JP2024505935A - 非炎症性食細胞作用誘導活性を有する融合分子 - Google Patents

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Abstract

食細胞作用誘導活性を有する融合分子に関するもので、従来の技術が有する炎症反応の活性化による組織損傷の問題を解決することができ、これにより、蓄積された異常タンパク質、例えば、β－アミロイド、タウ、α－シヌクレイン、ハンチンチンまたはプリオンなどを効果的に除去することで、このような物質の異常蓄積に起因するタンパク質症などの予防または治療用途への活用が可能である。【選択図】図１

Description

本発明は、非炎症性食細胞作用誘導活性を有する融合分子に関し、タンパク質症などの物質の異常蓄積に起因する疾患の予防または治療の用途への活用の可能性を提示する。
多くの退行性疾患は、特定のタンパク質の異常な折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ、フォールディング）、ポリマー化（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）及び蓄積を特徴とする。このようなタンパク質症（ｐｒｏｔｅｏｐａｔｈｙ、プロテオパチー）には、様々な種類のアミロイドーシス（ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ、アミロイド症）が含まれる。
アミロイドーシス（ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ、アミロイド症）は、アミロイド線維として知られる異常なタンパク質が組織に蓄積する一群の疾患である。アミロイドは、顕微鏡で見た場合に繊維状に現れる直径７～１３ｎｍでβシート（β－ｓｈｅｅｔ）構造のタンパク質塊であり、チオフラビンＴ（チオＴ）及びコンゴーレッド（ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ）により染色される特徴を有している。アミロイドは正常な体内では見られず、３６種のタンパク質がアミロイドを形成しうることが現在まで報告されている（非特許文献１：Ｐｉｃｋｅｎ，Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．（２０２０），１４３：３２２－３３４）。代表的なアミロイドーシスには、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）およびプリオン病（ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）などの神経疾患が含まれ、その他にも、原因タンパク質と影響を受けた臓器によって様々な様相を有する複数のアミロイドーシスが存在する。
アルツハイマー病は、認知症の最大の原因であり、学習障害と記憶障害を伴う致命的な疾患である。２０５０年には世界人口の中で１億３千万人がアルツハイマー病に罹患すると予測されており、すでに６５歳以上の人口の中では９人当たり１人がアルツハイマー病と診断されている。
アルツハイマー病は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ：Ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）が非正常的に分解されて生じるβ－アミロイド（Ａβ）タンパク質が脳細胞膜の外側に沈着して蓄積することを特徴とし、これとともに微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）に結合するタウ（ｔａｕ）タンパク質の過剰リン酸化による異常な結合を示す。
その中でも、β－アミロイドの凝集によって生じるオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）とフィブリル（ｆｉｂｒｉｌ）は、様々な経路を通じてシナプス（ｓｙｎａｐｓｅ）機能の低下及び細胞毒性を起こし、脳で免疫を担当する星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）及び小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ、ミクログリア）の機能変化をよって神経細胞に再度悪影響を及ぼす悪循環が行われるということが最近報告されている。
現在まで、ＦＤＡ承認されたアルツハイマー病治療薬は、アセチルコリン（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）分解を抑制したり、ＮＭＤＡ受容体の活性を抑制したりする薬剤であり、これらは、本疾患の根本的な治療ではなく、症状の一時的な緩和のみを目標とする。したがって、アルツハイマー病を根本的に治療できる方法は、これまで存在しておらず、人口高齢化時代における患者の治療およびケアに最も高い費用がかかる疾患として知られている。
アルツハイマー病の根本的な治療のために、現在まで数十年間、β－アミロイドの生成抑制および除去に重点を置いて薬開発が行われている。しかし、残念ながら大部分のβ－アミロイドの生成抑制及び除去のために開発されたアルツハイマー治療薬が臨床段階で効果を奏することができず失敗した。例えば、β－アミロイド減少のためのＢＡＣＥ阻害剤の場合、認知機能低下が発生したアルツハイマー患者では、すでにβ－アミロイドプラークが蓄積されており、神経細胞死が起こっているので、さらなる生成を妨害する戦略はあまり効果的ではない。
近年、β－アミロイドオリゴマーとフィブリルに特異的に結合するモノクローナル抗体がアルツハイマー病患者においてβ－アミロイド除去を誘導し認知機能を回復させたという研究結果が報告され、β－アミロイド抗体によるアルツハイマー病治療戦略が新たな希望として急浮上している。
現在まで提案されたβ－アミロイドモノクローナル抗体の作用機序としては、β－アミロイド抗体がβ－アミロイドオリゴマーとフィブリルに結合してこれらの凝集を防ぐこと、または小膠細胞がモノクローナル抗体を認識するＦｃ受容体を介してβ－アミロイドの食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を起こすことなどがある。
しかし、このようなアルツハイマー病治療薬の開発の進展にもかかわらず、β－アミロイドモノクローナル抗体を用いた現在の免疫療法は、抗体処理患者の５５％で重度の浮腫（ｅｄｅｍａ）を伴うアミロイド関連画像異常（ＡＲＩＡ：Ａｍｙｌｏｉｄ－Ｒｅｌａｔｅｄ－Ｉｍａｇｉｎｇ－Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）現象を示し、これを理由に、実際約３５％のＡＲＩＡ患者が臨床試験から途中で除外された。ＡＲＩＡ現象は、β－アミロイドモノクローナル抗体がＦｃ受容体の刺激時に必然的に活性化する炎症反応によるシナプス及び細胞毒性が原因であることが知られている。
脳内に存在するシナプスと神経細胞が炎症性サイトカインに対して敏感に反応するため、β－アミロイドモノクローナル抗体を用いた治療は、結局、β－アミロイドをある程度除去したとしても、同時に神経細胞やシナプスにもダメージを与えてしまう、避けられないという本質的な問題を抱えている。また、モノクローナル抗体と共に、ＡｌｅｃｔｏｒとＤｅｎａｌｉなどの企業は、小膠細胞の免疫学的機序を調節するＴＲＥＭ２等のターゲットを活性化することで、小膠細胞のβ－アミロイド除去能力を向上させる戦略を提示して、注目を集めている。しかしならが、これもまた小膠細胞が過度に活性化する場合、全般的な食細胞作用能力の増加によるシナプス損傷が予想される。
したがって、アルツハイマー病の治療における今後の重要な課題は、炎症反応とシナプスの損傷を起こすことなく、β－アミロイドオリゴマーとフィブリルのみを選択的に除去できる方法を開発することであり、このような薬物は、アルツハイマー病の治療に大きく貢献することが期待される。
さらに、前記のように炎症反応とこれに伴う追加の組織損傷を起こさずに目標とする異常蓄積物質、例えばタンパク質症の原因となる異常蓄積タンパク質のみを選択的に除去できる方法を広く適用して、タウ（Ｔａｕ）やα－シヌクレイン（α－Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）およびハンチンチン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）などの異常蓄積タンパク質を選択的に除去できる方法を開発できるであろう。このような薬物は、ハンチントン病などの神経疾患だけでなく、特定物質の異常蓄積に関連する疾患全般の治療にも大きく貢献することが期待される。
Ｐｉｃｋｅｎ，Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．（２０２０），１４３：３２２－３３４ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３：６５５１，１９７８ Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，ＤＮＡ，３：４７９－４８８，１９８４；Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４４：１７７，１９８６ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３：７１０，１９８６ Ｈｉｇｕｃｈｉ，１９８９，「Ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ＤＮＡ」ｉｎ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ６，ｐｐ．６１－７０ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｒｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９） Ｄｅｕｓｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０） ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，４ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（２００３） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ ｔｈ ｅｄ．，１９９５）
