JP2017528449A - アミロイドーシスのための標的化免疫療法 - Google Patents

アミロイドーシスのための標的化免疫療法 Download PDF

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Abstract

抗体をアミロイド沈着物にターゲティングするための方法および組成物が開示される。例えば、アミロイド沈着物に結合するアミロイド反応性ペプチドを被験体に投与する。次いで、アミロイド反応性ペプチドに対する抗体を被験体に投与する。抗体を投与すると、アミロイド反応性ペプチドが抗体に結合して、抗体をアミロイド沈着物にプレターゲティングする。他の例では、アミロイド反応性融合ペプチドは、公知の抗体のエピトープを含有する。融合ペプチドを被験体に投与すると、融合ペプチドは、被験体におけるアミロイドに結合する。次いで、融合ペプチドのエピトープに結合する公知の抗体を被験体に投与して、抗体を、融合ペプチドが結合したアミロイド沈着物にターゲティングする。

Description

関連出願への相互参照
本願は、「Ｐｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ」と称される、２０１４年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／０４１，８８８号の優先権利益を主張する。上記優先権出願の開示全体が、本明細書中に参照によって完全に組み込まれる。
政府支援の陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された、補助金番号Ｒ０１ＤＫ０７９９８４のもとで、政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、アミロイド反応性ペプチドおよびアミロイド反応性融合ペプチド（次に、これがアミロイド沈着物に結合する）に結合する抗体に関する。抗体およびアミロイド反応性ペプチドの組み合わせは、細胞応答を誘導して罹患被験体の組織からアミロイド沈着物を取り除くことによって、複数の形態のアミロイドーシスを処置するために使用され得る。
背景
アミロイドーシスは、きわめて重要な臓器および組織におけるタンパク質原線維およびヘパラン硫酸プロテオグリカンの凝集および沈着を特徴とする致死的なタンパク質フォールディング障害である（Ｍｅｒｌｉｎｉ，Ｇら、（２００３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９，５８３−５９６；Ｍｅｒｌｉｎｉ，Ｇら、（２００４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２５５，１５９−１７８；Ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｉ，Ｅら、（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１，１０６５−１０８４；Ｍｅｒｌｉｎｉ，Ｇ．（２００４）Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｍｅｄ．６２，１０４−１０５）。アミロイドの弱まることのない蓄積は常に、臓器機能不全および深刻な罹患率または死亡につながる。沈着は、アルツハイマー病、ハンチントン病もしくはプリオン病を有する患者のように脳性であり得るか、または軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスおよび２型糖尿病を有する患者で見られるように末梢性であり得る。限局性または全身性にさらに下位分類して、前駆体タンパク質が局所的に（沈着部位で）産生されるか、または血流中を循環して遠隔の解剖学的部位に沈着するかについてそれぞれ示されている（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐら、（２００７）Ａｍｙｌｏｉｄ．１４，１７９−１８３）。アミロイドは、腎臓、膵臓、肝臓、脾臓、神経組織以外の任意の臓器または組織を侵し得、心臓は、家族型または散発型の末梢性アミロイド疾患を有する患者における主要な沈着部位を構成する。現在のところ、アルツハイマー病に罹患している米国人は４００万人超であり、この数字は、２０５０年までに１６００万人超に増加すると推定されている。それは、群を抜いて最も一般的な形態のアミロイドーシスであり、最大の社会経済的影響をもたらす。対照的に、末梢性（または全身性）アミロイドーシスは希少障害であるが、米国だけで毎年５０００人超の新たな患者を占めている。
これらのうち、主な末梢性アミロイドーシスは、軽鎖関連（ＡＬ）アミロイドーシス（免疫グロブリン軽鎖タンパク質から構成される原線維の沈着をもたらす散発性モノクローナル形質細胞異形成）である。ＡＬは、すべての末梢性アミロイド症例の約２／３を占めており、米国における年間１００，０００人当たりの推定発生率は約１．４人であり、これは、急性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病のものと同程度である（Ｇｒｏｕｐ，Ｕ．Ｓ．Ｃ．Ｓ．Ｗ．（２００７）Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：１９９９−２００３ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｂ−Ｂａｓｅｄ Ｒｅｐｏｒｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ａｔｌａｎｔａ）。ＡＬの頻度は、関連する形質細胞異形成多発性骨髄腫の１／５程度であるが、部分的には、臓器破壊の進行が急速であること、有効な抗アミロイド治療薬が無いこと、および臓器不全の発症前に疾患を有効に診断不可能であることが原因で、それは、恐らくはより破壊的であり、生存中央値はわずか１３．２カ月間である。全ＡＬ患者の５％未満が、診断時から１０年間またはそれ超生存している（Ｃｏｍｅｎｚｏ，Ｒ．Ｌら、（２００２）Ｂｌｏｏｄ ９９，４２７６−４２８２）。また、心臓性ＡＬアミロイドーシスを有する患者では、生存中央値は５カ月間未満である。
米国における末梢性アミロイドーシスの別の流行型は、慢性炎症性障害、例えば関節炎、結核および家族性地中海熱に関連する炎症関連（ＡＡ）アミロイドーシスである。ＡＡの発生率は、欧州の特定地域で最も高く、頻度は人種集団によって異なる（Ｂｕｃｋ，Ｆ．Ｓら、（１９８９）Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．２，３７２−３７７）。家族性地中海熱が流行しており、未処置の地域では、ＡＡの発生率は、１００％であり得る。欧州では、デンマークで実施された剖検研究に基づく発生率は、０．８６％と推定されている（Ｌｏｆｂｅｒｇ，Ｈら、（１９８７）Ａｃｔａ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ，ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ，ｅｔ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ ９５，２９７−３０２）；しかしながら、関節リウマチまたは乾癬性関節炎の患者では、ＡＡの発症は、２６％程度の高さであり得る。かかる高い有病率は、疾患を早期に検出するスクリーニングプログラムを当然のこととし得る。アミロイドの沈着は、血清アミロイドタンパク質Ａ（ｓＡＡ）（アミロイド原線維の前駆体）の血漿濃度の持続的な増加に関連する（Ｒｏｃｋｅｎ，Ｃら、（２００２）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．４４０，１１１−１２２）。ＡＡは、沈着する前駆体タンパク質の種類の点でＡＬと異なるが、両方とも、原線維形成および沈着に関連する共通の機構的特徴を共有する（Ｒｏｃｋｅｎ，Ｃら、（２００６）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２１０，４７８−４８７；Ｒｏｃｋｅｎ，Ｃら、（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８，１０２９−１０３８）。
アミロイドの病因が十分に確立されている障害に加えて、他の症候群において、アミロイドの構造特性および色素特性を有する原線維沈着が確認されているが、疾患状態との関連性はまだ確立されていない。例えば、２型糖尿病では、膵島アミロイド前駆体タンパク質（ＩＡＰＰ）が、ランゲルハンス島においてアミロイドとして沈着する（Ｊａｉｋａｒａｎ，Ｅ．Ｔら、（２００１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５３７，１７９−２０３）。ＩＡＰＰの凝集は、膵臓細胞に対して毒性のオリゴマー構造をもたらす（Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙら、（２００７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５６，１３２４−１３３２）。したがって、１型糖尿病患者におけるＩＡＰＰアミロイドの形成は、β細胞の破壊に寄与し、インスリン依存への移行をもたらすことが示唆されている（Ｊａｉｋａｒａｎ，Ｅ．Ｔら、（２００１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５３７，１７９−２０３）。別の例では、アテローム性動脈硬化性頚動脈を有する患者の半数超において、アポリポタンパク質Ａ−Ｉから構成されるアミロイド原線維を含有するプラークが確認されている（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐら、（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７，１１８６−１１９２；Ｍｕｃｃｈｉａｎｏ，Ｇ．Ｉら、（２００１）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９３，２７０−２７５）。これらの原線維の沈着は、高齢の患者においてより一般的であるが、ａｐｏＡ−Ｉが、プラーク発生の早期に存在することは間違いない（Ｖｏｌｌｍｅｒ，Ｅら、（１９９１）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．Ａ．Ｐａｔｈｏｌ．Ａｎａｔ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．４１９，７９−８８）。最後の例として、最近、Ａｐｏ−Ａ−Ｉアミロイドは、膝代替手術を受けている患者から得られた膝関節半月板においても確認されたので、関節の物理的劣化に寄与する可能性がある（Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ａら、（２００６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．５４，３５４５−３５５０）。
合計で、２９個超のタンパク質が、アミロイド沈着物中の原線維の構成成分として化学的または血清学的に同定されている。それは、疾患を区別し、処置を決定し、予後診断を確立するこれらのタンパク質の性質である。アミロイド原線維は、臨床的に異種の疾患群に関連し、構造的に区別可能で機能的に多様な前駆体タンパク質を形成し得るが、沈着それ自体は、原線維構造、原線維エピトープ、および類似のアクセサリー分子（ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を含む）の自然増加を含むいくつかの非常に類似する特徴を共有する。アミロイドは、原線維に加えて、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）および特にパールカンＨＳＰＧを含む異種複合体である（Ａｎｃｓｉｎ，Ｊ．Ｂ．（２００３）Ａｍｙｌｏｉｄ １０，６７−７９；Ａｉｌｌｅｓ，Ｌら、（１９９３）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９，４４３−４４８；Ｋｉｓｉｌｅｖｓｋｙ，Ｒ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．９，２３−２４；Ｋｉｓｉｌｅｖｓｋｙ，Ｒ．（１９９０）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６３，５８９−５９１；Ｓｎｏｗ，Ａ．Ｄら、（１９８７）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５６，１２０−１２３；Ｌｉ，Ｊ．Ｐら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ １０２，６４７３−６４７７）。アミロイドおよびアミロイド関連障害の部分的なリストは、（以下の）表１に提供されている。
これまでに、アミロイド沈着物を除去するための最も有効な治療的介入であって、臓器機能の回復を促進し、予後の改善につながり得る治療的介入は、免疫療法の手段としてアミロイド反応性抗体の使用を伴う。ＡＬアミロイドーシスの処置のためのモノクローナル抗体１１−１Ｆ４、ＡＬアミロイドーシスを有する患者のためのＮＥＯＤ００１、アミロイドーシスのためのＧＳＫ２３９８８５２（抗ＳＡＰモノクローナル抗体）、アルツハイマー病のためのソラネズマブ、アルツハイマー病のための静脈内ＩｇＧ（ＩＶＩＧ）、およびアルツハイマー病のためのバピネオズマブを含め、アミロイド関連疾患のためのいくつかの免疫療法（抗体）が開発されている。これらの各アプローチには限界があるか、または大規模な臨床試験（第２／３相）で検証されていない。
Ｍｅｒｌｉｎｉ，Ｇら、（２００３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９，５８３−５９６ Ｍｅｒｌｉｎｉ，Ｇら、（２００４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２５５，１５９−１７８ Ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｉ，Ｅら、（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１，１０６５−１０８４ Ｍｅｒｌｉｎｉ，Ｇ．（２００４）Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｍｅｄ．６２，１０４−１０５ Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐら、（２００７）Ａｍｙｌｏｉｄ．１４，１７９−１８３ Ｃｏｍｅｎｚｏ，Ｒ．Ｌら、（２００２）Ｂｌｏｏｄ ９９，４２７６−４２８２ Ｂｕｃｋ，Ｆ．Ｓら、（１９８９）Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．２，３７２−３７７ Ｌｏｆｂｅｒｇ，Ｈら、（１９８７）Ａｃｔａ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ，ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ，ｅｔ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ ９５，２９７−３０２ Ｒｏｃｋｅｎ，Ｃら、（２００２）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．４４０，１１１−１２２ Ｒｏｃｋｅｎ，Ｃら、（２００６）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２１０，４７８−４８７ Ｒｏｃｋｅｎ，Ｃら、（２００１）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８，１０２９−１０３８ Ｊａｉｋａｒａｎ，Ｅ．Ｔら、（２００１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５３７，１７９−２０３ Ｌｉｎ，Ｃ．Ｙら、（２００７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５６，１３２４−１３３２ Ｊａｉｋａｒａｎ，Ｅ．Ｔら、（２００１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５３７，１７９−２０３ Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ，Ｐら、（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７，１１８６−１１９２ Ｍｕｃｃｈｉａｎｏ，Ｇ．Ｉら、（２００１）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９３，２７０−２７５ Ｖｏｌｌｍｅｒ，Ｅら、（１９９１）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．Ａ．Ｐａｔｈｏｌ．Ａｎａｔ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．４１９，７９−８８ Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ａら、（２００６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．５４，３５４５−３５５０ Ａｎｃｓｉｎ，Ｊ．Ｂ．（２００３）Ａｍｙｌｏｉｄ １０，６７−７９ Ａｉｌｌｅｓ，Ｌら、（１９９３）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９，４４３−４４８ Ｋｉｓｉｌｅｖｓｋｙ，Ｒ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．９，２３−２４ Ｋｉｓｉｌｅｖｓｋｙ，Ｒ．（１９９０）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６３，５８９−５９１ Ｓｎｏｗ，Ａ．Ｄら、（１９８７）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５６，１２０−１２３ Ｌｉ，Ｊ．Ｐら、（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ １０２，６４７３−６４７７
概要
特定の例示的な態様では、アミロイド沈着物に結合するアミロイド反応性ペプチドが提供される。例えば、アミロイド反応性ペプチドは、表１に同定されているアミロイドの１種または複数種に結合する。特定の例示的な実施形態では、アミロイド沈着物に結合するアミロイド反応性融合ペプチドが提供される。アミロイド反応性融合ペプチドは、例えば、公知の抗体のエピトープに融合される。特定の例示的な態様では、アミロイド反応性ペプチドに結合する抗体が提供される。アミロイド反応性融合ペプチドのエピトープに結合する抗体（アミロイド反応性抗体を含む）も提供される。
特定の例示的な態様では、クリアランスすべきアミロイド沈着物をターゲティングする方法が提供される。前記方法は、例えば、アミロイド沈着物を、アミロイド沈着物に結合するアミロイド反応性ペプチドと接触させることを含む。前記方法はまた、アミロイド反応性ペプチドを、アミロイド反応性ペプチドに結合する抗体と接触させることを含む。アミロイド反応性ペプチドと、アミロイド反応性ペプチドに結合する抗体との接触は、クリアランスすべきアミロイド沈着物をプレターゲティングする。その後、アミロイド沈着物のプレターゲティングは、沈着物のクリアランスをもたらす。
特定の例示的な態様では、被験体におけるアミロイド沈着物を取り除くための方法が提供される。前記方法は、例えば、アミロイドーシスを有する被験体を選択すること、およびアミロイド沈着物に結合するアミロイド反応性ペプチドを前記被験体に投与することを含む。アミロイド反応性ペプチドの投与に加えて、前記方法は、アミロイド反応性ペプチドに結合する抗体またはその官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）もしくは機能的断片を被験体に投与することを含む。被験体への抗体またはその機能的断片の投与は、被験体におけるアミロイド沈着物のクリアランスをもたらし、それにより被験体を処置する。
特定の例示的な態様では、アミロイド反応性ペプチドは、アミロイド反応性ペプチドに結合されたエピトープを含む。エピトープは、例えば、公知の抗体のエピトープである。被験体に投与される場合、例えば、エピトープに対する抗体またはその機能的断片の結合は、アミロイド沈着物のクリアランスの増加をもたらす。特定の例示的な態様では、エピトープは、アミロイド反応性抗体に結合するためのモチーフを含む。例えば、抗体はアミロイド反応性抗体であるので、アミロイド沈着物のエピトープに直接的に結合し得る。
特定の例示的な態様では、被験体におけるアミロイド沈着物を取り除くための方法が提供される。前記方法は、例えば、アミロイドーシスを有する被験体を選択すること、および有効量のアミロイド反応性融合ペプチドを前記被験体に投与することを含む。アミロイド反応性融合ペプチドは、アミロイド沈着物に結合するアミロイド反応性ペプチドと、前記アミロイド反応性ペプチドに融合されたエピトープであって、抗体に結合するエピトープとを含む。前記方法はまた、有効量の抗体またはその断片を被験体に投与することを含む。アミロイド反応性融合ペプチドに対する抗体またはその断片の結合は、アミロイド沈着物のクリアランスをもたらす。
特定の例示的な態様では、キットが提供される。前記キットは、例えば、有効量のアミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドと、前記アミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドに結合する有効量の抗体とを含む。前記キットはまた、前記キットを使用するための、例えば本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチド、融合ペプチドおよび抗体を投与するための指示を場合により含む。
特定の例示的な態様では、アミロイド反応性ペプチド（例えば、表２に同定されているアミロイド反応性ペプチド）に対する結合親和性を有する実質的に純粋な抗体が提供される。
当業者であれば、示されている例示的な実施形態に関する以下の詳細な記載を考慮することによって、例示的な実施形態のこれらのおよび他の態様、目的、特徴および利点が明らかになるはずである。
図１Ａ〜１Ｂは、アミロイド反応性ペプチドを介した（例えば、ｐ５またはｐ５＋１４）（図１Ａ）、およびアミロイド反応性ペプチド（例えば、ｐ５または０５＋１４）に結合した抗体エピトープ（例えば、ペプチドＡ１２）を介した（図１Ｂ）、アミロイドへの抗体のターゲティングを示す概略図である。
図２は、特定の例示的な実施形態にしたがって、ペプチドｐ４３またはｐ５＋１４でコーティングした、λ６可変ドメイン（ｒＶλ６Ｗｉｌ、別名 ＷＩＬ）から構成される合成軽鎖関連（ＡＬ）原線維へのモノクローナル抗体クローン４、５、１２および１３のターゲティングを実証するグラフである。
図３は、特定の例示的な実施形態にしたがって、ペプチドｐ４３またはｐ５＋１４でコーティングしたマウスＡＡアミロイド関連アミロイド抽出物（ＡＥＦ）への抗体クローン４、５、１２および１３のターゲティングを実証するグラフである。
図４は、特定の例示的な実施形態にしたがって、モノクローナル抗体クローン４、５、１２および１３が、溶液からビオチン化ペプチドｐ５＋１４を捕捉し得ることを実証するグラフである。
