CN1335936A - 报道基因基团导入细菌脂多醣衍生的碳水化合物及随后使该衍生物偶合至固体表面上的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种将多酸(PS)固化到一固体表面的方法,该多醣具有酮－羧基(－C(=O)－COOH)或对应于它的缩酮或半缩酮基,如衍生自KDD(2－酮基－3－去氧－D－甘露糖辛酸),该方法包括下列步骤:(a)在多醣的羧基与报道基因分子(RM)之间形成一共价键,从而形成多醣一报道基因分子偶联物(PS－RM),该报道基因分子包括一识别/底物部位(如,生物素或蒽醌);及(b)经由在该报道基因分子的识别/底物部位与该固体表面的收受/药剂部分之间形成一特异性键(如,经由光学偶合或形成亲和性配对)而固定化该多醣一报道基因分子偶联物。本发明也提出一种可经如此得到的固体表面及使用该表面用语诊断目的用途,例如用以测定作为人类或动物致病原的革兰氏阴性菌的细菌感染,例如,肠细菌、呼吸道细菌、泌尿生殖器细菌、及神经病原性细菌,例如沙门氏菌种、放线杆菌。

Description

报道基因基团导入细菌脂多醣衍生的碳水化合物及随后使该衍生物偶合至固体表 面上的方法

发明领域

本发明涉及一种将特种多醣固定到固体表面的方法。该方法用于构成用以检检对应于多醣抗原的抗体的可靠性检定法非常有价值。本发明也涉及一种改性固体表面及此种表面在各种诊断性检定法中的用途。再者，本发明涉及新的KDO衍生物，该衍生物在构成改性固体表面中为有用的中间体。

发明背景

细菌脂多醣(LPSs)为革兰氏阴性菌的特性性外膜组成物。LPSs广泛地用在经特殊设计用来特异性检测源自人类和动物的细菌感染所致在血清、血浆、肉汁、唾液或其它体液中的抗体的诊断检定法中作为抗原。LPSs具有高度免疫原性，且包括针对某一细菌株的诸表面抗原决定部位之一。事实上，血清型的界定常根据LPS及/或荚膜多醣(CPS)的抗原性。LPS分子的抗原特异性存在于LPS的多醣部份，O-抗原，而LPS的毒性是由LPS的脂质部份中所含残基引起的，其经称为脂质A。LPSs为具有高度两亲性(amphiphilic)的化合物，因为有一亲水性O-多醣基和一疏水性脂质基同时存在于LPS分子内之故。大多数经鉴定过的LPSs都具有相同的主要构造，其特别保存在LPSs的脂质A和内核部份之内。内核是包括在O-抗原与脂质A之间的键的多醣部份。此键不变地包括在最内部KDO-残基的半缩酮官能与脂质A所含GlcNAC-残基的羟基之间的酮糖苷键(Ketosidic bond)。特定细菌血清型所含O-抗原会随着重复单位的数目而变异，且可能含有乙酰基、磷酸基、糖基或其它基的非一化学计量性取代。通常，设有O-抗原的LPS-分子，亦即除了脂质A之外，只载有部份内核醣者，系称为“粗”(rough)LPS，而载有O-抗原的LPS-分子称为”平滑”者(Smooth)(Raetz，C.R.H.大肠杆菌与沙门氏菌：细胞和分子生物学，第11卷，第二版，1035-1063页，美国微生物学会，华盛顿，1996年，Hitchcock等人，1986年，生物学杂志，166，699-705。Raetz，C.R.H.in：Escherichiacoli and Salmonella：Cellular and Molecular Biology(Neidhardt，F.C.E.A.，ed.)Vol.1，2nd Ed.，pp 1035-1063，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1996；Hitchcock et al.，1986，J.Bacteriol.166，699-705)。

ELISA，酶联免疫吸附检定，为一种测定抗体所用的熟知方法。于这种检定中，LPSs经由被动吸附而涂覆(或固定化)到一固体表面(如塑料表面)，于该处用做对特定抗体的探针(probe)。该方法包括将经LPS-涂覆的表面与要检定抗体存在的生物样品一起温浸，接着将LPS-抗体复合物与经标记(labelled)的二级抗体一起温浸。

以前，LPSs通常是在对分子没有任何改性之下固定到一固体表面上，这是因为分子的疏水性脂质A部份可作为相当有效的“锚”，将LPSs透过非共价键疏水性交互作用结合到该表面，而留下亲水性O-多醣指向外以供与结合成分，如抗体，交互作用所用之故。不过，可以见得，LPSs固化到疏水性表面上的效率决定于该表面的本质及在游离LPSs和所形成的LPS胶束(micelles)之间的平衡。在游离LPSs与所形成的LPS胶束之间的平衡决定于LPSs的两亲性本质，而且在来自不同细菌株的LPSs之间会有变异，也在不同的LPS血清型之间有变异。某些类型的LPSs经证明为非常难以在涂覆溶液中加入各种胶束分散剂(清洁剂)，经由非一共价键结而固化到固体表面上。

因此，最佳涂覆条件会在来自不同细菌株的LPS之间及相同细菌的血清型之间变异不定，造成要将二种或更多种不同的LPSs同时固化到相同的表面上时非常困难。这种现象经推测是因为具良好涂覆性的LPS类型会将较低涂覆性类型竞争掉之故。这种现象可用业经证明不能有效涂覆到塑料上的婴儿沙门氏菌(Salmonellainfantis)LPS来阐述。在测定鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)与婴儿沙门氏菌特异性抗体的检定法中，这种现象会导致使用经证明可涂覆得远较为佳且载有相同抗原性血清型(O-抗原)的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)LPS取代婴儿沙门氏菌LPS的作法(Nielsen，B.等人，1995微生物学，47，205-218。Nielsen，B.et al.，1995，Vet.Microbiol.，47，205-218)LPS形成胶束(或聚集物)的倾向更被认为会减低LPS涂层的稳定性，因为双分子型(或聚集型或簇团型(cluster))LPS与表面之间的交互作用被认为较弱于在单一LPS分子与表面之间的交互作用。换句话说，LPS以簇团形式涂覆的潜在倾向可能导至减低且不可预测的涂层稳定性，并且缩短涂层的长期稳定性。

欧洲专利公开号为EP 0 101 119披露经由将脂多醣与不溶性载体所含胺基或羧基缩合物将该脂多醣固化到该不溶性载体上。

JP-A-2-242448(日本专利摘要)描述将3-去氧-D-甘露糖醛酸的脂质A糖苷透过酰胺键而固定到不溶性载体的表面。

高度亲水性抗原，如细菌多醣(PS)常常非常难以吸附(固定化)到血清学检定法中最常用到的表面上，例如在ELISA和RIA(放射免疫检定法)中所用的塑料，凝集技术中所用的乳胶粒子，和DVDF(聚偏二氟乙烯)及浸黏(dip-stick)、印渍(blotting)或其它快速检定法中所用的硝酸纤维素和其它物质。因此之故，PS因而不能有效地涂覆且需要使用大量的多醣抗原或极端的pH，并且不能与多醣混合物使用(Elkins et al.，1990，J.Immunol.Meth.130，123-131)。相反地，虽然有上述诸项缺陷，LPSs仍几乎无反地用为涂覆抗原，因为脂质A可提供将表面充分涂覆抗原所需的疏水性之故。

PSs是从以前的LPSs分离出，其目的为制备PS与载体物质的偶联物(Conjugates)，最常见的是为疫苗目的所用的载体蛋白质(Aron等人，1993，临床微生物学杂志，31，975-978，Aron et al.，1993，J.Clin.Microbiol.31，975-978；Lambden and Heckels，1982免疫方法学杂志48，233-240，Lambden and Heckels，1982，J.Immunol.Meth.48，233-240；Gupta等人，1995，儿童免疫63，2805-2810，Gupta et al.，1995，Inf.Immun.63，2805-2810)。

如前证明的那样，鼠伤寒沙门氏菌脂多醣(LPS)所含多醣部份可用生物素衍化并固定化到经链霉抗生物素蛋白一涂覆的ELISA板上，于其上其可被抗PS的抗体所识别。经由使用生物素的酰肼衍生物，可以使PS在没有事先的氧化步骤之下直接与生物素-酰肼反应；该酰肼经证明可与PS所含环原性末端KDO的半缩酮反应。这种程序虽则可以导致在抗原性上完整的生物素化PS-衍生物，不过，也会促成不稳定的衍生物，因而必须在检定中导入抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白涂层([Wiuft，C.，Lind.P.，Heegaard，P.，1997，区域选择性偶联将碳水化合物还原成酰肼以进行细菌多糖的衍生反应并用于免疫分析，第二版，碳水化合物工程会议，La Rochelle，法国，第66页，]Wiuft，C.，Lind.P.，Heegaard，P.，1997，Regioselectivecoupling of reducing carbohydrates to hydrazides for derivatization of bacterialpolysaccharides and application to immunoassays，Proc.2nd，Carbohydrate EngineeringMeeting，La Rochelle，France，p.66)。

Meikle等人(Glycoconjugate.J.7，207-218，1990)在ELISA中使用PS，其中将PS直接偶合到一竞争设置中的测定酶上。该偶合经由将PS所含KDO单位的酮-羧酸基中的酮基予以还原性胺化而实施的。该PS/测定酶偶联物不用来涂覆而是在该检定的后面步骤中用在溶液内。

通常，PS对固体表面的结合需要将PS分子改性，不过要以使O-抗原部份保持不变更之方式完成。有许多这种改性的已对天然存在的多醣说明过。一个熟知的例子为不含疏水性部份(或基)的荚膜多醣(CPSs)偶合到蛋白质上([Laferriere等人，1997，疫苗15，179-186；Beuvery等人，1986，发育生物学标准63，117-128]Laferriere et al.，1997，Vaccine 15，179-186；Beuvery et al.，1986，Develop.Biol.Standard.63，117-128)。然后将所得荚膜多醣-蛋白质复合物透过载体蛋白质中的疏水性基吸附到表面上。细菌荚膜多醣也经由羟基与疏水性基，例如苯基或酪胺的非-特定取向性反应予以改性，以增强CPS分子的整体疏水性以及对固体表面的结合能力([(Kristensen and Bentzon，1992，APMIS 100，142-146)Kristensen and Bentzon，1992，APMIS 100，142-146)。

一项重大问题在于在将多醣衍化之后可能难以保留住抗原性，因为大多数的方法都不是导向于在多醣抗原的任何特定区进行衍化，因而可能破坏或改变多醣的抗原决定部位之故。

这些缺点可由本发明经限制碳水化合物的某些区域的衍化而得以克服。

附图简要说明图1：大肠杆菌(E.Coli)K12 LPS的示意分子结构。缩写：GlcN，D-葡糖胺；kdo，3-去氧-O-甘露-辛酮糖酸；Hep，L-甘油基-D-甘露庚糖；Glc，D-葡萄糖；Gol，D-半乳糖；GlcNAc，N-乙酰基-D-葡糖胺；Rha，L-鼠李糖；Galf，D-呋喃半乳糖；P，磷酸根；P-Etn，磷酸乙醇胺；P-P-Etn，乙醇胺焦磷酸盐；Ac，乙酸根。图2：显示出得自典型革兰氏阴性菌的LPS所含内核和脂质A部份。图3：得自鼠伤害沙门氏菌的LPS所具UV光谱图。图4：得自猪霍乱沙门氏菌的LPS所具UV光谱图。图5：左图：得自鼠伤害沙门氏菌的纯化LPS之银染色聚丙烯酰胺凝胶。第1道：低分子量标志物(BioRad)；2：空白；3：4微克LPS；4：8微克LPS；5：12微克LPS；6：16微克LPS；7：20微克LPS；8：24微克LPS；9：空白。右图：得自鼠伤害沙门氏菌的LPS的考马氏蓝染色聚丙烯酰胺凝胶：所用样品同上。图6：左图：得自猪霍乱沙门氏菌的纯化LPS所得银染色聚丙烯酰胺凝胶。第1道：空白；2：低分子量标志物(BioRad)；3：空白；4：6微克LPS；5：12微克LPS；6：18微克LPS；7：24微克LPS；8：30微克LPS；9：36微克LPS；10：空白。右图：得自猪霍乱沙门氏菌的LPS所得考马氏蓝染色聚丙烯酰胺凝胶。所用样品同上。图7：得自鼠伤害沙门氏菌的LPS和PS之间接ELISA。抗原从0.4微克/毫升起以2-倍滴定值排行予以涂覆。使用经稀释1/400的鼠伤害沙门氏菌阳性猪血清作为抗体(样品的出现顺序(于“1”开始最高OD值)：LPS E-01，LPS E-02，PS E-02，PS E-01)。图8：得自猪霍乱沙门氏菌的LPS和PS之间接ELISA。从0.6微克/毫升起以2-倍滴定值排行涂覆抗原。使用经稀释1/600的婴儿沙门氏菌阳性猪血清作为抗体(样品的出现顺序：(于“1”开始最高OD值)：LPS E-06，LPS E-08，PS E-08，PS E-06)。图9：得自猪霍乱沙门氏菌的纯化PS所得银染色聚丙烯酰胺凝胶。1-5：不同批的PS。施加1.5微克。图10：得自鼠伤寒沙门氏菌的AQ-PS之UV光谱图。图11：得自猪霍乱沙门氏菌的AQ-PS之UV光谱图。图12：得自猪霍乱沙门氏菌的AQ-PS所得银染色聚丙烯酰胺凝胶。1-2：两不同批的AQ-PS。施加1.5微克。图13：在经鼠伤寒沙门氏菌LPS-涂覆板上以2-倍滴定值的鼠伤寒沙门氏菌进行的竞争性ELISA，相对于用完整鼠伤寒沙门氏菌LPS的竞争。两种竞争性抗原都从5毫克/毫升开始滴定。诸板都用鼠伤寒沙门氏菌LPS以0.05微克/毫升涂覆。使用1/400的鼠伤寒沙门氏菌阳性猪血清作为抗体(上曲线：LPS；下曲线：PS)。