本発明は、食細胞作用誘導活性を有する融合分子に関し、標的物質の異常蓄積に起因する疾病の予防または治療の用途への活用の可能性を提示することを目的とする。
本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した技術的課題に制限されず、言及していない他の技術的課題は、以下の記載から当業界の通常の技術者に明確に理解されるであろう。
本発明の一様態は、ＴＡＭ受容体結合能を有する第１の領域と、標的物質に特異的に結合する第２の領域とを含む、食細胞作用誘導活性を有する融合分子を提供する。
ここで、前記ＴＡＭ受容体は、具体的に、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ及びＭｅｒＴＫからなる群から選択される１つ以上であってよく、これらはラミニンＧ様ドメイン（ｌａｍｉｎｉｎ Ｇ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ又はＬＧ ｄｏｍａｉｎ）と結合して食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を誘導し得る。
前記第１の領域は、Ｇａｓ６、ＰｒｏＳ１、Ｔｕｂｂｙ、Ｔｕｌｐ１、Ｇａｌ３またはこれらの活性断片を含み得、これらの固有のＴＡＭ受容体との相互作用による食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）誘導能が保存された形態のタンパク質であれば、その形態や範囲において特に制限されない。前記第１の領域は、好ましくは、Ｇａｓ６、ＰｒｏＳ１またはこれらの活性断片の中から選択され得る。
より具体的に、前記第１の領域は、Ｇａｓ６もしくはＰｒｏＳ１のラミニンＧ様ドメイン、またはその活性断片を含み得、これらは種々の組織で強く発現する食細胞作用関連架橋分子（ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）としてラミニンＧ様ドメインを含んでおり、それによってＴＡＭ受容体を介して食細胞作用を誘導し得る。
前記ラミニンＧ様ドメインは、具体的にＬＧ１ドメイン、ＬＧ２ドメインまたはこれらの組み合わせを含んでもよく、好ましくは、ＬＧ１ドメインおよびＬＧ２ドメインの両方を含んでもよく、これらは前記ＴＡＭ受容体と結合して食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を誘導し得る。
前記第１の領域は、配列番号１及び配列番号２のうちの１つ以上の配列を含むペプチド、または配列番号３及び配列番号４のうちの１つ以上の配列を含むペプチドであってもよい。好ましくは、前記第１の領域は、配列番号１及び配列番号２の両方の配列を含む配列、または配列番号３及び配列番号４の両方の配列を含む配列、のいずれか一方の配列を含むペプチドであってもよく、より好ましくは、配列番号５または配列番号６の配列を含むペプチドであってもよい。前記配列番号の配列を含むペプチドは、前記アミノ酸配列だけでなく、アミノ酸配列変異体も含む、前記配列変異体とは、アミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が異なる配列を有するタンパク質を意味し、前記融合分子の活性を維持する限り、タンパク質の最終構造物におけるあらゆる切断、欠失、挿入、置換等、およびこれらの組み合わせも可能である。配列変異体の一例は、活性に必須でない部位のアミノ酸残基を切断もしくは欠失した形態、または自己抑制に重要な部位のアミノ酸残基を置換した形態である。また、場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されることもできる。このような配列の変異と修飾により、アミノ酸配列上の変異によりタンパク質の機能および／または安定性（熱安定性、ｐＨ安定性、構造安定性など）および／または溶解度が増加した場合がより好ましい。
前記アミノ酸配列における変異を誘発する方法は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を変異させることにより、変化するアミノ酸配列に該当するヌクレオチド配列を含む核酸分子を有するように製造する方法を利用するものであって、これをコードする遺伝子を取得する方法は、当技術分野で周知の全ての突然変異技術を用いて、生体内または実験管内で突然変異を行うことができる。例えば、部位特異的変異導入（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（非特許文献２－４：Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３：６５５１，１９７８；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，ＤＮＡ，３：４７９－４８８，１９８４；Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４４：１７７，１９８６；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３：７１０，１９８６）、ＴＡＢリンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＰＣＲ技術（非特許文献５：Ｈｉｇｕｃｈｉ，１９８９，「Ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｔｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ＤＮＡ」ｉｎ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ６，ｐｐ．６１－７０）などが使用できる。
また、前記第１の領域がＧａｓ６またはＰｒｏＳ１のラミニンＧ様ドメイン（ｌａｍｉｎｉｎ Ｇ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ）またはその活性断片を含む場合、前記第１の領域は、Ｇｌａドメインを含まなくてもよく、これは、第１の領域がホスファチジルセリン（ＰＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）を認識するのを防ぎ、第２の領域が標的物質を認識して食細胞作用を誘導する目的のためであり得る。
また、前記第１の領域がＧａｓ６またはＰｒｏＳ１のラミニンＧ様ドメイン（ｌａｍｉｎｉｎ Ｇ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ）、またはその活性断片を含む場合、前記第１の領域は、Ｇｌａドメイン及びＥＧＦドメインの両方を含まなくてもよく、これは、前述のＧｌａドメインを含まないことにより得られる技術的効果と共に、前記融合分子の精製過程で凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）現象を抑制して収率を増大させる目的のためであり得る。
前記標的物質は、生体組織に蓄積されて疾病を引き起こす物質であり得る。例えば、これは、患者の影響を受けた（ａｆｆｅｃｔｅｄ）、すなわち、罹患（ｄｉｓｅａｓｅｄ）組織に蓄積されているものであり得る。前記疾病において蓄積される物質はタンパク質、すなわち、前記疾病はタンパク質症であり得るが、これに限定されるものではない。例えば、前記標的物質はアミロイドであり、すなわち、前記タンパク質症はアミロイドーシスであり得る。前記標的物質は、下記表１の異常蓄積物質の中から選択されるものであり得、このとき、前記疾病は、各異常蓄積物質が検出される疾病であり得る。例えば、前記タンパク質症は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病及びプリオン病の中から選択されるものであり得、このとき、前記標的物質は、当該疾患の原因となる異常蓄積タンパク質であり得、すなわち、それぞれβ－アミロイド（β－Ａｍｙｌｏｉｄ）、タウ（Ｔａｕ）、α－シヌクレイン（α－Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）、ハンチンチン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）、プリオン（ｐｒｉｏｎ）タンパク質であり得る。
Figure 2024505935000002
Figure 2024505935000003
Figure 2024505935000004
Figure 2024505935000005
前記標的物質に特異的に結合する第２の領域は、前記標的物質に特異的に結合する抗体、その活性断片、抗体様タンパク質、ペプチド、アプタマー及び可溶性受容体の中から選択されるものであってもよいが、当該標的物質に特異的に結合できる形態のものであれば、特に制限はない。
ここで、抗体又はその活性断片は、例えば、ｉ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の中から選択される免疫グロブリン；ｉｉ）Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨＨ、ＶＮＡＲなどの天然（ｎａｔｉｖｅ）抗体断片；ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ペンタボディ（ｐｅｎｔａｂｏｄｙ）などのエンジニアリングされた抗体；の中から選択されるものであってもよい。前記抗体又はその活性断片は、例えば、当該標的物質に対して特異的に結合する抗体又は抗体から由来した６つの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲｓ）に基づくＭａｂ、Ｆａｂ又はその一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）であり得る。すなわち、前記標的物質に特異的に結合するタンパク質またはその活性断片は、当該標的物質に特異的に結合する、活性に必須な部分を含むものであり、前記第１の領域と連結され、炎症反応を伴わずにシナプス損傷を起こさない効果を示すものであれば、その形態や範囲において特に制限されるものではない。例えば、前記標的物質は、β－アミロイドであってもよく、この場合、前記標的物質に特異的に結合するタンパク質又はその活性断片は、アデュカヌマブ（ａｄｕｃａｎｕｍａｂ）又はその一本鎖Ｆｖ断片を含むものであってもよい。前記第２の領域は、アデュカヌマブ（ａｄｕｃａｎｕｍａｂ）、セモリネマブ（ｓｅｍｏｒｉｎｅｍａｂ）及びシンパネマブ（ｃｉｎｐａｎｅｍａｂ）からなる群から選択されるいずれか１つから由来した６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に基づくＭａｂ、Ｆａｂまたは一本鎖Ｆｖ断片を含むものであってもよい。