図５は、特定の例示的な実施形態にしたがって、ＡＡ ＡＥＦのプレターゲティングと、プレインキュベートした複合体の標準的な一段階結合との比較を示すグラフである。
図６は、特定の例示的な実施形態にしたがって、ペプチドｐ５＋１４がアミロイド沈着物と共局在する（左欄）（これは、コンゴーレッド染色組織切片においても観察される（右欄））ことを実証する一連の顕微鏡写真である。
図７は、特定の例示的な実施形態にしたがって、ペプチドの存在下および非存在下における、アミロイド沈着物に対するモノクローナル抗体クローン４、５、１２および１３の結合を比較する一連の顕微鏡写真である。
図８は、特定の例示的な実施形態にしたがって、ｐ６６のアミノ酸配列に基づくｐ６６の２つの予測構造を示す概略図である。
図９は、特定の例示的な実施形態にしたがって、公知の１１−１Ｆ４エピトープペプチド［Ｌｅｎ（１−２２）］と比較した、ｐ６６（１１−１Ｆ４ペプトープ）に対する１１−１Ｆ４の結合を示すグラフであり、ｐ６６のエピトープ部分がｐ５＋１４配列の存在によって損なわれないことを実証している。
図１０は、特定の例示的な実施形態にしたがって、１１−１Ｆ４が、低い親和性で、ＷｉｌおよびＡβ（１−４０）アミロイド原線維の両方に結合することを実証するグラフである。
図１１は、特定の例示的な実施形態にしたがって、ｐ６６の存在下では、特にＷｉｌ原線維に対して、しかしＡβ（１−４０）原線維に対しても１１−１Ｆ４モノクローナル抗体の反応性が増強されることを実証するグラフである。
図１２は、特定の例示的な実施形態にしたがって、原線維物質がｐ６６の結合に必要であり、したがって抗体のｐ６６媒介性ターゲティングに必要であることを実証するグラフである。
図１３は、特定の例示的な実施形態にしたがって、ペプチドｐ６６およびｐ５＋１４が、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（図１３Ａ）および１．０Ｍ ＮａＣｌ（図１３Ｂ）中で合成アミロイドサンプルおよび天然に存在するアミロイドサンプルに同等に良く結合することを示す一組のグラフである。
図１４は、特定の例示的な実施形態にしたがって、マウスに注射したｐ６６が、インビボで様々な組織におけるアミロイド沈着物に選択的に結合することを実証する一連のマイクロオートラジオグラフおよびコンゴーレッド染色顕微鏡写真である。
図１５は、特定の例示的な実施形態にしたがって、健常野生型マウスに注射したｐ６６が、インビボで調査した組織のいずれにも結合しないことを実証する一連のマイクロオートラジオグラフである。
図１６は、特定の例示的な実施形態にしたがって、インビボにおける、注射後（ｐｉ）４時間および７２時間のＡＡマウスにおける１２５Ｉ−ｐ６６のＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング（図１６Ａ）、ならびに注射後（ｐｉ）２時間のＡＡおよびＷＴ（健常、アミロイドフリー）マウスにおける１２５Ｉ−ｐ６６の組織生体内分布（図１６Ｂ）を示す画像（図１６Ａ）およびグラフ（図１６Ｂ）である。
図１７は、特定の例示的な実施形態にしたがって、インビボにおける、ペプトープｐ６６でプレターゲティングしたＡＡマウスに１１−１Ｆ４モノクローナル抗体を注射した２４時間後のマウスの評価を示す、様々な組織型からの一連の顕微鏡写真およびマイクロオートラジオグラフである。ペプチドｐ６６は、１２５Ｉ−１１−１Ｆ４モノクローナル抗体およびＡＡアミロイドと共局在することが示されている。
図１８は、特定の例示的な実施形態にしたがって、ｐ５＋１４対照ペプチドでプレターゲティングしたＡＡマウスに１２５Ｉ−１１−１Ｆ４モノクローナル抗体を注射した２４時間後のマウスの評価を示す、様々な組織型からの一連のマイクロオートラジオグラフである。ｐ５＋１４対照ペプチドのみでマウスを前処置するとき、１１−１Ｆ４モノクローナル抗体は、アミロイドに局在しない。
図１９は、特定の例示的な実施形態にしたがって、ｐ６６またはｐ５＋１４を前注射し、１１−１Ｆ４モノクローナル抗体を注射した７２時間後のＡＡマウスにおける肝臓マクロファージの評価を示す一連の顕微鏡写真である。ｐ６６と１１−１Ｆ４モノクローナル抗体との組み合わせは、肝臓周囲のアミロイド沈着物におけるマクロファージ蓄積の増加をもたらす。
例示的な実施形態の詳細な説明
概要
アミロイド反応性ペプチド、アミロイド反応性融合ペプチド、ならびにアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドに対する抗体を含む組成物が本明細書に記載される。アミロイドーシスの処置のためにこれらを使用する方法も本明細書に記載される。例えば、前記アミロイド反応性ペプチド、アミロイド反応性融合ペプチドおよび抗体は、アミロイドーシスを有する被験体におけるアミロイド沈着物を標的とするために使用され得る。被験体におけるアミロイド沈着物をターゲティングすることによって、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチド、アミロイド反応性融合ペプチド、抗体および方法は、被験体自身の免疫系によるアミロイド沈着物のクリアランスを開始させる。すなわち、記載されるアミロイド反応性ペプチド、アミロイド反応性融合ペプチド、抗体および方法は、アミロイドーシスを有する被験体をこのように処置する。
より具体的には、アミロイド沈着物を構成するアミロイドの１種または複数種の成分（例えば、タンパク質原線維またはグリコサミノグリカン）に結合するアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドが提供される。例えば、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、複数のアミロイド沈着物型に結合する汎アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドであり得る。
アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドに結合する抗体も提供される。例えば、前記抗体は、前記抗体が１種または複数種のアミロイド反応性ペプチドに結合するように、アミロイド反応性ペプチドの１種または複数種に対して生じる。アミロイド反応性ペプチドの１種または複数種が被験体に投与されると、例えば、アミロイド反応性ペプチドは、被験体内のアミロイド沈着物に局在するおよび被験体内のアミロイド沈着物に結合する。その後、前記抗体が被験体に投与されると、前記抗体は、アミロイド反応性ペプチドに結合する。このように、前記抗体は、アミロイド反応性ペプチドを介してアミロイド沈着物に間接的に結合する。
加えてまたはあるいは、特定の例では、アミロイド反応性ペプチドは、公知の（対応する）抗体の「エピトープ」ペプチドに融合されて、アミロイド反応性融合ペプチドを形成する。例えば、エピトープは、アミロイド反応性ペプチドのＣ末端に融合され得る。融合されたエピトープを用いて、前記抗体は、アミロイド反応性ペプチドのペプチドエピトープ（「ペプトープ」）を認識してそれに結合する。かかるペプトープ含有アミロイド反応性融合ペプチドが被験体に投与されると、例えば、前記ペプチドは、被験体内のアミロイド沈着物に局在および結合する。次いで、被験体への前記抗体の投与は、ペプトープを介したアミロイド反応性融合ペプチドに対する前記抗体の結合をもたらす。
加えてまたはあるいは、特定の例では、アミロイド反応性ペプチドのエピトープ部分は、アミロイド反応性抗体の公知のエピトープである。すなわち、前記抗体は、１種または複数種のアミロイドタンパク質に結合することが公知である。したがって、アミロイド反応性ペプチドに対するアミロイド反応性抗体エピトープの融合は、アミロイド反応性抗体エピトープを介したアミロイド反応性融合ペプチドに対するアミロイド反応性抗体の結合を可能にする。アミロイド反応性抗体エピトープを含有するかかるアミロイド反応性融合ペプチドが被験体に投与されると、前記ペプチドは、被験体内のアミロイド沈着物に局在および結合する。次いで、被験体へのアミロイド反応性抗体の投与は、ペプトープを介したアミロイド反応性融合ペプチドに対するアミロイド反応性抗体の結合をもたらす。さらに、前記抗体はアミロイド反応性抗体であるので、前記抗体はまた、アミロイド沈着物に直接的に結合する。
かかる融合ペプチドの例では、汎アミロイド反応性融合ペプチドがアミロイド沈着物型の全部または一部に結合する能力は、単一の抗体の投与が、複数のアミロイド沈着物型に対して有効であることを可能にする。換言すれば、アミロイド反応性抗体は、１つまたは少数のアミロイド型にのみ結合し得る一方、（アミロイド反応性抗体エピトープを含む）アミロイド反応性融合ペプチドの使用は、アミロイド反応性抗体を複数のアミロイド型に対してプレターゲティングし得る。アミロイド反応性抗体の使用は、アミロイド反応性抗体が反応性であるアミロイド沈着物を直接的にターゲティングするというさらなる利点を有する。
いかなる特定の理論にも縛られないが、−本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドに対する結合を介した−アミロイド沈着物に対するアミロイド反応性抗体の結合は、例えば、オプソニン化およびファゴサイトーシスなどのプロセスを介したアミロイド沈着物のクリアランスをもたらすと考えられる。換言すれば、アミロイド沈着物に対する抗体の局在化は、オプソニン化および／またはファゴサイトーシスが、ターゲティングされたアミロイド沈着物の全部または一部を除去する免疫応答を引き起こすと考えられる。アミロイドーシスを患っている被験体におけるアミロイド沈着物のクリアランスを開始および促進することによって、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチド、アミロイド反応性融合ペプチド、抗体および方法は、被験体を処置するために使用され得る。さらに、アミロイド反応性融合ペプチドに結合する公知のアミロイド反応性抗体を使用することによって、本明細書に記載される方法および組成物は、既存の抗体（非アミロイド特異的抗体を含む）をアミロイドーシスの処置における使用に適合させることを可能にする。
用語の概要
特に注記がない限り、技術用語は、通常の使用法にしたがって使用される。分子生物学における共通用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔ，２００８（ＩＳＢＮ ０７６３７５２２２３）；Ｋｅｎｄｒｅｗら、（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ ９７８０４７１１８５７１０）および他の類似参考文献に見出され得る。本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明確な指示がない限り、単数形および複数形の両方を指す。「ｅ．ｇ．」という略語は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、「ｅ．ｇ．」という略語は、「例えば」という用語と同義である。本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
核酸またはポリペプチドについて示されているすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよびすべての分子量または分子量値は近似値であり、記載のために提供されていることをさらに理解すべきである。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に使用し得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合、用語の説明を含め、本明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示的なものに過ぎず、限定的であることを意図しない。本開示の様々な例示的な実施形態の概説を容易にするために、特定の用語の説明を以下に提供する。
「アミロイド反応性ペプチド」は、アミロイド沈着物、例えば表１に同定されているアミロイドのいずれかに結合するペプチドである。アミロイド反応性ペプチドはまた、「汎」アミロイド結合ペプチドであり得、アミロイド反応性ペプチドが複数のアミロイド型に結合することを意味する。「アミロイド反応性融合ペプチド」は、例えば、エピトープなどの別のペプチドに融合されて融合ペプチドをもたらすアミロイド反応性ペプチドである。
「投与」または「投与すること」は、選択経路による被験体への組成物の導入を指す。例えば、選択経路が静脈内である場合、組成物は、組成物を被験体の静脈に導入することによって投与される。いくつかの例では、本明細書に開示されるペプチドおよび抗体は、被験体に投与される。
「動物」は、例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーの、生きている多細胞脊椎動物生物を指す。
「抗体」は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラおよびヘテロ免疫グロブリン（モノクローナル抗体が好ましい）のクラスに属する一本鎖、二本鎖および多重鎖タンパク質および糖タンパク質を指す；それはまた、これらの免疫グロブリンの合成変異体および遺伝子操作変異体を含む。「抗体断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ならびに所望の１つまたは複数の標的エピトープに対する特異性を有する抗体の任意の部分を含む。「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンによって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、ミエローマ細胞と免疫脾臓細胞との融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって産生される。
「エピトープ」は、抗体アミノ酸配列の特異性によって決定される、抗体によって認識される抗原上の部位を指す。エピトープは、抗原決定基とも称される。例えば、エピトープは、特定の抗体によって認識される組換えタンパク質の一部であり得る。さらに、エピトープは、立体構造エピトープおよび線状エピトープであり得る。
「キメラ抗体」は、２つの異なる抗体（これらは、典型的には異なる種のものである）由来の配列を含む抗体を指す。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒトおよびマウス抗体断片、一般にヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体（典型的には、マウス）およびヒト抗体由来の抗体であって、親抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持するが、ヒトにおいて低免疫原性の抗体を指す。
「相補性決定領域」またはＣＤＲは、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を共に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３とそれぞれ称される３つのＣＤＲを有する。定義によれば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）によって示されているナンバリング規則を使用して、軽鎖のＣＤＲは、２４位および３４位（Ｌ−ＣＤＲ１）、５０位および５６位（Ｌ−ＣＤＲ２）、８９位および９７位（Ｌ−ＣＤＲ３）の残基によって結合される；重鎖のＣＤＲは、３１位および３５ｂ位（Ｈ−ＣＤＲ１）、５０位および６５位（Ｈ−ＣＤＲ２）、９５位および１０２位（Ｈ−ＣＤＲ３）の残基によって結合される。
「フレームワーク領域」は、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列を指す。抗体のこれらの部分は、ＣＤＲを、抗原結合のための適切な配向で保持するのに役立つ。
「特異性決定残基」またはＳＤＲは、抗原接触に直接的に関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。
「定常領域」は、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。本発明では、変異体抗体は、ヒト免疫グロブリン由来の定常領域を含む。重鎖定常領域は、α、δ、ε、γまたはμの５つのアイソタイプのいずれかから選択され得る。様々なサブクラス（例えば、重鎖のＩｇＧサブクラス）の重鎖が、異なるエフェクター機能に関与する。したがって、所望の重鎖定常領域を選択することによって、所望のエフェクター機能を有するヒト化抗体を産生し得る。軽鎖定常領域は、κ型またはλ型、好ましくはκ型であり得る。
「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、任意の天然に存在するアミノ酸、任意の天然に存在しないアミノ酸、任意の改変（誘導体化を含む）アミノ酸、または当技術分野で公知の任意のアミノ酸模倣物を指す。アミノ酸は、それらの共通の３文字略語および１文字略語の両方によって言及され得る。
「アミロイド」、「アミロイド沈着物」または「アミロイド原線維」という用語は、特定の構造的特徴を共有する不溶性線維性タンパク質凝集体を指す。臓器におけるアミロイドの異常蓄積は、アミロイドーシスにつながり得る。それらは出現の点で多様であるが、すべてのアミロイドは、共通の形態学的特性（例えば、コンゴーレッドなどの特定の色素による染色）を有し、染色後に偏光によって特徴的な赤緑色の複屈折様相を有する。アミロイドはまた、共通の超微細構造特徴ならびに共通のＸ線回折スペクトルおよび赤外スペクトルを共有する。
「アミロイドーシス」は、アミロイド沈着物の存在などのアミロイドの存在を特徴とする病理学的状態または疾患を指す。
「取り除く（ｃｌｅａｒ）」または「クリアランス」は、測定可能な程度の軽減または除去を指す。例えば、本明細書に記載されるアミロイド沈着物のクリアランスは、沈着物を、測定可能なまたは識別可能な程度に軽減または除去することに関する。
「キャリア」は、通常の薬学的に許容され得るキャリアを指す。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ（１９９５）には、本明細書に開示されるペプチドの薬学的送達に適切な組成物および製剤が記載されている。一般に、キャリアの性質は、用いられる特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的および生理学的に許容され得る流体、例えば水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどをビヒクルとして含む注射液を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル形態）の場合、通常の非毒性固体キャリアとしては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。生物学的に中性なキャリアに加えて、投与すべき医薬組成物は、例えば、微量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。
例示的なキャリアとしては賦形剤または安定剤であって、用いられる投与量および濃度でそれらに曝露される細胞、組織、哺乳動物または被験体に対して非毒性の賦形剤または安定剤が挙げられる。多くの場合、薬学的に許容され得るキャリアは、水性ｐＨ緩衝溶液である。薬学的に許容され得るキャリアの例としては、限定されないが、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤も挙げられる。本明細書で使用されるキメラ抗体は、２つの異なる抗体（これらは、典型的には異なる種のものである）由来の配列を含む抗体を指す。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒトおよびマウス抗体断片、一般にヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
「ＤＮＡ」（デオキシリボ核酸）は、ほとんどの生物の遺伝物質を構成する長鎖ポリマーを指す（いくつかのウイルスは、リボ核酸（ＲＮＡ）から構成される遺伝子を有する）。ＤＮＡポリマーにおける反復単位は４つの異なるヌクレオチドであり、これらはそれぞれ、リン酸基が結合したデオキシリボース糖に結合した４つの塩基（アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン）の１つを含有する。ヌクレオチドのトリプレット（コドンと称される）は、ポリペプチド中の各アミノ酸をコードする。コドンという用語はまた、ＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ中の３つのヌクレオチドの対応する（および相補的な）配列に使用される。
「有効量」または「適切な量」または「治療有効量」は、有益なまたは所望の臨床的または生化学的結果を達成するのに十分な物質の量を指す。有効量は、１回またはそれを超えて投与され得る。例えば、本明細書に記載されるペプチドまたは融合ペプチドの有効量は、アミロイドに結合するのに十分な量であって、アミロイドの検出を可能にするのに十分な量である。本明細書に記載されるペプチドまたは融合ペプチドは、例えば、約１μｇ／ｋｇ体重〜約３０ｍｇ／ｋｇを超える量で非経口投与される場合に有効であり得る。本明細書に記載される抗体の治療有効量（ｔｈｅｉｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）は、本明細書に記載されるペプチドまたは融合ペプチドに結合するのに十分な量である。
「免疫細胞」は、宿主防御機構に関与する任意の細胞を指す。これらとしては、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、肥満細胞、マクロファージ、抗原提示細胞、好塩基球、好酸球および好中球が挙げられ得る。「免疫応答」は、刺激に対する免疫系の細胞（例えば、マクロファージ、好中球、Ｂ細胞またはＴ細胞）の応答である。
「標識」は、別の分子の検出を容易にするために、その分子に直接的または間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物または組成物を指す。標識の特定の非限定的な例としては、蛍光タグ、化学発光タグ、ハプテン、酵素結合および放射性同位体が挙げられる。
「哺乳動物」は、ヒト、家庭動物および農場動物ならびに動物園動物、スポーツ動物またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなどを含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。哺乳動物は、ヒトであり得る。
「作動可能に連結された」は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれるときに、第１の核酸配列が第２の核酸配列に接続されていることを指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、同じリーディングフレームにおいて近接している。
本明細書で使用される「オプソニン化する」または「オプソニン化」は、宿主の細胞性免疫系が標的を「異物（ｆｏｒｅｉｇｎ）」として免疫グロブリンによって認識することを指す。例えば、アミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドを介したアミロイド沈着物に対する免疫グロブリン（例えば、本明細書に記載される抗体）の結合は、アミロイド原線維の貪食を増強する。