图14：在经猪霍乱沙门氏菌LPS-涂覆板上以2-倍滴定值的猪霍乱伤寒沙门氏

菌进行之竞争性ELISA，相对于用完整猪霍乱沙门氏菌LPS的竞争。两种竞

争性抗原都从5毫克/毫升开始滴定。诸板都用猪霍乱沙门氏菌LPS以0.5

微克/毫升涂覆。使用1/600的猪霍乱沙门氏菌阳性猪血清作为抗体。(最平

滑的曲线(且最高OD出现于1和2)：PS)。

图15：AQ-PS(鼠伤寒沙门氏菌)浓度对光偶合效率的影响。

图16：AQ-PS(猪霍乱沙门氏菌)浓度对光偶合效率的影响。

图17：无机盐和pH对于(鼠伤寒沙门氏菌)的光偶合效率的影响。

图18：无机盐和pH对于AQ-PS(猪霍乱沙门氏菌)的光偶合效率的影响。

图19：AQ-PS(鼠伤寒沙门氏菌)和AQ-PS(猪霍乱沙门氏菌)的照射时间对光偶合效率的影响。

图20：猪血清对经光偶合的AQ-PS(鼠伤寒沙门氏菌)的血清学检验(间接ELISA)。血清1到5：没有任何沙门氏菌历史(阴性)的血清；血清6至15：得自用鼠伤寒沙门氏菌感染(阳性)的实验感染猪的血清。

图21：对得自鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的经光偶合AQ-PS混合物所进行的ELISA。样品1-10：阴性对照血清。样品11-20：得自实验鼠伤寒沙门氏菌感染猪的阳性血清。

图22：经光偶合的AQ-PS混合物(鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌)的储存稳定性。血清：白：没有任何沙门氏菌经历(阴性)的血清；红、粉红、棕、绿：经用鼠伤寒沙门氏菌实验感染的猪所得血清(阳性)；黄、蓝：得自用婴儿沙门氏菌实验感染的猪的血清(阳性)。

图23：PS和生物素-PS偶联物(鼠伤寒沙门氏菌)在链霉抗生物素蛋白涂覆板上的间接ELISA(左栏：生物素-PS；右栏：PS)。

图24：APP5b PS-AQ偶联物，从500毫微克PS-AQ每洞起始的2-倍滴定。该板用APP5b阳性猪血清与阴性血清(SPF血清)在PBST中稀释1∶400后一起温浸。

发明概述

本发明提出将多醣固化到一固体表面上的新颖的方法。

因此，本发明提出一种将多醣(PS)固化到一固体表面的方法，该多醣具有一酮基-羧基(-C(＝O)-COOH)或其所对应的缩酮基或半缩酮基，该方法包括下列诸步骤：a)在该多醣的羧基与一报道基因分子(RM)之间形成一共价键，由是形成多醣一报

道基因分子偶联物(PS-RM)，该报道基因分子包括一识别/底物部位；及b)经由在该报道基因分子的识别/底物部位与该固体表面的收受/药剂部位之间

形成一特异性键，而将该多醣一报道基因分子偶联物(PS-RM)固定化。

本发明也提出一种可经如此得到的固体表面，以及该固体表面对于诊断目的的用途。

再者，本发明提出一种通式I化合物

(或，假如R²为氢，可以选用它的酮基类似物)其中R¹选自氢和一报道基因分子L-R，此处L为该报道基因分子的选用的连接体部份，而R为该报道基因分子的报道部份；R^N选自氢和C_1-4的烷基；F选自下列的单键、亚苯基、羰基(C(＝O))、羰基亚胺基(C(＝O)-NH-)、硫羰基(C(＝S))、和亚胺基(-NH-)；R²、R⁷、R⁸各为独立地选自氢和羟基保护基；R⁴选自下列的氢、单醣或双醣残基及羟基保护基；且R⁵选自下列的氢、“选择性官能基保护多醣残基”和羟基保护基，及其制备方法。

因此，本发明的一项特殊目的为提出一种将衍生自细菌多醣的LPS特定取向地偶合到固体表面的方法，该方法可通用于所有类型的此等LPS衍生细菌多醣，该方法对多醣的抗原性结构没有影响且最后，当固化多醣用于检定时，不会将其成分导入到非特异性背景中或导入不理想的交叉反应性。发明详述

如上所述，本发明，与其它一起，是有关一种将一多醣(PS)固定化到一固体表面上的方法。

于本发明文中，术语“多醣”一词意指一包括二或更多种经糖苷键连接的单醣的单位。优选的是该“多醣”包括至少5，例如5至1000个连接单醣单位，例如至少10，如10至1000个连接单醣单位，特别者至少25，如25至500个，连接单醣单位。该多醣可经连接形成一线型或分支型多醣。

个别单醣典型地是本领域技术人员公知的天然存在的单醣，它是天然来源的多醣中的成分。这些单醣的例子为核糖、去氧核糖、阿拉伯糖、木糖、芥菜糖、岩藻糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖胺、胞壁酸、半乳糖胺、葡萄糖酸、艾柱糖醛酸、甘露糖醛酸、古洛糖醛酸、半乳糖酸、甘油、甘露庚糖、3-去氧-甘露-辛酮糖酸、神经胺糖酸(5-胺基-3，5-二去氧-D-甘油基-D-羊乳-壬酮糖酸)、阿比可糖、N-乙酰基-羊乳糖胺、和N-乙酰基-呋喃半乳糖。特别有用的例子为D-核糖、D-去氧核糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-芹菜糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖胺、胞壁酸、D-半乳糖胺、D-葡萄糖酸、L-艾杜糖醛酸、D-甘露糖醛酸、L-古洛糖醛酸、D-半乳糖酸、L-甘油基-D-甘露-庚糖、3-去氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)、神经胺糖酸(5-胺基-3，5-二去氧-D-甘油基-D-半乳糖-壬酮糖酸)、阿比可糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺、及N-乙酰基-D-呋喃半乳糖。最有用的是D-葡萄糖胺、KDO、L-甘油基-D-甘露-庚糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、L-鼠李糖、和D-呋喃半乳糖。

该多醣基本上可为未经取代的，不过由于多醣的典型生物来源，其典型地以非-化学计量方式含有下列取代基：乙酰基、磷酸根、焦磷酸根、磷酸乙醇胺、乙醇胺焦磷酸根、O-甲基、硫酸根，或其它基团。

天然存在的细菌脂多醣通常以含有不同数目的重复性单位，因而不同分子量的分子混合物形式存在，如已重复地显示于某些细菌株的脂多醣，包括0至40重复单位的分子，涵盖低于10至高于100KD的分子量([Goldman and Leive，1980，欧洲生物化学杂志，107，145-153]Goldman and Leive，1980，Eur.J.Biochem.107，145-153)。(一重复性单位为单醣或更常者在O-多醣中重复的寡醣(参看，例如图1))。此等有趣的寡醣重复性单位的例子包括鼠伤寒沙门氏菌的四聚醣重复单位及大肠杆菌K12的乙酰基化五聚醣(Raetz 1996)。普遍的是，LPS衍生多醣的分子量可在2至50KD的范围内，对应于0至40个重复单位，常具有双型分布，分别为具有0和1个重复单位的分子的过度代表，及具有25至35重复单位的分子之过度代表(Raetz 1996)。通常有利的是保持住天然LPS的分子量分布以反映出完整O-抗原的正确抗原性。

因此，必须知道，上述单醣单位数目和分子量的范围关系到天然存在的LPSs中发现的平均单醣数目。

要被固化的多醣包括一酮基一羧基(-C(＝O)-COOH)或对应于彼的缩酮基或半缩酮基，其为建立对固体表面的连接的关键固着点。在许多情况下(优选的是)，此酮基-羧基是由多醣中所含KDO(2-酮基-3-去氧-D-甘露-辛糖醇)单醣单位所提供。一或更多个KDOs是以一或更多个(典型者3个；参看图1)键联单醣的形式存在于所有已知的革兰氏阴性脂多醣的内核寡多醣内。这些KDOs中之一者包括对脂质A所含己糖胺二体物的糖苷键，它可以是相同的KDO单醣或另一KDO单醣，则包括对该脂多醣所含多醣部份其余部份的还原性端的糖苷键。

图1阐示出得自大肠杆菌K-12的典型革兰氏阴性细菌脂多醣(摘自Raetz1996)。

本发明特别可应用的多醣基本上等同于革兰氏阴性细菌脂多醣(LPS)所含碳水化合物部份的多醣。“革兰氏阴性细菌脂多醣所含碳水化合物部份”意指除了包括脂质A部份的用酯及/或酰胺键中用脂肪酸衍化过的单醣之外，该脂多醣的整个多醣链，或“树”。另外，该碳水化合物部份不一定包括整个多醣链的所有KDO单位(参看下文)。

“实质等同于”优选的是也指该多醣具有与天然脂多醣所含碳水化合物部份实质相同的生物学结合活性。此意谓着多醣所含O-抗原(血清型特异性部份)的外核部份优选的是实质地等同于天然细菌脂多醣，而在该碳水化合物部份从脂质A部份经化学方式切除掉之时，某些内核单醣(如，一或二个，但非全部的KDO单位)可能经化学方式切除掉(参看图2，脂多醣(LPS)变成多醣(PS)的可能作用点)。重要的是要知道多醣的特点是其血清型特异性要实质地保存住，亦即，天然脂多醣(LPS)的O-抗原部份实质地不受该切除所影响。

脂多醣多醣的内核部份定义为充分保存住的革兰氏阴性细菌脂多醣所含KDO和含庚糖还原性寡醣，该寡醣含有在KDO与脂质A之间的键联。

脂质A为细菌脂多醣的充分保存的部份，其包括经键结到经取代己糖胺二体物的脂肪酸，它转而为键结到未经改性脂多醣中的内核所含还原性KDO。

优选的是，该多醣经由将革兰氏阴性细菌脂多醣所含内核与脂质A之间的骨架键选择性地水解而得到(或至少可得到)。优选的是，在该选择性水解中，多醣上的取代基例如乙酰基、磷酸基、焦磷酸基、磷酸乙醇胺、乙醇胺焦磷酸、O-甲基、硫酸根，或其它基团等不会被切断。

“选择性水解”意指化学或酶方式促成的水解，其优先切断所选糖苷键，亦即，于本文中在脂质A部份与KDO部份之间的键。

虽然本发明可应用(且有利地应用)于衍生自革兰氏阴性细菌脂多醣(LPS)的多醣(PS，亦即没有脂质部份的多醣)，不过必须知道它可以实现，而且可能根据本发明的方法使用完整的革兰氏阴性细菌脂多醣(LPS)，从而得到良好的结果。此举之所以被认为可行是因为下述事实所致，亦即，该脂多醣包括有所需的酮基-羧基之故。此方面构成本发明的另一具体实例。因此，本发明也提出一种方法，其中该多醣还包括革兰氏阴性细菌脂多酯的脂质部份，亦即，该”多醣”由是构成一细菌脂多醣。

衍生该多醣(及因而也为该脂多醣)的细菌优选的是为人类或动物致病原的革兰氏阴性细菌，例如肠细菌、呼吸道细菌、泌尿生殖器细菌，及神经病原性细菌。

可产生在本发明内特别有用的多醣的细菌例子选自包括下列的人类革兰氏阴性菌包括嗜血菌属(Haemophilus sp.)、大肠杆菌种(Echerichia Coli ssp.)、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)、博德特氏菌属(Bordetella sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、衣原体(Chlamydia sp.)、奈瑟氏球菌属(Neisseria sp.)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、志贺氏菌属(Shigella sp.)、变形菌属(Proteus sp.)、布鲁氏菌属(Brcella sp.)、链杆菌属(Streptobacillus sp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia sp.)、Legionellapneumophila，及黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，特别者为流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、肠沙门氏菌种(Salmonella lnterica ssp.)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、铜缘假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psitacci)、脑膜资奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhea)、霍乱弧菌、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)，及痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)，及动物或染白动物的细菌包括选自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠沙门氏菌，及彼等的所有血清型，尤其是鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、猪霍乱沙门氏菌、曼哈顿沙门氏菌(Salmonella manhatten)、都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)、婴儿沙门氏菌、大肠杆菌种，包括0157，引起水肿的大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)，及空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，以及选自HAP细菌组的呼吸道细菌，特别者放线杆菌属，尤其是下列HAP组的细菌：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)及Mannheimiasp.。LPS的分离

LPSs通常是经由水酚萃取接着各种纯化步骤，从革兰氏阴性细菌分离出来(Raetz 1996)。这些方法通常可应用到所有类别的细菌LPS。此外，LPSs也可从商业上取得。LPS的特征

分离出的LPS可经由多种不同方法的特点是，如在实验段中可以使用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)来分析LPS的分子量分布、平滑及粗两类LPSs，包括市面上可取得的物质，都可以用这种方法来分析。此外也可以使用质谱分析法、NMR、间接ELISA(参看“实验段”)、UV-分光测定法(参看“实验段”)、免疫印迹法以及其它方法。PS的制备

已知完整O-抗原可以经由剪切O-多醣从脂质A部份分离出LPS。此程序可经由常规地将O-多醣中的KDO所含还原性端，与LPS的脂质A部份所含GlcNAc之间的酸不安定性糖苷键予以酸水解(如0.1M乙酸在90℃下1小时)，接着施以水性氯仿/甲醇萃取而得多醣(PS)(Raetz 1996)。

分离出的PS含有(实质)完整的LPS所含O-抗原。从PS消除掉脂质A有助于抗体对O-抗原的接近性(Munfora and Hall，1979，Inf.Imm.26，42-48)以及使O-抗原的内毒性相对于对应的LPS减低约1000倍([van de Wiel等人，1987，疫苗5，33-38]van de Wiel et al.，1987，Vaccine 5，33-38)。此外，PSs都是纯亲水性分子，具有低毒性，高度可溶于水性溶液中，且显示出形成胶束的倾向。PSs因而比LPSs更容易处置。