前記抗体又はその活性断片は、Ｆｃ領域を含まないものであってもよく、好ましくは、Ｆｃ受容体（特に、Ｆｃγ受容体）に結合しないＦｃ領域変異体を含んでいてもよい。このようなＦｃ領域変異体は、錠剤などの物性を向上させるためのものとして含まれてもよい。
前記抗体様タンパク質（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）とは、抗体のように標的物質に特異的に結合できるタンパク質スキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を指す。抗体様タンパク質は、平均サイズ約１５０ｋＤａの抗体に比べて２～２０ｋＤａと小さいので、抗体がアクセスできない結合部位を標的にするように設計できる。抗体よりも高温でも安定であり、ウイルスや酵母などの非哺乳類の細胞を用いた合成や化学的合成が遥かに容易であることが知られている。
本発明において、アプタマーとは、特定の物質に対して高い特異性及び親和性を有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）またはＲＮＡを指す。アプタマーは、特定の物質に対して高い親和性と安定性を有するため、比較的単純な方法で合成でき、結合力を高めるために様々な修飾が可能であり、細胞やタンパク質、さらには小さい有機物質も標的物質となり得るため、その特異性および安定性が既に開発されている抗体に比べて非常に高いという特徴がある。また、アプタマーは、公知の指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化（ＳＥＬＥＸ：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）方法により製造可能である。例えば、β－アミロイド、タウ、α－シヌクレインに特異的に結合するアプタマーを、公知のＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）方法によって製造した後、それを前記第１の領域と連結することができ、これにより、本発明による融合分子を生成することができる。
本発明のアプタマーは、β－アミロイド、タウ、α－シヌクレインに特異的に結合できるものであれば特に限定されず、アプタマーに使用される塩基は、特別な言及がない限り、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕおよびこれらのデオキシ（ｄｅｏｘｙ）形態の塩基からなる群から選択されるものであってもよい。
また、前記アプタマーは、安定性を増進させるために、５’末端部位、中間部位、３’末端部位、または両末端部位にポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、逆位デオキシチミジン（ｉｄＴ：ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、ロック核酸（ＬＮＡ：Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、２’－メトキシヌクレオシド、２’－アミノヌクレオシド、２’Ｆ－ヌクレオシド、アミンリンカー、チオールリンカーおよびコレステロールからなる群から選択される１種以上が結合して修飾されたものであってもよい。ｉｄＴ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）は、一般的にヌクレアーゼに対する耐性が弱いアプタマーのヌクレアーゼによる分解を防ぐために使用される分子の１つであって、核酸ユニット（単位体）は、前のユニットの３’－ＯＨと次のユニットの５’－ＯＨと結合して鎖を形成するが、ｉｄＴは、前のユニットの３’－ＯＨと次のユニットの３’－ＯＨを結合して３’－ＯＨではない５’－ＯＨが露出するように人為的な変化を加えることにより、ヌクレアーゼの一種である３’エキソヌクレアーゼ（３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）による分解を抑制する効果を起こす分子である。
本発明の可溶性受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、標的物質、すなわち、内因性リガンド（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｌｉｇａｎｄ）と結合できる活性を有する領域（ｄｏｍａｉｎ）を含み、前記領域は、内因性膜受容体または細胞内の受容体から由来したものまたはその誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）であってもよい。このとき、本発明の融合分子の第２の領域に含まれる前記可溶性受容体は、好ましくは、前記内因性受容体における、標的物質に結合する以外の活性を有する領域を除去したものを用いることができる。
本発明において、前記第２の領域となりうるペプチドとは、標的物質に特異的に結合できるアミノ酸をモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ、単量体）とするポリペプチドのうち、前記抗体又はその活性断片、抗体様タンパク質及び可溶性受容体を除いた残りを意味する。
本発明による融合分子は、ＴＡＭ受容体との相互作用を通じて前記食細胞作用を誘導するため、前記食細胞作用は、ＴＡＭ受容体を発現する細胞において誘導され得る。食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、食作用、貪食作用、ファゴサイトーシス）は、一般に、細胞や０．５μｍ以上の粒子を飲み込むことであり、当該細胞または粒子を係留（ｔｅｔｈｅｒ）、飲み込み（ｅｎｇｕｌｆ）後に分解（ｄｅｇｒａｄｅ）させる過程を含む。このとき、食細胞作用は、内在化された（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）細胞や粒子を取り囲むファゴソーム（ｐｈａｇｏｓｏｍｅ）を形成し、ファゴソームとリソソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）との融合によるファゴリソソーム（ｐｈａｇｏｌｙｓｏｓｏｍｅ）内で分解する過程を含んでもよい。このとき、食細胞作用の中でアポトーシスや壊死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）機序で死んだり死んでいったりする細胞をエフェロサイトーシス（ｅｆｆｅｒｏｃｙｔｏｓｉｓ）とも呼ぶ。
前記ＴＡＭ受容体を発現する細胞は、１つ以上の専門食細胞（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ、プロフェッショナル食細胞）、１つ以上の非専門食細胞（ｎｏｎ－ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ、ノンプロフェッショナル食細胞）またはその組み合わせであり得る。ここで、専門食細胞とは、食作用により死滅した細胞及び蓄積されたデブリなどを除去することを主な機能とする細胞を指し、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、マクロファージ）、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）及び肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）が含まれる。大食細胞（マクロファージ）は、通常、感染の経路となり得る各組織に留まり、多くの場合、組織別に異なる名称で呼ばれており、その例として、脂肪組織の脂肪組織マクロファージ（ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、骨髄や血液の単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、肝臓のクッパー細胞（Ｋｕｆｆｅｒ ｃｅｌｌ）、リンパ節の洞組織球（ｓｉｎｕｓ ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ）、肺胞の肺胞マクロファージ（ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、結合組織の組織球（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ）またはその連結体である巨細胞（ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ）、中枢神経系の小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ、マイクログリア）、胎盤のホフバウアー細胞（Ｈｏｐｆｂａｕｅｒ ｃｅｌｌ）、腎臓の糸球体内メサンギウム細胞（Ｉｎｔｒａｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｍｅｓａｎｇｉａｌ ｃｅｌｌ）、骨の破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）、肉芽腫（ｇｒａｎｕｌｏｍａｓ）の類上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄ ｃｅｌｌ）、脾臓の赤脾髄（ｒｅｄ ｐｕｌｐ ｏｆ ｓｐｌｅｅｎ）の赤脾髄マクロファージ（ｒｅｄ ｐｕｌｐ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、腹腔（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃａｖｉｔｙ）の腹膜マクロファージ（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、パイエル板（Ｐｅｙｅｒ’ｓ ｐａｔｃｈ）のリソマック（ＬｙｓｏＭａｃ）などが挙げられる。