「ペプチド」は、２つもしくはそれを超えるアミノ酸（アミノ酸の化学改変体および誘導体を含む）を含むか、または前記アミノ酸からなる任意のペプチドまたはペプチド模倣構造体を指す。例えば、ペプチドは、抗体に結合され得るエピトープを含むように改変され得る。特定の例示的な実施形態では、ペプチドは、アミロイド反応性ペプチド（これは、ペプチドが、アミロイドに結合することによってアミロイドと反応することを意味する）であり得る。
「ポリペプチド」は、単量体が、アミド結合を介して互いに接続されたアミノ酸残基であるポリマーを指す。アミノ酸がα−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれかが使用され得、Ｌ−異性体が好ましい。本明細書で使用される「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質などの改変配列を含むことを意図する。「ポリペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質、および組換え的または合成的に産生されるタンパク質をカバーすることを特に意図する。いくつかの例では、ポリペプチドは、１種または複数種の本明細書に開示されるペプチドである。本明細書で使用される「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」または「融合ペプチド」という用語は、ペプチドの部分と、タンパク質に付加された別の部分とを有する天然に存在しないタンパク質を指す。例えば、抗体エピトープは、タンパク質に共有結合されて融合タンパク質を形成し得る。
「タンパク質」は、遺伝子によってコードされる生物学的分子であって、アミノ酸から構成される生物学的分子を指す。
「医薬品」は、被験体または細胞に適切に投与された場合に、所望の治療効果または予防効果を誘導することができる化合物または組成物を指す。例えば、医薬品は、本明細書に記載されるペプチドおよび本明細書に記載される抗体を含み得、その投与は、アミロイド沈着物のクリアランスをもたらす。
「精製された」または「単離された」分子は、それらの天然環境から取り出された生物学的分子または合成分子であって、それらに天然に会合している他の成分から単離または分離されており、前記成分を含まない生物学的分子または合成分子を指す。「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要としない；むしろ、それは、相対的な用語を意図する。したがって、例えば、精製されたまたは「実質的に純粋な」タンパク質調製物は、細胞内または生成反応チャンバー内で（適切であるように）、言及されているタンパク質が、その天然環境にあるタンパク質よりも純粋なものである。
「組換え」核酸は、天然に存在しない配列を有するか、または他の方法で分離された２つの配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有する核酸である。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成によって、またはより一般的には単離された核酸セグメントの人工的な操作によって、例えば遺伝子工学技術によって達成される。
「特異的に結合する」という用語は、２つの分子間の、例えば本発明のペプチドとアミロイドとの間の非ランダム結合反応を指す。「特異的に結合する」という用語は、「選択的にターゲティングする」または「選択的に会合する」と互換的に使用され得る。
アミロイドに関して、「選択的にターゲティングする」または「選択的に会合する」という用語は、例えば、アミロイドへの選択的局在化または結合を指す。例えば、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドは、沈着物に結合することによってアミロイド沈着物をプレターゲティングする。次いで、本明細書に記載されるように、例えばオプソニン化のために、前記ペプチドまたは融合ペプチドに結合する抗体は、アミロイドを標的とする。
「配列同一性」は、２つの核酸配列または２つのアミノ酸配列間の類似性を指し、配列間の類似性（配列同一性と別称される）に関して表される。配列同一性は、同一性（または類似性もしくは相同性）の割合に関してしばしば測定される；割合が高いほど、２つの配列はより類似する。
比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ Ｇｅｎｅ ７３：２３７−２４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，１０８８１−９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ．Ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８，１５５−６５，１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４，３０７−３１，１９９４．Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）に記載されており、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な考察が示されている。
配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびインターネット上を含むいくつかの供給源から入手可能である。
「被験体」は、脊椎動物を指す。脊椎動物は、哺乳動物、例えばヒトであり得る。被験体は、ヒト患者であり得る。被験体は、疾患または症状（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を患っているまたは疾患または状態を患っていると疑われる患者であり得、処置もしくは診断を必要とし得るか、または疾患もしくは症状の進行のモニタリングを必要とし得る。患者はまた、有効性のモニタリングを必要とする処置治療中であり得る。一部の例示的な実施形態では、被験体としては、アミロイドーシス、例えばアルツハイマー病、ハンチントン病もしくはプリオン病、または軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスおよび２型糖尿病を有する患者に認められるような末梢性アミロイドーシスを患っている被験体が挙げられる。
「処置する」または「処置」という用語は、疾患または病理学的状態の発症開始後に、該疾患または病理学的状態の徴候または症候を改善する治療的介入を指す。疾患または病理学的状態に関して、「改善すること（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」という用語は、処置の任意の観察可能で有益な効果を指す。有益な効果は、例えば、感受性の強い被験体における疾患の臨床症候の発症の遅延、疾患の一部もしくは全部の臨床症候の重症度の軽減、疾患進行の減速、被験体の健康全般もしくは健康（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）の改善によって、または当技術分野で周知の他のパラメータであって、特定の疾患に特異的なパラメータによって証明され得る。「予防的」処置は、病状を発症するリスクを減少させる目的で、疾患の徴候を示していない被験体、または初期徴候のみを示す被験体に施行される処置である。
「ベクター」は、宿主細胞に導入され、それにより形質転換宿主細胞をもたらす核酸分子を指す。組換えＤＮＡベクターは、組換えＤＮＡを有するベクターである。ベクターは、宿主細胞においてそれが複製することを可能にする核酸配列、例えば複製起点を含み得る。ベクターはまた、１種または複数種の選択可能マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝子エレメントを含み得る。ウイルスベクターは、１種または複数種のウイルス由来の少なくともいくつかの核酸配列を有する組換えＤＮＡベクターである。ベクターという用語は、プラスミド、線状核酸分子、ならびに全体を通して記載されるようにアデノウイルスベクターおよびアデノウイルスを含む。
アミロイド反応性ペプチド
特定の例示的な実施形態では、アミロイドに特異的に結合し、したがって本明細書に記載される様々な方法および医薬組成物において有用なアミロイド反応性ペプチドおよびアミロイド反応性融合ペプチドが提供される。「アミロイド反応性」ペプチドとして、前記ペプチドは、アミロイドおよび／またはアミロイド沈着物の成分に結合してそれらと相互作用する。例えば、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、アミロイド沈着物を構成する原線維の１種または複数種の成分に結合する。アミロイド型は、任意のアミロイドであり得る。
加えてまたはあるいは、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、１種または複数種の他のアミロイド沈着物成分、例えばヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に結合し得る。特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、複数のアミロイド沈着物型に結合する合成汎アミロイド反応性ペプチドである。例えば、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、ＡＡ、ＡＬ、ＡＨ、ＡＴＴＲ、Ａβ２Ｍ、ＡＬｅｃｔ２、野生型ＴＴＲ、ＡＡｐｏＡＩ、ＡＡｐｏＡＩＩ、ＡＧｅｌ、ＡＬｙｓ、ＡＬｅｃｔ２、Ａｆｉｂ、ＡＣｙｓ、ＡＣａｌ、ＡＭｅｄｉｎ、ＡＩＡＰＰ、ＡＰｒｏ、ＡＩｎｓ、ＡＰｒＰ、Ａβまたはそれらの組み合わせまたは他のアミロイドのいずれか１つに結合し得る。特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドは、米国特許第８，８０８，６６６号（これは、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）に開示されているペプチドである。
加えてまたはあるいは、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、１種または複数種のアミロイド型に結合する機能的断片を含み得る。かかる断片は、例えば、親アミロイド反応性ペプチドのアミロイド結合特性を維持する。特定の例示的な実施形態では、１種または複数種の本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、複数のアミロイド沈着物型に結合する。例えば、アミロイド反応性ペプチドの断片は、複数のアミロイド型に結合する汎アミロイド反応性ペプチド断片であり得る。
アミロイド反応性ペプチドは、例えば、約３〜約５５個のアミノ酸を含む。例えば、前記ペプチドは、約３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個または５５個のアミノ酸を含み得る。特定の例示的な実施形態では、前記ペプチドは、約２００Ｄａ〜約６ｋＤａの分子量を有し得る。前記ペプチドの分子量は、例えば、約３００Ｄａ、４００Ｄａ、５００Ｄａ、１Ｋｄａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａまたは５ｋＤａであり得る。
特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドの全部または一部を形成するアミノ酸は、立体異性体であり得る。加えてまたはあるいは、本明細書に記載されるペプチドの全部または一部を形成するアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸の改変体、天然に存在しないアミノ酸、翻訳後修飾アミノ酸、酵素合成アミノ酸、誘導体化アミノ酸、アミノ酸を模倣するように設計された構築物または構造物などであり得る。本発明のペプチドを形成するアミノ酸は、天然に存在するタンパク質に見出される２０種の一般アミノ酸の１つもしくはそれを超えるアミノ酸、または改変および異常アミノ酸の１つもしくはそれを超えるアミノ酸であり得る。特定の例示的な実施形態では、アミノ酸は、Ｄ−またはＬ−アミノ酸であり得る。
特定の例示的な実施形態では、前記ペプチドはまた、１種または複数種の改変アミノ酸を含み得る。改変アミノ酸は、誘導体化アミノ酸または改変および異常アミノ酸であり得る。改変および異常アミノ酸の例としては、限定されないが、２−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、３−アミノアジピン酸（Ｂａａｄ）、β−アミノプロピオン酸（Ｂａｌａ、β−アラニン）、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ、ピペリジン酸）、４−アミノ酪酸（４Ａｂｕ）、６−アミノカプロン酸（Ａｃｐ）、２−アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、３−アミノイソ酪酸（Ｂａｉｂ）、２−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、デスモシン（Ｄｅｓ）、２，２’−ジアミノピメリン酸（Ｄｐｍ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、Ｎ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）、Ｎ−エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、アロヒドロキシリジン（ＡＨｙｌ）、３−ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ）、４−ヒドロキシプロリン（４Ｈｙｐ）、イソデスモシン（Ｉｄｅ）、アロイソロイシン（Ａｌｌｅ）、Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｍｅｌｌｅ）、６−Ｎ−メチルリジン（ＭｅＬｙｓ）、Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）およびオルニチン（Ｏｒｎ）が挙げられる。
改変および異常アミノ酸の他の例は、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｒｉｌ ２００２，Ｅｄｉｔｅｄ Ｇｒｅｇｏｒｙ Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｒｕｂｙ Ｖ Ｊ，Ａｌ−ｏｂｅｉｄｉ Ｆ ａｎｄ Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ Ｗ：Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６８：２４９−２６２，１９９０；およびＴｏｎｉｏｌｏ Ｃ：Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ３５：２８７−３００，１９９０（これらの教示はすべて、参照により本明細書に明確に組み込まれる）に一般に記載されている。
特定の例示的な実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は連続的であり、Ｄ−またはＬ−アミノ酸の配列を中断するいかなる改変および異常アミノ酸も存在しない。他の実施形態では、前記配列は、１種または複数種の上記改変および異常アミノ酸を含み得る。例えば、前記ペプチドの配列は、１種または複数種の改変および異常アミノ酸によって中断されてもよい。したがって、アミロイドに特異的に結合する非ペプチド主鎖を有する構造物を含む、偽ペプチドおよびペプチド模倣物が提供される。特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、ペプチドの単量体と比較して、アミロイドに対する親和性が増強されているペプチドの二量体または多量体を含む。
特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、正に荷電したアミノ酸が豊富であり得る。例えば、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、少なくとも約１５％の正に荷電したアミノ酸（例えば、アルギニンまたはリジン）を含み得る。他の例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、約１５％〜約５０％、約２０％〜約４５％、約２５％〜約４０％または約３０％〜約３５％の正に荷電したアミノ酸（例えば、アルギニンまたはリジン）を含み得る。
特定の例示的な実施形態では、特定のアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、（以下の）表２に示されているように、配列番号１〜１７として示されているアミノ酸配列の１種または複数種を含む。
特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、配列番号１〜１７として示されている配列の１種または複数種と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一のペプチドを含む。特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合された機能的リーダー配列を含み得る。例えば、表２に示されている配列の１種または複数種は、前記ペプチドのＮ末端に融合されたＧＧＧＹＳ−（配列番号２４）配列またはＣＧＧＹＳ−（配列番号２５）配列を含み得る。リーダー配列は、例えば、細胞透過性配列であり得る。
特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドは、公知の抗体に対するエピトープを含むように改変される。すなわち、公知の抗体またはその機能的断片のエピトープは、１種または複数種の本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドに結合されて、アミロイド反応性融合ペプチドを形成する。本明細書に記載される方法によれば、エピトープを含むアミロイド反応性融合ペプチドが、エピトープが反応する抗体と接触するときに、前記抗体は、エピトープに結合する（したがって、エピトープを介してアミロイド反応性ペプチドに間接的に結合する）。このように、抗体エピトープは、例えば、エピトープが反応する抗体に対するエピトープの結合をもたらす任意の抗体エピトープであり得る。特定の例示的な実施形態では、表２に同定されているアミロイド反応性ペプチド（配列番号１〜１７）のいずれかは、かかるエピトープに融合されて、アミロイド反応性融合ペプチドを形成し得る。
特定の例示的な実施形態では、タンパク質の末端は、抗体にアクセス可能である可能性が高いので、および末端へのエピトープの付加は、タンパク質の機能に影響を与える可能性が低いので、アミロイド反応性融合ペプチドのエピトープは、アミロイド反応性ペプチドのＮ末端またはＣ末端の一番端に付加される。加えてまたはあるいは、例えば、融合ペプチドの末端がペプチドの機能に重要である場合、またはプロセシングがこれらの末端で行われる場合、内部部位へのエピトープの付加が使用され得る。特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性融合ペプチドは、エピトープをアミロイド反応性ペプチドに融合するためのリンカー配列を含み得る。融合ペプチドを形成するために使用される場合にペプチドの機能を妨げないリンカー配列は、当技術分野で公知の任意の配列であり得る。特定の例示的な実施形態では、リンカーは、以下の配列「ＳＶＴＶＶＴ」（配列番号２１）を有する。
特定の例示的な実施形態では、融合ペプチドのエピトープは、アミロイドに結合する抗体のエピトープである（すなわち、エピトープは、アミロイド反応性抗体のエピトープである）。例えば、エピトープは、ＡＡ、ＡＬ、ＡＨ、ＡＴＴＲ、Ａβ２Ｍ、ＡＬｅｃｔ２、野生型、ＴＴＲ、ＡＡｐｏＡＩ、ＡＡｐｏＡＩＩ、ＡＧｅｌ、ＡＬｙｓ、ＡＬｅｃｔ２、Ａｆｉｂ、ＡＣｙｓ、ＡＣａｌ、ＡＭｅｄｉｎ、ＡＩＡＰＰ、ＡＰｒｏ、ＡＩｎｓ、ＡＰｒＰ、Ａβアミロイドまたは任意の他のアミロイドに結合する抗体のエピトープである。かかる実施形態では、アミロイド反応性抗体は、本明細書に記載されるように、（１）エピトープを含むアミロイド反応性ペプチド、および（２）前記抗体が対象とするアミロイド型（複数可）の両方に結合し得る。特定の例示的な実施形態では、エピトープは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグまたは当技術分野で公知の他のタグであり得る。
特定の例示的な実施形態では、エピトープは、１１−１Ｆ４抗体またはその機能的断片に結合するエピトープであり、１１−１Ｆ４抗体は、米国特許第８，１０５，５９４号およびＯ’Ｎｕａｌｌａｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，４６（５），１２４０−１２４７（これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）に記載されている。例えば、アミロイド反応性モノクローナル抗体１１−１Ｆ４の公知の結合モチーフであるＬｅｎ（１−１６）ペプチドは、エピトープの基礎として使用され得る。かかる例示的な実施形態では、モノクローナル抗体１１−１Ｆ４は、本明細書に記載されるように、アミロイド反応性ペプチドに直接的に結合するよりもむしろ、エピトープアミノ酸配列を介してＬｅｎ（１−１６）ベースのペプチド−エピトープ（「ペプトープ」）融合物に結合する。例えば、表２のアミロイド反応性ペプチドのいずれかは、Ｌｅｎ（１−１６）ベースの配列「ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳ ＬＡＶＳＬＧ」（配列番号２２）に融合されて、本明細書に記載されるアミロイド反応性融合ペプチドを形成し得る。例として、アミロイド反応性融合ペプチドは、配列番号２２に示されているＬｅｎ（１−１６）ベースの配列に融合された配列番号１７のアミロイド反応性ペプチド（ｐ５＋１４）を含み得る。
特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドは、以下の１２−ｍｅｒエピトープ配列：「ＫＨＹＡＡＦＰＥＮＬＬＩ」（配列番号２３）を有する１１−１Ｆ４抗体エピトープに融合される。特定の例示的な実施形態では、ＫＨＹＡＡＦＰＥＮＬＬＩエピトープ配列は、表２のアミロイド反応性ペプチドのいずれかに融合されて、アミロイド反応性融合ペプチドを形成する。例として、配列番号１７として示されている配列を有するアミロイド反応性ペプチド（ｐ５＋１４）は、ＫＨＹＡＡＦＰＥＮＬＬＩ配列に融合されて、アミロイド反応性融合ペプチドを形成する。かかる例示的な実施形態では、１２ｍｅｒエピトープ配列は、本明細書に記載されるリンカー配列を介して、前記ペプチドに（例えば、前記ペプチドのＣ末端に）間接的に融合され得る。例えば、リンカー配列は、ＳＶＴＶＶＴ（配列番号２１）であり得る。特定の例示的な実施形態では、ｐ５＋１４ペプチドに融合された１１−１Ｆ４抗体１２−ｍｅｒエピトープを含むアミロイド反応性融合ペプチドは、以下のアミノ酸配列（配列番号１８または「ｐ６６」）（下線部は、１１−１Ｆ４反応性１２ｍｅｒエピトープであり、ＳＶＴＶＶＴは、リンカー配列である）を有する：
