CN1145639C - 呼吸道合胞体病毒亚基疫苗制剂 - Google Patents
呼吸道合胞体病毒亚基疫苗制剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1145639C CN1145639C CNB97197862XA CN97197862A CN1145639C CN 1145639 C CN1145639 C CN 1145639C CN B97197862X A CNB97197862X A CN B97197862XA CN 97197862 A CN97197862 A CN 97197862A CN 1145639 C CN1145639 C CN 1145639C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- rsv
- mixture
- feature
- kilodaltons
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 title claims abstract description 152
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 45
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 57
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 38
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 13
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims abstract description 7
- 208000030925 respiratory syncytial virus infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 14
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 14
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 9
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 7
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical group [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 7
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 5
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 claims description 4
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 4
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims description 4
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 4
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 241001559187 Human rubulavirus 2 Species 0.000 claims description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 claims 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 claims 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 abstract description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 24
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 18
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 15
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 11
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 244000309466 calf Species 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 8
- 241000144300 Peromyscus gossypinus Species 0.000 description 7
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- UNEIHNMKASENIG-UHFFFAOYSA-N para-chlorophenylpiperazine Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1N1CCNCC1 UNEIHNMKASENIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 6
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 6
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 6
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 5
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003141 anti-fusion Effects 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 4
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 3
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000220457 Crotalaria Species 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 description 1
- QTYUSOHYEPOHLV-FNORWQNLSA-N 1,3-Octadiene Chemical compound CCCC\C=C\C=C QTYUSOHYEPOHLV-FNORWQNLSA-N 0.000 description 1
- GHKCSRZBNZQHKW-UHFFFAOYSA-N 1-sulfanylethanol Chemical class CC(O)S GHKCSRZBNZQHKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical class O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 229920002729 Cinchotannic acid Polymers 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010022941 Iridocyclitis Diseases 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710175243 Major antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124679 RSV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000018569 Respiratory Tract disease Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101000654530 Tupaia virus (isolate Tupaia/Thailand/-/1986) Small hydrophobic