另有其它方法可以用来得到去脂质LPS多醣，包括用肼或NaOH的碱性水解，释出磷酸酯和其它酯以外的酯化脂肪酸，但不释出经酰胺键结合的脂肪酸(Gupta等人，1995)，及噬菌体媒介的将完整LPS的O-多醣或PS隆解成较小的寡醣单位，而不保留末端KDO单醣(Svenson et al.1979，J.Virol.32，583-592)。除了在实施例中采用的相-萃取法之外，经由酸水解加上胶透层析术收拾处理出PS，也是本领域技术人员公知的(Lambden and Heckles，1982)。PS的特征

分离出的PS可用许多种方法予以表示其特征，如在实验段所述。可以使用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠--聚丙烯酰胺凝胶电泳)来分析剩余的LPS。此外也可以使用质谱分析法、NMR、间接和竞争性ELISA(参看“实验段”)、UV-分光测定法(参看“实验段”)、免疫印迹及其它方法。多醣报道基因组偶联物的制备

为了得到经固化多醣抗原在诊断检定或其它应用中的最佳效能，需要将抗原以明确取向固化在固体表面上。本发明中列举需要在一个报道基因分子(reportermolecule)与多醣抗原之间特定取向地形成一化学稳定性键。

如上所述，本发明方法包括在多醣(PS)所含羧基与报道基因分子(RM)之间形成一共价键，由此形成多醣-报道基因分子偶联物(PS-RM)，其中该报道基因分子包括一识别/底物部位。

术语“报道基因分子”一词指一化学单位，它是用来建立在多醣与固体表面之间的特异性连接。报道基因分子包括至少一报道基因部份，其包括该识别/底物部位，和一可选择的连接体部分。

该多醣-报道基因分子偶联物(PS-RM)优选的是具有通式PS’-C(＝O)-N(R^N)-F-L-R，其中PS’-C(＝O)为该多醣，N(R^N)-F为直接涉及在该多醣与报道基因分子之间的共价键连接中的基团，R^N表示氢或C_1-4-烷基，L为该报道基因分子的连接体部份，且R为该报道基因分子的报道基因部份。特别是，-N-F-表胺基(-N-)、苯胺基(-N-ph)、酰肼基(-N-C(＝O)-)、脲氨基(-N-C(＝O)-NH-)、硫代卡巴肼基(-N-C(＝S)-NH-)，或肼基(-N-NH-)。优选的是-N-F-为胺基。

术语“C_1-4-烷基”一词意欲涵盖甲基、乙基、丙基(1-丙基和2-丙基)、环丙基、丁基(1-丁基、2-丁基、2-甲基-丙-1-基和2-甲基-丙-2-基(三-丁基))。

有多种类型的报道基因部份在下面”多醣-报道基因分子偶联物的固定化”下有概括地说明。

报道基因部份的例子为光化学反应性基团，例如经取代的香豆素、苯并呋喃、吲哚、白芷素、补骨脂内脂(psoralens)、碳烯类及氮烯前体、酮类、及氰类，如蒽醌(AQ)醌菲和苯醌；熟化学反应基团例如羧酸、一胺、二胺、酰基肼、脲氨、硫代脲氨、硫羟、脂肪肼、芳香肼、环氧化物及顺丁烯二酰亚胺；且一亲和性配对中的一部份(优选的是具有较低分子量的一份，如最高达7,000分子量者)例如生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/NeutrAvidin^TM、谷胱甘肽/谷胱甘肽-S-转移酶、亚胺基二乙酸金属复合物/六聚组氨酸-标记肽和蛋白质、氮基三乙酸金属错合物/六聚组氨酸-标记肽和蛋白质、LNA/LNA、LNA/DNA、LNA/RNA、DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA、PNA/RNA、PNA/DNA、及斜对特定半抗原(hapten)培养的单株-或多株-抗体/半抗原。优选的是，该报道基因部份包括一生物素(亲和配对的一部份)或一蒽醌。

该报道基因分子中除了报道基因部份之外也可包括一适当的连接体部份(L)。此等连接体可用来提供给经固定化多醣充足的伸缩性/移动性。

在报道基因分子与多醣之间的选用连接体部份可用于各种不同目的。连接体部份可用来将报道基因与多醣单离开因而增进随后的固化步骤。同时，该间隔质也会增强多醣抗原决定部位的呈现，改良固化多醣为基础的诊断检定法或其它应用。恰当的连接体也可视需要提供荷电、无荷电、亲水性或疏水性部份体，以影响例如在复合到多醣中的报道基因间隔质分子的溶解性，以及经固化多醣最后应用的性质。因此，恰当的偶联物设计和最适化的复合方案为产生最佳多醣报道基因偶联物，供随后固化到固体表面所涉及的能力的关键要素。

连接体部份的例子为选自下列的C_1-20-亚烷基的双基，可以包括芳族或单-/多-不饱和烃或环状烃、低聚氧化乙烯，低聚酰胺类，例如低聚甘氨酸、低聚丙氨酸、低聚赖氨酸和低聚肽、低聚-磷酸二酯、低聚-磷酰胺酸酯、低聚-磷酸二酰胺、低聚-磺酸酯，和低聚-磺酰胺。再者，该连接体也可包括组合的前述诸单位。

优选的是，该连接体部份，若有存在时，可在上式PS’-C(＝O)-N(R^N)-F-L-R(及上文式II中)中的F与R之间导入1至30个原子，优选的是3至20个原子。

优选的是，该报道基因分子具有最大10,000，例如最大5,000，优选的是最大2,500的平子量。

报道基因分子所含报道基因部份的术语“识别/底物部位”一词指称作为或包括(生物学)识别部位(亦即，亲和配对的一部份)或化学反应性部份或光化学反应性部份，其是打算与固体表面的收受/药剂部位形成特殊键。

如上所述，发现多醣中含酮基-羧基单醣单位所含羧酸为在多醣与含有适当官能基团的报道基因分子之间进行特定取向性及化学选择性键形成的特别良好把手。

有数种亲核剂，包括一胺和二胺、脂族肼、芳族肼、脲氨、硫代脲氨和酰基肼，都能够在藉于偶合剂下，与羧酸部份体形成稳定的共价键。因此，含有这种亲核性基团的报道基因即可与羧酸形成稳定的共价键。必须知道“报道基因部份”本身可能包括这种亲核基团。另外，该亲核剂可以直接或经由选择性连接体部份(L)导入。含这种亲核剂的报道基因分子的制备对于本领域技术人员公知的(参看，例如，[Greg T.Hermanson等人，固化亲合性配体技术，学院印刷公司，1992]Greg T.Hermanson et al.，Immobilized Aftinity Ligand Technigues，Academic Press Inc.，1992)。

偶合剂是作为羧酸的活化剂，随后被亲核剂作用导致稳定共价键的形成。偶合剂的例子为碳化二酰亚胺类，例如二异丙基碳化二酰亚胺和水溶性碳化二酰亚胺(WSC，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二酰亚胺)，鏻盐例如六氟磷酸苯并三唑氧基-三-(二甲胺基)鏻(BOP)，及六氟磷酸(苯并三唑基)-N-氧基-吡咯锭鏻(PyBOP)、尿盐(uronium salts)，例如六氟磷酸O-苯并三唑基-N，N，N’，N’-四甲基尿(HBTU)，O-(3，4-二氢-4-酮基-1，2，3-苯并三丫嗪基)-N，N，N’，N’-四甲基尿(TBTU)，及六氟磷酸N，N’-四甲基fluoroformidinium(TFFH)。有许多种类的偶合剂的使用是本领域技术人员所熟知([M.Bodanszky，肽合成的原则，第二版，Springer-Verlay，1993]M.Bodanszky，Principles of Peptide Synthesis，2nd Edition，Springer-Verlay，1993)。助手亲核剂例如N-羟基丁二酰亚胺和1-羟基苯并三唑的加入可增强偶和动力学以及压抑副反应，例如使用碳化二酰亚胺作为偶合剂时的D-→N酰基重排([M.Bodanszky，肽合成的原则，第二版，Springer-Verlay，1993]M.Bodanszky，Principles of PeptideSynthesis，Ind Edition，Springer-Verlag，1993)。

偶合反应可以在水溶液中或在水与水可溶性有机溶剂，例如N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚酰、二氧杂环己烷、甲醇、乙醇和丙酮等的混合物中或在纯有机溶剂中实施。该溶剂或溶剂混合物系经选择以促成反应物的最可能溶解度者。

在使用水或水/有机溶剂混合物时，偶合反应中的pH值可以经由使缓冲溶液予以控制。pH值经选择以促成最佳偶合反应条件，同时保存多醣和报道基因分子的完整性。优选的是，该pH值保持在5与9之间以保存住多醣所含O-抗原上的酸或碱不安定性抗原决定部位。这种不安定性基的一个例子为O-乙酰基，非常普遍地出现在多醣O-抗原内。偶合反应的最适pH也决定于亲核剂的本质。胺类为一种碱性化合物，其可低pH值质子化而使其成为非亲核性，因此，使用胺类的偶合反应最好在高于7的pH下实施。其它亲核剂例如芳族肼、胺基肼、硫代脲氨和酰基肼，都具有远较为低的碱性，而促使偶合反应得以在中性pH或甚至更低值之下实施。决定偶合反应最适pH的另一项因素为活化羧酸部份体被氢氧根离子作用的竞争性水解。这种副反应可以经由在偶合中使用低于8的pH值予以减到最小。于有机溶剂中，偶合反应中的pH值可经由使用适当的有机或无机酸和碱而达到，根据在溶剂中的溶解度以及根据相对酸或碱强度而选择的。如上所述，正确的条件为选择成能促进共价键偶合同时保存住多醣和报道基因分子的完整性。

该偶合反应典型地是在-20至100℃，常为0至20℃范围内，例如5℃左右的温度下实施。

除了上文所提诸参数之外，反应时间以及多醣、偶合剂和报基因的用量对于得到理想多醣报道基因偶联物而言都具关键性。本案发明人已开发出偶合方案，其可产生可复制的偶联物，具有优良产率及保存住多醣的致免疫原性抗原决定部位以及报道基因分子的完整性之性质(参看实验段)。这种最适化常为商业应用所需为本领域技术人员所公知。

于本发明一有趣且在商业上非常有益的实施方案是衍生自沙门氏菌LPS的多醣，及包括生物素或蒽醌基团的报道基因分子，其经利用碳化二酰亚胺偶合剂经由酰胺键偶合到该多醣。

本发明另一有趣且在商业上非常有益的实施方案是衍生自放线杆菌LPS的多醣，及包括生物素或蒽醌基团的报道基因分子，其经利用碳化二酰亚胺偶合剂经由酰胺键偶合到该多醣。

这些实施方案要在“实验段”中详细地讨论。

根据本发明方法第一步骤产生的中间体据信其本身具有新颖者。

因此，本发明也提出一种通式I化合物

(或，当R²为氢时，可选择其酮基类似物)其中R¹选自氢和报道基因分子L-R，其中L为该报道基因分子的选用连接体，且R为该报道基因分子的报道基因部份；R^N为选自氢和C_1-4--烷基；F为选自下列的单键、亚苯基、羰基(C(＝O))、羰基亚胺基(C(＝O)-NH)、硫羰基(C(＝S))，和亚胺基(-NH-)；R²、R⁷、R⁸为各自独立地选自氢和羟基保护基；R⁴为选自下列的氢、单-或双-醣残基和羟基保护基；且R5选自下列的氢、“选择性的官能基团保护的多醣残基”和羟基保护基。

术语“单-或双-醣残基”指称包括一或两个经糖苷基键联的单醣单位之残基。较佳例子为KDO-2-基、4-磷酸基乙醇胺-KDO-2-基、L-鼠李糖基-(1→4)-KDO-2-基，和KDO-(2→4)-KDO-2-基。

术语“多醣残基”一词指多醣(如上文所定义者)的部份，其与式IKDO单醣单位及任何R4醣取代基一起形成多醣(PS)。因此，多醣残基优选的是包括2至997经键联的单醣单位，例如至少7个，如7至997个，经键联的单醣单位，特别是至少22个，如22至497个，经键联的单醣单位。如上文对“多醣”所定义的那样，多醣残基可为经非化学计量地取代。

术语“选择性官能基团保护”一词指载有在偶合步骤中存在的条件下具反应性的官能基团的寡醣片段，以现有技术公知的方法选择性地将官能基保护住。它意谓着将官能基团例如羟基、胺基、羧基、磺酸基，和氢硫基等选择性地将官能基团保护住。保护(和解保护(deprotection))是以现有技术公知的方法实施的(参看，例如，[Greene，T.W.and Wuts，P.G.M.，“有机合成中的保护基团“第二版，John Wiley，N.Y.(1991)，和M.J.Gait，寡聚核苷酸的合成，IRL Press，1984]Greene，T.W.andWuts，P.G.M.，“Protective Groups in Organic Synthesis”，2^nd Ed.，John Wiley，N.Y.(1991)，及M.J.Gait，Oligonucleoride Synthesis，IRL Press，1984)。

术语“羟基保护基”的示范例子为选择性经取代的苯基甲基，例如4，4’-二甲氧基三苯基甲基(DMT)、4-单甲氧基三苯基甲基(MMT)，和三苯基甲基，选择性取代的9-(9-苯基)占吨基(pixyl)，选择性取代的乙氧羰氧基、对-苯基偶氮苯氧羰氧基、四氢呋喃基(thp)、9-茀基甲氧羰基(Fmoc)、甲氧基四氢呋喃基(mthp)，硅烷氧基例如三甲基硅烷氧基(TMS)、三异丙基硅烷基(TIPS)、第三丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、三乙基硅烷基、和苯基二甲基硅烷基、苯氧羰基或取代的苯氧羰基醚例如2-溴苯氧羰基、第三丁基醚，烷基醚例如甲基醚、缩醛(包括二个羟基)，酰氧基，例如乙酰氧基或卤素取代的乙酰基，如氯乙酰基或氟乙酰基、异丁酰基、三甲基乙酰基、苯甲酰基和取代的苯甲酰基、甲氧甲基(MOM)、苯基醚或取代的苯基醚，例如2，6-二氯苯基(2，6-Cl₂Bzl)。另外，可选择性由连接体接合到一固体载体而将羟基保护住。