特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性融合ペプチドは、以下の配列（配列番号１９）（Ｘは、リンカー配列のアミノ酸であり、下線部は、１１−１Ｆ４ １２−ｍｅｒエピトープである）を有する：
特定の例示的な実施形態では、１１−１Ｆ４抗体１２ｍｅｒエピトープを含むアミロイド反応性融合ペプチドは、以下のアミノ酸配列（配列番号２０）（下線部は、１１−１Ｆ４反応性エピトープであり、Ｘは、リンカー配列のアミノ酸であり、「ｎ」は、リンカーのアミノ酸数である）を有する：
例えば、アミロイド反応性ペプチドおよびエピトープの機能が保存されている限り、「ｎ」は、任意のアミノ酸数に相当し得る。例えば、「ｎ」は、約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個のアミノ酸に相当し得る。
特定の例示的な実施形態では、１１−１Ｆ４抗体１２ｍｅｒエピトープを含むアミロイド反応性融合ペプチドは、配列番号１８〜２０として示されている配列のいずれかと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である。
特定の例示的な実施形態では、エピトープは、モノクローナル抗体２Ａ４、７Ｄ８および８Ｇ９のエピトープまたはその機能的断片を含み得る。これらの抗体は、例えば、特定のアミロイド原線維に結合するアミロイド反応性抗体である。Ｊ．Ｓ．Ｗａｌｌら、ＡＬ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ａ Ｃｒｙｐｔｉｃ Ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｆｉｂｒｉｌｓ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（１２）：ｅ５２６８６（２０１２）；Ｊ．Ｓ．Ｗａｌｌら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ＡＡ Ａｍｙｌｏｉｄ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１１．０００３２（２０１１）（これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）を参照のこと。このように、これらの抗体に対するエピトープまたはその機能的断片は、例えば、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドに融合されて、２Ａ４、７Ｄ８または８Ｇ９抗体の１種または複数種に対するエピトープを有する融合ペプチドを作り得る。したがって、特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるエピトープは、２Ａ４、７Ｄ８または８Ｇ９抗体の結合モチーフを含む。抗体２Ａ４、７Ｄ８または８Ｇ９のエピトープまたはその機能的断片を有する、かかる融合ペプチドは、本明細書に記載されるとおり、クリアランスすべき様々なアミロイド型に対する２Ａ４、７Ｄ８または８Ｇ９抗体の１種または複数種を標的とし得る。
特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドのいずれかは、前記ペプチドのＮ末端に融合された機能的リーダー配列を含み得る。例えば、表２に示されている配列の１種または複数種は、単離されたペプチドのＮ末端の端に融合されたＧＧＧＹＳ−（配列番号２４）配列またはＣＧＧＹＳ−（配列番号２５）配列を含み得る。
本明細書に記載される抗体エピトープを有するアミロイド反応性ペプチドおよびアミロイド反応性融合ペプチドは、標準的な分子生物学的技術を使用した化学合成または組換え手段を含む当業者に公知の任意の技術によって作製され得る。前記ペプチドは、従来技術にしたがって、溶液中でまたは固体支持体上で合成され得る。様々な自動合成機が市販されており、公知のプロトコールにしたがって使用され得る（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，１９８４；Ｔａｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６４４２，１９８３；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４１−３４７，１９８６；およびＢａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−２８４，１９７９（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）を参照のこと）。
あるいは、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし、発現に適切な条件下で培養し、ペプチドを単離する組換えＤＮＡ技術が用いられ得る。
特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、単離または精製によって得られ得る。タンパク質精製技術は、一段階で、細胞、組織または臓器のホモジナイズならびにペプチドおよび非ペプチド分画への粗分画を伴う。他のタンパク質精製技術としては、例えば、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、抗体などを用いた、または熱変性による沈殿、続いて：遠心分離；クロマトグラフィー工程、例えばイオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシルアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィー；等電点電気泳動；ゲル電気泳動、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動；ならびにこれらのおよび他の技術の組み合わせが挙げられる。
様々なクロマトグラフィー技術としては、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーが挙げられる。特に効率的なペプチド精製方法は、中高圧液体クロマトグラフィー（ｆａｓｔ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＦＰＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。
様々な精製工程の実行順序が変更され得るか、例えばまたは特定の工程が省略され得、さらに、実質的に精製されたペプチドを調製するための適切な方法がもたらされる。
前記ペプチドは、ポリペプチドまたはタンパク質の一部であり得、ポリペプチドまたはタンパク質の生化学的または酵素的断片化によって生成され得る。したがって、本発明のペプチドは、（ａ）化学合成によって生成され得、（ｂ）組換えＤＮＡ技術によって生成され得、（ｃ）より大きい分子の生化学的もしくは酵素的断片化によって生成され得、（ｄ）上に列強された方法ａ〜ｄの組み合わせによる方法によって生成され得、または（ｅ）当業者に公知の任意の他のペプチド生成手段によって生成され得る。
化学合成の間に、アミロイド反応性ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端が改変されて、それにより、安定性および製剤化の改善、プロテアーゼ分解に対する抵抗性などが得られ得る。アミノ酸の改変の例としては、ペグ化、アセチル化、アルキル化、ホルミル化、アミド化が挙げられる。また、ペプチドの安定性を改善するために、鎖に沿って、天然に存在しない様々なアミノ酸が導入され得る。
特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドをコードする核酸分子も提供される。例えば、前記核酸分子は、配列番号１〜２０のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の、例えば配列番号１〜２０のいずれか１つとして示されているアミノ酸と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。本明細書に記載される組成物および方法との関連では、例えば本明細書に記載される少なくとも１つのアミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドをコードする核酸配列は、確立された分子生物学的手順を使用して、宿主細胞において発現可能なベクター（例えば、アデノウイルスベクター）に組み込まれる。例えば、少なくとも１つのアミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）は、制限酵素消化、ＤＮＡポリメラーゼによるフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）、エキソヌクレアーゼによる欠失、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによる伸長、合成のもしくはクローニングされたＤＮＡ配列のライゲーション、一本鎖バクテリオファージ中間体による部位特異的配列変異などの標準的な手順を用いて、またはＰＣＲもしくは他のインビトロ増幅と組み合わせて特定のオリゴヌクレオチドを使用して操作され得る。
本明細書に記載される少なくとも１つのアミロイド反応性ペプチドまたは融合物をコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞において発現可能なベクターの産生によって当業者に手引きするのに十分な例示的な手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９２（および２００３年への補遺）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９９（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）に見出され得る。
典型的には、少なくとも１つのアミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む転写制御配列に作動可能に連結される。プロモーターは、宿主細胞の転写機構（または導入された合成機構）によって認識されるポリヌクレオチド配列であって、転写の開始に関与するポリヌクレオチド配列である。ポリアデニル化シグナルは、翻訳のために核外のｍＲＮＡ転写産物を適切にプロセシングして細胞質に輸送するために、前記転写産物の末端上への一連のヌクレオチドの付加を指令するヌクレオチド配列である。
例示的なプロモーターとしては、ウイルスプロモーター、例えばサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（「ＣＭＶ」）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（「ｔｋ」）、ＳＶ４０初期転写ユニット、ポリオーマ、レトロウイルス、パピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ならびにヒトおよびサル免疫不全ウイルスが挙げられる。他のプロモーターは、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡ ＤＱαおよびＤＱβ、β−インターフェロン、インターロイキン−２、インターロイキン−２受容体、ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＲα、β−アクチン、筋クレアチンキナーゼ、プレアルブミン（トランスサイレチン）、エラスターゼＩ、メタロチオネイン、コラゲナーゼ、アルブミン、フェトプロテイン、β−グロビン、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ＨＡ−ｒａｓ、インスリン、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、αｌアンチトリプシン、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストン、Ｉ型コラーゲン、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ９４およびＧＲＰ７８）、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、トロポニンＩ（ＴＮＩ）、血小板由来成長因子およびジストロフィン、樹状細胞特異的プロモーター、例えばＣＤｌ Ｉｃ、マクロファージ特異的プロモーター、例えばＣＤ６８、ランゲルハンス細胞特異的プロモーター、例えばランゲリン、ならびにケラチノサイトおよび皮膚および肺の上皮細胞に特異的なプロモーターを含む哺乳動物遺伝子から単離される。
プロモーターは、誘導性または構成的のいずれかであり得る。誘導性プロモーターは、誘導物質の存在下以外では不活性であるかまたは低い活性を示すプロモーターである。誘導性プロモーターの例としては、限定されないが、ＭＴ ＩＩ、ＭＭＴＶ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、ＳＶ４０、マウスＭＸ遺伝子、α−２−マクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ遺伝子ｈ−２ｋｂ、ＨＳＰ７０、プロリフェリン、腫瘍壊死因子または甲状腺刺激ホルモン遺伝子プロモーターが挙げられる。
典型的には、プロモーターは、さらなる因子の非存在下で宿主細胞に導入されると高い転写レベルをもたらす構成的プロモーターである。場合により、転写制御配列は、最小プロモーターのみの場合に観察される上記の転写を増加させる１種または複数種のエンハンサーエレメント（これは、１種または複数種の転写因子の結合認識部位である）を含む。遺伝子転写産物の適切な終結およびポリアデニル化をもたらすためのポリアデニル化シグナルを含むことが望ましい場合がある。例示的なポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモン、ＳＶ４０および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子から単離されている。本明細書に記載されるアデノウイルスベクターとの関連では、これらのまたは他のポリアデニル化シグナルのいずれかが利用され得る。
本明細書に記載されるアミロイド反応性融合ペプチドなどの融合ペプチドを作製する方法もまた当業者に周知である。かかるタンパク質は、例えば、二官能性架橋試薬を使用する化学結合（ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）によって、完全な融合ペプチドのデノボ合成によって、またはプレターゲティングペプチドをコードするＤＮＡ配列を、第２のペプチドもしくはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合し、続いて、インタクトなペプチドまたは融合ペプチドを発現させることによって産生され得る。
本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドを発現させるための宿主細胞としては、原核生物または真核生物が挙げられる。適切な原核生物宿主としては、大腸菌などの細菌宿主細胞が挙げられる。様々な大腸菌株としては、限定されないが、ＨＢ１０１、ＤＨ５、ＤＨ１０およびＭＣ１０６１が挙げられる。適切な真核生物宿主としては、酵母および哺乳動物細胞が挙げられる。例としては、限定されないが、サッカロミセス（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；２９３（ヒト胎児腎臓）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）；２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）；２９３Ｔおよび変異体２９３Ｔ／１７（２９３ｔｓＡ１６０９ｎｅｏおよび変異体ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）（ＳＶ４０ Ｔ抗原によって形質転換されたヒト胎児腎臓）；ＣＯＳ−１およびＣＯＳ７（ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ株）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）；マウスセルトリ細胞；ＣＶＩ（サル腎臓細胞）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；ＶＥＲＯ７６（アフリカミドリザル腎臓細胞）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８７）；ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；ＭＤＣＫ（イヌ腎臓細胞）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；ＢＲＬ３Ａ（バッファローラット肝臓細胞）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；Ｗ１３８（ヒト肺細胞）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓細胞）（ＨＢ８０６５）；ならびにＭＭＴ ０６０６５２（マウス乳腺腫瘍）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）が挙げられる。
さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長類細胞株および齧歯類細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、および一次外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子について遺伝子型的に欠損性であり得るか、または優性に作用する選択遺伝子を含有し得る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、限定されないが、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃもしくはＮＩＨマウス由来の３Ｔ３株、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞株が挙げられる。
本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドをコードする核酸で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることによって産生され得る。核酸で宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトするための方法は周知であり、常習的に実施される。本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドをコードする核酸配列はまた、例えば、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションによって、培養哺乳動物細胞に導入され得る（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １４：７２５，１９７８；Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３，１９８１；Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６，１９７３）。クローニングされたＤＮＡ配列を哺乳動物細胞に導入するための他の技術、例えばエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５，１９８２）またはリポフェクションも使用され得る。クローニングされたＤＮＡが組み込まれている細胞を同定するために、一般に、選択可能マーカーが、目的の遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞に導入される。培養哺乳動物細胞において使用するための選択可能マーカーの例としては、薬剤、例えばネオマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートに対する抵抗性を付与する遺伝子が挙げられる。選択可能マーカーは、増幅可能な選択可能マーカー、例えばＤＨＦＲ遺伝子およびＤＨＦＲｒであり得る。選択可能マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓ．）によって概説されており、選択可能マーカーの選択は、十分に当業者のレベルの範囲内である。
アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドに対する抗体
本明細書で提供されるように、アミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドに結合する任意の抗体は、本明細書に記載される方法および組成物の範囲内で使用され得る。より具体的には、本明細書に記載される様々なアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドは、アミロイドに結合する。したがって、１種または複数種のアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドに対する抗体の結合は、アミロイドへの抗体のターゲティングをもたらす。このように、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドに結合する抗体は、抗体をアミロイド沈着物にターゲティングするために、本開示の範囲内で使用され得る。
特定の例示的な実施形態では、前記抗体は、表２において配列番号１〜１７に示されている配列を有するアミロイド反応性ペプチドのいずれか１つに特異的に結合する。特定の例示的な実施形態では、前記抗体は、表２において配列番号１〜１７として示されている配列の１種または複数種と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一のアミロイド反応性ペプチドの１種または複数種の機能的ペプチド断片に結合する。
特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドに対する抗体は、ペプチドｐ４３（配列番号１２）およびＡＡアミロイド含有物質で適切な宿主を免疫することによって生成される。かかる実施形態では、生成される抗体は、アミロイド反応性ペプチドｐ５、ｐ９、ｐ３１、ｐ４３、ｐ４４、ｐ５０、ｐ５８およびｐ５＋１４に対して反応性であり得る（抗体反応性については、（以下の）表３を参照のこと、およびペプチドの対応する配列識別番号の表記については、（上記）表２を参照のこと）。特定の例示的な実施形態では、以下の表３に提供されている抗体を産生する細胞株が提供される。本明細書に記載されるアミロイド反応性タンパク質結合特性を有する抗体を依然として産生するかかる細胞株のサブクローンおよび変異体クローンも提供される。