protein Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 201000004612 anterior uveitis Diseases 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000003391 densitometric scan Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000013010 irrigating solution Substances 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010034897 lentil lectin Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- UGZADUVQMDAIAO-UHFFFAOYSA-L zinc hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Zn+2] UGZADUVQMDAIAO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910021511 zinc hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940007718 zinc hydroxide Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18521—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18551—Methods of production or purification of viral material
Abstract
用温和的去垢剂提取浓缩的病毒中的蛋白质,并将蛋白质加载到羟磷灰石或其它离子交换基质柱上,和用温和的盐处理洗脱蛋白质分离和纯化呼吸道合胞体病毒(RSV)的融合(F)蛋白,附着(G)蛋白和基质(M)蛋白。配制成免疫原性组合物的F,G和M蛋白质是安全和高度免疫原性的,能保护相关的动物模型抵抗呼吸道合胞体病毒感染引起的疾病。
Description
发明领域
本发明涉及免疫学领域,特别涉及抗呼吸道合胞体病毒感染的疫苗制剂。
参考的相关申请
本申请书是1996年7月12日递交的在审美国专利申请号08/679,061的延续部分。
发明背景
人呼吸道合胞体病毒是婴儿和少年中下呼吸道感染的主要起因(参考文献1到3-在本公开物结尾出现的表中,表中的每个参考文献引入本文作为参考文献)。全球每年发生65百万例感染(参考文献4)。在美国,一年中单单小孩有100,000人可能因为RS病毒引起的肺炎和细支气管炎需要去医院(参考文献5,6)。每年在美国提供给感染RS病毒的小孩的住院和非卧床治疗的费用超过$340百万(参考文献7)。由RS病毒感染导致的严重下呼吸道疾病主要发生在2到6个月的婴儿(参考文献8)。在美国每年大约4,000名婴儿死于感染RS病毒和丙型副流感病毒(PIV-3)引起的严重呼吸道疾病产生的并发症。世界卫生组织(WHO)和国立过敏和感染疾病研究院(NIAID)疫苗顾问委员会已经将RS病毒的疫苗开发排列在仅次于HIV的第二位。
在教科书“病毒学领域”,Fields,B.N.等人,Raven出版社,N.Y.(1996),特别是“呼吸道合胞体病毒”Collins,P.,McIntosh,K.,和Chanock,R.M.,44章,1313-1351页中已经阐明和详细叙述了RSV的结构和组成(参考文献9)。
RSV的两个主要的保护性抗原是被膜融合(F)和附着(G)糖蛋白(参考文献10)。F蛋白是作为约68千道尔顿前体分子(F0)合成的,它可以用蛋白酶水解分割成二硫键连接的F1(约48千道尔顿)和F2(约20千道尔顿)的多肽片断(参考文献11)。G蛋白质(约33千道尔顿)严重地0-糖基化,产生表观分子量约为90千道尔顿的糖蛋白(参考文献12)。已经将两个广谱的RS病毒亚型确定为A和B(参考文献13)。在这些亚型中的主要抗原差异是在G糖蛋白,而F糖蛋白是极为保守的(参考文献7,14)。
除了F和G糖蛋白产生的抗体应答,RSV产生的人细胞毒素T细胞已经显示能够识别RSV F蛋白,基质蛋白M,核蛋白N,小疏水蛋白质SH,和非结构蛋白1b(参考文献15)。