氨基保护基的示范例子为Fmoc(氟基甲氧羰基)、BOC(第三丁氧羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧羰基(alloc，AOC)、苯氧羰基(Z，Cbz)，取代的苯氧羰基，例如2-氯苯氧羰基(2-ClZ)、一甲氧基三苯基甲基(MMT)、二甲氧基三苯基甲基(DMT)、邻苯二甲酰基，和9-(9-苯基)占吨基(pixyl)。

羧基保护基的示范例子为烯丙基酯、甲基酯、乙基酯、2-氰基乙基酯、三甲基硅烷基乙基酯、苯基酯(Obzl)、2-金刚烷基酯(O-2-Ada)、环己基酯(OcHex)、1，3-恶唑啉、恶唑，1，3-恶唑烷、酰胺和酰基肼。

氢硫基保护基的示范例子为三苯基甲基(Trt)、乙酰胺基甲基(acm)、三甲基乙酰胺基甲基(Tacm)、2，4，6-三甲氧基苯基(Tmob)、第三丁基次磺酰基(StBu)、9-氟基甲基(Fm)、3-硝基-2-吡啶次磺酰基(Npys)，和4-甲基苯基(Meb)。

在一令人感兴趣的实施方案中，R¹为L-R。再者，式I中的-N-F-优选的是指胺基(-N-)、苯胺基(-N-Ph)、酰肼基(-N-C(＝O)-)、脲氨基(-N-C(＝O)-NH-)、硫代脲氨基(-N-C(＝S)-NH-)，或肼基(-N-NH-)，特别是氨基。

基团L优选的是经指为上文所定义的二基团(连接体部份)且，再者，报道基因分子(L-R)优选的也是上文所定义者。特别另人感兴趣的是报道基因分子包括生物素或蒽醌(特别是蒽醌)作为报道基因部份的一部份的变异体。

再者，本发明提出一种制备上文所定义的通式I化合物的方法，包括将通式III化合物

其中R²、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷和R⁸皆为对通式I所定义者，呈完全或部份官能基团保护形式，与通式IV氮化合物反应H-N(R^N)-F-R¹         IV其中R¹、F和R^N皆为对通式I所定义者；以及选择性地将所得产物完全或部份地解保护，得到通式I化合物。

优选的是，该通式III化合物是以其活化酯形式使用。特别是，在通式III羧酸化含物与氢化合物IV之间的反应是经使用偶合剂，例如上文提及者予以助成。

因此，本发明也提出式I化合物，它是用以制备一检定装置，用以测定抗革兰氏阴性菌及/或革兰氏阴性菌的O-抗原的抗体。

本发明还提出一种式I化合物，它是用以制备载有经固化多醣的固体表面。多醣报道基因基团偶联物的分析

常常有价值的是在固化到固体表面之前能够评估报道基因基团多醣偶联物所具品质。恰当的分析方案必须可用来确定在接合到报道基因分子之后多醣上的免疫原性抗原决定部位都保持完整且同时要确定偶联物以可复制方式产生。

与本发明相关联的是已开发出能够用来评估接到多醣的报道基因的量，以及评估多醣报道基因制备物中所含DNA和蛋白质UV光谱分析方法。因此，如在“实验”段中所说明的那样，可以使用260和280nm的吸光测量来评估DNA和蛋白质的含量，同时在对报道基因特定的波长下评估接着到多醣的报道基因的量。如在“实验段”中所说明的竞争性ELISA和间接ELISA为一种定量分析不同多醣报道基因偶联物制备物中完整免疫原性抗原决定部位的存在之有力工具。如此，两种已开发的分析技术的组合可以确实使不同批的多醣报道基因制备物能受到品质管制。最后一种决定性分析方案为定量测量将多醣报道基因偶联物固定化的能力。这些程序都在下文及“实验段”中概述之。多醣报道基因分子偶联物的固化

于根据本发明方法的后续步骤中，在该报道基因分子的识别/底物部位与该固体表面的收受/药剂部位之间形成特异性键，将该多醣-报道基因分子偶联物固定化到固体表面上。

术语“形成特异性键”一词指在该多醣/报道基因分子偶联物的报道基因部份与该固体表面之间建立一共价键以及建立非共价键包括亲和性配对。于本发明一方面中，该报道基因部份为一种光化学反应性基团，其能够在用光照射下形成对固体表面的共价键。光化学反应性基的例子为经取代香豆素类、苯并呋喃类、吲哚类、白芷素及特别者补骨脂内脂，如在EP 0 319 957中所披露者。有许多专利公报US-A-4 722 906、US-A-4 973 493、US 5 002 582和PCT/US88/04491披露出选自碳烯与氮烯前体和酮类中的光化学反应性基团，它能够在用光照射下形成对固体表面的共价键。一种特别较佳的光化学反应性基团亚类为醌类例如在WO 96131557中所披露，如蒽醌(AQ)、苯醌和菲醌。特别有用的光化学反应性基团为蒽醌基。

对固体表面的共价键的光化学形成典型地包括下列诸步骤：将多醣报道基因分子偶联物(PS-RM)调成在恰当溶剂中的溶液。优选的是，该溶剂为水、或为水与水溶性有机溶剂，例如N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二氧杂环己烷、甲醇、乙醇和丙酮等混合物或为纯有机溶剂。该溶剂或溶剂混合物经选择以确得该多醣报道基因分子偶联物的溶解度，但同时又可促成供后续固化步骤所用的最佳条件。使用水或水/水溶性有机溶剂混合物时，可以加入无机盐以增强对固体表面的光化学偶合步骤，以及控制溶液的pH值。如在“实验段”中所证实者，盐的正确本质以及多醣报道基因分子偶联物的浓度，及溶液的pH值都是可以调整以得到改良结果的参数。时常地，该光化学程序需要一含碳表面(或可由含碳表面获得帮助)。

将该多醣报道基因分子偶联物溶液以溶液形式与固体表面接触，并曝露于具有适当波长的光。优选的是，该波长选在200到700nm之间，不过仍决定于所选的特殊光化学反应性基。用于蒽醌，该波长典型地为300至400nm。照射时间则依多醣报道基因分子偶联物的本质而变化，优选的是，该照射时间应该小于200分钟。另外，可将多醣报道基因分子偶联物溶液与固体里面接触，将溶剂或溶剂混合物挥发掉，并最后依上文所述使偶联物曝光。在此两种情况中，其后都是用水或适当的水/溶剂混合物清洗，以脱除掉非共价键结合的偶联物。

本发明第二方面中，该报道基因部份为一种热化学反应性基，能够以化学选择性方式对具有适当官能基团的固体表面形成共价键。热化学反应性基团的例子为羧酸、一胺、二胺、酰基肼、脲氨基类、硫代脲氨基类、硫醇类、脂族肼、芳族肼、环氧化物及顺丁烯二酰亚胺类。热化学程序经常需要含碳表面(或由含碳表面获得帮助)。

多醣报道基因分子偶联物(PS-RM)是经在恰当的溶剂内调成溶液。优选的是，该溶剂为水、或水/水溶性有机溶剂，例如N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二氧杂环己烷、甲醇、乙醇和丙酮等的混合物或纯有机溶剂。该溶剂或溶剂混合物是经选择后使该多醣报道基因分子偶联物溶解，而同时达到后续固定化步骤的最佳条件。将该多醣报道基因分子偶联物溶液与该固体表面接触以帮助共价键形式。可能有需要添加额外的偶合剂以期促进共价键形成。在大部份情况中，非常重要的是在共价键形成中控制pH值。在水溶液或水/水混溶性溶剂混合物中，这方面可经由使用标准缓冲液而达到。在有机溶剂中，可经使用适当的有机或无机酸和碱来达到，根据它在溶剂中的溶解度以及根据相对酸或碱强度来选择。所有情况都要选出正确的条件促进共价键偶合，同时保持多醣和报道基因分子的完整性。大部份情况，可在不将溶剂蒸发下进行共价键的形成，不过在某些情况中，蒸发可能是有利的。许多种方法都已为本领域技术人员所熟知(Greg T.Hermanson et al.，Immobilized Affinity Ligand Techniques，Academic PressInc.，1992)。

于本发明第三方面中，该报道基因分子为一亲和配对的一份子，亲和配对是本领域技术人员所熟知的(Greg T.Hermanson et al.，Immobilized Affinity LigandTechniques，Academic Press Inc.，1992)且其示范例子有生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、谷胱甘肽/谷胱甘肽-S-转移酶、亚胺基二乙酸金属错合物/六聚组氨酸标记和蛋白质、氮基三乙酸金属错合物/六聚组氨酸标记和蛋白质、DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RAN及针对半抗原培养的单一或多-株抗体/半抗原。亲和配对的一种特别吸引人的例子为锁定核酸(locked nucleic acid)的两互补股(LNA，Nielsen et al.，Chem.Commun.1997，9，825-6)。优选的是，用来制备多醣报道基因偶联物的亲和配对之部份为低分子量到中等分子量的化合物，其优选的是低于10,000，最佳者低于7,000。

将该多醣报道基因分子偶联物在恰当溶剂内调成溶液。优选为，该溶剂为水，或水与水可混溶性有机溶剂例如N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、甲醇、乙醇和丙酮的混合物或为纯有机溶剂。该溶剂或溶剂混合物系经选择以确保该多醣报道基因分子偶联物的溶解，且又同时促成后续固定化步骤的最佳条件。将该多醣报道基因分子偶联物与已用该亲和配对的第二部份预涂覆过之固体表面相接触。于大部份情况中，需要控制溶液中的pH、离子本质和浓度，且于许多情况中，需要添加清洁剂以使固定化步骤最适化。有许多种此等方法系谙于此技者所熟知者([GregT.Hermanson等人，固化亲合性配体技术，学院印刷公司，1992]Greg T.Hermansonet al.，Immobilized Affinity Ligand Techniques，Academic Press Inc.，1992)。

本文所披露的各种方法具有非常重要的性质是它可以促成将一种以上的多醣报道基因共轭物的混合物，同时以非常明确的方式固化到相同的表面上。如在“实验段”中所述，多醣报道基因共轭物的固化可以个别地固化，且于最后在混合反应中实施，并以混合共轭物为基础进行应用。经固化的各共轭物的个别比例可以根据特殊应用而容易地进行优化。

多醣要黏附的固体表面可以选自多种用于分析和诊断领域中的固体表面。最引入注意的固体表面类型为有机聚合物、玻璃、硅和氧化硅(硅土)以及它们的复合材料。

在这些有机聚合物中，其范例为聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯、纤维素、硝酸纤维素、琼脂糖、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙酸乙烯酯、聚二氟乙烯、聚戊基戊烯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚氯乙烯、其中以聚苯乙烯和聚碳酸酯为特别有用的例子。

于玻璃和陶瓷中，硼硅酸玻璃(Pyres玻璃)和碱石灰玻璃为特别相关的示例，如，呈样品管、管瓶、和显微术载玻片等形式。

物体本身可具有一形式或可经设计和成型供特别合意的用途所用。例如，该物体可为片、膜、珠粒、丸粒、盘、板、环、棒、网、薄膜、滤器、托盘、微型板(微滴板)、黏片、或多叶黏片(multi-bladed stick)。要根据本发明予以涂覆的特别有用物体为微型板(微滴板)，如聚苯乙烯微型板(微滴板)、黏片、载片、管子和珠粒。

本文所披露的方法具有另一重要性质为其可用空间可寻址方式实施多醣报道基因共轭物的固化的能力，这一点在生物芯片和生物传感器及其它微型化诊断系统的发展中是非常重要的。在这些系统中，需要将该检定的至少一种成分固定化在明确的位置上。如此可使每一分析成分能按位置来鉴别，促成在一分析样品内同时测定许多种分析成分。

此外也相信多醣的固化可根据一代用方法来实施，其中在多醣的羧基与固定表面所接着的化学官能基，例如胺、苯胺、肼等之间直接形成一共价键。在某些情况中，可以使用商业上可取得的固体表面，例如得自Nunc，Denmark的CovaLink微型板。据信这种方法的使用比根据主要实施方案的诸具体实例并不见得好，特别是针对再现性而论时。不过，相信该代用方法可用来固化已消掉脂质部份的多醣(PS)。

因此，本发明也提出一种将多醣(PS)固定化到固体表面的方法，该多醣具有酮基-羧酸基(-C-(＝O)-COOH)或其所对应的缩酮基或半缩酮基，该方法包括在该多醣所含羧基与该固体表面所含化学官能基之间形成一共价键。

从上述明显可知该固体表面所含化学官能性优选的是应该与上文所指明者为相同类型而导致在多醣与固体表面之间的键类型相对于上文对于在该多醣与报道基因分子之间的键结有基本上相同的类型，亦即，PS′-C(＝O)-N(R^N)-F-L-SS类型的键，此处PS′、L、R^N和F皆为上文所定义，且SS为该固体表面。必须知道N(R^N)-F-L可为固体表面的部份或为该多醣要偶合之处，或，另外，该N(R^N)-F-L可在偶合到固体表面的前先偶合该多醣。

摘言之，本发明也提出根据上述本发明所得到(或可得到)的固体表面。固化共轭物的应用

LPS衍生多醣所固化住的固体表面具有在诊断和分析领域中的各种用途，例如，用以测定各种动物，如猪和家禽，中的沙门氏菌感染。

在一较佳实施方案中，经固化的沙门氏菌多醣包括O-抗原1，4，5，6，7和12，是由蒽醌-偶合鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌LPS-衍生多醣的混合物所表示，它经两种多醣的最适化混合物偶合到固体表面，如实施例24中所述。该固体表面打算用于对针对具有所述血清型的沙门氏菌种和沙门氏菌O-抗原抗体的免疫检定，该免疫检定包括将该表面与一样品接触，优选的是为液体样品例如血清、肉汁、牛奶或其它生物衍生出的流体。然后用包括酶标记(enzyme label)的测定抗体测定出抗体，整个检定以酶连接免疫吸着检定(EILISA)方式实施。其它标记，例如萤光性标记，时间解析萤光测定用的标记，一般的放射性标记，用于邻近闪烁计数的放射性标记等等都可以使用。