一方、非専門食細胞は、当該食細胞が存在する組織に特異的な機能を主にするが、必要に応じて食作用を行うことができる細胞を意味し、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、間葉系細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ）などが該当され、一部の組織特異的な細胞、例えば、中枢神経系の星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）や希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）、網膜のミュラーグリア（Ｍｕｌｌｅｒ ｇｌｉａ）、肝臓の肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、筋肉の衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌ）、睾丸のセルトリ細胞（Ｔｏｓｅｒｌｉ ｃｅｌｌ）などを含み、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）、大顆粒リンパ球（ｌａｒｇｅ ｇｒａｎｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、好酸球（ｅｓｉｎｏｐｈｉｌ）、好塩基球（ｂａｓｏｉｌ）、Ｂ細胞（Ｂ Ｃｅｌｌ）などの一部のフリンパを含む。本発明による融合分子は、除去すべき標的物質が蓄積された組織に特異的な食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）内で食細胞作用を誘導することができる。例えば、脳内に蓄積された異常タンパク質を除去しようとする場合、前記食細胞作用は、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）、希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）またはこれらの組み合わせにおいて誘導され得る。これは、例えば、本発明による融合分子をこのような組織に局所的に投与したり、該当組織内の細胞が前記融合分子を発現及び分泌させるように操作したりして誘導され得る。
前記食細胞作用の誘導は、炎症反応を伴わない場合がある。これは、標的物質を除去しながらも炎症反応を誘導することなく、炎症反応に起因する組織の損傷を抑制できるという点で、当該標的物質の蓄積に起因する組織の機能低下を既存の技術に比べてより安全に治療することができる。
前記融合分子は、標識（ｔａｇ、タグ）を含んでもよい。このような標識を融合分子に付加する場合、これを前記融合分子の精製、発現、作用の有無または作用過程などの確認に使用することができる。
前記標識は、Ｈｉｓ－タグ、Ｔ７－タグ、Ｓ－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、Ｓｔｒｅｐ－タグ、チオレドキシン（Ｔｒｘ：ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）－タグ、ヒスパッチチオレドキシン（Ｈｉｓ－ｐａｔｃｈ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）－タグ、ｌａｃＺ（Ｌ－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）－タグ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）－タグ、ｔｒｐＥ－タグ、アビジン／ストレプトアビジン／ストリップ（ａｖｉｄｉｎ／ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ／Ｓｔｒｅｐ）－タグ、Ｔ７遺伝子（ｇｅｎｅ）１０－タグ、ストレプトコッカルタンパク質Ａ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）－タグ、ストレプトコッカルタンパク質Ｇ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）－タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タグ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ：ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ’ｓ：ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ：ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、ガラクトース結合タンパク質（ｇａｌａｃｔｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）－タグ、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ：ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）－タグ、ＨＳＶ－タグ、Ｂ－（ＶＰ７ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ：ブルータングウイルスのＶＰ７タンパク質領域）－タグ、ポリシステイン（ｐｏｌｙｃｙｓｔｅｉｎｅ）－タグ、ポリフェニルアラニン（ｐｏｌｙｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）－タグ、（Ａｌａ－Ｔｒｐ－Ｔｒｐ－Ｐｒｏ）ｎ－タグ、ポリアスパラギン酸（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）－タグ、ｃ－ｍｙｃ－タグ、乳糖抑制子（ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）－タグなどがあり、これらに限定されない。前記標識は、目的タンパク質のＮ－末端、Ｃ－末端又は内部に位置していてもよい。
前記融合分子は、Ｎ末端にシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅまたはリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ））をさらに含んでいてもよい。シグナルペプチドは、分泌経路（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙ）に向かうタンパク質の合成初期にＮ末端に存在する短いペプチドであり、当該タンパク質の細胞内位置、（膜タンパク質の場合）膜トポロジー（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｏｐｏｌｏｇｙ）等を指定することが知られている。前記シグナルペプチドは、前記融合分子が発現されて細胞外に分泌される過程で切断されてもよい。
前記融合分子に含まれる前述の第１の領域、第２の領域、標識、シグナルペプチド、または最小限の機能性を有する領域（例えば、ＬＧ１及びＬＧ２領域、またはｓｃＦｖの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域）は、互いに直接連結されてもよく、短いオリゴペプチドまたはポリペプチドを含むリンカーによって連結されてもよい。一般に、リンカーは２～５００個のアミノ酸残基を含み得る。前記リンカーは、前述した各領域が意図した活性を有するように連結して前記融合分子を構成できるようにするリンカーであれば、特にその長さや種類に制限はない。一般的に使用されているオリゴペプチドリンカーの例としては、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、すなわち一つ以上のＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒユニットが繰り返されている形態のリンカーが挙げられる。その他に、（ＧＳＳＧＧＳ）ｎ、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、ＣＲＲＲＲＲＲＥＡＥＡＣ、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ、ＧＧＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧ、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＡＫＡ、ＰＡＰＡＰ、（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ、ＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶ、ＰＬＧＬＷＡ、ＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥ、ＡＧＮＲＶＲＲＳＶＧ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＦＬＧ、またはＧＳＳＧＧＳＧＳＳＧＧＳＧＧＧＤＥＡＤＧＳＲＧＳＱＫＡＧＶＤＥなどもリンカーとして使用できるが、これらに限定されない。
本発明の一様態として、前記融合分子をコードする核酸分子及びこれを含む発現ベクターを提供する。
前述のように、前記融合分子をコードする核酸分子配列は、これと同等な活性を有するタンパク質をコードする限り、１つ以上の核酸塩基の置換、欠失、挿入、またはこれらの組み合わせによって変異され得る。