安全有效的RSV疫苗尚未得到并且急需。开发RS病毒的疫苗的途径包括用福尔马林失活病毒(参考文献16),分离冷适应和/或温度敏感的突变体病毒(参考文献17),和纯化F或G糖蛋白(参考文献18,19,20)。临床实验结果已经显示活减毒和福尔马林失活的疫苗都不能恰当保护疫苗抵抗RS病毒感染(参考文献21到23)。鼻内给药的减毒冷适应和/或温度敏感RS病毒突变体遇到的问题包括临床致病率,遗传的不稳定性和过度减毒(参考文献24到26)。皮下给药的活RS病毒疫苗也不灵验(参考文献27)。通常利用甲醛作为失活试剂制备失活的RS病毒疫苗。Murphy等人(参考文献28)已经报道了关于在用福尔马林失活的RS-病毒免疫的婴儿和小孩中的免疫应答的资料。婴儿(2到6个月)发展了对F糖蛋白的高效价抗体,但对G蛋白的应答较小。与那些在幼儿时期感染RS病毒的小孩相比,较大的小孩(7到40个月)发展了F和G抗体效价。但是,婴儿和小孩都发展了比感染天然RS病毒的同年龄的个体更低水平的中和抗体。这种不平衡的免疫应答对主要的免疫原RS病毒的F(融合)和G(附着)蛋白的高抗体效价和低中和抗体效价,部分原因是F和G糖蛋白中的重要表位由于福尔马林处理而改变。另外,一些接受福尔马林失活RS病毒疫苗的婴儿在随后与天然RS病毒接触后,与没有免疫的个体相比发展了更严重的下呼吸道疾病(参考文献22,23)。所以,福尔马林失活RS病毒疫苗已经确认为不可接受为对人使用的疫苗。
在用福尔马林失活的RS病毒免疫的棉鼠中也看到了异常免疫应答的迹象(参考文献29)。另外,在棉鼠中对RS病毒的福尔马林失活疫苗的评估显示在受到活病毒攻击时,免疫动物肺组织病理进一步发展(参考文献30)。
福尔马林失活的RS病毒疫苗制剂引起的疾病增强机制仍然有待确定,但却是有效的RS病毒疫苗的开发的主要障碍。疾病加强可能部分是由于福尔马林对F和G糖蛋白的作用。另外,有人已经提出了非RS病毒加强疾病的特异机制,其中对存在于疫苗制剂中的污染细胞或血清的成分的免疫应答可能部分地对疾病的恶化起作用(参考文献31)。确实,用HEp-2细胞溶胞物接种和受到HEp-2细胞上生长的RS病毒攻击的小鼠和棉鼠发展了提高的肺炎症应答。
另外,通过免疫亲和色谱层析,在酸性pH下洗脱纯化的RS病毒糖蛋白是免疫原性和保护性的,而且在棉鼠中诱导的免疫增强(参考文献29,32)。
显然,仍然需要免疫原制剂,包括疫苗,不仅能有效地授予对RSV引起的疾病的预防性,而且不产生不需要的副作用,如免疫增强。同时存在需要诊断RSV感染的抗原和产生抗体(包括单克隆)的免疫原,这些抗原和免疫原特异地识别RSV蛋白质,可以用于例如诊断RS病毒引起的疾病。
发明概要
本发明提供生产疫苗级细胞系呼吸道合胞体病毒(RSV),例如,VERO,MRC5或WI38细胞,从发酵罐收集物纯化病毒,从纯化的病毒提取F,G和M蛋白质,和共纯化F,G和M蛋白质的方法,但不涉及免疫亲和或小扁豆凝集素(lentil lectin)或伴刀豆球蛋白A的亲和步骤。特别是,例如在WO91/00104(1990年6月28日委派给代理人递交的美国07/773,949,它的公开物引入本文作为参考文献)中叙述的凝集素亲和方法,可以导致配体过滤到产物中。
另外,本文首次提供了共分离和共纯化RSV的F,G和M蛋白和含有RSV蛋白质的共纯化混合物的免疫原组成的方法。
共分离和共纯化的F,G和M RSV蛋白是无热原的,非免疫增强的,和基本无血清和细胞污染的。分离和纯化的蛋白质是免疫原性的,无任何感染性RSV和其它不利因素的。
因此,在本发明的一个方面中,提供了呼吸道合胞体病毒(RSV)的纯化的融合(F)蛋白,附着(G)蛋白和基质(M)蛋白的混合物。
融合(F)蛋白可以包括多聚体融合(F)蛋白,当在非还原条件下分析时,它可以包括分子量约为70千道尔顿的异二聚体和二聚体和三聚体形式。
附着(G)蛋白在非还原条件下分析时,可以包括低聚物G蛋白,分子量约为95千道尔顿的G蛋白,分子量约为55千道尔顿的G蛋白。
当在非还原条件下分析时,基质(M)蛋白可以包括分子量约为28到34千道尔顿的蛋白质。
当在还原SDS-PAGE中分析时,本文提供的蛋白质混合物包括的融合(F)蛋白含有F1,分子量约为48千道尔顿,和F2,分子量约为23千道尔顿,包括的附着(G)蛋白含有分子量约为95千道尔顿的G蛋白和分子量约为55千道尔顿的G蛋白,包括的基质(M)蛋白含有分子量约为31千道尔顿的M蛋白。
根据本发明的这一方面提供的混合物可以包括F,G和M蛋白质,相对的比例是:
F约为35到70(重量)%
G约为5到30(重量)%
M约为10到40(重量)%