本明細書に記載される抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。特定の例示的な実施形態では、抗体は、配列番号１〜１７として示されている配列を有するアミロイド反応性ペプチドまたはその断片のいずれか１つに特異的に結合するヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。例えば、抗体は、配列番号１〜１７として示されている配列の１種または複数種と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一のアミロイド反応性ペプチドの機能的ペプチド断片に特異的に結合するヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。特定の例示的な実施形態では、抗体は、本明細書に記載されるアミロイド反応性融合ペプチドのエピトープに結合するヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。例えば、抗体は、本明細書に記載される１１−１Ｆ４ １２−ｍｅｒエピトープのＬｅｎ（１−１６）エピトープに結合するヒト化１１−１Ｆ４抗体またはその機能的断片であり得る。
特定の例示的な実施形態では、ヒト抗体は、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。特定の例示的な実施形態では、ヒト化抗体は、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。特定の例示的な実施形態では、キメラ抗体は、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。特定の例示的な実施形態では、抗体は、マウス抗体またはウサギ抗体である。特定の例示的な実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。特定の例示的な実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。例えば、抗体は、アミロイド反応性ペプチド上のまたはアミロイド反応性ペプチドに結合された特定のエピトープを認識するモノクローナル抗体である。
特定の例示的な実施形態では、抗体は、アミロイド反応性抗体である。例えば、抗体は、アミロイド反応性融合ペプチドおよび特定のアミロイドの両方に共通のエピトープを認識するモノクローナル抗体（または「ｍＡＢ」）であり得る。アミロイド反応性抗体が結合し得る例示的なアミロイドとしては、限定されないが、ＡＡ、ＡＬ、ＡＨ、ＡＴＴＲ、Ａβ２Ｍ、ＡＬｅｃｔ２、野生型、ＴＴＲ、ＡＡｐｏＡＩ、ＡＡｐｏＡＩＩ、ＡＧｅｌ、ＡＬｙｓ、ＡＬｅｃｔ２、Ａｆｉｂ、ＡＣｙｓ、ＡＣａｌ、ＡＭｅｄｉｎ、ＡＩＡＰＰ、ＡＰｒｏ、ＡＩｎｓ、ＡＰｒＰまたはＡβアミロイドの１種または複数種のアミロイドが挙げられる。かかる例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドは、本明細書に記載される抗体によって認識されるエピトープに融合される。したがって、アミロイド反応性抗体は、アミロイド反応性融合ペプチドの融合されたエピトープを認識する。アミロイド反応性抗体はまた、例えば、エピトープが由来するアミロイドの共通のエピトープを介して、アミロイドを直接的に認識する。
特定の例示的な実施形態では、抗体は、アミロイド反応性融合ペプチドに結合する１１−１Ｆ４抗体またはその機能的断片である。１１−１Ｆ４抗体は、例えば、ＡＬを有する患者におけるＡＬアミロイドに結合することが示されている。すべての被験体が１１−１Ｆ４に対して免疫応答性という訳ではなく、このｍＡｂは、インビボでＡＴＴＲまたはＡＡアミロイドに結合しない。したがって、１１−１Ｆ４抗体の有用性を有利に高めるために、１１−１Ｆ４抗体の結合モチーフは、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドに融合され得る。
例えば、１１−１Ｆ４結合モチーフを、本明細書に記載される１種または複数種の汎アミロイド反応性ペプチドに融合して、アミロイド反応性融合ペプチドをもたらし得る。次いで、有利には、単独で使用する場合に上記の不利な点を有する１１−１Ｆ４抗体を単一の抗体として使用して、汎アミロイド反応性融合ペプチドに対する結合を介して、複数のアミロイド型を標的とし得る。換言すれば、１１−１Ｆ４またはその断片の使用は、数種のアミロイド型との相互作用以外にも拡大され得、そうでなければ非免疫反応性の被験体において使用され得る。
特定の例示的な実施形態では、１１−１Ｆ４抗体は、アミロイド反応性融合ペプチドのアミロイド反応性ペプチドに融合されたＬｅｎ（１−１６）ベースのエピトープに結合し得る。加えてまたはあるいは、１１−１Ｆ４抗体は、１１−１Ｆ４ １２−ｍｅｒ結合モチーフおよびリンカー領域を含む、配列番号１８として示されている配列を有するアミロイド反応性融合ペプチドに結合し得る。加えてまたはあるいは、１１−１Ｆ４抗体は、１１−１Ｆ４ １２−ｍｅｒ結合モチーフおよび可変リンカー領域を含む、配列番号１９〜２０のいずれか１つとして示されている配列を有するアミロイド反応性融合ペプチドに結合し得る。
本明細書に記載される方法によれば、汎アミロイド反応性融合ペプチドに結合するアミロイド反応性抗体の使用は、（１）特定のアミロイドを直接的に標的とするために、単一の抗体を使用すること、および（２）（別の方法では、抗体単独で様々なアミロイド型を結合し得ない場合に）アミロイド反応性ペプチドを介して広範囲の他のアミロイド型を標的とするために、同じ単一の抗体を使用することの利点を有する。例えば、本開示では、１１−１Ｆ４抗体の使用は、１１−１Ｆ４結合モチーフを含むアミロイド反応性融合ペプチドを介した複数のアミロイド型への１１−１Ｆ４抗体のターゲティングによる様々なアミロイド系疾患の処置へと大幅に拡大される。
特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載される抗体の機能的断片は、本明細書で提供される方法および組成物にしたがって使用され得る。例えば、一次抗体構造の一部のみを含む断片であって、抗体の免疫反応特性を実質的に保持する断片が産生され得る。かかる断片としては、例えば、当技術分野で周知の方法によるインタクトな抗体のタンパク質分解切断によって産生される断片、または部位特異的変異誘発を使用して終止コドンをヌクレオチド配列の所望の位置に挿入することによって産生される断片が挙げられる。例えば、終止コドンをＣＨ１の後に挿入してＦａｂ断片を産生し得るか、またはヒンジ領域の後に挿入してＦ（ａｂ’）２断片を産生し得る。少なくとも免疫反応性断片を含む一本鎖抗体および融合タンパク質もまた、本発明の範囲内に含まれる。特定の例示的な実施形態では、前記抗体またはその断片は、治療活性を有するエフェクター部分に直接的または間接的に結合され得る。適切なエフェクター部分としては、サイトカイン、細胞毒素、放射性核種、薬物、免疫調節剤、治療用酵素、抗増殖剤などが挙げられる。抗体をかかるエフェクターに結合するための方法は、当技術分野で周知である。
本明細書で提供されるアミロイド反応性ペプチドおよび融合ペプチドに対する抗体は、任意の方法を使用して調製され得る。例えば、任意の実質的に純粋なアミロイド反応性ペプチドまたはその断片は、特定の抗体が産生されるように、動物において免疫応答を誘発するための免疫原として使用され得る。例えば、配列番号１〜１７として示されている配列を有するアミロイド反応性ペプチドまたはその断片のいずれかは、アミロイド反応性ペプチドに対する抗体を生成するための免疫抗原として使用され得る。
特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドまたはその断片のいずれかを、マウスＡＡアミロイド含有材料（アミロイド増強因子または「ＡＥＦ」）と組み合わせ得る。次いで、アミロイド反応性ペプチドまたはその断片とＡＥＦとの複合体を免疫原として使用し得る。例えば、ペプチドｐ４３（配列番号１２）をＡＥＦと混合し得る。次いで、複合体化したＡＥＦ／ｐ４３の懸濁液でマウスを免疫して、アミロイド反応性ペプチドに対する抗体を生成し得る（本明細書の表３を参照のこと）。
加えてまたはあるいは、動物を免疫するために使用される免疫原は、化学的に合成され得るか、または翻訳されたｃＤＮＡから得られ得る。さらに、所望により、免疫原は、キャリアポリペプチドにコンジュゲートされ得る。免疫ポリペプチドに化学的にカップリングされる一般に使用されるキャリアとしては、限定されないが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキソイドが挙げられる。
ポリクローナル抗体の調製は、当業者に周知である。例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ，ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍａｎｓｏｎら），１５頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２）およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ，Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｔｉｏｎ ２．４．１（１９９２）を参照のこと。加えて、当業者であれば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製および濃縮に関する免疫学分野で一般的な様々な技術を知っている（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｕｎｉｔ ９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４）。
モノクローナル抗体の調製もまた当業者に周知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；Ｃｏｌｉｇａｎら、ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．５．１ ２．６．７；およびＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，７２６頁（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂ．１９８８）を参照のこと。簡潔に言えば、モノクローナル抗体は、抗原（例えば、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドの１つ）を含む組成物をマウスに注射すること、血清サンプルを分析することによって抗体産生の存在を確認すること、脾臓を摘出してＢリンパ球を取得すること、前記Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを産生すること、前記ハイブリドーマをクローニングすること、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択すること、およびハイブリドーマ培養物から前記抗体を単離することによって得られ得る。モノクローナル抗体は、十分に確立された様々な技術によって、ハイブリドーマ培養物から単離および精製され得る。かかる単離技術としては、プロテインＡセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．７．１ ２．７．１２ および ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．９．１ ２．９．３；Ｂａｒｎｅｓら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ），ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＶＯＬ．１０，７９頁 １０４頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２）を参照のこと。
加えて、モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボ増殖方法は、当業者に周知である。インビトロ増殖は、哺乳動物血清（例えば、ウシ胎児血清）または微量元素および成長持続サプリメント（例えば、正常マウス腹腔滲出細胞、脾臓細胞および骨髄マクロファージ）を場合により補充した適切な培養培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地またはＲＰＭＩ１６４０培地）中で行われ得る。インビトロ産生は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、大量の所望の抗体を得るためのスケールアップを可能にする。大規模なハイブリドーマ培養は、エアリフト反応器中で、連続撹拌反応器中で、または固定もしくは捕捉細胞培養物で、均一な懸濁培養によって行われ得る。インビボ増殖は、細胞クローンを、親細胞と組織適合性の哺乳動物（例えば、同系（ｏｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）マウス）に注射して、抗体産生腫瘍の成長を引き起こすことによって行われ得る。特定の例示的な実施形態では、注射前に、炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）などの油で動物をプライミングする。１〜３週間後、動物の体液から、所望のモノクローナル抗体を回収する。いくつかの場合では、本明細書で提供される抗体は、非ヒト霊長類を使用して作製され得る。ヒヒにおいて治療上有用な抗体を生じさせるための一般的な技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、国際特許公開ＷＯ９１／１１４６５号（１９９１）およびＬｏｓｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４６：３１０（１９９０）に見出され得る。
特定の例示的な実施形態では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体であり得る。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖（ｌｉｇｈｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｃｈａｉｎ）由来のマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変ドメインに移植し、次いで、ヒト残基をマウスカウンターパートのフレームワーク領域に代入することによって産生され得る。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分の使用は、ヒトを処置する場合、マウス定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題を軽減する。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的な技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３８３３（１９８９）に記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を産生するための技術は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４（１９８８）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７（１９９２）；およびＳｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５０：２８４４（１９９３）に記載されている。
方法および薬理学的組成物
アミロイド疾患、例えばアルツハイマー病、ハンチントン病もしくはプリオン病、または軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスおよび２型糖尿病を有する患者に見られるような末梢性を含むアミロイドーシスの処置のための治療方法が提供される。特定の例示的な実施形態では、前記方法は、アミロイドーシスを有する被験体であって、その内部のアミロイド沈着物を取り除くべき被験体を選択することを含む。前記方法はまた、有効量の１種または複数種のアミロイド反応性ペプチドまたはアミロイド反応性融合ペプチドを被験体に投与することを含む。特定の例示的な実施形態では、被験体は、配列番号１〜２０として示されている配列を有するペプチドの１種または複数種を投与され得る。前記方法は、有効量の本明細書に記載される１種または複数種の抗体を被験体に投与することをさらに含む。有効量の本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドおよび抗体の投与は、被験体におけるアミロイド沈着物のクリアランスをもたらす。
アミロイド沈着物を取り除くための方法も本明細書で提供される。例えば、アミロイド沈着物を、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドまたはアミロイド反応性融合ペプチドと接触させる。次いで、アミロイド反応性ペプチドまたはアミロイド反応性融合ペプチドを抗体と接触させる。抗体は、アミロイド反応性ペプチドに結合し、クリアランスすべきアミロイド沈着物を標的とする。アミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドと、アミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドに結合する抗体との接触は、クリアランスすべきアミロイド沈着物を標的とする。
特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性融合ペプチドに融合されたエピトープへの抗体またはその機能的断片の結合は、被験体からのアミロイド沈着物のクリアランスの増加をもたらす。例えば、抗体がアミロイド反応性抗体である場合、（アミロイド反応性ペプチドを伴わない）抗体のみの投与は、アミロイド沈着物のいくらかのクリアランスをもたらし得る。しかしながら、アミロイド反応性融合ペプチドの投与後に、アミロイド反応性抗体が投与される場合、クリアランスの増加が達成される。すなわち、クリアランスのレベルは、アミロイド反応性融合ペプチドの使用によって、アミロイド反応性抗体のみの使用よりも大きなものであり得る。特定の例示的な実施形態では、被験体において、クリアランスの増加が観察され得る。例えば、限定的な改善（すなわち、アミロイド沈着物のわずかな減少）を伴う、アミロイド反応性抗体のみを最初に被験体に提供し得る。しかしながら、本明細書に記載されるアミロイド反応性融合ペプチドおよびアミロイド反応性抗体の投与は、アミロイド沈着物のより大きなクリアランスおよびしたがって被験体の改善をもたらし得る。
特定の例示的な実施形態では、本明細書で提供される方法は、アミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドを介して抗体が抗体沈着物に結合する部位において免疫応答を誘発することを含む。例えば、被験体へのアミロイド反応性ペプチドもしくは融合ペプチドおよび抗体の投与、またはアミロイド沈着物とアミロイド反応性ペプチドもしくは融合ペプチドおよび抗体との接触は、沈着部位における免疫細胞の蓄積をもたらす。免疫細胞は、例えば、マクロファージであり得るか、またはアミロイド沈着物を取り除く免疫応答において公知のもしくは該免疫応答に関与する他の任意の他の細胞であり得る。有利には、本明細書で提供される方法および医薬組成物は、健常組織に影響を与えずに、クリアランスすべきアミロイド沈着物を標的とすることができる。
特定の例示的な実施形態では、十分なクリアランス期間後に、抗体は被験体に投与されるか、またはアミロイド沈着物と接触される。例えば、アミロイドーシスを有する被験体では、被験体の系からの未結合のアミロイド反応性ペプチドのクリアランスを可能にする十分なクリアランス期間後に、抗体は投与される。すなわち、アミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドがアミロイドに結合するために、および過剰なアミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドを被験体から排除するために十分な時間が経過した後に、抗体は被験体に提供される。したがって、特定の例示的な実施形態では、アミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドの投与の約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、７８時間、８４時間または９６時間後に、抗体は投与される。
本明細書に記載される方法によれば、図１は、アミロイドへの抗体のターゲティングの例を示す概略図を提供する。図１Ａに示されているように、例示的なアミロイド反応性ペプチドｐ５またはｐ５＋１４は、ＡＬ、ＡＴＴＲおよびＡＡアミロイドをプレターゲティングする。次いで、抗ｐ５抗体ペプチドは、ｐ５ペプチドをターゲティングする。図１Ｂに示されているように、例えば、１１−１Ｆ４抗体のＡ１２ベースのエピトープ（本明細書に記載される１１−１Ｆ４ １２−ｍｅｒ）をｐ５またはｐ５＋１４ペプチドのＣ末端の端に融合する。結合したエピトープを有する、アミロイド反応性ペプチドｐ５またはｐ５＋１４は、ＡＬ、ＡＴＴＲおよびＡＡアミロイドをプレターゲティングし、次いで、１１−１Ｆ４抗体は、前記エピトープに結合する。したがって、前記エピトープに対する１１−１Ｆ４抗体の結合は、１１−１Ｆ４抗体をｐ５またはｐ５＋１４ペプチドおよびしたがってアミロイドにターゲティングする（図１Ｂ）。
いかなる特定の理論にも縛られないが、アミロイド反応性ペプチドを介したアミロイド沈着物に対する本明細書に記載される抗体のプレターゲッティングは、アミロイド沈着物の部位に対する宿主免疫応答を誘発すると考えられる。次に、免疫応答は、例えば、オプソニン化およびファゴサイトーシスなどのプロセスを介したアミロイド沈着物のクリアランスをもたらす。例えば、抗アミロイド抗体は、マウスにおける注射したアミロイドーマを取り除くことが示されている（米国特許第８，１０５，５９４号）。さらに、肝臓における例示的な免疫応答が図１９に示されており、マクロファージが、インビボでマウスにおける標的としたアミロイドに蓄積することが示されている。例えば、ペプチドｐ６６および１１−１Ｆ４抗体を注射したマウスは、処置の７２時間後に、アミロイド部位におけるマクロファージ浸潤の誘導を示す（図１９を参照のこと）。
本明細書で提供される特定の例示的な方法では、有効量のｐ６６ペプチドまたはその機能的断片を被験体に投与する。その後（例えば、２４〜４８時間後）、有効量の１１−１Ｆ４抗体またはその機能的断片を被験体に投与する。１１−１Ｆ４抗体の投与は、被験体におけるアミロイド沈着物のクリアランスをもたらす。本明細書で提供される特定の例示的な実施形態では、アミロイド沈着物を、ｐ６６ペプチドまたはその機能的断片と接触させる。その後、アミロイド沈着物を、１１−１Ｆ４抗体またはその機能的断片と接触させる。アミロイド沈着物と１１−１Ｆ４抗体との接触は、アミロイド沈着物のクリアランスをもたらす。例えば、被験体への１１−１Ｆ４抗体の投与−または、アミロイド沈着物と１１−１Ｆ４抗体との接触−は、例えば、アミロイド沈着物の部位へのマクロファージまたは他の免疫細胞の蓄積を誘発することによって、アミロイド沈着物の部位における免疫応答を誘発する。