前記融合分子をコードする核酸分子配列は、天然から分離されるか、人為的に合成または遺伝的組換え方法により作成され得る、前記融合分子をコードする核酸分子配列は、これを発現することができる発現ベクターに作動的に連結して提供される。
前記「発現ベクター」とは、目的遺伝子をコードする核酸配列を適切な宿主細胞に導入して目的タンパク質または目的ＲＮＡを発現できるベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結されている必須の調節要素を含む遺伝子作製物をいう。このような発現ベクターには、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターおよびウイルスベクターなどの全てのベクターが含まれる。
適切な発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどの発現調節エレメントを有する。開始コドン及び終結コドンは、一般的にタンパク質をコードする核酸配列の一部とみなされ、タンパク質コード配列は、ベクターで作動可能であるようにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）になるように作成される。プロモーターは構成的または誘導性であり得る。さらに、通常の発現ベクターは選択マーカーを含む。発現ベクターとの作動的連結は、当該技術分野で周知の遺伝子組換え技術を使用して達成でき、かつ部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術分野で公知の酵素などを使用して行うことができる。
前記発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞で前記融合分子を発現させた後に精製及び分離するために、または当該細胞が前記融合分子を発現および分泌できるように、生体内（インビボ）注入時に細胞に導入されて構成されてもよい。生体内の細胞に導入する必要がある場合、前記ベクターは、非組み込み（ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）ベクター、すなわち、宿主細胞のゲノムに組み込まれていないベクターであることが好ましい。
本発明の一態様として、前記融合分子を発現する細胞を提供する。
前記細胞は、前記核酸分子またはこれを含む発現ベクターを含むように形質転換されたものであってもよく、前記「形質転換」には、有機体、細胞、組織または器官に核酸分子を導入する如何なる方法も含まれ、当分野において公知の通り、これは、宿主細胞によって適切な標準技術を選択して行われてもよい。このような方法には、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ、エレクトロポレーション法）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、シリコンカーバイド繊維を用いた攪拌、アグロバクテリウム媒介形質転換、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介形質転換方法などが含まれるが、これらに限定されない。
前記宿主細胞としては、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）またはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））などの原核宿主細胞があるが、これらに限定されない。また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ネウロスポラ・クラ ッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、サッカロマイセス（Ｓｃｈａｃｃｈｏｍｙｃａｓａｒｏｍｙｃｅｓ）などを含む酵母、その他の下等真核細胞または昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物などを含む高等真核生物に由来する細胞を宿主細胞として使用することができる。
前記細胞で融合分子を発現させた後、分離および精製には、通常の生化学分離技術、例えば、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（親和性クロマトグラフィー）などの各種クロマトグラフィーなどを用いることができ、通常、純度の高いタンパク質を分離するためにこれらを組み合わせて用いる（非特許文献６－７：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｒｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｓｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））．
本発明の一様態として、前記融合分子または前記発現ベクターを含む、前記標的物質の生体組織への蓄積に起因する疾病を予防または治療するための薬学的組成物（医薬組成物）を提供する。ここで、前記組成物は、前記疾病の原因物質、すなわち、標的物質が蓄積される箇所に局部的に投与されるものでもある。
また、本発明の一様態として、前記融合分子の薬学的有効量を個体に投与するステップを含む、タンパク質症を予防または治療する方法を提供する。
さらに、本発明の一態様として、タンパク質症の予防または治療のための薬剤を製造するための前記融合分子の用途を提供する。
前記薬学的組成物中の有効成分としての前記融合分子は、「薬学的有効量」で含まれる。前記用語「薬学的有効量」は、上記の融合分子の有効性または活性を達成するのに十分な量を意味する。
前記薬学的組成物は、経口的または非経口的に投与することができ、好ましくは非経口的に、より好ましくは除去すべき標的物質が蓄積された組織に局所的に投与することができる。
本明細書で使用される用語「非経口的投与」は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技術を含む。
前記薬学的組成物を注射剤として製剤化する場合、当該技術分野で公知の通常の注射剤の製造方法によって製造することができる。前記注射剤は、患者に投与する場合にそのままで使用できるように滅菌媒質に分散された形態であってもよいし、投与時に注射用の蒸留水を加えて適切な濃度で分散させた後に投与する形態であってもよい。
前記薬学的組成物を経口投与剤として製剤化する場合、担体として希釈剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、甘味剤、安定剤および防腐剤の中から選択される１種以上を使用することができ、添加剤としては香料、ビタミン類および抗酸化剤の中から選択される１種以上を使用することができる。
前記薬学的組成物の製剤化に必要な技術及び薬剤学的に適切な担体、添加剤等に関しては当該製剤学分野で通常の知識を有する者に広く知られており、これと関連して文献、例えば、非特許文献８－１０：ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，４ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（２００３）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ ｔｈ ｅｄ．，１９９５）等を参照してもよい。
前記薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、病状、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性などの要因によって様々に処方され得る。本発明の薬学的組成物の投与量は、成人基準で０．０００１～１０００μｇ／ｋｇ（体重）である。
本発明は、食細胞作用誘導活性を有する融合分子に関するもので、従来技術が有する炎症反応の活性化に起因する組織損傷の問題を解決することができ、これによって異常蓄積物質、例えば、β－アミロイド、タウ、α－シヌクレイン、ハンチンチンまたはプリオンなどを効果的に除去して、このような蓄積によって引き起こされる疾病、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病またはプリオン病の予防または治療の用途への活用が可能である。このような融合分子は、精製された融合分子の形で、または細胞内導入時に前記融合分子を発現及び分泌できる遺伝子治療剤ベクターの形で患者に投与され得る。
但し、本発明の効果は、上記の効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明又は特許請求の範囲に記載された発明の構成から推論可能な全ての効果が含まれる。
Ｇａｓ６に基づくβ－アミロイド及びＦＩＴＣキメラ貪食誘導体の模式図である。 製造例１により製造されたＦＬＡＧ Ｔａｇを含むキメラ貪食誘導体を作製し、これをウェスタンブロットにより確認した結果である。 製造例１により製造されたキメラ貪食誘導体のＴＡＭ受容体に対する作用を示す模式図である。 αＡβ－Ｇａｓ６の選択的なβ－アミロイド摂取能力を確認した結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてβ－アミロイドｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを用いてＨＭＣ３細胞株におけるαＡβ－Ｇａｓ６のβ－アミロイド摂取能力を示した代表図である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてβ－アミロイドｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを用いてＨＭＣ３細胞株におけるαＡβ－Ｇａｓ６のβ－アミロイド摂取能力を確認した結果である。 αＡβ－Ｇａｓ６のβ－アミロイド摂取能力がＴＡＭ受容体の中でもＡｘｌに依存することを確認した結果である。 αＡβ－Ｇａｓ６のβ－アミロイド摂取能力がＴＡＭ受容体の中でもＡｘｌに依存することを確認した結果である。 αＡβ－Ｇａｓ６のβ－アミロイド摂取能力がＴＡＭ受容体の中でもＡｘｌに依存することを確認した結果である。 ＴＨＰ－Ａｘｌ細胞を用いてαＡβ－Ｇａｓ６とアデュカヌマブによる炎症反応シグナル伝達の活性化を比較分析した結果である。 ＴＨＰ－Ａｘｌ細胞を用いてαＡβ－Ｇａｓ６とアデュカヌマブによる前炎症性サイトカイン分泌レベルを比較分析した結果である。 αＡβ－Ｇａｓ６の抗炎症活性を確認した結果である。 αＡβ－Ｇａｓ６によって大幅に増加した小膠細胞のβ－アミロイド除去能力を確認した結果である。 αＡβ－Ｇａｓ６によって大幅に増加した星状膠細胞のβ－アミロイド除去能力を確認した結果である。 αＡβ－Ｇａｓ６とアデュカヌマブにより変化する星状膠細胞の前炎症性サイトカインの転写レベルを確認した結果である。 αＡβ－Ｇａｓ６とアデュカヌマブにより変化するＢＶ２の前炎症性サイトカインの転写レベルを確認した結果である。 ５ＸＦＡＤアルツハイマー病モデルマウスにおけるαＡβ－Ｇａｓ６タンパク質投与によるαＡβ－Ｇａｓ６のβ－アミロイドプラーク除去能力を確認した結果である。 ５ＸＦＡＤアルツハイマー病モデルマウスにおけるαＡβ－Ｇａｓ６ウイルス投与によるαＡβ－Ｇａｓ６のβ－アミロイドプラーク除去能力を確認した結果である。 αＡβ－Ｇａｓ６タンパク質の投与時に、５ＸＦＡＤアルツハイマー病モデルマウスから小膠細胞により除去されて、リソソームに含まれるβ－アミロイドが増加したことを確認した結果である。