当在还原条件下经过SDS-PAGE分析,并在银染后进行光密度扫描,发现在这一混合物中分子量约为48千道尔顿的F1和分子量约为23千道尔顿的F2混合物的比例可能约在1∶1和2∶1之间。F,G和M蛋白质的混合物的纯度可能至少约为75%,优选地至少约
85%。
根据本发明的这一方面,利用如下所述的分离方法,本文提供的混合物没有单克隆抗体和没有小扁豆凝聚素和伴刀豆球蛋白A。
在本文提供的蛋白质的混合物中提供的RSV蛋白质在制备的温和条件下通常基本上是非变性的,并可以含有来自RSV A和RSV B亚型的一种或两种的RSV蛋白质。
本发明的优选的实施方案,提供了非变性的呼吸道合胞体病毒(RSV)的蛋白质的共分离和共纯化的混合物,基本包括RSV的融合(F)蛋白,附着(G)蛋白和基质(M)蛋白,其中混合物中没有含有伴刀豆球蛋白A的小扁豆凝聚素和单克隆抗体。
根据本发明的另一个方面,提供了含有免疫有效量的本文提供的混合物的免疫原性制剂。
可以将本文提供的免疫原性组合物配制成含有F,G和M蛋白质的疫苗,用于对寄主内给药,寄主可以是灵长类,特异地是人寄主,以便保护寄主抵抗RSV引起的疾病。
本发明的免疫原性组合物可以配制成微粒,胶囊,ISCOMs或脂质体。免疫原性组合物另外可以至少含有一个其它免疫原性或免疫刺激的物质,它至少可以是一种佐药或至少是一种免疫调节物,如包括ILK的细胞因子。
至少一种佐药可以选自磷酸铝,氢氧化铝,QS21,Quil A或其衍生物或成分,磷酸钙,氢氧化钙,氢氧化锌,糖脂类似物,氨基酸的十八烷基酯,胞壁酰二肽,含磷氮链聚合物(polyphosphazene),脂蛋白,ISCOM基质,DC-Chol,DDA,和其它佐药和细菌毒素,它们的成分和衍生物。这些物质在委派给代理人在1994年6月10日递交的USSN08/258,228中有叙述,该专利的公开物引入本文作为参考文献(WO 95/34323)。在特殊情况下,诱导Th1应答的佐药是符合需要的。
本文提供的免疫原性组合物可以配制成至少含有一种其它免疫原,方便地它可以含有来自PIV-1,PIV-2和/或PIV-3的人副流感病毒(PIV)蛋白,如PIV F和HN蛋白。但是,其它免疫原如来自衣原体,脊髓灰质,乙型肝炎,白喉毒素,破伤风毒素,流感,嗜血杆菌,B.pertussis,肺炎球菌,分枝菌,甲型肝炎和Morraxella的也掺入了组合物,成为多价(联合)疫苗。
本发明的其它方面提供了在寄主中产生免疫应答的方法,途径是对寄主给药免疫有效量的本文提供的免疫原性组合物。优选地,将免疫原性组合物配制成疫苗,以便对寄主内给药和对包括人的寄主给药,使寄主抵抗RSV引起的疾病。免疫应答可以是体液的或细胞调节的免疫应答。
在其它方面,本发明提供了生产抵抗呼吸道合胞体病毒(RSV)感染引起的疾病的疫苗的方法,该方法包括对测试受试者给药本文提供的免疫原性组合物,以便确定其给药的量和频率,使受试者能够抵抗RSV引起的疾病;和根据确定的给药量和频率配制适于对处理寄主给药的形式的免疫原性组合物。处理寄主可以是人。
本发明的其它方面提供了确定样品中存在与呼吸道合胞体病毒(RSV)的F,G或M蛋白特异反应的抗体的方法,包括步骤:
(a)将样品与本文提供的混合物接触,产生含有呼吸道合胞体病毒蛋白和存在于与其特异反应的样品中的任何所述抗体的复合物;和
(b)确定复合物的产生。
在本发明的另一个方面,提供了确定样品中存在呼吸道合胞体病毒(RSV)的F,G或M蛋白的方法,包括步骤:
(a)用本文提供的免疫原性组合物免疫受试者,以便产生特异于RSV的F,G和M蛋白质的抗体;
(b)将样品与抗体接触,产生含有存在于样品中的任何RSV蛋白质和蛋白质特异抗体的复合物;和
(c)确定复合物的产生。
本发明的另一个方面提供了确定样品中与呼吸道合胞体病毒的F,G或M蛋白质特异反应的抗体的存在的诊断试剂盒,该试剂盒包括:
(a)本文提供的混合物;
(b)将混合物与样品接触,产生复合物的方法,该复合物含有呼吸道合胞体病毒蛋白和任何样品中存在的所述抗体;和
(c)确定复合物产生的方法。
在本发明的另一方面,提供了产生特异于呼吸道合胞体病毒(RSV)的单克隆抗体的方法,包括:
(a)对至少一个小鼠给药本文提供的免疫原性组合物以便产生至少一个免疫小鼠;
(b)从至少一个免疫小鼠中移取B-淋巴细胞;
(c)将至少来自一个免疫的小鼠的B-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,从而产生杂交瘤;
(d)克隆产生选定的抗RSV蛋白质抗体的杂交瘤;