本发明提出载有依上文所述(或以其它方法产生相同结果)固化的多醣的固体表面在诊断或抗原血清定型检定，优选的是诊断检定中的用途。该检定优选的是为固相免疫检定，特别者，该诊断检定为一种血清学检定，例如测定对抗微生物例如革兰氏阴性菌的抗体所用的血清学检定。特别者，该诊断检定为一种测定对抗沙门氏菌种的抗体所用的血清学检定。

本发明也提出一种测定对抗单或多种革兰氏阴性菌的抗体所用的检定位置，其包括具有经固化到其上的多醣固体表面，该多醣对应于革兰氏阴性菌的细菌脂多醣(LPS)所含碳水化合物部份，该固化是透过该多醣所含KDO单醣单位的羧酸基完成的。所述的多醣优选的是根据本文所定义的方法固化到该固体表面上。于此检定装置中所包括的固体表面典型地具有特别适合标的检定所用的形状。该检定装置可还包括一保护片且可以并入一使用说明片。

特别有吸引性的检定装置是用于细菌血清型分析及用于抗原测定。再者，包括有固化到装置组件表面上的一种以上PS的检定装置构成优选实施方案。

本发明也提出一种用以估计特定细菌的数目，用以检定细菌血清型，以及用以测定抗原(LPS/PS)的方法，它利用上文所述的检定装置。特别吸引人的具体实例包括使用AQ-PS固定化微型板。这些诊断方法可促成能够测定生物体液中甚至很少量的细菌及提供细菌血清型的测定。这对于沙门氏菌和放线杆菌感染的测定特别引人兴趣而且有用。

实验通论

氯仿、二甲亚(DMSO)和甲醇都是购自Labscan且都是HPLC纯，乙酸(99-100％)购自Riedelde Hien，水溶性碳化二酰亚胺(WSC，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二酰亚胺)来自NovaBiochem，N-羟基丁二酰亚胺(96％)来自Aldrich，“Slide-a-lyzer”来自Pierce，H-βAla-βAla-(CH₂)₃-NHCO-AQ  HCl按先前所述予以合成(WO 96/31557)(βAla意指β-丙氨酸)。透析管(MWCO：6-8000)购自Spectra/Por，聚苯乙烯微型板(PolySorp)得自Nunc.PBS：磷酸盐缓冲食盐水，pH7.2，0.15M NaCl。PBS，Tween：PBS+0.05％Tween 20。PBS，Tween，BSA：PBS-Tween+1％BSA(牛血清白蛋白)。OPD-底物溶液：0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，pH5.0，0.66毫克/毫升OPD(O-伸苯基二胺)，0.012％H₂O₂。所有猪血清都得自the Danish Veterinary Laboratory。

实施例1得自鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的脂多醣(LPS)的纯化。培养：使用鼠伤寒沙门氏菌no.3389-1/92(O：1，4，5，12)和猪霍乱沙门氏菌库氏变种no.143(O：6，7)来制备LPS。用于平板培养时，使用增补5％牛血的哥伦比亚琼脂(Columbia agar)(C-血琼脂)(Oxoid，Unipath Ltd.，Basingstoke，UK)作为固体生长培养基。用于肉汤培养时，细菌在烧瓶中37℃下以130 rpm摇动喜气生长。菌株在增补10％甘油的LB-肉汤内贮存在-80℃。用于酸酵时，在装有4升LB培养基的7升MBR Labor Bioreactor(MBR Bio Reactor AG，Switzerland)内进行800毫升过夜肉汤培养物。整个过程中将温度维持在37℃，且将pH保持在7.2，并经由在500rpm固定搅动下通入无菌大气压空气，将通气而自调节调定在50％pO₂。经由添加硅酮乳液控制发泡。在接种90分钟后，加入400毫升25％葡萄糖。接种5小时后，将通气减低到约1升每分钟。在培养约18小时，停止通气并在20℃和200rpm下添加150毫升的福尔马林到约3％的最后浓度，且在这些条件下继续抑活化20小时。

在添加福尔马林6小时后，检查C-血琼脂上培养物的抑活化情形，将该经接种的C-血琼脂板温浸整个晚上。若经察抑活化已完全，则可释出经抑活化的培养物供后续处理所用。萃取：从经福尔马林杀死的培养物经由热水酚萃取而萃取出LPS，如Hassan et al.，1990所说明。简述之，将5升经抑活化的培养物肉汤中的细菌用3×4升PBS洗清，接着用5至10体积的丙酮在20℃下洗4次，干燥后，再悬浮于Milli Q水中。用热(65℃)的45％酚水溶液从该悬浮液萃取出LPS；于该悬浮液中加入等体积的预热90％酚水溶液后，将混合物保持在65至68℃，温和搅动下10分钟。冷却到4℃，接着以10,000g离心30分钟之后，小心地取出上层水相并在4℃下针对Milli Q水透析至少48小时(换液三次)，且随后予以冷冻干燥。

从一批酸酵器培养物所得的纯化LPS的平均产率为1700毫克干重，其范围为1500至2200毫克。其纯度为从SOS-凝胶(参看实施例3)和UV-分析测量估计的。如从图5可见，在凝胶上只看到残余量的蛋白质。在280nm的消光测量显示出LPS水溶液(5至10毫克LPS/毫克)含有约1.5毫克/毫升的蛋白质。在经银染的SDS-PAGE(参看实施例3)上，可以看到典型的梯状排列带，显示已回收整体范围的分子量。

实施例2LPS的UV分析

可以使用UV光谱分析术来分析LPS的DNA和蛋白质含量。DNA含量可在260nm测量而蛋白质含量在280nm测量。简言之，将LPS溶在超纯水中到0.5毫克/毫升的最终浓度。只用超纯水作为参比，测量从200至400nm的UV光谱。图3显示出衍生自鼠伤寒沙门氏菌的LPS所得典型UV-光谱，而图4显示出衍生自猪霍乱沙门氏菌的LPS所得典型UV光谱。

实施例3LPS的SDS-PAGE分析

可以使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来分析LPS制备物以测定该制备物的分子量分布。经由这种方法，平滑LPS制备物典型地产生代表有递增分子量的LPS分子的带“梯”，每一带以该O-多醣所含重复单位的分子量相隔开。聚丙烯酰胺凝胶(12.5％)是根据Laemmli的方法操作的([Laemmli，英国，1970，自然227，680-685，在嗜菌体T4的头部组装中结构蛋白的剪切]Laemmli，U.K.，1970，Nature 227，680-685，Cleavage of structural proteins during the assemblyof the head of bacteriophage T4)。将LPS稀释在样品缓冲液中到2至4毫克/毫升LPS(1％SDS)的最终浓度并煮沸5分钟后，加到诸洞内。要测定蛋白质时，将凝胶置于0.4％(w/w)Coomassie Brilliant Blue R250中染色。要测定LPS时，根据Tsai andFrasch的方法([Tsai，C.-M.，Frasch，C.E.，1982，生物化学年报119，115-119，在聚丙烯酰胺内测定脂多糖的银敏感菌株]Tsai，C.-M.，Frasch，C.E.，1982，Anal.Biochem.119，115-119，A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides inPolyacrylamide gels)将凝胶银染。

图5显示出鼠伤寒沙门氏菌LPS制备物的典型分析，而图6显示出猪霍乱沙门氏菌LPS制备物的典型分析。如从这些图中可以看出者，用Coomassie BrilliantBlue染色只能看到残留量的蛋白质，而在银染凝胶上，可以看到梯状带排列，显示已回收到整个范围的分子量。

实施例4测定LPS和PS的间接ELISA

由于完整的LPS普常具有透过分子的疏水性脂质A-部份被动地结合到微型板之能力，因此可以使用有涂覆LPS的间接ELISA来测定某一LPS制备物中的LPS含量。以同样的方式，可以经由涂覆PS制备物来分析某一PS制备物中完整PS的存在。

间接ELISA基本上系根据B.Nielsen et al.(1995)先前公开的方案，只省略掉诸板的阻断(blocking)而实施的。用二倍稀释率系列的LPS或PS制备物涂覆诸板，典型地是以0.05毫克/洞在0.1M碳酸钠，1.0M NaCl，pH 9.6起始，并置于4℃下整个晚上。于PBS，Tween中清洗之后，加入对抗鼠伤寒沙门氏菌O-抗原的标准单株抗体(MAB Hytest Clone 1E6，1毫克/毫升，在PBS，Tween，BSA中稀释1/25000)或在PBS，Tween，BSA中稀释1/400的阳性猪血清。图7中使用的是阳性猪血清。每洞加入100微升并在室温下温浸1小时。然后将诸板置于PBS，Tween中洗三次且随即用HRP-接合兔子抗小鼠IgG(PO 260，DAKO，稀释1∶2,000)对MAb温浸，或用HRP-接合兔子抗猪IgG(PO164，DAKO，稀释1∶2,000)对猪血清温浸；稀释是在PBS，Tween，BSA内于室温下一小时完成的。依前述将诸板洗过，并于每一洞中加入100微升OPD底物溶液且温浸10至15分钟。同100微升0.5M H₂SO₄停止反应并在490nm读取光密度同时减除650nm光密度进行背景校正。

图7显示出上文所述用阳性猪血清分析鼠伤寒沙门氏菌LPS和PS制备物的典型实施例，而图8显示出使用婴儿沙门氏菌阳性猪血清对猪霍乱沙门氏菌LPS制备物的相应分析。可以看出LPS制备物结合到诸板上，且可被抗体特异地识别，而在对标准制备物相比时可对它的定量分析，而PS则展现出对诸板有很少的结合。

实施例5LPS和PS中免疫原性抗原决定部位的竞争性ELISA测定

不同的LPS制备物中完整免疫原性抗原决定部位的存在，可经由使用固定浓度的完整LPS来涂覆，并将要研究的抗原(LPS或PS)制备物与测定抗体一起温浸而以竞争型ELISA予以测定。除了有竞争物的存在之外，该ELISA完全按实施例4中所述间接ELISA来实施。典型地，使用从5毫克/毫升抗原的2倍滴定系列，且从相对于不含竞争性抗原中所得OD-水平之OD-水平减低看出竞争效应。

图13显示出使用以鼠伤寒沙门氏菌LPS涂覆的微型板得到经鼠伤寒沙门氏菌PS制备物竞争的典型结果，其中以鼠伤寒沙门氏菌LPS制备物作为竞争对照，并用经稀释到1/400的鼠伤寒沙门氏菌阳性猪血清，接着HRP-接合兔子-抗猪IgG(DAKO PO164，1/2000)予以测定，如实施例4所述。可以看出PS制备物于恰当浓度下也和完整LPS一般具有竞争性，显示出在PS中保存着抗原性抗原决定部位。图14绘示出对猪霍乱沙门氏菌抗原，使用1/600阳性猪血清所得相同结构。再度地，可以看出相对于完整PS之下，PS制备物也保存着抗原性。

实施例6从衍生自鼠伤寒沙门氏菌的LPS经由去脂质化制备PS

将经冷冻干燥的鼠伤寒沙门氏菌所衍生的LPS(1.55克)溶解在超纯水(388毫升)中，然后加入乙酸(22毫升，0.37摩尔)。将该混合物分成40毫升部份到Nunc塑料管内。将密封的管子置于烘箱(90℃，60分钟)内加热，接着置于冰浴内冷却10分钟使该混合物达到室温。将诸混合物合并并用氯仿/甲醇(2∶1混合物，v/v，4×580毫升)萃取合并水相。随后将水相置于4℃下针对超纯水透析1至2天(直到酚的气味消散挥为止)，并于最后予以冷冻干燥，得白色固体PS。按实施例2中所述实施UV分析(0.5毫克/毫升)。产率：0.520克(34％)，UV分析：A(260nm)：1.0；A(280nm)：0.82。

实施例7从衍生自猪霍乱沙门氏菌的LPS经由去脂质化制备PS

将经冷冻干燥的衍生自猪霍乱沙门氏菌之LPS(1.13克)溶解在超纯水(283毫升)中，然后加入乙酸(16.2毫升，0.27摩尔)。将混合物分成40毫升份于Nunc塑料管内。将诸密封管子置于烘箱内加热(90℃，60分钟)，接着在冰浴中冷却10分钟使混合物到达室温。将诸混合物合，并且用氯仿/甲醇(2∶1混合物v/v，4×425毫升)萃取合并水相。随后将水相置于4℃下针对超纯水透析1至2天，得白色固体PS。按实施例2中所述实施UV分析(0.5毫克/毫升)。产率：0.262克(23％)，UV分析：A(260nm)：1.52；A(280nm)：1.09。

实施例8PS的SDS-PAGE分析

经由银染可见的SDS-PAGE可以用来分析经LPS水解衍生的PS中有否残留LPS的存在。由于PS不含脂质性，SDS-结合性脂质A部份体，因此PS不会和SDS复合形成会在电泳中移动的荷电复合物。因此，纯PS不会在银染SDS-PAGE中产生分离带。PS制备物的SDS-PAGE是按实施例3中所述实施的。图9显示出5种不同的猪霍乱沙门氏菌PS制备物所得典型结果。如从图中可看到，在这些PS制备物中仍有微量LPS存在。

实施例9PS被动结合到微型板的能力的测定

经由去脂质化从LPS衍生的PS会失去经由被动吸附而结合到微型板的能力。因此按实施例4中所述予以检试的PS制备物，相对于相称量的LPS产生非常小的OD信号，如在图7和图8中对鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌可分别看到。