αＡβ－Ｇａｓ６タンパク質の投与時、５ＸＦＡＤアルツハイマー病モデルマウスから星状膠細胞により除去されて、リソソームに含まれるβ－アミロイドが増加したことを確認した結果である。 αＡβ－Ｇａｓ６ウイルスの投与時、５ＸＦＡＤアルツハイマー病モデルマウスから小膠細胞により除去されて、リソソームに含まれるβ－アミロイドが増加したことを確認した結果である。 αＡβ－Ｇａｓ６ウイルス投与時、５ＸＦＡＤアルツハイマー病モデルマウスから星状膠細胞により除去されて、リソソームに含まれるβ－アミロイドが増加したことを確認した結果である。 ５ＸＦＡＤアルツハイマー病モデルマウスにおいてアデュカヌマブの副作用により異常に増加した小膠細胞によるシナプス消滅現象が、αＡβ－Ｇａｓ６ウイルス投与時には大きく回復することを確認した結果である。 ５ＸＦＡＤアルツハイマー病モデルマウスにおいてアデュカヌマブの副作用により異常に増加した小膠細胞によるシナプス消滅現象が、αＡβ－Ｇａｓ６ウイルス投与時には大きく回復することを確認した結果である。 αＡβ－Ｇａｓ６ウイルスの投与時、５ＸＦＡＤアルツハイマー病モデルマウスにおける認知及び記憶能力を確認するための実験プロトコルである。 αＡβ－Ｇａｓ６ウイルスの投与時、５ＸＦＡＤアルツハイマー病モデルマウスにおけるマウスの認知及び記憶能力が回復して、アデュカヌマブのそれよりも優れていることを確認した結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてタウｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを用いてＨＭＣ３細胞株におけるαＴａｕ－Ｇａｓ６のタウ摂取能力を確認した結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてα－シヌクレインｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを用いてＨＭＣ３細胞株におけるααＳｙｎ－Ｇａｓ６のα－シヌクレイン摂取能力を確認した結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてβ－アミロイドｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを用いて、一次培養された星状膠細胞におけるαＡβ－ＰｒｏＳ１のβ－アミロイド摂取能力を確認した結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてβ－アミロイドｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを用いてＨＭＣ３細胞株におけるαＡβ（Ｆａｂ）－Ｇａｓ６のβ－アミロイド摂取能力をそれぞれ確認した結果である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてβ－アミロイドｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを用いてＨＭＣ３細胞株におけるαＡβ（Ｍａｂ）－Ｇａｓ６のβ－アミロイド摂取能力をそれぞれ確認した結果である。
以下、より具体的に説明するために、実施形態と実験例を挙げて詳細に説明する。しかし、下記の実施形態と実験例は例示的なものであり、発明の範囲がこれに限定されるものではない。
製造例１．β－アミロイド除去活性を有するＧａｓ６に基づく融合分子の製造（Ｉ）：ｓｃＦｖ形態のβ－アミロイド結合領域
Ｇａｓ６タンパク質に基づくβ－アミロイド（Ａβ）特異的キメラ貪食誘導体を作製するために、まず、アポトーシス細胞（Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）のホスホチジルセリン（ＰＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）を認識する部位であるＧｌａドメインを除去し、その位置にβ－アミロイド特異抗体であるアデュカヌマブ（ａｄｕｃａｎｕｍａｂ）の単一鎖Ｆｖ断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、一本鎖可変断片；ｓｃＦｖ）を導入した［αＡβ－Ｇａｓ６（Ｅ）］。
また、タンパク質生産の効率性のために、Ｇａｓ６タンパク質の内部残基（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｓｉｄｕｅ）に存在するＥＧＦリピートドメイン（ＥＧＦ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎ）も共に除去し、アデュカヌマブのｓｃＦｖを導入したαＡβ－Ｇａｓ６も作製した（図１）。
さらに、アデュカヌマブのｓｃＦｖのβ－アミロイド特異的結合を確認するための対照群として、アデュカヌマブのｓｃＦｖの代わりにＦＩＴＣを選択的に認識するＥ２ ｓｃＦｖを導入したαＦＩＴＣ－Ｇａｓ６（Ｅ）、αＦＩＴＣ－Ｇａｓ６を共に作製した。
下記表２は、前記融合分子の製造に関連したアミノ酸配列であり、下記表３は、前記融合分子の製造に関連したヌクレオチド配列である（下線の付いた配列は、Ｆｌａｇ ｔａｇ）。
Figure 2024505935000006
Figure 2024505935000007
Figure 2024505935000008
Figure 2024505935000009
Figure 2024505935000010
Figure 2024505935000011
Figure 2024505935000012
Figure 2024505935000013
Figure 2024505935000014
Figure 2024505935000015
Figure 2024505935000016
Figure 2024505935000017
Figure 2024505935000018
製造例２．タウを標的とするＧａｓ６に基づく融合分子
Ｇａｓ６タンパク質に基づくタウ特異的キメラ貪食誘導体を作製するために、まず、Ｇｌａドメイン及びＥＧＦリピートドメインを除去し、その位置にタウ特異抗体であるセモリネマブ（ｓｅｍｏｒｉｎｅｍａｂ）の単一鎖Ｆｖ断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）を導入した（αＴａｕ－Ｇａｓ６）。前記キメラ貪食誘導体のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、表４に示す通りである。
Figure 2024505935000019
Figure 2024505935000020
Figure 2024505935000021
製造例３．α－シヌクレインを標的とするＧａｓ６に基づく融合分子
Ｇａｓ６タンパク質に基づくα－シヌクレイン特異的キメラ貪食誘導体を作製するために、まず、Ｇｌａドメイン及びＥＧＦリピートドメインを除去し、その位置にα－シヌクレイン特異抗体であるシンパネマブ（ｃｉｎｐａｎｅｍａｂ）の単一鎖Ｆｖ断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）を導入した（ααＳｙｎ－Ｇａｓ６）。前記キメラ貪食誘導体のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、表５に示す通りである。
Figure 2024505935000022
Figure 2024505935000023
Figure 2024505935000024
製造例４．β－アミロイドを標的とするＰｒｏＳ１に基づく融合分子
ＰｒｏＳ１タンパク質に基づくβ－アミロイド（Ａβ）特異的キメラ貪食誘導体を作製するために、まず、Ｇｌａドメイン及びＥＧＦリピートドメインを除去し、その位置にβ－アミロイド特異抗体であるアデュカヌマブ（ａｄｕｃａｎｕｍａｂ）の単一鎖Ｆｖ断片（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）を導入した（αＡβ－ＰｒｏＳ１）。前記キメラ貪食誘導体のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、表６に示す通りである。
Figure 2024505935000025
Figure 2024505935000026
製造例５．β－アミロイドを標的とするＧａｓ６に基づく融合分子（ＩＩ）：ＦａｂおよびＭａｂ形態のβ－アミロイド結合領域
Ｇａｓ６タンパク質に基づくβ－アミロイド（Ａβ）特異的キメラ貪食誘導体を作製するために、まず、アポトーシス細胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）のホスホチジルセリン（ＰＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）を認識する部位であるＧｌａドメインを除去し、その位置にβ－アミロイド特異抗体であるアデュカヌマブ（ａｄｕｃａｎｕｍａｂ）の抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ；Ｆａｂ）またはモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｍａｂ）を導入した（αＡβ［Ｆａｂ］－Ｇａｓ６、αＡβ［Ｍａｂ］－Ｇａｓ６）。前記２つのキメラ貪食誘導体のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、表７及び表８に示す通りである。