(e)培养产生选定的抗RSV蛋白质抗体的菌落;和
(f)从选定的培养物分离抗RSV蛋白质抗体。
在另一方面,本发明提供了产生呼吸道合胞体病毒蛋白的共分离和共纯化混合物的方法,包括在培养基的细胞上生长RSV,从培养基分离生长的病毒,至少增强来自分离的病毒的F,G和M蛋白质;和共分离和共纯化溶解的RSV蛋白质。
在离子交换基质,优选地磷酸钙基质,特异地羟磷灰石基质上加载溶解蛋白质可以进行共分离和共纯化,并选择性地从离子交换基质中共洗脱F,G和M蛋白质。首先可以用脲洗涤生长的病毒以便除去污染,但基本不除去F,G和M蛋白质。
本发明的优点包括:
-共分离和共纯化RSV的F,G和M蛋白质;
-含有这样的蛋白质的免疫原性组合物;
-分离这样的蛋白质的方法;和
-鉴定RSV和感染的寄主的诊断试剂盒。
附图的简要说明
图1,包括小组a和b,显示了在还原(小组(a))和非还原(小组(b))条件下,利用银染聚丙烯酰胺凝胶对纯化的RSV A亚基制剂进行的SDS-PAGE分析。
图2,包括小组a,b,c,和d,显示了在还原条件下,对纯化的RSV亚基制剂进行的Western影印分析。
图3,包括小组a,b,c和d,显示了在非还原条件下,对纯化的RSV亚基制剂进行的Western影印分析。
图4,显示了在还原条件下,通过对聚丙烯酰胺凝胶银染,对纯化的RSV B亚基制剂进行的SDS-PAGE分析。
发明的一般说明
如上面讨论,本发明提供了从RS病毒共纯化和共分离的F,G和M蛋白质。病毒生长在疫苗级细胞系上,如VERO细胞和人二倍体细胞,如MRC5和WI38,收集生长的病毒。在存在小牛胚胎血清(FBS)和胰蛋白酶时完成发酵。
将病毒收集物过滤,然后通常利用需要的分子量截止膜切向流动超滤浓缩,和渗滤。可以离心病毒收集浓缩物,丢弃上清液。首先用含有脲的缓冲液洗涤离心之后的沉淀,以便除去可溶的污染,而基本不影响保留F,G和M蛋白质,然后再离心。然后用去垢剂提取来自离心的沉淀,以便增强来自沉淀的F,G和M蛋白质。通过将沉淀再悬浮于原始收集浓缩体积的提取缓冲液可以产生这样的去垢剂提取物,该缓冲液含有去垢剂,如非离子去垢剂,包括TRITONX-100,非离子去垢剂辛二烯酚(乙二醇)10。其它去垢剂包括辛基葡萄苷和Mega去垢剂。
在离心除去非可溶蛋白质后,通过色谱层析方法纯化F,G和M蛋白质提取物。首先将提取物用于离子交换层析基质,允许F,G和M蛋白质与基质结合,而杂质流过柱。离子交换层析基质可以是任何符合需要的层析物质,具体的磷酸钙基质,特定地是羟磷灰石,虽然其它物质,如DEAE和TMAE和其它也可以使用。
然后,通过适当的洗脱剂从柱中共洗脱结合的F,G和M蛋白质。得到的共纯化的F,G和M蛋白质可以进一步加工以便增加其纯度。
本文使用的纯化的F,G和M蛋白质的形式可以是同源和异源低聚物,包括F:G异源二聚体和包括二聚体,三聚体和更高类型。根据这一过程制备的RSV蛋白质制剂证明没有任何外来的试剂,血细胞吸附试剂或活病毒。
利用本文提供的制剂与作为佐药的矶或IscomatrixTM伍用肌肉内免疫棉鼠组。如下面的表1和2所示,可以获得强抗融合和中和效价。如下面表3和4所示,在上和下呼吸道可以得到了抗病毒感染的完全保护。
另外,利用本文提供的制剂结合作为佐药的矾和IscomatrixTM,含磷氮链聚合物和DC-chol肌肉内免疫小鼠组。如下面的表5和6所示,可以获得强中和和抗F抗体效价。另外,如在肺匀浆物中没有病毒显示,获得了抗病毒感染的完全保护(下面表7)。
利用本文提供的制剂结合作为佐药的矾和IscomatrixTM免疫猴的组。如下面的表8和9所示,获得了强中和效价和抗F抗体效价。
本文产生的动物免疫数据证明,通过使用温和的去垢剂从病毒提取主要的RSV蛋白质,和温和的盐从离子交换基质洗脱蛋白质,获得了F,G和M RSV蛋白质的共纯化混合物,这些蛋白质能够在实验动物模型中引发免疫应答,给予抗RSV攻击的保护功能。
本发明涉及将来自呼吸道合胞体病毒的F,G和M蛋白质的混合物用作疫苗中的活性成分的药学物质,抵抗活性多核体病毒引起的疾病。
在另一个方面,本发明提供了来自呼吸道合胞体病毒的F,G和M蛋白质制备疫苗组合物用于免疫抵抗呼吸道合胞体病毒感染引起的疾病的用途。
本领域技术人员很明了的是,本发明的各种实施方案在疫苗,呼吸道合胞体病毒感染的诊断和治疗,和免疫试剂的产生领域具有许多应用。下面进一步提出了这一问题的其它非限制讨论。
1.疫苗制剂和使用