アミロイド疾患の処置のための医薬組成物（本明細書で提供される方法のいずれかで使用され得る医薬組成物を含む）も本明細書で提供される。医薬組成物の目的は、被験体への化合物または物質（例えば、本明細書に記載されるペプチドおよび抗体）の投与を容易にすることである。医薬組成物は、例えば、アミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドを含む。前記組成物はまた、本明細書に記載される抗体を含む。特定の例示的な実施形態では、被験体への投与のための単一医薬組成物は、本明細書に記載される（１）アミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドおよび（２）抗体の両方を含むのに対して、他の実施形態では、被験体への投与のためのアミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドおよび抗体は、別個の医薬組成物中にある。かかる医薬組成物は、例えば、被験体におけるアミロイド沈着物を取り除くことによって、被験体におけるアミロイドーシスを処置するために、有効量のアミロイド反応性ペプチド（またはアミロイド反応性融合ペプチド）および抗体を含む。
特定の例示的な実施形態では、医薬組成物は、選択された特定の投与様式に応じて、適切な固体または液体キャリアを含む。有用な薬学的に許容され得るキャリアおよび賦形剤は通常のものであり、当業者に公知である。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的および生理学的に許容され得る流体ビヒクル、例えば水、生理食塩水、他の平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどである注射液を含む。含まれ得る賦形剤は、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物などの他のタンパク質である。所望により、投与すべき医薬組成物はまた、微量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。
医薬組成物が静脈内投与される場合、水が好ましいキャリアであり得る。食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、特に注射溶液のための液体キャリアとして用いられ得る。前記組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を場合により含有し得る。かかる組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出製剤などの形態をとり得る。前記組成物は、従来の結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドと共に、坐薬として製剤化され得る。経口製剤は、標準的なキャリア、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。これらのおよび他の適切な医薬キャリアの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上記）に記載されている。
特定の例示的な実施形態では、前記組成物はまた、可溶化剤、および注射部位の痛みを緩和するための局所麻酔薬（例えば、リグノカイン）を含み得る。前記成分は、活性剤の量を示す密閉密封容器（例えば、アンプル）中、凍結乾燥した乾燥粉末もしくは無水濃縮物として、別個に供給されるかまたは一緒に混合して単位剤形で供給される。前記組成物が注入によって投与される場合、それは、医薬品グレードの滅菌水または生理食塩水を含有する輸液ボトルで投薬され得る。前記組成物が注射によって投与される場合、投与前に前記成分が混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
標的組織がその経路を介して利用可能である限り、治療組成物の投与は、任意の一般的な経路であり得る。これとしては、同所注射経路、皮内注射経路、皮下注射経路、筋肉内注射経路、腹腔内注射経路または静脈内注射経路が挙げられる。加えてまたはあるいは、経路は、経口投与、鼻腔投与、眼投与、口腔投与または他の粘膜投与もしくは局所投与であり得る。かかる医薬組成物は、通常、本明細書に記載される生理学的に許容され得るキャリア、緩衝液または他の賦形剤を含む薬学的に許容され得る組成物として投与される。
医薬組成物の剤形は、選択された投与様式によって決定される。例えば、注射液に加えて、局所製剤、吸入製剤、経口製剤および坐薬製剤が用いられ得る。局所製剤は、点眼薬、軟膏、スプレーなどを含み得る。吸入調製物は、液体（例えば、溶液または懸濁液）であり得、ミスト、スプレーなどを含み得る。経口製剤は、液体（例えば、シロップ、溶液または懸濁液）または固体（例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル）であり得る。坐薬調製物はまた、固体、ゲルまたは懸濁液形態であり得る。固体組成物の場合、通常の非毒性固体キャリアは、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。かかる剤形を調製する実際の方法は公知であり、または当業者に明らかである。
医薬組成物の有効量は、意図する目的、例えばアミロイド沈着物のクリアランスなどに基づいて決定される。適切な用量は、被験体の特徴、例えば、被験体がヒトまたは非ヒトであるか、年齢、体重、および被験体の症状または状態（ｓｔａｔｕｓ）に関係する他の健康検討事項、投与様式、投与経路および投与回数、ならびに医薬組成物が核酸またはウイルスを含むかに応じて変動する。一般に、本明細書に記載される医薬組成物は、アミロイド沈着物のクリアランスを介してアミロイドーシスを処置する目的で投与される。投与される活性化合物（複数可）の量は、処置される被験体、苦痛の重症度、および投与方法に依存し、処方する臨床医の判断に委ねることが最良である。これらの範囲内で、投与すべき製剤は、処置される被験体において所望の効果を達成するのに有効な量の有効成分（複数可）の量を含有する。特定の例示的な実施形態では、単位投与量は、約０．１〜約１０ｍｇ／被験体／日であり得る。薬剤が隔離部位に投与され、循環系またはリンパ系に（例えば、体腔にまたは臓器の内腔に）投与されない場合、約０．１〜最大約１００ｍｇ／被験体／日の投与量が特に使用され得る。
特定の例示的な実施形態では、医薬組成物は、ポンプを介して（Ｌａｎｇｅｒ、前掲；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１，１９８７；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７，１９８０；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４，１９８９を参照）、または例えばミニポンプを使用して連続皮下注入によって送達され得る。静脈内バッグ溶液もまた用いられ得る。適切な用量の選択における１つの要因は、従事者が適切であると考える、本明細書に開示される方法によって測定して得られた結果である。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−３３，１９９０）で議論されている。
特定の例示的な実施形態では、ポンプは埋め込まれる（例えば、米国特許第６，４３６，０９１号；米国特許第５，９３９，３８０号；および米国特許第５，９９３，４１４号を参照）。本明細書に記載される医薬組成物を含む治療剤の一定のかつ長期の投与または注入を患者に提供するために、埋め込み可能薬物注入デバイスが使用される。かかるデバイスは、能動型または受動型のいずれかに分類され得る。
活性薬物またはプログラム可能注入デバイスは、前記組成物を患者の系に送達するためのポンプまたは計量システムを特徴とする。現在利用可能なかかる能動型注入デバイスの例は、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ ＳＹＮＣＨＲＯＭＥＤ（商標）プログラム可能ポンプである。対照的に、受動型注入デバイスはポンプを特徴とせず、むしろ、目的の薬剤を送達するための加圧薬物リザーバーに依拠する。かかるデバイスの例としては、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ ＩＳＯＭＥＤ（商標）が挙げられる。
特定の例示的な実施形態では、医薬組成物は、持続放出系によって送達される。持続放出系の適切な例としては、適切なポリマー材料（例えば、造形品の形態の半透過性ポリマーマトリックス、例えばフィルムまたはマイクロカプセル（ｍｉｒｏｃａｐｓｕｌｅ））、適切な疎水性材料（例えば、許容され得る油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂および難溶性誘導体（例えば、難溶性塩など）が挙げられる。持続放出組成物は、（粉末、軟膏、ゲル、ドロップまたは経皮パッチによって）経口投与、非経口投与、槽内投与、腹腔内投与、局所投与され得るか、または経口もしくは経鼻スプレーとして投与され得る。持続放出マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６，１９８３、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート））；（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７，１９８１；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５，１９８２、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、同上文献）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が挙げられる。
ポリマーは、イオン制御放出に使用され得る。制御薬物送達に使用するための様々な分解性および非分解性ポリマーマトリックスは、当技術分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：５３７，１９９３）。例えば、ブロックコポリマーのポロクサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）４０７は、低温では、粘性だが流動性の液体として存在するが、体温では半固体ゲルを形成する。それは、組換えインターロイキン−２およびウレアーゼの製剤化および持続送達のための有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：４２５，１９９２；およびＰｅｃ，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４（２）：５８，１９９０）。あるいは、タンパク質の制御放出のためのマイクロキャリアとして、ヒドロキシアパタイトが使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２：２１５，１９９４）。
特定の他の例示的な実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物の制御放出および薬物ターゲティングのために、リポソームが使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，１９９３）。治療用タンパク質の制御送達のための多数のさらなる系が公知である（例えば、米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，１８８，８３７号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９５７，７３５号；および米国特許第５，０１９，３６９号；米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，５１４，６７０号；米国特許第５，４１３，７９７号；米国特許第５，２６８，１６４号；米国特許第５，００４，６９７号；米国特許第４，９０２，５０５号；米国特許第５，５０６，２０６号；米国特許第５，２７１，９６１号；米国特許第５，２５４，３４２号；および米国特許第５，５３４，４９６号）。
被験体が必要とし許容する投与量および回数に応じて、単回投与または複数回投与による組成物が投与される。一実施形態では、投与量は、ボーラスとして１回投与されるが、別の実施形態では、治療結果が達成されるまで、定期的に適用され得る。一般に、用量は、被験体に対する許容され得ない毒性を生じずに、疾患の症候または徴候を処置または改善するのに十分である。全身投与または局所投与が利用され得る。
特定の例示的な実施形態では、キットが提供される。前記キットは、例えば、典型的には、本明細書に記載されるアミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドまたはそれらの機能的断片の１種または複数種、例えば、配列番号１〜２０として示されている配列を有するアミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチド（またはそれらの機能的断片）の１種または複数種を含む。前記キットはまた、本明細書に記載される抗体またはその機能的断片を含む。前記キットのアミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドおよび抗体は、例えば、本明細書に記載されるように、１種または複数種の医薬組成物に製剤化され得る。前記キットは、アミロイド反応性ペプチドまたは融合ペプチドおよび抗体の使用手段を開示する説明資料を含み得る。説明資料は、書面、電子形態（例えば、コンピュータディスケットまたはコンパクトディスク）であり得るか、または映像（例えば、ビデオファイル）であり得る。前記キットはまた、前記キットがデザインされる特定用途（すなわち、アミロイドーシスの処置）を容易にするためのさらなる成分を含み得る。
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、その範囲を限定すると決して解釈されるべきではない。
実施例１−アミロイド反応性ペプチドを用いたアミロイドへの抗体のターゲティング
ペプチドの合成および精製
ペプチドを化学的に合成し、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ［１１００ ｓｅｒｉｅｓ；Ａｇｉｌｅｎｔ］）によって、０．０５％トリフルオロ酢酸を含む０〜５０％アセトニトリル水溶液の直線勾配で逆相Ｃ３マトリックスから溶出することによって精製した。１ｍＬ／分の流速を使用して、カラムからペプチドピークを溶出した；１ｍＬ画分を回収し、ピーク画分をプールし、単一四重極ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＭＳによって、質量を決定した。精製したペプチドを５ｍｇアリコートとして凍結乾燥し、本発明者らは、使用前にリン酸緩衝食塩水（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２；ＰＢＳ）に再懸濁した。再懸濁したペプチドを、使用まで４℃で保存した。
抗体産生
マウスＡＡアミロイド含有物質（アミロイド増強因子）と混合したペプチドｐ４３を免疫原として使用することによって、５つのマウスモノクローナル抗体を産生した。より具体的には、複合体化したＡＥＦ／ｐ４３懸濁液（ペプチドおよびＡＥＦを混合し、１６，０００×ｇで遠心分離することによって複合体を洗浄してから、滅菌ＰＢＳに再懸濁した）でマウスを免疫した。ＰＢＳ／アラムアジュバント中で調製したＡＥＦ／ｐ４３免疫原（５０μｇ−複合体中の総質量）をマウスに４回与えた。免疫後に、マウスを安楽死させ、マウス脾細胞を単離し、標準的なＰＥＧ融合によってＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合させ、プレーティングし、１０日間の培養後に、上清を、直接ＥＬＩＳＡによって、免疫原との免疫応答性についてスクリーニングした。９６ウェルマイクロプレートのウェルを、ＡＥＦおよびｐ４３ペプチドで（連続的に）コーティングした。融合クローン由来の培養上清をウェルに添加し、結合したマウス抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧを使用して検出した。比色基質としてＡＢＴＳを使用し、反応性を、プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ）を使用して４０５ｎｍで測定した。上記ＥＬＩＳＡに基づいて、反応性の上清を含むウェル中の細胞を限界希釈によってサブクローニングし、続いて、クローンを、上記のようにＥＬＩＳＡによって、ＡＥＦ／ｐ４３との反応性について再スクリーニングした。次いで、免疫陽性サブクローン由来の上清を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングしたペプチドまたはＡＥＦのみに対する結合について再試験した。ＡＥＦのみと反応性のクローンは、さらに利用しなかった；他のクローン（クローン４、５、８、１２および１３）はすべて、ｐ４３／ＡＥＦ複合体およびｐ４３のみの両方と反応した。ペプチドｐ４３反応性クローンを増殖させ、アイソタイプを決定し（すべてがＩｇＧ１、κであることが示された）、凍結保存した。その後の実験では、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、サブクローン上清からｍＡｂ（モノクローナル抗体）を精製した。いくつかの場合では、精製したｍＡｂを、標準的な手順（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して共有結合による連結（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｌｉｎｋａｇｅ）によってビオチンで標識した。ペプチド反応性抗体を、ユーロピウム結合免疫吸着アッセイ（ＥｕＬＩＳＡ）によって、アミロイド反応性ペプチドおよび関連ペプチドのパネルに対する反応性についてさらに特性評価した。次いで、５つの抗体クローン（すなわち、クローン４、５、８、１２および１３）を下記のようにさらに調査した。
サブクローンのペプチド反応性
ｐ４３と構造的に関係する合成ペプチド（表２、配列番号１２を参照のこと）との５つの各精製ビオチン化ｍＡｂの反応性を、ＥｕＬＩＳＡによって試験した。より具体的には、一晩インキュベートすることによって、９６ウェルマイクロプレートのウェルを２００ｎｇの合成ペプチドでコーティングした。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのリン酸緩衝食塩水溶液（ｐＨ７．２）を使用することによって、ウェルをブロッキングしてから、精製ビオチン化ｍＡｂ（クローン４、５、８、１２または１３）を１００ｎｇ／ウェル添加した。ユーロピウム結合ストレプトアビジンを添加し、続いて増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加することによって、結合したｍＡｂの検出を行った。Ｖｉｃｔｏｒ３プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、時間分解蛍光を測定した。
表３および４に示されているように、各クローンは、Ｌ−アミノ酸から構成されるＬｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘのヘプタッドアミノ酸リピート（Ｘは、ＡｌａまたはＧｌｎである）を有するペプチドと反応性であった。Ｌｙｓ残基の間隔の変更、またはＡｒｇに代えてのＬｙｓの置換、またはヘプタッドにおけるＤ−アミノ酸の使用は、抗体結合の喪失または減少をもたらした。
ｐ４３ペプチドおよびｐ５＋１４ペプチドを用いたアミロイド原線維のプレターゲティング
ユーロピウム結合免疫吸着アッセイ（ＥｕＬＩＳＡ）によって、合成アミロイド原線維に対する５つの各ｍＡｂの反応性を試験した。より具体的には、一晩インキュベートすることによって、９６ウェルマイクロプレートのウェルを、５００ｎｇのマウスＡＡアミロイド関連アミロイド抽出物（ＡＥＦ）、またはλ６可変ドメイン（ｒＶλ６Ｗｉｌ、別名 ＷＩＬ）から構成される合成軽鎖関連（ＡＬ）合成原線維のいずれかでコーティングした。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのリン酸緩衝食塩水溶液（ｐＨ７．２）を使用することによって、ウェルをブロッキングしてから、ペプチドｐ４３（免疫原）またはペプチドｐ５＋１４（１００ｎｇ／ウェル）を添加した。次いで、ウェルを洗浄し、ビオチン化ｍＡｂ（クローン４、５、８、１２または１３）を１００ｎｇ／ウェル添加した。ユーロピウム結合ストレプトアビジンを添加し、続いて増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加することによって、結合したｍＡｂの検出を行った。Ｖｉｃｔｏｒ３プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、時間分解蛍光を測定した。
図２に示されているように、免疫原のペプチドｐ４３でコーティングした原線維の存在下では、すべてのｍＡｂが反応性であった。しかしながら、ペプチドｐ５＋１４の存在下では、クローン４、５、１２および１３のみが、アミロイド原線維に結合した。プレターゲティングペプチドの非存在下では、原線維に対するｍＡｂの結合はなかった。図３に示されているように、前記ペプチドを使用してマウスＡＡアミロイド抽出物（アミロイド増強因子；ＡＥＦ）をプレターゲティングしたところ、同様のデータが得られた。
プレターゲッティングペプチドの捕捉
ｍＡｂクローン４、５、１２および１３クローンが、溶液からビオチン化ペプチドｐ５＋１４を捕捉することができるかを決定するために、本発明者らは、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用した。より具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロプレートを、示されているｍＡｂで一晩コーティングし（５００ｎｇ／ウェル）、ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液でウェルをブロッキングしてから、ビオチン化ｐ５＋１４ペプチド（１００ｎｇ／ウェル）を添加した。ビオチン化ペプチドｐ５Ｒおよびｐ３１Ｇ（別名 ｐ５Ｇ）を陰性対照として使用した。洗浄工程後、上記のように、ユーロピウム結合ストレプトアビジンを添加することによって、捕捉されたペプチドの検出を行った。
図４に示されているように、ｍＡｂクローン４、５、１２および１３は、それらをマイクロプレートのウェルに吸着させたときに、溶液からビオチン化ペプチドｐ５＋１４を捕捉することができることが示された。対照的に、クローンのいずれとも反応性ではないビオチン化形態のペプチドｐ５Ｒおよびｐ５Ｇは、捕捉されなかった（図４）。ｒＶλ６Ｗｉｌ原線維およびＡＡ−ＡＥＦに結合した場合、ｍＡｂクローン８はペプチドｐ５＋１４に結合せず、溶液中のビオチン化ｐ５＋１４を捕捉しなかった。
ＡＡ−ＡＥＦアミロイド抽出物に対する結合
別のアッセイでは、アミロイドターゲティングペプチドｐ５＋１４とプレインキュベートして複合体を形成した後に、ＡＡ−ＡＥＦアミロイド抽出物に対する前記ｍＡｂクローンの結合能力を調査した。より具体的には、ＥＬＩＳＡウェルを、ＡＡアミロイド関連抽出物（ＡＥＦ：５００ｎｇ／ウェルで一晩）でコーティングした。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡのリン酸緩衝食塩水溶液（ｐＨ７．２）を使用することによって、ウェルをブロッキングしてから、ペプチド：ｍＡｂモル比（ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）１：２、１：１または１：０．５のペプチドｐ５＋１４およびビオチン化ｍＡｂ（４、５、８、１２または１３）溶液を添加し、９０分間プレインキュベートした。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、上記のように、ユーロピウム結合ストレプトアビジンを添加し、続いて増強溶液を添加することによって、結合したｍＡｂの検出を行った。図５に示されているように、ｍＡｂクローンの添加前に、結合を、ｐ５＋１４を用いた標準的なプレターゲッティングと比較した。