实施例10胸膜肺炎放线杆菌PS的制备培养条件 使用胸膜肺炎放线杆菌血清型5b参比菌株L20，和血清型6参比菌株Femψ来制备LPS-抗原。将诸菌株置于增补5％牛血的肉汤琼脂板上生长([Jacobsen，M.J.and Nielsen，J.P.，1995，从扁桃体中分离胸膜肺炎放线杆菌的敏感性和显示性培养基的开发，兽医微生物学47，191-197]Jacobsen，M.J.and Nielsen，J.P.，1995，Development of a selective and indicative medium for isolation of Actinobacilluspleuropneumoniae from tonsils.Vet.Microbiol.47，191-197)，其中使用非溶血性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)护士菌株；或在修改PPLO-琼脂板作为固体培养基上生长(Nicolet，J.，1971，Zentralbl.Bacteriol.Abt.1 Orig.216，487-495，Sur I′Hemophilose du porc III.Differenciation serologic deHaemophilus parahaemolyticus)。将胸膜肺炎放线杆菌增殖所用的液体生长培养基由增补着10克/升酵母菌萃取物(Oxoid L21，Unipath Ltd.，Basingstoke，UK)和0.03％(w/v)NAD(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)的30克/升Trypticase大豆肉汤(BBL 11768，Becton Dickinson，Cockeysville，MD，USA，pH7.2)所构成。将1升液体培养液置于2升Frlenmeyer摇瓶内在37℃，以130rpm摇动而生长。萃取：按先前所述方法([Nielsen，R.，Andresen，L.O.and Plambeck，T.，1996，与血清型2和7抗原相关的胸膜肺炎放线杆菌生物型1菌株的血清学特征，Acta Vet.Scand.37，327-336]Nielsen，R.，Andresen，L.O.and Plambeck，T.，1996，Serologicalcharacterization of Actinobacillus pleuropneumoniae biotype l strains antigenicallyrelated to both serotype 2 and 7.Acta Vet.Scand.37，327-336)从胸膜肺炎放线杆菌血清型5b，菌株L20和血清型6，菌株Femψ制备LPS，不同处在于起始物为10克干重得自液体整夜培养的细胞且其体积亦按比例放大。以90,000xg超离心，沉淀出凝胶状LPS。将沉淀出的LPS溶在2毫升去离子水中并冷冻干燥。PS之制备  基本上按实施例6和7中对沙门氏菌PS所说明者从两种胸膜肺炎放线杆菌血清型所得经冷冻干燥LPS制备PS。PS产率预期在10至40％范围内，其系相对于起始LPS量。

实施例11AQ-PS偶联物之UV分析

使用UV光谱分析法来分析PS的AQ、DNA和蛋白质含量。DNA含量在260nm测量而蛋白质含量在280nm测量，至于AQ含量可在260nm、280nm和33nm测量(参看有机化学光谱方法“Spectroscopic methods in organic chemistry，3′d ed.，p31”，D.H.Williams and I.Fleming，McGraw-Hill(UK)1980)。简言之，将AQ-PS溶解在超纯水中到0.5毫克/毫升的最终浓度。在200至400nm，以单独的超纯水作为参比而测量UV光谱。图10显示出衍生自鼠伤寒沙门氏菌的AQ-PS的典型UV光谱，图11显示出衍生自猪霍乱沙门氏菌的AQ-PS的典型UV光谱。

实施例12H-βAla-βAla-(CH₂)₃-NHCO-AQ  HCl对衍生自鼠伤寒沙门氏菌的PS的接合

制备下列偶合缓冲液和新鲜制备的药剂溶液：溶液1：1mM N-羟基丁二酰亚胺在DMSO中(6毫克N-羟基丁二酰亚胺溶在50毫升DMSO中)溶液2：2mM WSC在超纯水中(10毫克WSC溶在25毫升水中)。溶液3：2mM报道基因在超纯水中(对于H-βAla-βAla-(CH₂)₃-NHCO-AQHCl，系将24毫克溶在25毫升水中)缓冲液：碳酸氢钠缓冲液，pH8.0(将碳酸氢钠(8.4克)溶在超纯水中并用1M HCl水溶液将pH调到8.0)。

称取衍生自鼠伤寒沙门氏菌的PS(50毫克)到一圆底烧瓶内。加入溶液1(3.13毫升)接着添加溶液2(1.56毫升)、溶液3(1.56毫升)然后缓冲液(6.25毫升)。将所得透明溶液置于4℃下搅拌整个晚上。随后将反应混合物置于4℃下针对超纯水透析3天，每天更换超纯水，且于最后冷冻干燥一天而得白色固体PS-AQ偶联物。该制备物也可能包括AQ-LPS偶联物，决定于PS制备物中所含完整LPS的量。产率：83％；UV分析：A(260nm)：1.11；A(280nm)：0.57；A(330nm)：0.17。

实施例12aH-βAla-βAla-(CH₂)₃-NHCO-AQ HCl对衍生自胸膜肺炎放线杆菌血清型5b的PS的接合。

溶液1至3皆为实施例12中所述者。

称取衍生自胸膜肺炎放线杆菌5b(App5b)的PS(2毫克，0.025毫摩尔-得自实施例10)到一圆底烧瓶内。加入溶液1(0.125毫升)，接着添加溶液2(0.063毫升)、溶液3(0.063毫升)然后缓冲液(0.25毫升)。将所得透明溶液置于4℃下搅拌整个晚上。随后将所得反应混合物针对超纯水透析3天，每天更换一次超纯水。将该PS-AQ溶液冷冻干燥一天，由是得到白色固体PS-AQ偶联物。该制备也可能包括有少量的AQ-LPS偶联物，决定于PS制备物中完整LPS的含量。

实施例13H-βAla-βAla-(CH₂)₃-NHCO-AQ HCl对衍生自猪霍乱沙门氏菌的PS的接合

称取衍生自猪霍乱沙门氏菌的PS(50毫克)到一圆底烧瓶内。加入溶液1(3.13毫升)，接着加入溶液2(1.56毫升)、溶液3(1.56毫升)然后缓冲液(6.25毫升)。将所得透明溶液置于4℃下搅拌整个晚上。随后将反应混合物在4℃下针对超纯水透析三天，每天更换超纯水，且于最后予以冷冻干燥一天而得白色固体PS-AQ偶联物。该制备物可能也包括AQ-LPS偶联物，决定于PS制备物中完整LPS的含量。产率：66％；UV分析：A(260nm)：1.29；A(280nm)：0.58；A(330nm)：0.15。

实施例14H-βAla-βAla-(CH₂)₃-NHCO-AQ HCl对衍生自婴儿沙门氏菌的PS之接合

称取衍生自婴儿沙门氏菌的PS(2毫克)到一圆底烧瓶内。加入溶液1(0.125毫升)，接着添加溶液2(0.063毫升)、溶液3(0.063毫升)然后缓冲液(0.25毫升)。将所得透明溶液置于4℃下搅拌整个晚上。随后将反应混合物在4℃下针对超纯水透析三天，每天更换超纯水，且于最后冷冻干燥一天而得白色固体PS-AQ偶联物。该制备物也可能包括AQ-LPS偶联物，决定于该PS制备物中完整LPS的含量。

实施例15AQ-PS的SDS-PAGE分析

可以使用银染检视的SDS-PAGE来分析AQ-PS偶联物中的AQ-LPS偶联物含量。该AQ-PS制备物是实施例3中所述以SDS-PAGE予以检测的。图12显示出两种猪霍乱沙门氏菌AQ-PS制备物的典型结果。

实施例16AQ-PS和AQ-LPS中免疫原性抗原决定部位的竞争性ELISA测定

不同的AQ-PS或AQ-LPS制备物中完整免疫原性抗原决定部位的存在可以用竞争性ELISA在LPS-涂覆微型板上测定。因此，不同的AQ-PS/AQ-LPS制备物基本上按实施例5中所述，经过将二倍稀释率系列的AQ-PS/AQ-LPS与测定抗体一起温浸而进行检测。该板按实施例5中所述予以处理和读取。此分析的结果为将递增量的AQ-PS加到诸板上会导致因所加入的AQ-PS对于抗体的增加竞争所致信号的递减。此结果显示出AQ-PS内仍然保存着LPS和PS的抗原性。

实施例17AQ-PS和AQ-LPS对聚苯乙烯微型板的光化学偶合，适用程序

将经冷冻干燥的AQ-PS/AQ-LPS偶联物溶解在超纯水中到1毫克/毫升的最终浓度。这些偶联物储液于保存在4℃下，没有直接光照之下具有长期安定性(大于3个月)。于光偶合之前，将该储液在0.1M MgCl₂去矿质水溶液中稀释。对于每一应用(实施例18和19)必须个别地决定每一种个别偶联物的最终最适浓度，光偶合中的pH及无机盐的存在。非常稀的光偶合溶液必须小心地避免直接日光。将稀释过的偶联物溶液加到聚苯乙烯微型板的每一洞(100微升/洞)。将该板置于恰当的UV光源下并随即用UV光照射20分钟。建议的UV-光源为Philips HPA 400(该灯发射出主要在310与400nm之间的低能量UV-A和UV-B光(WO 96/31557))或Philips25W-S萤光管，其发射出在310与400nm之间的UV光，最大输出是在345nm。UV照射的最适条件以及照射时间(参看实施例20)必须根据所用的UV-光源和设备予以最适化。于UV-照射之后，将该板抽吸，用去矿质水洗清(3×300微升)且最后置于37℃下干燥30分钟。干燥板必须保持于室温黑暗中。

实施例18AQ-PS/AQ-LPS偶联物浓度对光偶合效率的影响

将得自鼠伤寒沙门氏菌或猪霍乱沙门氏菌的AQ-PS/AQ-LPS偶联物以不同的浓度固化到微型板上，以测定UV照射对固定化该等偶联物的效率。

制备衍生自鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的AQ-PS/AQ-LPS储液，如实施例17中所述，在单个管内将每一偶联物稀释到1000、750、500、250和100毫微克/毫升鼠伤寒沙门氏菌及1000、750、500、250和100毫微克/毫升猪霍乱沙门氏菌的最终浓度。使用0.1M MgCl₂阴性对照。将5种个别的鼠伤寒沙门氏菌偶联物溶液加到聚苯乙烯微型板的列1-2、3-4、5-6、7-8和9-10(100微升/洞)，并将0.1MMgCl₂加到列11-12。将该等微型板置于UV-光源之下并予以照射20分钟。在UV-照射之后，将诸板抽吸，用去矿质水洗涤(4×300微升)并于没有干燥之下直接检定。于行A-B的每一洞中加入在PBS，Tween，BSA中稀释(1∶400)的鼠伤寒沙门氏菌阳性对照猪血清，并于第一板的行C-D的每一洞加入在PBS，Tween，BSA中稀释(1∶400)的鼠伤寒沙门氏菌阴性对照猪血清(100微升/洞)。于第二板的行A-B的每一洞内加入在PBS，Tween，BSA中稀释(1∶400)的猪霍乱沙门氏菌阳性对照猪血清，且在行C-D中的每一洞内加入在PBS，Tween，BSA中稀释(1∶400)的猪霍乱沙门氏菌阴性猪血清(100微升/洞)。于温和搅动下在室温中温浸60分钟，抽吸并用PBS-Tween洗所有的洞(3×300微升)。于每一洞中加入在PBS，Tween，BSA中稀释(1∶2000)的HRP-标记兔子抗-猪IgG(DAKO PO164)。在室温下温和搅动温浸60分钟，洗诸洞并于该板的每一洞中加入OPD-底物溶液(100微升/洞)。将该板置于黑暗中温浸20分钟并经由添加0.5M H₂SO₄(100微升/洞)停止酶反应。于492nm下在ELISA读取器上读取其结果。

图15显示出使用衍生自鼠伤寒沙门氏菌衍生的AQ-PS所得典型结果且第16图显示出衍生自猪霍乱沙门氏菌的AQ-PS所得典型结果。

实施例19无机盐和pH值对于AQ-PS/AQ-LPS偶联物的光偶合效率的影响

使用去矿质水制备下列缓冲液和盐溶液：0.1M NaCl、0.1M KCl、0.1M LiCl、0.1M MgCl₂和PBS pH 7.2。依实施例17中所述制备衍生自鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的AQ-PS偶联物的储液，并将每一种偶联物稀释到个别管子内，管内装有不同的缓冲液和盐溶液，到最终浓度为5微克/毫升鼠伤寒沙门氏菌及10微克/毫升猪霍乱沙门氏菌。作为参考，制备两种偶联物在去矿质水中的溶液作为对照。将个别的鼠伤寒沙门氏菌偶联物溶液加到聚苯乙烯微型板的1-6列(100微升/洞)并将猪霍乱沙门氏菌偶联物加到7-12列(100微升/洞)。将该微型板置于UV-光源下并照射20分钟。于UV照射之后，抽吸该板，用去矿质水洗涤(4×300微升)并在没有干燥下直接检定。于行A1-C6的每一洞中加入在PBS，Tween，BSA中稀释(1∶400)的鼠伤寒沙门氏菌阳性对照猪血清，于行D1-F6的每一洞中加入在PBS，Tween，BSA内稀释(1∶400)的鼠伤寒沙门氏菌阴性对照猪血清，于行A7-C12的每一洞中加入在PBS，Tween，BSA中稀释(1∶400)猪霍乱沙门氏菌阳性对照猪血清，在行D7-F12的每一洞中加入在PBS，Tween，BSA中稀释(1∶400)的猪霍乱沙门氏菌阴性对照猪血清，及在G行和H行中加入单独的PBS，Tween，BSA(100微升/洞)。在室温及温和搅动下温浸60分钟，抽吸及用PBS-Tween洗所有的洞(3×300微升)。并于A1至G12的每一洞中加入在PBS，Tween，BSA中稀释(1∶2000)的HRP-标记兔子抗猪IgG(DAKO PO164)。在室温及温和搅动下温浸60分钟，抽吸诸洞并于板的每一洞中加入OPD-底物溶液(100微升/洞)。将该板置于黑暗中温浸20分钟并经由添加0.5M H₂SO₄(100微升/洞)以停止酶反应。在ELISA读取器上在492nm读取结果。图17显示出使用得自鼠伤寒沙门氏菌的AQ-PS所得典型结果，而图18显示出使用衍生自猪霍乱沙门氏菌的AQ-PS所得典型结果。