Figure 2024505935000027
Figure 2024505935000028
Figure 2024505935000029
Figure 2024505935000030
Figure 2024505935000031
実験例１．β－アミロイドを標的とするＧａｓ６に基づく融合分子（Ｉ）：ｓｃＦｖ形態のβ－アミロイド結合領域
１－１．形質転換細胞の融合分子の発現確認
ＨＥＫ２９３細胞へのプラスミドの形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、トランスフェトクション）後、製造例１による、Ｆｌａｇ ｔａｇを含む融合分子の発現を、Ｆｌａｇ ｔａｇを用いたウェスタンブロットで確認し、その結果を図２に示した。
１－２．製造された融合分子のβ－アミロイド特異的結合能の確認
αＡβ－Ｇａｓ６（Ｅ）、αＡβ－Ｇａｓ６、αＦＩＴＣ－Ｇａｓ６（Ｅ）、αＦＩＴＣ－Ｇａｓ６がβ－アミロイドとＦＩＴＣをそれぞれ選択的に認識できるかどうかを確認するために、それぞれのプラスミドが形質導入されたＨＥＫ２９３細胞から分泌された細胞培養液を集めて、β－アミロイドオリゴマーとＦＩＴＣが付着したビーズ（ｂｅａｄ）を用いて実験した。その結果、図４に示すように、αＡβ－Ｇａｓ６（Ｅ）、αＡβ－Ｇａｓ６はβ－アミロイドオリゴマービーズのみを認識し、αＦＩＴＣ－Ｇａｓ６（Ｅ）、αＦＩＴＣ－Ｇａｓ６はＦＩＴＣビーズのみを認識し、食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を誘導することを確認した。
αＡβ－Ｇａｓ６（Ｅ）とαＡβ－Ｇａｓ６は類似の活性を示すことが確認されたが、Ｇａｓ６のＥＧＦドメインをさらに除去したαＡβ－Ｇａｓ６が、タンパク質精製過程で凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）することなく高収率で得られることを発見し、今後の実験ではαＡβ－Ｇａｓ６を使用することが決定された。
１－３．製造された融合分子の作用機序の確認
（１）細胞株を用いた確認
β－アミロイドオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）をｐＨ指示薬と結合（コンジュゲーション）させて、これが食細胞作用によって摂取（ｕｐｔａｋｅ）されるときに細胞中のリソソーム内で赤色蛍光を発することができるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａβ ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを開発した。
ＴＡＭ受容体を発現するヒトミクログリア細胞株であるＨＭＣ３細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａβ ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを行った結果、β－アミロイドオリゴマーがαＡβ－Ｇａｓ６により選択的に除去されることが確認された（図５および図６）。
特に、ＴＡＭ受容体の機能を阻害する抗体を一緒に処理した実験により、Ｔｙｒｏ３、Ｍｅｒｔｋ、ＡｘｌのうちαＡβ－Ｇａｓ６が主にＡｘｌを介してβ－アミロイドオリゴマーを除去することが確認された（図７～図９）。実際、ＡｘｌをＨＭＣ３細胞から除去したときは、αＡβ－Ｇａｓ６の活性が大幅に減少した。また、ＴＡＭ受容体を発現しないヒト単核球細胞株であるＴＨＰ－１は、αＡβ－Ｇａｓ６によるβ－アミロイド除去能の増加を示さなかったが、Ａｘｌを過剰発現させたＴＨＰ－Ａｘｌ細胞は、αＡβ－Ｇａｓ６に依存的にβ－アミロイドフィブリル（ｆｉｂｒｉｌ）を摂取する能力が大きく増加していることが確認された。
次に、Ａｘｌを過剰発現させたＴＨＰ－Ａｘｌ細胞がＡｘｌ受容体とＦｃ受容体の両方を持っているため、αＡβ－Ｇａｓ６とアデュカヌマブを介してβ－アミロイドを摂取したときに誘導される炎症反応の程度を確認した。このために、まず、ＮＦ－ｋＢレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）をＴＨＰ－Ａｘｌ細胞で発現させて対照群、αＡβ－Ｇａｓ６とアデュカヌマブをβ－アミロイドオリゴマーと一緒にそれぞれ添加したとき、ＮＦ－ｋＢレポーターが、アデュカヌマブ添加時には大幅に増加したが、αＡβ－Ｇａｓ６の場合には対照群と同等またはそれ以下に発現されることが確認された（図１０）。また、最も代表的な３種類の炎症性サイトカインであるＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＴＮＦの分泌タンパク質量を測定したとき、アデュカヌマブを処理した場合、ＴＨＰ－Ａｘｌ細胞では、対照群に比べて前記炎症性サイトカインのタンパク質の量が顕著に増加した（図１１）。しかし重要なことに、αＡβ－Ｇａｓ６では、これらの炎症性サイトカインの量が対照群に比べて増加していないことが確認された。これは、我々の仮説が示唆しているように、αＡβ－Ｇａｓ６融合貪食誘導体タンパク質がＴＡＭ受容体を介して標的物質を食細胞作用するときに、自然な死滅細胞の認識及びエフェロサイトーシス（ｅｆｆｅｒｏｃｙｔｏｓｉｓ）と同様に炎症反応を誘導しないという核心的な結果である。
また、αＡβ－Ｇａｓ６は、アデュカヌマブとは異なり、炎症反応を抑制する機序として知られているＴｗｉｓｔ１／２遺伝子の発現を増加させることが確認された（図１２）。
（２）星状膠細胞と小膠細胞を用いた確認
脳内でＴＡＭ受容体を発現する細胞である星状膠細胞と小膠細胞がαＡβ－Ｇａｓ６を介してβ－アミロイドを除去できるかどうかを調べるために、マウスの脳から採取した星状膠細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）と小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）をそれぞれ精製した後、培養した。その後、精製されたαＡβ－Ｇａｓ６とアデュカヌマブをβ－アミロイドフィブリル（アミロイド線維）と一緒に入れて、β－アミロイドフィブリルの除去の程度をリアルタイムで観察した。
その結果、Ａｘｌ発現細胞株であるＨＭＣ３で得られた結果と同様に、αＡβ－Ｇａｓ６が濃度依存的にミクログリアのβ－アミロイド除去能力を増加させることが確認された（図１３）。重要なことに、アデュカヌマブを入れた場合、星状膠細胞のβ－アミロイド除去能力が全く変化しないが、αＡβ－Ｇａｓ６の場合、星状膠細胞のβ－アミロイド除去能力が濃度依存的に有意に増加することが確認された（図１４）。これは、星状膠細胞がＦｃ受容体を発現しないがＴＡＭ受容体を発現するという事実により、αＡβ－Ｇａｓ６が、以前はわずかであったβ－アミロイド除去能力を大幅に向上させることを意味する。
星状膠細胞と小膠細胞細胞株であるＢＶ２細胞にαＡβ－Ｇａｓ６とアデュカヌマブをβ－アミロイドフィブリルとそれぞれ一緒に入れてβ－アミロイド摂取を増加させた後、それぞれ細胞で炎症反応の程度を調べるためにＴＮＦ、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂのｍＲＮＡレベルを測定した（図１５及び図１６）。その結果、細胞株で得られた結果と同様に、アデュカヌマブを処理した場合、星状膠細胞とＢＶ２細胞では、対照群に比べて上記炎症性サイトカインの転写体とタンパク質の量が有意に増加しているが、αＡβ－Ｇａｓ６では、これらの炎症性サイトカインの量が対照群に比べて増加していないことが確認された。
上述のように、αＡβ－Ｇａｓ６融合貪食誘導体を用いることが、既存のモノクローナル抗体治療剤の重大な副作用である炎症反応を伴わずに患者の脳に蓄積されたβ－アミロイドプラークを星状膠細胞と小膠細胞を介して効果的に除去する画期的な方法になり得ることを発見し、これは、非常に有望な結果であり、現在の治療戦略を大幅に改善できる可能性があると考えられている。
１－４．Ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性評価
（１）融合分子又はその発現ベクターの導入による有効性（効能）
アルツハイマー病モデルマウスとして５ＸＦＡＤを使用した。５ＸＦＡＤは、５つの突然変異遺伝子を同時に発現させるため、β－アミロイドプラークの生成時期が早く、老化とは関係なく生後３～４ヶ月からβ－アミロイドプラークによる病的症状を研究することが可能である。
５ＸＦＡＤモデルを通じてｉｎ ｖｉｖｏでのαＡβ－Ｇａｓ６の効果を検証するために、αＡβ－Ｇａｓ６を２つの異なる方法で脳に送達した。アルツハイマー病モデルマウスにおいても、アデュカヌマブは血管注射や腹腔注射では脳にうまく到達しないことが、これまでの研究ですでに知られている。そこで、αＡβ－Ｇａｓ６の効果をアドゥカヌミの効果と正確に比較分析するために、１）マウスの脳に直接カニューレを挿入する（ｃａｎｎｕｌａｔｉｏｎ）手術を施し、精製したαＡβ－Ｇａｓ６とアドゥカヌミをそれぞれ１日に１回ずつ脳の脳室（ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）に３週間注入し、２）αＡβ－Ｇａｓ６とアドゥカヌミをそれぞれレンチウイルスの形で作製し、マウスの海馬に三次元的定位置注射（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を使用して発現させた。重要なことに、αＡβ－Ｇａｓ６精製タンパク質を添加したり、遺伝子をレンチウイルス形態で発現させたりするとき、いずれも有意にβ－アミロイドプラーク数が減少したことが見出された（図１７及び図１８）。
また、αＡβ－Ｇａｓ６がそれぞれタンパク質とウイルスの形で脳に送達されたときの小膠細胞および星状膠細胞のリソソーム内のβ－アミロイド量を定量した結果、この両細胞においてβ－アミロイド除去能力が大幅に上昇したことが明らかになった（図１９～図２２）。
これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究結果と同様に、ＴＡＭ受容体が小膠細胞と星状膠細胞の両方で発現しているため、αＡβ－Ｇａｓ６が導入されると小膠細胞と星状膠細胞がβ－アミロイドを認識して除去できるようになることを意味する。
（２）抗体治療剤と本発明の融合分子の効果の比較
アルツハイマー病では、小膠細胞によってシナプスが無差別に除去され、シナプスの数が減少することが知られている。驚くべきことに、この現象は、アデュカヌマブをアルツハイマー病モデルマウスに送達された場合に深化した、αＡβ－Ｇａｓ６をウイルス形態で発現させたときは、小膠細胞による異常なシナプス除去が正常レベルに回復した（図２３および図２４）。
のみならず、アルツハイマー病モデルマウスにおいて、新しいオブジェクトの形状や位置を記憶する認知および記憶力テストを図２５のプロトコルによってそれぞれ実行した場合、αＡβ－Ｇａｓ６の発現は、アデュカヌマブに比べて有意に優れた認知および記憶力回復効果を示した（図２６）。
さらに、本発明のキメラ貪食誘導体タンパク質が様々な標的物質の除去にも効果的であるかどうかを確認するために、β－アミロイドに加えて、タウ（Ｔａｕ）及びα－シヌクレイン（αＳｙｎ）に特異的な貪食誘導タンパク質を製造例２及び３と同様にして製造し、実験例２及び３に示すように各標的物質の除去効果を確認した。
実験例２．タウを標的とするＧａｓ６に基づく融合分子
タウオリゴマー（ｔａｕ ｏｌｉｇｏｍｅｒ）をｐＨ指示薬と結合（コンジュゲーション）させて、これが食細胞作用によって摂取（ｕｐｔａｋｅ）されたときに細胞中のリソソーム内で赤色蛍光を発することができるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔａｕ ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを開発した。ＴＡＭ受容体を発現するヒトミクログリア細胞株であるＨＭＣ３細胞に、製造例２による貪食誘導体タンパク質［αＴａｕ－Ｇａｓ６］を発現する培養液を処理してｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔａｕ ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを行い、その結果、図２７に示すように、タウオリゴマーがαＴａｕ－Ｇａｓ６により選択的に除去されることが確認された。
実験例３．α－シヌクレインを標的とするＧａｓ６に基づく融合分子
α－シヌクレインオリゴマー（αＳｙｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒ）をｐＨ指示薬と結合（コンジュゲーション）させて、これが食細胞作用によって摂取（ｕｐｔａｋｅ）されたときに細胞中のリソソーム内で赤色蛍光を発することができるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ αＳｙｎ ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを開発した。ＴＡＭ受容体を発現するヒトミクログリア細胞株であるＨＭＣ３細胞に、製造例３による貪食誘導体タンパク質［ααＳｙｎ－Ｇａｓ６］を発現する培養液を処理してｉｎ ｖｉｔｒｏ αＳｙｎ ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを行い、その結果、図２８に示すように、α－シヌクレインオリゴマーがααＳｙｎ－Ｇａｓ６により選択的に除去されることが確認された。
実験例４．β－アミロイドを標的とするＰｒｏＳ１に基づく融合分子
次に、キメラ貪食誘導タンパク質の作製において、Ｇａｓ６の代わりにＴＡＭ受容体の他のリガンド（ｌｉｇａｎｄ）を用いても効果があるかどうかを確認するために、ＰｒｏＳ１リガンドを用いて製造例４と同様にしてαＡβ－ＰｒｏＳ１を作製し、有効性を評価した。このために、ＴＡＭ受容体を発現する一次培養されたマウス星状膠細胞において、αＡβ－ＰｒｏＳ１を発現する培養液を処理して実験例１－３で使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａβ ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを行い、その結果、図２９に示すように、β－アミロイドオリゴマーがαＡβ－ＰｒｏＳ１により選択的に除去されることが確認された。
実験例５．β－アミロイドを標的とするＧａｓ６に基づく融合分子（ＩＩ）：ＦａｂおよびＭａｂ形態のβ－アミロイド結合領域
次に、キメラ貪食誘導タンパク質の作製において、標的タンパク質の結合ドメインがｓｃＦｖ以外の様々な標的結合部位を使用できるかどうかを確認するために、ｓｃＦｖの代わりに、抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｆａｂ）あるいは完全な形態のモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｍａｂ）を用いて、製造例５により貪食誘導タンパク質を製造して実験を行った（αＡβ［Ｆａｂ］－Ｇａｓ６およびαＡβ［Ｍａｂ］－Ｇａｓ６）。このために、ＴＡＭ受容体を発現するヒト小膠細胞株であるＨＭＣ３細胞に、αＡβ［Ｆａｂ］－Ｇａｓ６およびαＡβ［Ｍａｂ］－Ｇａｓ６を発現する培養液を処理して実験例１－３で使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａβ ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ ａｓｓａｙを行い、その結果、図３０および図３１に示すように、β－アミロイドオリゴマーがαＡβ［Ｆａｂ］－Ｇａｓ６およびαＡβ［Ｍａｂ］－Ｇａｓ６のそれぞれにより選択的に除去されることが確認された。
本発明の範囲は、後述する請求の範囲によって定められ、特許請求の範囲の意味、範囲、及びその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態は本発明の範囲に含まれる。
発明を実施するための形態は、上記の発明を実施するための最良の形態で共に説明された。
本発明の実施形態による食細胞作用誘導活性を有する融合分子は、従来技術が有する炎症反応の活性化による組織損傷の問題を解決することができ、これによって異常蓄積された物質、例えば、β－アミロイド、タウ、α－シヌクレイン、ハンチンチンまたはプリオンなどを効果的に除去することで、このような蓄積に起因する疾病、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病またはプリオン病の予防や治療用途に活用することができて、前記疾患の治療剤産業での利用が可能である。

Claims (17)

  1. ＴＡＭ受容体結合能を有する第１の領域と、標的物質に特異的に結合する第２の領域とを含む
    ことを特徴とする食細胞作用誘導活性を有する融合分子。
  2. 前記ＴＡＭ受容体は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ及びＭｅｒＴＫからなる群から選択される１つ以上である
    請求項１に記載の融合分子。
  3. 前記第１の領域は、Ｇａｓ６、ＰｒｏＳ１、Ｔｕｂｂｙ、Ｔｕｌｐ１、Ｇａｌ３またはこれらの活性断片を含む
    請求項１に記載の融合分子。
  4. 前記第１の領域は、Ｇａｓ６もしくはＰｒｏＳ１のラミニンＧ様ドメイン（ｌａｍｉｎｉｎ Ｇ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ）、またはその活性断片を含む
    請求項１に記載の融合分子。
  5. 前記第１の領域は、配列番号１及び２の配列を含むラミニンＧ様ドメイン、または配列番号３及び４の配列を含むラミニンＧ様ドメインである
    請求項１に記載の融合分子。
  6. 前記標的物質は、生体組織に蓄積されて疾病を起こす物質である
    請求項１に記載の融合分子。
  7. 前記標的物質は、アミロイドである
    請求項６に記載の融合分子。
  8. 前記疾病は、アミロイドーシスである
    請求項６に記載の融合分子。
  9. 前記標的物質は、β－アミロイド（β－ａｍｙｌｏｉｄ）、タウ（Ｔａｕ）、α－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）、ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）、プリオン（ｐｒｉｏｎ）及び表１の異常蓄積物質の中から選択される
    請求項１に記載の融合分子。
  10. 前記標的物質に特異的に結合する第２の領域は、前記標的物質に特異的に結合する抗体、その活性断片、抗体様タンパク質、ペプチド、アプタマー及び可溶性受容体の中から選択される
    請求項１に記載の融合分子。
  11. 前記食細胞作用は、ＴＡＭ受容体を発現する細胞で誘導される
    請求項１に記載の融合分子。
  12. 前記ＴＡＭ受容体を発現する細胞は、１つ以上の専門食細胞（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）、１つ以上の非専門食細胞（ｎｏｎ－ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）またはその組み合わせである
    請求項１１に記載の融合分子。
  13. 前記食細胞作用の誘導は、炎症反応を伴わない
    請求項１に記載の融合分子。
  14. 請求項１に記載の融合分子をコードする
    ことを特徴とする核酸分子。
  15. 請求項１に記載の核酸分子を含む
    ことを特徴とする発現ベクター。
  16. 請求項１に記載の融合分子を発現する
    ことを特徴とする細胞。
  17. 請求項１に記載の融合分子または請求項１５に記載の発現ベクターを含む、前記標的物質が生体組織に蓄積されて引き起こされる疾病の予防または治療のための薬学的組成物。

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