プレターゲティングの免疫組織化学検査
ｍＡｂクローン４、５、１２または１３と併用したペプチドｐ５＋１４のプレターゲッティング有効性を、ヒトＡＴＴＲ含有ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を使用してさらに評価した。より具体的には、ホルマリン固定パラフィン包埋ヒトトランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイド含有組織から切断した厚さ６マイクロメートルの切片を、ＣｉｔｒａＰｌｕｓ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）と共に９０℃で３０分間インキュベートすることによって抗原回復に供した。ペプチドｐ５＋１４を約３μｇ／ｍＬ（ｍＡｂに対して３０倍モル過剰（ｍｏｌａｒ ｅｘｃｅｓｓ））で組織に添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴで３０分間洗浄することによって、未結合の試薬を除去した。（ｐ５＋１４有りまたは無しの）組織を、ビオチン化抗ペプチドｍＡｂ（クローン４、５、１２または１３）の３μｇ／ｍＬ溶液で免疫染色した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を添加し、続いて３，３’−ジアミノベジデン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を添加することによって、スライドを顕色した。
上記のように、陽性対照として、ビオチン化ｐ５＋１４ペプチド（ｍＡｂなし）を使用して、この組織におけるＴＴＲアミロイドを直接染色した（赤色の矢印、下）。
組織におけるアミロイドの存在および分布を確認するために、コンゴーレッドで連続スライドを染色した。簡潔に言えば、コンゴーレッド溶液（８０％エタノール溶液中０．８％ｗ／ｖコンゴーレッド、０．２％ＫＯＨｗ／ｖ）中で、組織を室温で１時間インキュベートした。次いで、切片を水で洗浄し、マイヤーヘマトキシリンで２分間懸濁することによって対比染色した。水道水で５分間リンスした後、組織を、エタノールｘ２およびＡｍｅｒｉｃｌｅａｒで脱水してから、トルエン系封入剤を使用してカバースリップした。図６に示されているように、交差偏光照明（ｃｒｏｓｓ−ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）を使用して顕微鏡で観察したところ、コンゴーレッド染色組織における緑赤色の複屈折物質として、アミロイドの存在が証明された（白色の矢印）。
直接ビオチン化して、ヒトＡＴＴＲアミロイドを含有する組織切片に添加したところ、ｐ５＋１４ペプチドはアミロイド沈着物と共局在するが、これは、コンゴーレッド染色組織切片においても観察される（図６）。非ビオチン化ペプチドｐ５＋１４を組織切片に添加し、ビオチン化抗ペプチドｍＡｂのプレターゲティング剤としてＡＴＴＲアミロイドに結合させたところ、アミロイドは、組織切片において褐色の沈着物として容易に視覚化された。「バックグラウンド」の染色は、ほとんどまたは全く観察されなかった。対照的に、プレターゲッティングｐ５＋１４ペプチドの非存在下で、ビオチン化ｍＡｂを添加したところ、アミロイドまたは健常周辺組織に対する結合は存在しなかった（図７）。
考察
これらのデータは、免疫治療抗体（例えば、サブクローニングしたｍＡｂ４、５、１２または１３）の添加前に、ｐ５＋１４ペプチド（または類似の変異体）を使用してアミロイドをプレターゲティングし得ることを示している。前記ｍＡｂは、アミロイド結合ペプチドに直接的に結合してそれをターゲティングすることができ、それにより、細胞性免疫応答（以下を参照のこと）を介してアミロイドのオプソニン化を誘発して、組織アミロイド沈着物を除去することができる。加えて、以前の研究に記載されているように（Ｗａｌｌら、２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１５ Ａｐｒ ２７；２０（５）：７６５７−８２．（ＰＭＩＤ）、プレターゲティング抗アミロイド免疫療法プロトコールの第１工程に加えて、アミロイドプレターゲティングペプチドを放射性標識して分子イメージング剤として使用し得る。特に、プレターゲティングペプチドｐ５＋１４および類似試薬は、（そこから原線維が形成される前駆体タンパク質にかかわらず）多くの種類のアミロイドに結合することが示されたので、例えば、適切な反応性ｍＡｂと共にペプチドｐ５＋１４を使用したプレターゲティング免疫療法は、すべてではないが多くの形態のアミロイドーシスにおいて有効であり得る。
実施例２−アミロイド反応性融合ペプチドを用いたプレターゲティング
内臓アミロイドーシスは、機能障害および死亡につながるきわめて重要な臓器におけるタンパク質原線維の沈着を特徴とする。現在、ヒトでは、アミロイド原線維の成分として、２７個超の異なるタンパク質が同定されている（特に、免疫グロブリン軽鎖（ＡＬアミロイド）、トランスサイレチン（ＡＴＴＲ）および血清アミロイドタンパク質Ａ（ＡＡ））。新規処置として、アミロイド原線維反応性抗体を使用した免疫療法が開発中である。１１−１Ｆ４という名称の一つの抗体（ｍＡｂ）は、ＡＬを有する患者におけるＡＬアミロイドに結合することが示されている。しかし、すべての患者が免疫応答性という訳ではなく、このｍＡｂは、インビボでＡＴＴＲまたはＡＡアミロイドに結合しない。したがって、１１−１Ｆ４の有用性を高めるために、本発明者らは、汎アミロイド反応性ペプチドと１２−ｍｅｒ １１−１Ｆ４エピトープ配列とを併せ持つ合成二官能性ペプチド（「ペプトープ」−名称ｐ６６（配列番号１８）を開発した。実施例１に上記されているペプチド合成および精製を使用して、ｐ６６ペプチドを作製した。ｉＴＡＳＳＥＲ（Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ ＡＳＳＥｍｂｌｙ Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）を使用して、本発明者らは、ｐ６６のアミノ酸配列に基づく２つの基本構造を予測した（図８）。
マウス１１−１Ｆ４とペプチドｐ６６および「天然」エピトープとの相互作用
ｐ６６のエピトープ部分は、親ｐ５＋１４親配列の存在によって損なわれないことを示すために、本発明者らは、マウス１１−１Ｆ４と、ペプチドｐ６６、およびκ４免疫グロブリン軽鎖から単離された「天然」エピトープ（名称Ｌｅｎ（１−２２））との相互作用を評価した。より具体的には、５０μｌ／ウェルの０．８３ｍＭ ｐ６６（ペプトープ）ペプチドまたはＶκ４Ｌｅｎ（１−２２）ペプチド（変性κ４軽鎖タンパク質のＮ末端に存在する１１−１Ｆ４の「天然エピトープ」）で、ｃｏｓｔａｒ高結合９６ウェルマイクロプレートを３７℃で一晩コーティングした。０．０５％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）の１×溶液で、プレートを洗浄した−各工程間に、同様の洗浄工程を実施した。「ブロッキング工程」として、プレートを、１ウェル当たり２００μｌのＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡと共に３７℃で１時間インキュベートした。出発濃度として１００ｎＭ（ＢＳＡＴ−ＰＢＳ中、０．０５％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）から滴定することによって、マウス１１−１Ｆ４ ｍＡｂの結合をアッセイし、マイクロプレート全体で１：２希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。ビオチン化ヤギ抗マウス二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を、ＢＳＡＴで１：３０００希釈して使用した。検出媒体としてユーロピウム結合ストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し（原液の１：１０００希釈）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の添加後に、結合した１１−１Ｇ４を定量し、Ｖｉｃｔｏｒ３ Ｗａｌｌａｃプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、時間分解蛍光を測定した。
本発明者らは、マイクロプレートの表面上に乾燥させると、マウス１１−１Ｆ４がｐ６６およびＬｅｎ（１−２２）の両方に結合したことを見出したが（図９）、これは、ｐ６６のエピトープ部分が親ｐ５＋１４親配列の存在によって損なわれないことを示している。各ペプチドについて、推定親和性（ＥＣ５０−５０％最大結合におけるｍＡｂの濃度）は、約０．５ｎＭであると推定された（図９）。
マウス１１−１Ｆ４と合成アミロイド原線維との相互作用
１１−１Ｆ４と合成アミロイド原線維との相互作用を評価するために、本発明者らは、マウス１１−１Ｆ４と、λ６軽鎖Ｗｉｌ（軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスに関連する）またはＡβ（１−４０）（アルツハイマー病および脳アミロイド血管障害に関連する）から構成される合成アミロイド原線維との相互作用を評価した。より具体的には、ｒＶλ６Ｗｉｌ（ＡＬ原線維）またはＡβ（１−４０）から構成される５０μｌ／ウェルの０．８３ｍＭ合成アミロイド原線維で、Ｃｏｓｔａｒ高結合プレートを３７℃で一晩コーティングした。０．０５％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）の１×溶液で、プレートを洗浄した−各工程間に、同様の洗浄工程を実施した。「ブロッキング工程」として、プレートを、１ウェル当たり２００μｌのＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡと共に３７℃で１時間インキュベートした。出発濃度として１００ｎＭ（ＢＳＡＴ中）からのマウス１１−１Ｆ４ ｍＡｂを添加し、マイクロプレート全体で１：２希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。ビオチン化ヤギ抗マウス二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を、ＢＳＡＴで１：３０００希釈して使用した。検出媒体としてユーロピウム結合ストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し（原液の１：１０００希釈）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の添加後に、結合した１１−１Ｇ４を定量し、Ｖｉｃｔｏｒ３ Ｗａｌｌａｃプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、時間分解蛍光を測定した。本発明者らは、マウス１１−１Ｆ４がＷｉｌおよびＡβ（１−４０）原線維の両方に結合したが、０．１μＭの１１−１Ｆ４ ｍＡｂであっても飽和しなかったことを見出した（図１０）。
マウス１１−１Ｆ４と合成アミロイド原線維との相互作用に対するｐ６６の効果
１１−１Ｆ４抗体と合成アミロイド原線維との相互作用を評価する（ａｓｓｅｓ）ために、本発明者らは、マウス１１−１Ｆ４と、λ６軽鎖Ｗｉｌ（軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスに関連する）またはＡβ（１−４０）（アルツハイマー病および脳アミロイド血管障害に関連する）から構成される合成アミロイド原線維との相互作用を評価した（ａｓｓｅｄ）。より具体的には、本発明者らは、ｐ６６の存在下における相互作用を評価した。ｒＶλ６Ｗｉｌ（ＡＬ原線維）またはＡβ（１−４０）から構成される５０μｌ／ウェルの０．８３ｍＭ合成アミロイド原線維で、Ｃｏｓｔａｒ高結合プレートを３７℃で一晩コーティングした。０．０５％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）の１×溶液で、プレートを洗浄した−各工程間に、同様の洗浄工程を実施した。「ブロッキング工程」として、プレートを、１ウェル当たり２００μｌのＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡと共に３７℃で１時間インキュベートした。ペプチドｐ６６（ペプトープ）を原線維含有ウェルに添加し（１００μｌの０．８３ｍＭ原液）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。未結合のペプトープを除去するための洗浄工程後、出発濃度として１００ｎＭ（ＢＳＡＴ中）からのマウス１１−１Ｆ４ ｍＡｂを添加し、マイクロプレート全体で１：２希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。ビオチン化ヤギ抗マウス二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を、ＢＳＡＴで１：３０００希釈して使用した。検出媒体としてユーロピウム結合ストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し（原液の１：１０００希釈）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の添加後に、結合した１１−１Ｇ４を定量し、Ｖｉｃｔｏｒ３ Ｗａｌｌａｃプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、時間分解蛍光を測定した。本発明者らは、ｐ６６を原線維コーティングマイクロプレートウェルに添加したところ、特にＷｉｌ原線維に対して、しかしＷｉｌ原線維に対しても１１−１Ｆ４ ｍＡｂの反応性が増強されたことを見出した（図１１）。
合成原線維に対するｐ６６結合に対するＢＳＡブロッキングの効果
１１−１Ｆ４抗体と合成アミロイド原線維との相互作用を評価するために、本発明者らは、マウス１１−１Ｆ４と、λ６軽鎖Ｗｉｌ（軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシスに関連する）またはＡβ（１−４０）（アルツハイマー病および脳アミロイド血管障害に関連する）から構成される合成アミロイド原線維との相互作用を評価した。より具体的には、本発明者らは、原線維結合に対するＢＳＡのブロッキング能力を評価した。１ウェル当たり２００μｌのＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって、Ｃｏｓｔａｒ高結合プレートを「ブロッキング」した。ペプチドｐ６６（ペプトープ）を、ブロッキングしたウェルに添加し（１００μｌの０．８３ｍＭ原液）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。未結合のペプトープを除去するための洗浄工程後、出発濃度として１００ｎＭ（ＢＳＡＴ中）からのマウス１１−１Ｆ４ ｍＡｂを添加し、マイクロプレート全体で１：２希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。ビオチン化ヤギ抗マウス二次抗体（Ｓｉｇｍａ）を、ＢＳＡＴで１：３０００希釈して使用した。検出媒体としてユーロピウム結合ストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し（原液の１：１０００希釈）、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の添加後に、結合した１１−１Ｇ４を定量し、Ｖｉｃｔｏｒ３ Ｗａｌｌａｃプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、時間分解蛍光を測定した。本発明者らは、原線維の非存在下で、ｐ６６をＢＳＡブロッキングウェルに添加したところ、ペプチドの結合およびｍＡｂの反応性が観察されなかったことを見出した（図１２）。
合成アミロイドおよび天然に存在するアミロイドに対するｐ６６およびｐ５＋１４の結合
合成アミロイドおよび天然に存在するアミロイドに対するｐ６６およびｐ５＋１４の結合を評価するために、クロラミンＴ（新たに作製した水中１ｍｇ／ｍｌ）による酸化を使用して、ヨウ素−１２５（Ｉ−１２５、１２５Ｉ）でペプチドｐ６６またはｐ５＋１４を放射性標識した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５固相およびＰＢＳ中０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチンの移動相を使用してサイズ排除クロマトグラフィーによって、反応混合物から遊離Ｉ−１２５を除去した。約２５０μｌの画分を収集し、ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａ ＩＩ自動ガンマカウンター）を使用して、それぞれの放射能を測定した。ピーク放射能を有するペプチド画分をプールし、「プルダウン」アッセイに使用した。
プルダウンアッセイでは、マウス：（ｍ）ＡＡおよび野生型（ＷＴ））肝臓ホモジネート（２５μｌ）；ｒＶλ６Ｗｉｌ（ＡＬ）、Ａβ（１−４０）および膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）合成原線維（２５μｇ）および；トランスサイレチン関連（ＡＴＴＲ）、ＡＬκ４−ＣａｂおよびＡＬλ１−Ｓｈｉｐヒトアミロイド抽出物（５０μｇ）に対する１２５Ｉ標識ペプチドの結合。ＰＢＳＴ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）または１Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳＴ中で、１２５Ｉ−ペプチドを調製した。１０μｌ（約５ｎｇ、約１００，０００カウント／分［ｃｐｍ］）の１２５Ｉ−ペプチド溶液を容量２００μｌで各試験サンプルに添加した。反応混合物を室温で１時間回転させ、次いで、１６，０００×ｇで１０分間、２回遠心分離した。各工程後に上清を取り出し、試験管に収集した。２回目のスピン後に得られたペレットをＰＢＳＴに再懸濁した。Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａ ＩＩ自動ガンマカウンターを使用して、上清およびペレットサンプルの両方の放射能を測定した。
結合したペプチド（％全体）＝（ペレットｃｐｍ）／（ペレットｃｐｍ＋上清ｃｐｍ）
にしたがって、結合したペプチド（％全体として表す）を計算した。
本発明者らは、ペプチドｐ６６（１１−１Ｆ４ペプトープ）およびｐ５＋１４の両方が、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（図１３Ａ）および１．０Ｍ ＮａＣｌ（図１３Ｂ）中で、合成アミロイドサンプルおよび天然に存在するアミロイドサンプルに同等に良く結合したことを見出したが、これは、１１−１Ｆ４エピトープ配列の存在が、アミロイドサンプルに対する結合または親和性を変化させなかったことを示している。
実施例３−マウスにおけるＡＡアミロイドに対する放射性標識１２５Ｉ−ｐ６６ペプトープのインビボ結合
ＡＬアミロイドーシスの優れたマウスモデルが存在しないので、本発明者らは、マウスモデルにおいて、全身性ＡＡアミロイドーシスとのペプチドｐ６６の反応性を調査することを選択した。特に、このマウスでは、マウス１１−１Ｆ４ ｍＡｂはＡＡアミロイドに結合しない。したがって、この系は、ｐ６６ペプチドを使用することによって１１−１Ｆ４反応性の誘導を実証するための優れたツールとして役立つ。マウスにおけるＡＡアミロイド沈着物中の（ヨウ素−１２５で標識された）ｐ６６ペプチドの取り込みを実証するために、マイクロオートラジオグラフィを使用した。実施例１に記載されているように、ペプチドｐ６６を産生および精製した。実施例２に上記されているように、Ｉ−１２５でｐ６６ペプチドを放射性標識した。他の詳細な方法は、以下に提供されている。
ＡＡアミロイドーシスのマウスモデル
１０μｇの精製脾性ＡＡアミロイド（アミロイド増強因子；ＡＥＦ）を含む１００μＬの滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を静脈内注射することによって、ヒトインターロイキン−６導入遺伝子を構成的に発現するＨ２−Ｌｄ−ｈｕＩＬ−６ Ｔｇ Ｂａｌｂ／ｃトランスジェニックマウスにおいて、全身性内臓ＡＡアミロイドーシスを誘導した。アミロイド負荷が有意であったＡＥＦ注射４〜６週間後のマウスにおいて、ペプチドｐ６６を評価した。
ＡＡマウスおよびＷＴマウスにおける１２５Ｉ−ｐ５＋１４のＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング
約５μｇの１２５Ｉ−ｐ６６（１２５μＣｉ）を外側尾静脈に注射したＷＴマウスまたはＡＡアミロイドマウス（ｎ＝３）を使用して、イメージングを実施した。適切な取り込み時間後（注射４時間後および７２時間後のデータが示されている）、イソフルランの過量吸入によって、マウスを安楽死させた。Ｉｎｖｅｏｎ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｐｌａｃｅソフトウェア（ｖｅｒ．２．０）を実行するＩｎｖｅｏｎトリモダリティイメージングプラットフォーム（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を使用して、ＳＰＥＣＴ画像を取得した。９０ｍｍのベッドトラベルを伴う、６０、１６秒の各プロジェクションで、低エネルギー（１２５Ｉ；２５〜４５ｋｅＶ）ガンマ光子を捕捉した。視野の中心から３０ｍｍにおいて、直径１ｍｍの５ピンホール（Ｍｏｕｓｅ Ｗｈｏｌｅ Ｂｏｄｙ）コリメータを使用した。３Ｄサブセット化による期待値最大化（３Ｄ ｏｒｄｅｒｅｄ ｓｕｂｓｅｔ ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ）（ＯＳＥＭ）アルゴリズム（８回反復；６つのサブセット）を使用して、データを、等方０．５０ｍｍボクセルを有する８８×８８×３１２マトリックス上に事後再構成した。
陽極電流５００ｍＡ、４×４ビニングで８０ｋＶｐにバイアスしたＸ線電圧を使用して、ＣＴデータを取得した。２２５ミリ秒露光を使用し、３６０の１°プロジェクションを収集した。Ｆｅｌｄｋａｍｐフィルタ逆投影アルゴリズムの実装を使用して、データを、等方０．１０６ｍｍボクセルを有する５１２×５１２×１２９６マトリックス上に再構成した。Ｉｎｖｅｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｗｏｒｋｐｌａｃｅ視覚化ソフトウェアパッケージ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を使用することによって、ＳＰＥＣＴおよびＣＴデータセットを自動で同時登録および視覚化した。イメージングデータを取得する５分前に、滅菌ＰＢＳで１：１希釈した約３００μＬのＩｏｈｅｘｏｌ ＣＴコントラスト剤をマウスに腹腔内投与した。
生体内分布の測定