实施例20照射时间对于AQ-PS/AQ-LPS偶联物光偶合效率之影响

将得自鼠伤寒沙门氏菌或猪霍乱沙门氏菌的AQ-PS/AQ-LPS固定化在微型板上以测定固定化该等偶联物的UV照射时间。

将板上加入AQ-PS/AQ-LPS偶联物(鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌)稀释在0.1M MgCl₂中所得稀溶液。作为阴性对照者，在板上加入0.1M MgCl₂。对该板(诸条)UV照射不同的时段。在UV-照射之后，用去矿质水洗该板(4×300微升)并在没有加以干燥下即直接进行检定。于板上加入在PBS-Tween中稀释(1∶400)的鼠伤寒沙门氏菌阳性猪血清和猪霍乱沙门氏菌阳性猪血清(100微升/洞)。将该板于室温及温和搅动下温浸60分钟。用PBST洗该板3次(300微升/洞)。于板中加入在PBST中稀释1∶2000，作为次级抗体的兔子抗-小鼠Ig接合HRP(PO260，Dako)。将该板于搅动下温浸1小时。用PBST(300微升/洞)洗该板三次。于板中加入OPD-H₂O₂溶液(100微升/洞)。将该板置于黑暗中温浸20分钟。经由添加0.5M硫酸(100微升/洞)停止酶反应。在一ELISA读取器中，于492nm读取该板。

图19显示出衍生自鼠伤寒沙门氏菌的AQ-PS偶联物和衍生自猪霍乱沙门氏菌的AQ-PS偶联物所得典型结果。

实施例21在经光偶合的衍生自鼠伤寒沙门氏菌的AQ-PS上进行猪血清的血清学检验

将得自鼠伤寒沙门氏菌且经接合到AQ的PS以下面的方法固定化在聚苯乙烯微型板上。将鼠伤寒沙门氏菌PS-AQ偶联物溶解在超纯水中。该溶液必须避光。取一液份的鼠伤寒沙门氏菌PS-AQ偶联物溶液在0.1M MgCl₂中进一步稀释，以期得到最适浓度。将该鼠伤寒沙门氏菌PS-AQ的稀溶液加到微型板上(100微升/洞)。用UV光照射该等板20分钟。于照射之后，用下面的程序洗诸板。丢弃鼠伤寒沙门氏菌PS-AQ偶联物溶液并用洗器加入300微升水。随后将该等微型板用水洗三次(3×300微升)。将该等板置于37℃下干燥30分钟。使该等微型板在室温中平衡15分钟后包装起来供未来使用。这个板必须保存在室温下。供血清学用途所用时，系研究得自猪的血清及/或肉汁。所用的ELISA程序为下面所述之间接ELISAO一恰当的参比血清组，也在每一板上平行于检体样品进行检验。于每一洞中加入在PBS，Tween，BSA中稀释的检体样品或参比血清(100微升/洞)。将该板在温和搅动下温浸一小时。用PBS，Tween(3×300微升)洗该板。于每一洞中加入在PBS，Tween，BSA中稀释的经接合到HRP的次级抗体(兔子抗-猪IgG HRP，PO164，Dako)(100微升/洞)。将该板于温和搅动下温浸一小时。用PBS，Tween(3×300微升)洗该板。于板中加入OPD溶液(100微升/洞)。将该板温浸20至25分钟，依对照样如何快速到达恰当OD值而定。经由添加100微升0.5M硫酸以停止酶反应。将该板以手摇动后在ELISA读器上于492nm下读取。

其结果经显示在图20中。如在该图中可看出者，血清1-5为沙门氏菌阴性而血清6-15为鼠伤寒沙门氏菌阳性。

实施例24使用经共价键偶合的脂多醣多醣：一种经偶合的沙门氏菌多醣之混合物—进进行

血清学检验

于一比较实验中用鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌多醣混合物按上文所述涂覆诸板(共价键混合-ELISA)，并与经传统方式用得自两相同沙门氏菌血清型的整个LPS涂覆的板相比较(“混合-ELISA”(Nielsen 1995))。使用四种鼠伤寒沙门氏菌阳性血清。二种婴儿沙门氏菌阳性血清及一种沙门氏菌阴性血清作为参比，血清以完全按照先前所述(Nielsen 1995)核准来自每一ELISA板面OD读值，如下文所述者。共价键混合一ELISA是依先前公开的混合一ELISA方案实施(Nielsen etal.1995)，不同处在于省略其中的阻断步骤(用牛血清白蛋白，BSA)。血清在PBS，Tween，BSA中稀释。施加100微升的每一种血清的二重复样，并在室温搅动下温浸1小时。然后用PBST洗诸板三次，且随后与在PBS，Tween，BSA中稀释1∶3000的HRP一接合兔子抗猪IgG(PO164，DAKO)在室温下温浸一小时。然后同上述般洗诸板，于每一洞中添加100微升OPD底物溶液，并温浸10至15分钟。用100微升H₂SO₄停止反应，并在490nm读取光密度，减去650nm光密度(背景校正)。

要检验该AQ-PS-涂覆板时，使用具有已知的在混合-ELISA中的反应的一组20种血清(得自多群的猪之20种血清)。图21显示出具型结果。在使用10OD％截止值时，于分别在AQ-PS-ELISA和混合-ELISA中检验中所有的血清都保持在相同的阳性组或阴性组之内。具有低反应性的样品之OD-水平都与这两系统有良好的关联。对于阳性样品，在AQ-PS-ELISA中，某些样品有稍微减低，不过此项特性每天都有变异。

实施例25衍生自鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的光偶合混合AQ-PS之再现性

AQ-PS固定化微型板的再现性已被研究有一颇长时间。微型板按上文所述用混合的衍生自鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的AQ-PS予以固定化。于每一板上以16重复方式加入参比血清。此程序经由在四板上重复一段4天。其结果经相对于对照参比血清予以标准化。板内变异经测量为7.7％，而板间变异经测量为5.1％。

实施例26衍生自鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的光偶合混合AQ-PS之储存稳定性

鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌混合AQ-PS ELISA板的储存稳定性为一项待研究的重要因素。长期贮存稳定性可提供与使用前的涂覆程序不相关的板且可提供在相同批内及不同批之间有最小变异性的板。PS-AQ固定化微型板的稳定性已被研究一段数月期间。板像按实施例23中所述制得，并在室温黑暗中贮存，然后使用一组针对鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌在PS/LPS中的O-抗原之参比血清检试诸板一段71天的期间。其结果可在图22中看出。如在图22中所见，诸板可以稳定至少71天。

实施例27使用以衍生自鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的光偶合混合AQ-PS为基础之血

清学检验测定猪群的感染水平

对经用衍生自鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的混合AQ-PS予以光偶合的微型板进行血清学用途的探讨。对于猪群的血清学普查，为达到具有最小变异的标准化微型板，以期在每一检定中达到可靠且具再现性的反应是非常重要的。要得到此结果，必须制得具有前述品质的板。

使用实施例26所述光偶合鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌PS混合物探讨一组来自59种习用猪群的血清(每一群10血清)。将此分析的结果相对于使用来自两相同沙门氏菌的LPS以传统方式涂覆“混合-ELISA”(Nielsen，1995)，对相同样品所得分析结果相比较。猪群是根据Mix-ELISA及Danish沙门氏菌普查程序的原理予以分类为具有低沙门氏菌普通性(Mousing J.，Jensen PT，Halgaard C.，Bager F，Feed N，Nielsen B，Nielsen JP，Bech-Nielsen S：1997，Nation-wide Salmonella entericasurveillance and Control in Danish，slaughter swine herds.Prev.Vet.Med.29：247-261)。

所用的ELISA程序为如下述的间接ELISA。于每一板上与样品平行地检验一恰当的参比血清组。将经在PBS，Tween，BSA中稀释的检体样品或参比血清(100微克/洞)加到每一洞中。将该板温浸一小时(温浸过程使用的搅动可增强在阳性与阴性样品之间的P/N比)。用PBS，Tween洗该板(3×300微升)。于每一洞中加入在PBS，Tween，BSA中稀释(1∶2000)的二级抗体接合HRP(兔子抗-猪IgG HRP，PO164，Dako)。将该板于温和搅动下温浸一小时。用PBS，Tween洗该板(3×300微升)。于该板中加入OPD溶液(100微升/洞)。将该板温浸20至25分钟，取决于对照样如何快速达到恰当OD值。经由添加100微升0.5M硫酸停止酶反应。将该板以人工摇动后在一ELISA读器上于492nm读取。

在590样品中只有4样品于光偶合检定中显示出阳性，保持所有群的分类为低沙门氏菌普遍性，也如同用传统“混合-ELISA”所发现的那样。

实施例28使用以衍生自鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的光偶合混合AQ-PS为基础的竞

争性ELISA检验测定鼠伤寒沙门氏菌

用衍生自鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的混合AQ-PS，予以光偶合的微型板可以用为抗原ELISA以测定沙门氏菌细菌或沙门氏菌抗原。在食品或环境中的沙门氏菌细菌的测定具有很大的潜在性。沙门氏菌细菌的测定可经由使用光偶合混合AQ-PS鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌作为竞争性ELISA按下面的程序完成。

将细菌样品以两倍稀释率，在PBS中稀释后加到板上(50微升/洞)。于板上添加在PBS，Tween，BSA中稀释，斜对相关的沙门氏菌血清型的单株抗体(50微升/洞)。作为阴性对照样者为将该单株抗体加到只装PBS的洞中。有关阳性对照，将PBS，Tween，BSA加到装PBS的洞中。将该板于温和搅动下温浸一小时。用PBS，Tween洗该板(3×300微升)。于每一洞中加入在PBS，Tween，BSA中稀释，经偶合到HRP的二级抗体(兔子抗-小鼠IgG HRP，PO260，Dako)(100微升/洞)。使用搅动将该板温浸一小时。用PBS，Tween洗该板(3×300微升)，于每次洗涤中要确定所有的洞都有填充掉。于该板中添加OPD溶液(100微升/洞)。将该板温浸20至25分钟，取决于对照样如何快速到达恰当OD值。添加100微升0.5M硫酸停止酶反应。将该板以人工摇动并在ELISA读器上于492nm读取。有单株抗体的洞是ULl00％反应率计算的。装PBS，Tween，BSA的洞是以0％反应率计算的。装细菌样品的洞所得OD反应是相对于阳性对照和阴性对照样进行计算的。反应的减低正比于样品的阳性递增。从滴定曲线可计算出滴定度(titre)。滴定度为可导致相对于没有竞争性抗原所得OD-值(100％反应)时有50％OD值减低的细菌溶液稀释倍数。

实施例29生物素对衍生自鼠伤寒沙门氏菌的PS的接合

制备下列偶合缓冲液及新制备的药剂溶液：溶液1：lmM N-羟基丁二酰亚胺，在DMSO中(6毫克N-羟基丁二酰亚胺溶解在

50毫升DMSO中)。溶液2：2mM WSC，在超纯水中(9.6毫克WSC溶解于25毫升水中)。溶液3：2mM生物素-胺，于超纯水中(19毫克溶于25毫升水中)。缓冲液：碳酸氢钠缓冲液，pH 8.0(将碳酸氢钠(8.4克)溶解在超纯水中并用1M HCl

水溶液将pH调到8.0)。

将所得透明溶液置于4℃下搅拌整个晚上。随后将反应混合物针对超纯水透析三天，每天更换超纯水。最后将PS-生物素偶联物冷冻干燥整个晚上。将经冷冻干燥的PS-生物素偶联物溶解在超纯水中到1毫克/毫升的最终浓度。此PS-生物素偶联物储液于储存在4℃下避免直接光照时具有长期稳定性(大于3个月)。将该储液稀释在PBS pH 7.2中，1∶100和1∶400。将经稀释的PS-生物素溶液加到有涂覆着链霉抗生物素蛋白(Pierce)的微型板(100微升/洞)。作为对照，将稀PS溶液(1∶100和1∶400，在PBS中)加到微型板(100微升/洞)。将该板搅动温浸一小时。用PBST洗该板3次(300微升/洞)。将对抗鼠伤寒沙门氏菌LPS(O-链)的单株抗体(S9，Hy Test Ltd.)以两倍稀释率(稀释在PBST中)加到板上(100微升/洞)。将该板搅动温浸一小时。用PBST(300微升/洞)洗该板三次。将在PBST中稀释1∶2000的二级抗体，接合到HRP的兔子抗-小鼠Ig(PO 200，Dako)加到板上。将该板搅动温浸一小时。用PBST(300微升/洞)洗该板3次。于板中加入OPD-H₂O₂溶液(100微升/洞)。将该板置于黑暗中温浸20分钟。经由添加0.5M硫酸停止酶反应(100微升/洞)。于一ELISA读器中在492nm读取该板。其结果示于图23中。从图23可以看出生物素接合PS可以结合到链霉抗生物素蛋白板上。

实施例30使用经共价键偶合脂多醣多醣的临床检验：经偶合的胸膜肺炎放线杆菌血清型5b

多醣

将如上文所述从胸膜肺炎放线杆菌血清型5b(App 5b)衍生的多醣(实施例10)按实施例12a中对沙门氏菌PS所述者用AQ予以衍化，且随后按前文所述(实施例17)偶合到得自Nunc的Poly Sorp免疫板。将该微滴板与App 5b PS-AQ偶联物以500毫微克到0.98毫微克PS-AQ/洞中的两倍稀释率分别共价偶合。于诸板上施加在PBS-T中稀释1∶400的阳性和阴性针对App 5b的血清。将诸板温浸1小时。用PBS-T洗诸板3次并随后与二级抗体(兔子抗-猪Ig HRP-接合)一起温浸。诸板经温浸1小时后，用PBS-T洗三次。用OPD将诸板显像。

