度を増大させる方法。
  25. 【請求項２５】 カルネキシン機能的活性を低減させる又は抑制する作用物
    質を投与する工程を含む、気道上皮細胞の先端面のクロリドイオン透過度を増大
    させる方法。
  26. 【請求項２６】 ＵＤＰグルコース：糖タンパク質グリコシルトランスフェ
    ラーゼの活性を低減させる又は抑制する作用物質を投与する工程を含む、のう胞
    性繊維症を治療する又はのう胞性繊維症の症状を緩和する方法。
  27. 【請求項２７】 小胞体Ｃａ＋＋ ＡＴＰａｓｅの活性を低減させる又は抑
    制する作用物質を投与する工程を含む、のう胞性繊維症を治療する又はのう胞性
    繊維症の症状を緩和する方法。
  28. 【請求項２８】 小胞体中のＣａ＋＋の濃度を下げる作用物質を投与する工
    程を含む、のう胞性繊維症を治療する又はのう胞性繊維症の症状を緩和する方法
    。
  29. 【請求項２９】 カルネキシン機能的活性を低減させる又は抑制する作用物
    質を投与する工程を含む、のう胞性繊維症を治療する又はのう胞性繊維症の症状
    を緩和する方法。
  30. 【請求項３０】 下記の工程： ａ）．小胞体中のミスアセンブルド又はミスフォルディド糖タンパク質の細胞
    内保持を示す細胞を候補化合物によって治療し：及び ｂ）．小胞体からミスアセンブルド又はミスフォルディドタンパク質が放出さ
    せる場所を求め、それにより小胞体から候補化合物を奇形のミスアセンブルド又
    はミスフォルディド糖タンパク質の放出を引き起こす作用物質として識別する を含む、ミスアセンブルド又はミスフォルディド糖タンパク質の小胞体に関連し
    た保持又は分解を抑制する作用物質を識別するための候補化合物を選別する方法
    。
  31. 【請求項３１】 下記の工程： ａ）．小胞体中のミスアセンブルド又はミスフォルディド糖タンパク質の細胞
    内保持を示す細胞を候補化合物によって治療し：及び ｂ）．小胞体からミスアセンブルド又はミスフォルディド糖タンパク質が放出
    させる場所を求め、それにより候補化合物を小胞体からミスアセンブルド又はミ
    スフォルディド糖タンパク質の放出を引き起こす作用物質として識別する を含む、ＵＤＰグルコース：糖タンパク質グリコシルトランスフェラーゼの機能
    的活性を抑制する作用物質を識別するための候補化合物を選別する方法。
  32. 【請求項３２】 サプシガルギン、ＤＢＨＱ又はシクロピアゾン酸のエーロ
    ゾル配合物を含む組成物。
  33. 【請求項３３】 ＵＤＰグルコースの活性を低減させる又は抑制する作用物
    質、小胞体Ｃａ＋＋ ＡＴＰａｓｅの活性を低減させる又は抑制する作用物質、
    ＩＰ３レセプター活性を低減させる又は抑制する作用物質、及びカルネキシン機
    能的活性を低減させる又は抑制する作用物質からなる群より選ぶ作用物質を二種
    又はそれ以上含む組成物。
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