１２５Ｉ−ｐ６６によるイメージングを受けているすべてのマウスから、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、小腸および大腸、胃ならびに心臓のサンプルを死後採取した。各サンプルを、風袋を量ったプラスチックバイアルに入れ、計量し、自動Ｗｉｚａｒｄ３ガンマカウンター（１４８０ Ｗａｌｌａｃ Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、１２５Ｉ放射能を測定した。生体内分布データを％注射用量／ｇ組織（％ＩＤ／ｇ）として表した。加えて、各組織のサンプルを１０％緩衝ホルマリン中で２４時間固定し、オートラジオグラフのためにパラフィン包埋した。
マイクロオートラジオグラフおよびＣＲ染色
オートラジオグラフのために、１２５Ｉ−ｐ６６を投与したマウス由来の組織を含有するホルマリン固定パラフィン包埋ブロックから、厚さ６μｍの切片を切断した。切片をＰｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置き、ＮＴＢ−２エマルジョン（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）中に浸漬し、暗所で保存し、４日間の曝露後に顕色した。ヘマトキシリンおよびエオシンで、各切片を対比染色した。アルカリコンゴーレッド溶液（０．８％ｗ／ｖコンゴーレッド、０．２％ｗ／ｖＫＯＨ、８０％エタノール）を用いて室温で１時間染色し、続いて、マイヤーヘマトキシリンで２分間対比染色することによって、連続組織切片においてアミロイドの検出を行った。
交差偏光フィルタを備えるＬｅｉｃａ ＤＭ５００光顕微鏡を使用して、すべての組織切片を調査した（コンゴーレッドの場合）。冷却ＣＣＤカメラ（ＳＰＯＴ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、デジタル顕微鏡画像を取得した。
結果および考察
コンゴーレッド染色組織では緑金色の複屈折として認められるアミロイド沈着物の部位におけるオートラジオグラフ中の黒銀粒子（１２５Ｉ−ｐ６６を示す）の沈着によって証明されるように、全身性ＡＡアミロイドーシスを有するマウスに注射した放射性標識（１２５Ｉ）ｐ６６は、アミロイド沈着物に特異的に結合した（図１４）。さらに、マイクロオートラジオグラフにより、１２５Ｉ−ｐ６６ペプチドは、健常組織に結合しないことが実証された（図１５）。より具体的には、オートラジオグラフ中の黒銀粒子（ｂｌａｃｋ ｓｉｌｖｅｒ ｇｒａｉｎ）（１２５Ｉ−ｐ６６を示す）の欠如によって証明されるように、健常ＷＴマウスに注射した放射性標識（１２５Ｉ）ｐ６６は、研究したいかなる組織にも結合しなかった（図１５）。最後に、図１６に示されているように、ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングおよび組織生体分布測定によって、インビボ（特に、肝臓、脾臓、膵臓および腸）におけるアミロイドとの１２５Ｉ−ｐ６６の反応性が確認された。インビボにおけるアミロイドとの反応性は十分に安定であり、ペプチド注射の少なくとも７２時間後において、ＳＰＥＣＴイメージングによって、肝臓におけるアミロイドを容易に視覚化することができた（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。
実施例４−インビボにおける全身性ＡＡアミロイドへの１２５Ｉ−１１−１Ｆ４のプレターゲティング
ＡＡアミロイドーシスのマウスモデルでは、マウスｍＡｂである１１−１Ｆ４ ｍＡｂは、ＡＡアミロイドに効率的に結合しない。したがって、本発明者らは、プレターゲティング剤としてペプトープｐ６６を使用することによって、マウスにおける１２５Ｉ−１１−１Ｆ４による特異的ＡＡアミロイド結合を実証しようとした。マウスにおけるＡＡアミロイド沈着物に対する１２５Ｉ−１１−１Ｆ４およびｐ６６ペプトープの結合を実証するために、マウスにおけるアミロイド結合ｐ６６の免疫組織化学的検出と組み合わせたマイクロオートラジオグラフを使用した。対照として、ｐ６６の代わりにペプチドｐ５＋１４をマウスに静脈内注射した。実施例１に記載されているように、ペプチドｐ６６を産生および精製した。実施例２に上記されているように、Ｉ−１２５でｐ６６ペプチドを放射性標識した。他の詳細な方法は、以下に提供されている。
ＡＡアミロイドーシスのマウスモデル
１０μｇの精製脾性ＡＡアミロイド（アミロイド増強因子；ＡＥＦ）を含む１００μＬの滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を静脈内注射することによって、ヒトインターロイキン−６導入遺伝子を構成的に発現するＨ２−Ｌｄ−ｈｕＩＬ−６ Ｔｇ Ｂａｌｂ／ｃトランスジェニックマウスにおいて、全身性内臓ＡＡアミロイドーシスを誘導した。アミロイド負荷が中程度であったＡＥＦ注射３〜４週間後のマウスにおいて、１２５Ｉ−１１−１Ｆ４のペプチドｐ６６プレターゲティングを評価した。
インビボプレターゲティング
３匹のマウスの３つのコホートに、約４００μｇの非標識ペプチドｐ６６をそれぞれ投与し、３つのコホートの第２のグループに、対照としてペプチドｐ５＋１４を投与した。ペプチド注射の２４時間後に、約１５０μＣｉ（約２０μｇ）の１２５Ｉ−１１−１Ｆ４ ＩＶをすべてのマウスの外側尾静脈に静脈内注射した。１１−１Ｆ４ ｍＡｂ注射の２４時間、４８時間および７２時間後に、ｐ６６マウスの１つのグループ（ｎ＝３）およびｐ５＋１４マウスの１つのグループ（ｎ＝３）を安楽死させ、固定とそれに続くマイクロオートラジオグラフィによる分析および免疫組織化学的分析のために、剖検のときに臓器を回収した。
マイクロオートラジオグラフィおよびコンゴーレッド染色
オートラジオグラフィのために、１２５Ｉ−ｐ６６を投与したマウス由来の組織を含有するホルマリン固定パラフィン包埋ブロックから、厚さ６μｍの切片を切断した。切片をＰｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置き、ＮＴＢ−２エマルジョン（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）中に浸漬し、暗所で保存し、４日間の曝露後に顕色した。ヘマトキシリンおよびエオシンで、各切片を対比染色した。アルカリコンゴーレッド溶液（０．８％ｗ／ｖコンゴーレッド、０．２％ｗ／ｖＫＯＨ、８０％エタノール）を用いて室温で１時間染色し、続いて、マイヤーヘマトキシリンで２分間対比染色することによって、連続組織切片においてアミロイドの検出を行った。
免疫組織化学検査
ｐ６６ペプトープまたはペプチドｐ５＋１４で処置したマウス由来のホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を、クエン酸緩衝液（ｐＨ６；Ｄａｋｏ）を使用して、９０℃で３０分間、抗原回復に供した。次いで、製造業者の指示にしたがって、過酸化水素、カゼイン、アビジンおよびビオチンで、組織をブロッキングした。次いで、ビオチン化ペプチド反応性ｍＡｂ（クローン１２−３［上記］）を添加し（ＰＢＳ中、１．６μｇ／ｍＬ）、サンプルを室温で２時間インキュベートし、続いて、４℃で一晩インキュベートし、続いて、室温でさらに２時間インキュベートした。組織を洗浄した後、Ｖｅｃｔｏｒ ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅを室温で４０分間添加し、続いて、Ｖｅｃｔｏｒ ＤＡＢを添加することによって、スライドを顕色した。
ｍＡｂ Ｉｂａ−１（１：８０００希釈）で染色し、続いて、ビオチン化ウサギ抗マウス二次試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｒａｂｂｉｔ Ｅｌｉｔｅ ｋｉｔ）を添加することによって、マクロファージの存在を検出した。上記のように、スライドを顕色した。交差偏光フィルタを備えるＬｅｉｃａ ＤＭ５００光顕微鏡を使用して、すべての組織切片を調査した（コンゴーレッドの場合）。冷却ＣＣＤカメラ（ＳＰＯＴ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、デジタル顕微鏡画像を取得した。
結果および考察
ペプトープｐ６６でプレターゲティングしたＡＡマウスに１１−１Ｆ４ ｍＡｂを注射した２４時間後、１２５Ｉ−１１−１Ｆ４はｐ６６と局在する（図１７）。より具体的には、免疫組織化学染色における褐色の着色は、組織中のＡＡアミロイドに特異的に会合したペプチドｐ６６の存在を示す（図１７）。オートラジオグラフ中の黒点状の着色は、１２５Ｉ−１１−１Ｆ４の存在を示しており、ｐ６６コーティングＡＡアミロイドとのみ共局在しているように見られる（図１７）。
対照的に、ｐ５＋１４対照ペプチドでプレターゲティングしたＡＡマウスに１１−１Ｆ４ ｍＡｂを注射した２４時間後のマウスの評価では、共局在が示されなかった（図１８）。すなわち、評価したすべての組織において、褐色のｐ５＋１４コーティングＡＡアミロイドが存在するにもかかわらず、マイクロオートラジオグラフ中の黒銀粒子の非存在によって証明されるように、１２５Ｉ−１１−１Ｆ４がアミロイドと共局在する証拠はほとんどなかった（図１８）。
最後に、ｐ６６またはｐ５＋１４を事前に注射して１１−１Ｆ４ ｍＡｂを注射した７２時間後のＡＡマウスにおける肝臓マクロファージは、マクロファージ浸潤の誘導を示した（図１９）。より具体的には、褐色の着色は、マウス肝臓におけるＩｂａ−１陽性マクロファージに関連していた。これらの予備的データは、ＡＡマウスにおけるｐ６６と１１−１Ｆ４との組み合わせ（図１９（上））が、ｐ５＋１４と１１−１Ｆ４ ｍＡｂとの併用（図１９（下））のものよりも大きい程度で、肝臓へのマクロファージ浸潤、およびアミロイド沈着物周囲のマクロファージのクラスタリングを誘導したことを示唆している。
開示される本発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態に関して、例証された実施形態は本発明の好ましい例に過ぎず、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではないことを認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの請求項の範囲および精神内に入るすべてを本発明者らの発明として主張する。

Claims (46)

  1. クリアランスすべきアミロイド沈着物をターゲティングする方法であって、
    アミロイド沈着物を、アミロイド沈着物に結合するアミロイド反応性ペプチドと接触させること；および
    該アミロイド反応性ペプチドを、該アミロイド反応性ペプチドに結合する抗体またはその機能的断片と接触させること
    を含み、
    該アミロイド反応性ペプチドを、該アミロイド反応性ペプチドに結合する該抗体と接触させることが、クリアランスすべき該アミロイド沈着物をターゲティングする、方法。
  2. クリアランスすべき前記アミロイド沈着物をターゲティングすることが、該アミロイド沈着物のクリアランスをもたらす、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アミロイド反応性ペプチドが、該アミロイド反応性ペプチドに融合されたエピトープをさらに含み、前記抗体またはその機能的断片が該エピトープに結合する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記融合されたエピトープに対する前記抗体またはその機能的断片の結合が、被験体からの前記アミロイド沈着物のクリアランスの増加をもたらす、請求項３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記抗体がアミロイド反応性抗体である、請求項３〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記エピトープが１１−１Ｆ４抗体結合モチーフを含む、請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記エピトープが、配列番号２２または配列番号２３として示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記アミロイド反応性ペプチドが、ＡＡ、ＡＬ、ＡＨ、ＡＴＴＲ、Ａβ２Ｍ、ＡＬｅｃｔ２、野生型、ＴＴＲ、ＡＡｐｏＡＩ、ＡＡｐｏＡＩＩ、ＡＧｅｌ、ＡＬｙｓ、ＡＬｅｃｔ２、Ａｆｉｂ、ＡＣｙｓ、ＡＣａｌ、ＡＭｅｄｉｎ、ＡＩＡＰＰ、ＡＰｒｏ、ＡＩｎｓ、ＡＰｒＰまたはＡβを含む１種または複数種のアミロイド沈着物型に結合する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記アミロイド反応性ペプチドが、配列番号１〜配列番号１７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  10. 前記アミロイド反応性ペプチドが、配列番号１として示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  11. 前記融合されたエピトープを含む前記アミロイド反応性ペプチドが、配列番号１８として示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項３〜７のいずれかに記載の方法。
  12. 前記融合されたエピトープを含む前記アミロイド反応性ペプチドが、配列番号１９として示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項３〜７のいずれかに記載の方法。
  13. 前記融合されたエピトープを含む前記アミロイド反応性ペプチドが、配列番号２０として示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項３〜７のいずれかに記載の方法。
  14. 前記抗体が、表３においてクローン４−２、５−１、１２−３または１３−２として示されているモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
  15. 前記抗体が、配列番号１、５、８、１２、１３、１５、１６または１７として示されているアミノ酸配列の１種または複数種と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するアミロイド反応性ペプチドの１種または複数種に結合するモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
  16. 被験体におけるアミロイド沈着物を取り除くための方法であって、
    アミロイドーシスを有する被験体を選択すること；
    アミロイド沈着物に結合するアミロイド反応性ペプチドを該被験体に投与すること；および
    該アミロイド反応性ペプチドに結合する抗体またはその機能的断片を該被験体に投与すること
    を含み、該被験体への該抗体またはその機能的断片の投与が、該被験体における該アミロイド沈着物のクリアランスをもたらす、方法。
  17. 前記アミロイド反応性ペプチドが、該アミロイド反応性ペプチドに融合されたエピトープをさらに含み、前記抗体またはその機能的断片が該エピトープに結合する、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記融合されたエピトープに対する前記抗体またはその機能的断片の結合が、前記被験体からの前記アミロイド沈着物のクリアランスの増加をもたらす、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記融合されたエピトープが、アミロイド沈着物に結合することが公知の抗体に対する抗体結合モチーフを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 前記融合されたエピトープが１１−１Ｆ４抗体結合モチーフを含む、請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. 前記エピトープが、配列番号２２または配列番号２３として示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記アミロイド反応性ペプチドが、ＡＡ、ＡＬ、ＡＨ、ＡＴＴＲ、Ａβ２Ｍ、ＡＬｅｃｔ２、野生型、ＴＴＲ、ＡＡｐｏＡＩ、ＡＡｐｏＡＩＩ、ＡＧｅｌ、ＡＬｙｓ、ＡＬｅｃｔ２、Ａｆｉｂ、ＡＣｙｓ、ＡＣａｌ、ＡＭｅｄｉｎ、ＡＩＡＰＰ、ＡＰｒｏ、ＡＩｎｓ、ＡＰｒＰまたはＡβを含む１種または複数種のアミロイド沈着物型に結合する、請求項１６〜２１のいずれかに記載の方法。
  23. 前記アミロイド反応性ペプチドが、配列番号１〜配列番号１７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１６〜２２のいずれかに記載の方法。
  24. 前記アミロイド反応性ペプチドが、配列番号１として示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１６〜２２のいずれかに記載の方法。
  25. 前記アミロイド反応性ペプチドおよび結合したエピトープが、配列番号１７として示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１６〜２２のいずれかに記載の方法。
  26. 前記融合されたエピトープを含む前記アミロイド反応性ペプチドが、配列番号１８として示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１７〜２２のいずれかに記載の方法。
  27. 前記融合されたエピトープを含む前記アミロイド反応性ペプチドが、配列番号１９として示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１７〜２２のいずれかに記載の方法。
  28. 前記抗体が、表３においてクローン４−２、５−１、１２−３または１３−２として示されているモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
  29. 被験体におけるアミロイドーシスを処置するための方法であって、
    アミロイドーシスを有する被験体を選択すること；
    アミロイド沈着物に結合するアミロイド反応性ペプチドと、該アミロイド反応性ペプチドに融合されたエピトープであって、抗体に結合するエピトープとを含む有効量のアミロイド反応性融合ペプチドを該被験体に投与すること；および
    有効量の該抗体またはその機能的断片を該被験体に投与すること
    を含む、方法。
  30. 前記アミロイド反応性融合ペプチドに対する前記抗体またはその断片の結合が、前記アミロイド沈着物のクリアランスをもたらす、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記アミロイド反応性融合ペプチドの前記アミロイド反応性ペプチドが、配列番号１〜配列番号１７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項２９または３０に記載の方法。
  32. 前記アミロイド反応性融合ペプチドの前記アミロイド反応性ペプチドが、ＡＡ、ＡＬ、ＡＨ、ＡＴＴＲ、Ａβ２Ｍ、ＡＬｅｃｔ２、野生型、ＴＴＲ、ＡＡｐｏＡＩ、ＡＡｐｏＡＩＩ、ＡＧｅｌ、ＡＬｙｓ、ＡＬｅｃｔ２、Ａｆｉｂ、ＡＣｙｓ、ＡＣａｌ、ＡＭｅｄｉｎ、ＡＩＡＰＰ、ＡＰｒｏ、ＡＩｎｓ、ＡＰｒＰまたはＡβを含む１種または複数種のアミロイド沈着物型に結合する、請求項および請求項２９〜３１に記載の方法。
  33. 前記抗体またはその機能的断片が、配列番号１８または配列番号１９または配列番号２０として示されているアミノ酸配列を有するペプチドの１種または複数種に対して反応性である、請求項２９〜３２のいずれかに記載の方法。
  34. 前記エピトープが、１１−１Ｆ４抗体のエピトープである、請求項２９〜３３のいずれかに記載の方法。
  35. 前記エピトープが、配列番号２２または配列番号２３の１つまたは両方として示されているアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の方法。
  36. アミロイド反応性ペプチドに対する結合親和性を有する実質的に純粋な抗体であって、該アミロイド反応性ペプチドが、配列番号１〜配列番号１７として示されているアミノ酸配列の１種または複数種と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、実質的に純粋な抗体。
  37. 前記アミロイド反応性ペプチドが、配列番号１、５、８、１２、１３、１５、１６および１７として示されているアミノ酸配列の１種または複数種と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項３６に記載の実質的に純粋な抗体。
  38. 表３においてクローン４−２、５−１、１２−３または１３−２として示されているモノクローナル抗体である、請求項３６または請求項３７に記載の実質的に純粋な抗体。
  39. アミロイドーシスを処置するための方法であって、
    アミロイドーシスを有する、処置すべき被験体を選択すること；
    配列番号１〜配列番号１７として示されているアミノ酸配列の１種または複数種と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むアミロイド反応性ペプチドを該被験体に投与すること；および
    請求項３６〜３７のいずれかに記載の抗体の１種または複数種を該被験体に投与すること
    を含む、方法。
  40. 前記アミロイド反応性ペプチドが、ＡＡ、ＡＬ、ＡＨ、ＡＴＴＲ、Ａβ２Ｍ、ＡＬｅｃｔ２、野生型、ＴＴＲ、ＡＡｐｏＡＩ、ＡＡｐｏＡＩＩ、ＡＧｅｌ、ＡＬｙｓ、ＡＬｅｃｔ２、Ａｆｉｂ、ＡＣｙｓ、ＡＣａｌ、ＡＭｅｄｉｎ、ＡＩＡＰＰ、ＡＰｒｏ、ＡＩｎｓ、ＡＰｒＰまたはＡβを含む１種または複数種のアミロイド沈着物型に結合する、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記被験体への前記抗体の投与が、アミロイド沈着物のクリアランスをもたらす、請求項３９〜４０のいずれかに記載の方法。
  42. 前記被験体への前記抗体の投与が、前記アミロイド沈着物に対する免疫応答を誘発する、請求項４０〜４１のいずれかに記載の方法。
  43. クリアランスすべき抗体をターゲティングする方法であって、
    アミロイド沈着物を、配列番号１〜配列番号１７として示されているアミノ酸配列の１種または複数種と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むアミロイド反応性ペプチドと接触させること；および
    該アミロイド反応性ペプチドを、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の抗体と接触させること
    を含む、方法。
  44. 前記アミロイド反応性ペプチドが、ＡＡ、ＡＬ、ＡＨ、ＡＴＴＲ、Ａβ２Ｍ、ＡＬｅｃｔ２、野生型、ＴＴＲ、ＡＡｐｏＡＩ、ＡＡｐｏＡＩＩ、ＡＧｅｌ、ＡＬｙｓ、ＡＬｅｃｔ２、Ａｆｉｂ、ＡＣｙｓ、ＡＣａｌ、ＡＭｅｄｉｎ、ＡＩＡＰＰ、ＡＰｒｏ、ＡＩｎｓ、ＡＰｒＰまたはＡβを含む１種または複数種のアミロイド沈着物型に結合する、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記アミロイド反応性ペプチドと前記抗体とを接触させることが、アミロイド沈着物のクリアランスをもたらす、請求項４３〜４４のいずれかに記載の方法。
  46. アミロイドーシスの処置のためのアミロイド反応性融合ペプチドであって、配列番号１８または１９または２０として示されている配列を有する、アミロイド反応性融合ペプチド。

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