其结果显示在图24中。该图证明胸膜肺炎放线杆菌血清型5b脂多醣衍生出的多醣可以接合到AQ并共价偶合到微型板表面。由于经PS-AQ抗原涂覆的板显示出与经LPS被动涂覆的板相似的反应，得知抗原性有保留下来。放线杆菌为HAP族的革兰氏阴性菌，因而在生物分类学上与沙门氏菌株没有密切关联。此点显示来自一般革兰氏阴性菌的LPS都可成功地转换为PS-AQ偶联物。

实施例31使用经共价偶合的脂多醣多醣进行的临床检验：偶合胸膜肺炎放线杆菌血清型6

多醣

将依上文所述(实施例10)从胸膜肺炎放线杆菌衍生所得多醣按实施例12至13中对沙门氏菌PS所述说者用AQ予以衍化并随后按上文所述偶合到得自Nunc的Poly Sorp免疫板(实施例17)。将此表面相对于经由得自相同胸膜肺炎放线杆菌(Ap)的完全LPS吸附而制得的传统表面，在使用多株抗体作为测定抗体，并用明确的猪血清予以阻断的竞争型ELISA中进行比较。简言之，该ELISA依下述实施的：经由在ELISA板中以棋盘式滴定定出Ap6 LPS抗原，血清和酶偶联物等的最适浓度。使用在PBS中稀释1∶10000的LPS涂覆微型板并在4℃下温浸整个晚上。用含0.05％Tween 20和1％牛血清白蛋白的PBS(PBS，T，BSA)在室温(RT)下阻断诸板30分钟。将检验血清用PBS，T，BSA稀释1∶10并以重复方式加到洞内，再于室温下温浸1小时。在不将诸板排空之下，在室温下加入稀释1∶8000的兔子血清30分钟。其后，用在PBS，T，BSA中稀释1∶1000的过氧化酶-接合猪抗-兔子免疫球蛋白(Dako，Copenhagen，Denmark)与该板温浸。使底物-染料溶液邻-苯二胺-H₂O₂反应15分钟后，经由添加0.5M H₂SO₄停止反应。测量490nm光密度而以650nm作为参比。使用含有PBS，T，BSA而没有血清的行所得光密度来计算个别血清的百分抑制率。将试验血清与兔子血清的稀释率和温浸时间予以调整，使阴性血清有0至25％抑制率，并且使阳性血清有80至100％抑制率。

其结果经预期可显示出Ap-衍生的多醣可以共价键地偶合到微型板的表面同时保持住其抗原性，且显示出相对于传统非共价键结涂覆整个LPS者相称或甚至较好的阻断行为。

实施例32H₂N-(CH₂)₃-NHCO-AQ-HCl对KDO的接合

将KDO(10毫克，40微摩尔)，H₂N-(CH₂)₃-NHCO-AQ-HCl(7毫克，20微摩尔)和BOP(21毫克，48微摩尔)溶解在DMSO中。然后，加入三乙胺(17微升，120微摩尔)，并在室温下搅拌该透明溶液60小时。将水(40毫升)加到反应混合物中，接着予以冷冻干燥。将固体产物混合物再溶解/再悬浮于水(1毫升)中，并加到事先用乙氰(7毫升)和水(7毫升)平衡过的Sepp Pak C18管柱(1毫升)上。用水(10毫升)，接着用水/乙氰(10毫升，1∶1 V/V)溶析该管柱。第一份水液份主要含有剩余的KDO和其它杂质，而第二份的水/乙氰液份含有AQ-KDO偶联物。TLC(1-丁醇/乙酸/水4∶1∶1)：Rf＝0.33 MS(MALDI-TOF)：545.8(MH⁺+H₂O)。实施例33使用AQ-PS固定化微型板建立用以估计特定细菌的数目，细菌的血清型测定或抗

原(LPS/PS)测定方法。

将细菌溶液或抗原溶液(LPS/PS)以二倍稀释率加到诸板上(50微升/洞)。将在PBS，Tween，BSA中稀释的抗鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌的单株抗体加到诸板上(50微升/洞)。将该板在温和搅动下温浸一小时。用PBS，Tween(300微升/洞)洗该板3次。将在PBS，Tween，BSA中稀释的经接合到HRP的兔子抗-小鼠IgG(PO 260，Dako)加到板上(100微升/洞)。于温和搅动下温浸该板一小时。用PBS，Tween(300微升/洞)洗该板3次。于该板中加入OPD-溶液(100微升/洞)。将该板置于黑暗中温浸20分钟。添加0.5M H₂SO₄(100微升/洞)停止反应。将该板在ELISA读器中于492nm读取。此方法可用来测定在生物体液中的少量细菌，且可提供细菌血清型的测定。

Claims (46)

1.一种将多醣(PS)固化一固体表面的方法，该多醣具有酮基-羧基(-C(＝O)-COOH)或其对应的缩酮基或半缩酮基，该方法包括下列诸步骤：

a)在该多醣的羧基与一报道基因分子(RM)之间形成共价键，进而形成一多醣-报道基因分子偶联物(PS-RM)，该报道基因分子包括一识别/底物部位；及

b)经在该报道基因分子的识别/底物部位与该固体表面的收受/药剂部位之间形成的特异性键固化该多醣-报道基因分子偶联物(PS-RM)。

2.一种将一多醣(PS)固化到一固体表面的方法，该多醣具有一酮基-羧基(-C(＝O)-COOH)或其对应的缩酮或半缩酮基，该方法包括在该多醣的羧基与连接到该固体表面的化学官能基团之间形成一共价键。

3.如权利要求1或2所述的方法，其多醣的酮基-羧基为该多醣的KDO(2-酮基-3-去氧-D-甘露辛酮糖酸)单醣单位的一部份。

4.如前述任何一项权利要求所述的方法，其中该多醣(PS)实质地等同于革兰氏阴性细菌脂多醣(LPS)的碳水化合物部份。

5.如权利要求4所述的方法，其中该多醣经由在革兰氏阴性细菌脂多醣的内核部份与脂质A部份之间的缩酮键予以选择性水解而得。

6.如权利要求1或3所述的方法，其中该多醣还包括革兰氏阴性细菌脂多醣的酯质部份，从而构成细菌脂多醣。

7.如权利要求4至6项中任一项所述的方法，其中该细菌脂多醣衍生自人类或动物致病原的革兰氏阴性细菌选出的细菌，例如肠细菌，呼吸道细菌，泌尿生殖器细菌和神经病原性细菌。

8.如权利要求7所述的方法，其中该细菌为动物病原性或染自动物性细菌，包括选自下列之中的肠细菌：大肠杆菌(Escherichia coli)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)，猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)，肠沙门氏菌(Salmonella enterica)，和它们的所有血清型，尤其是鼠伤寒沙门氏菌，肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)，猪霍乱沙门氏菌，曼哈顿沙门氏菌(Salmonella manhatten)，都柏林沙门氏菌(Salmonella dublin)，婴儿沙门氏菌(Salmonella infantis)，大肠杆菌种，包括O157，引起水肿疾病的大肠杆菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)，和空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejune)。

9.如权利要求7所述的方法，其中该细菌为选自HAP细菌组合中的呼吸道细菌，特别是放线杆菌属，尤其是HAP细菌：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)，睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)，溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)，多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)，副猪嗜血菌(Haemophrlus parasuis)及Mannheimia sp.。

10.如权利要求1或2所述的方法，其中该多醣具有至少1000的分子量。

11.如权利要求1和3至10项中任一项所述的方法，其中使用偶合剂介导在多醣与该报道基因分子之间形成共价键。

12.如权利要求2至10项中任一项所述的方法，其中使用偶合剂介导在该多醣与该固体表面所含化学官能基之间形成共价键。

13.如权利要求1和3至11项中任一项所述的方法，其中该报道基因分子包括用以呈现该识别/底物部位的报道基因部份及一用以将该报道基因部份连接到该多醣的连接体部份。

14.如权利要求13所述的方法，其中该多醣-报道基因分子偶联物(PS-RM)具有通式PS′-C-(＝O)-N(R^N)-F-L-R，其中PS′-C(＝O)为该多醣，N(R^N)-F为直接涉及在该多醣与该报道基因分子之间的共价键联中的基团，R^N为氢或C_1-4-烷基，L为报道基因分子的连接体部份，且R为该报道基因分子的报道基因部份。

15.如权利要求14所述的方法，其中-N-F-表示氨基(-N-)，苯胺基(-N-Ph)，酰肼基(-N-C(＝D)-)，脲氨基(-N-C(＝O)-NH-)，硫代脲氨基(-N-C(＝S)-NH-)，或肼基(-N-NH-)，优选的是为氨基。

16.如权利要求14所述的方法，其中L表示选自下列的双基：C_1-20-亚烷基，其选择性地包括芳族或单-/多-不饱和烃或环状烃；低聚氧化乙烯，低聚酰胺例如低聚甘氨酸，低聚丙氨酸，低聚赖氨酸和一般的低聚肽类，低聚-磷酸二酯，低聚磷酸-酰胺酸酯，低聚-磷酸-二酰胺，低聚磺酸酯，及低聚-磺酰胺。

17.如权利要求第1和3至16项中任一项所述的方法，其中该报道基因分子具有最高10,000，优选的是最高5,000，特别者最高2,500的分子量。

18.如权利要求14所述的方法，其中该报道基因部份为一光化学反应性基团。

19.如权利要求14所述的方法，其中该报道基因部份为一热化学反应性基团。

20.如权利要求14所述的方法，其中该报道基因部份为一亲和配对中的一部份。

21.如前述任何一项权利要求所述的方法，其中所述的固体表面为有机聚合物，玻璃，硅，氧化硅(硅土)或它们的复合材料的表面。

22.如前述任何一项权利要求所述的方法，其中将两种或多种多醣固定化，此处该等类别代表不同的细菌血清型。

23.如权利要求4至22项中任一项所述的方法，其中衍生PS所用的LPS为得自沙门氏菌的LPS，且该报道基因分子包括选自蒽醌和生物素，优选的为蒽醌的报道基因部份。

24.如权利要求4至22项中任一项所述的方法，其中衍生PS所用的LPS为得自放线杆菌的LPS，且该报道基因分子包括选自蒽醌和生物素，优选的为蒽醌的的报道基因部份。

25.经权利要求1至24项中任一项所述的方法得到一种固体表面。

26.如权利要求25所述的固体表面，它用于诊断检定。

27.如权利要求26所述的固体表面，其中该诊断检定为固相免疫检定。

28.如权利要求26所述的固体表面，其中该诊断检定为一种血清学检定，例如用以测定抗微生物的抗体的血清学检定。

29.如权利要求26所述的固体表面，其中该诊断检定为一种用以测定抗沙门氏菌种的抗体的血清学检定。

30.如权利要求26所述的固体表面，其中该诊断检定是一种用以测定抗放线杆菌种的抗体的血清学检定。

31.一种测定抗一或多种革兰氏阴性菌的抗体所用的检定装置，包括一固体表面，其上具有经固定化的多醣(PS)，该多醣(PS)是对应于该革兰氏阴性菌所含细菌脂多醣(LPS)的碳水化合物部份，该固化是透过该多醣所含KDO单醣单位的羧酸基而完成的。

32.如权利要求31所述的检定装置，其中该多醣是根据权利要求1至24项中任一项所述方法固化到该固体表面。

33.一种估计样品中细菌数目或对细菌抗原测定血清型的方法，该样品包括整个细菌，其部份体或溶裂物，该方法是使用如权利要求31或32所述的检定装置。

34.一种通式I化合物

(或，当R²为氢时，可选用其酮基类似物)其中

R¹选自氢和报道基因分子L-R，其中L为该报道基因分子的选用的连接体部份，且R为该报道基因分子的报道基因部份；

R^N选自氢和C_1-4烷基；

F选自下列的单键，伸苯基，羰基(C(＝O))，羰基亚胺基(C(＝O)-NH-)，硫羰基(C(＝S))和亚胺基(-NH-)；

R²，R⁷，R⁸各独立地选自氢和羟基保护基；

R⁴为选自氢，单-或双-醣残基和羟基保护基；且

R⁵为选自下列的氢，一“选择性保护官能基团的多醣残基”和羟基保护基。

35.如权利要求34所述的化合物，其中R¹为氢。

36.如权利要求34所述的化合物，其中R¹为L-R。

37.如权利要求34所述的化合物，其中-N-F-表示氨基(-N-)，苯胺基(-N-Ph-)，酰肼基(-N-C(＝O)-)，脲氨基(-N-C(＝O)-NH-)，硫代脲氨基(-N-C(＝S)-NH-)，或肼基(-N-NH-)，优选的是为氨基。

38.如权利要求34所述的化合物，其中L表示如权利要求16中定义的双基。

39.如权利要求36所述的化合物，其中该报道基因分子(R)具有最高10,000，优选的是最高5,000，且最佳者最高2,500的分子量。

40.如权利要求34所述的化合物，其中R⁴选自下列的KDO-2-基，4-磷酸-乙醇胺-KDO-2-基，L-鼠李糖基-(1→4)-KDO-2-基，和KDO-(2→4)-KDO-2-基。

41.如权利要求34所述的化合物，其中该多醣残基优选的是包括2-997个经连接的单醣单位，例如至少7个，如7-997个经连接的单醣单位，特别者至少22个，如22-497个经连接的单醣单位，它们的多醣残基可选择性地经非化学计量地取代。

42.一种如权利要求34所述的化合物，在用以制备测定抗革兰氏阴性菌的抗体用的检定装置中的应用。

43.一种如权利要求34所述的化合物，在用以制备载有固化多醣的固体表面中的应用。

44.一种制备权利要求34所述的通式I化合物的方法，其包括将通式III化合物

其中R²，R⁴，R⁵，R⁶，R⁷和R⁸皆为如权利要求34所定义，与通式IV氮化合物反应；

            H-N(R^N)-R¹                               IV

其中R¹和R^N皆为权利要求34所述的定义；及选择性地将所得产物完全或部份地解保护，以得到通式I化合物。

45.如权利要求44所述的方法，其中该通式III化合物以其活化酯的形式使用。

46.如权利要求44所述的方法，其中在该通式III羧酸化合物与该氮化合物IV之间的反应是经使用一偶合剂予以助成的。

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