从含有本文公开的RSV的免疫原性F,G和M蛋白质的混合物可以制备适于用作疫苗的免疫原性组合物。免疫原性组合物引发免疫应答,免疫应答产生抗体,包括抗RSV抗体,包括抗F,抗G和抗M抗体。这样的抗体可以是病毒的中和和/或抗融合的抗体。
含有疫苗的免疫原性组合物可以制备成可注射的,如液体溶液,悬浮液或乳剂。一种或多种活性免疫原成分可以与相容的药学可接受赋形剂混合。这样的赋形剂可以包括水,盐水,葡聚糖,甘油,乙醇,和它们的组合。免疫原性组合物和疫苗可以进一步含有辅助物质,如加湿剂或乳化剂,pH缓冲试剂,或佐药以便增强其效力。免疫原性组合物和疫苗可以通过胃肠外给药,皮下注射,皮内注射,或肌肉内注射经皮给药。可替代地,根据本发明形成的免疫原性组合物可以以一种方式配制和递送,这种方式能在粘膜表面引起免疫应答。所以,可以将免疫原性组合物通过鼻或口(胃内)的途径对粘膜表面给药。可替代地,其它给药方式,包括栓剂和口服配方也是符合需要的。对于栓剂,结合剂和载体可以包括,例如,聚亚烷基二醇或甘油三酯。这样的栓剂可以从含有范围约为0.5到10%,优选地1到2%的活性免疫原成分的混合物形成。口服配方通常可以包括使用的载体如,药物级的糖精,纤维素和碳酸镁。这些组合物可以采取溶液,悬浮液,片剂,丸剂,胶囊,持续释放配方或粉末的形式,并含有约1到95%的活性成分,优选地约20到75%。
以剂量配方相容的方式给药免疫原制剂和疫苗,给药量是治疗有效的,免疫原性的和保护性的。给药的量根据待治疗的个体,包括例如个体免疫系统合成抗体,并且如果需要,能够产生细胞传递的免疫应答的能力而变化。需要给药的活性成分的准确量是根据开业医师的判断确定的。但是,本领域的技术人员能容易地确定适当的剂量范围,可以是每次接种微克到毫克级的活性成分。开始给药和加强剂量的适当方法也是可变的,但是可以包括开始给药后接着加强给药的步骤。剂量也可以根据给药途径而变化,并将根据寄主的大小变化。
在本发明的免疫原性组合物中活性成分蛋白质的浓度通常约为1到95%。含有仅一个病原体的抗原物质的疫苗是单价疫苗。含有几个病原体的抗原物质的疫苗是联合疫苗,也属于本发明范围。这样的联合疫苗含有,例如来自多种病原体或来自同一病原体的多种菌株,或来自各种病原体的联合的物质。如上面说明,在本发明中将RSV A和RSV B的F,G和M蛋白质结合成单个的多价免疫原性组合物,它也可以含有其它免疫原。
如果抗原与佐药协同给药,可以明显提高免疫原性。佐药能增强抗原的免疫原性,但它们自身不必须具有免疫原性。佐药的作用可以在给药的位点附近局部地保留抗原,以便产生储存效果,便于缓慢,持续地将抗原释放到免疫系统的细胞中。佐药也可以吸引免疫系统的细胞到抗原储存位置,并刺激这样的细胞引发免疫应答。
免疫刺激试剂或佐药已经使用了许多年,能够增强寄主对例如疫苗的免疫应答。内在的佐药,如脂多糖,通常是用作疫苗的杀死或减毒的细菌的成分。外在的佐药是免疫调节剂,可以配制以便增强寄主的免疫应答。所以,已经鉴定佐药能够增强对肠胃外给药传递的抗原的免疫应答。这些佐药中的一些是毒性的,而且,能够引起不需要的副作用,使它们不适于在人和许多动物中使用。确实,在人和畜牧业疫苗中通常只将氢氧化铝和磷酸铝(通常总称为矾)用作佐药。矾在增强抗体对白喉和破伤风毒素的应答中的效力已经很好地确定了,HBsAg疫苗已经用矾辅助配制。而在一些应用中矾的用途已经很好确立,但它的用途是有限的。例如,对于流感,接种矾是无效的,通常不引发细胞介导的免疫应答。矾辅助抗原引发的抗体在小鼠中主要是IgG1同型,不是一些疫苗试剂的保护所最适的。
大范围的外在佐药可以引起对抗原的潜在免疫应答。这些包括与膜蛋白抗原复合的皂苷(免疫刺激复合物),含有矿物油的pluronic多聚体,在矿物油中的杀死的分支杆菌,Freund不完全佐药,细菌产物,如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS),以及脂A,和脂质体。
为了有效地诱导体液免疫应答(HIR)和细胞介导的免疫(CMI),经常将免疫原乳化于佐药中。许多佐药是有毒性的,诱导肉芽肿,急性和慢性炎症(Freund完全佐药,FCA),细胞溶解(皂苷和pluronic多聚体)和产生热原,关节炎和前眼色素层炎(LPS和MDP)。虽然FCA是良好的佐药,广泛地用于研究中,但它不允许用于人或畜牧业疫苗中,因为它有毒性。
2.免疫测试
本发明的RSV的F,G和M蛋白可以用作免疫原生产抗体,在免疫测试包括酶联免疫吸附测试(ELISA),RIA和其它非酶联抗体结合测试或本领域已知的用于检测抗体的方法中作为抗原。在ELISA测试中,选定的F,G或M蛋白质或蛋白质混合物是固定于选定的表面的,例如能够结合蛋白质的表面,如聚苯乙烯微滴平板的孔。在洗涤并除去不完全吸附的物质后,非特异蛋白如小牛血清白蛋白(BSA)的溶液可以与选定的表面结合,已知小牛血清白蛋白对测试样品是抗原中性的。这允许在固定的表面封闭非特异吸收位点,所以减少了抗血清中的蛋白质与表面的非特异结合引起的背景。
然后将固定表面与样品接触,如临床或生物物质,这些物质有待以形成免疫复合物(抗原/抗体)形式的方式测试。这包括用稀释剂稀释样品,稀释剂如BSA溶液,小牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸缓冲盐(PBS)/吐温。然后允许样品温育约2到4小时,温度约为25到37℃。温育后,洗涤接触样品的表面以便除去非免疫复合的物质。洗涤过程可以包括用溶液如PBS/吐温或硼酸缓冲盐洗涤。在测试样品和结合蛋白质之间形成特异免疫复合物后,随后洗涤,免疫复合物的形成,甚至是量都可以确定,方法是将免疫复合物与第二个抗体接触,第二个抗体是特异于第一个抗体的。如果测试样品是人源的,第二个抗体是对人免疫球蛋白具有特异性的抗体,并且通常是IgG。为了提供检测手段,第二个抗体可以具有相关的活性,如酶活性,例如在与适当的发色的底物温育时显出颜色。然后,利用分光光度计通过测量产生的颜色程度进行数量测定。
实施例
上面的公开内容一般性地说明了本发明。参考文献下面的特定实施例可以得到更完全的理解。叙述这些实施例只是为了说明,并不打算限制本发明的范围。由于情况的变化可能提出或提供的应急方法,变化的形式和替代的等当物也受到了关注。虽然本文已经使用了特定的术语,这样的术语打算用于描述,并不为了限制的目的。
在科学文献中已经充分报道了本公开物中没有明确叙述的确定组织培养感染剂量50(TCID50/毫升),噬菌斑和中和效价的方法,并且是本领域技术人员熟悉的范围内的。通过Pierce手册(23220,23225;Pierce化学公司,美国)叙述的二辛可酸(BCA)方法确定蛋白质浓度,该手册引入本文作为参考文献。
将CMRL1969和Iscove Modified Dulbecco培养基(IMDM)用于细胞培养和病毒生长。用于这一研究的细胞是从Merieux研究院得到的疫苗级非洲绿猴肾细胞(VERO lot M6)。使用的RS病毒和RS病毒亚型A(Long和A2菌株)是从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到的,最新的亚型A临床分离物和RSV亚型B临床分离物来自Baylor医学院。
实施例1:
该实施例叙述了在150升的调节发酵罐中的微载体珠上的哺乳动物细胞系上生产RSV的过程。
在含有360克Cytodex-1微载体珠的150升生物反应器中的60升pH7.2的CMRL1969培养基中加入浓度为105个细胞/毫升的疫苗级非洲绿猴肾细胞,搅拌2小时。再加入60升DMRL1969培养基达到总体积120升。加入胎牛血清使之最后浓度为3.5%。加入蔗糖到最后浓度为3克/升,加入L-谷氨酸到最后浓度为0.6克/升。控制溶解的氧(40%),pH(7.2),搅拌(36rpm),和温度(37℃)。检测细胞生长,蔗糖,乳酸,和谷氨酸水平。在4天时,从发酵罐中流干培养基,加入100升E199培养基(无胎牛血清),搅拌10分钟。使发酵罐流干,再用120升E199充满。
以感染复数(M.O.I)为0.001加入RSV亚型A的RSV接种物,然后培养培养物3天,然后流干三分之一到二分之一的培养基,用新鲜培养基替代。感染后6天,停止搅拌,允许小珠静止。流干病毒培养物液体,用20微米的滤纸过滤,然后用3微米的滤纸过滤,然后进一步加工。
将澄清的病毒收集物浓缩75到150倍,方法是利用300NMWL膜切向流动超滤,和含有10%甘油的磷酸缓冲盐渗滤。在-70℃冷冻储藏病毒浓缩物,然后进一步纯化。
实施例2:
这一实施例说明了从RSV亚型A的病毒浓缩物纯化RSV亚基的过程。
在如实施例1所述制备的病毒浓缩物的等分试样中加入50%聚苯乙烯二醇8000溶液,得到其最后浓度为6%。在室温下搅拌1小时后,在Sorvall SS-34离心机,4℃,15,000RPM离心混合物30分钟。在1毫摩尔磷酸钠,pH6.8,2摩尔脲,0.15摩尔NaCl中悬浮病毒沉淀,在室温下搅拌1小时,然后在15,000RPM再离心30分钟。离心机是Sorvall SS-34,温度为4℃。然后在1毫摩尔硫酸钠,pH6.8,50毫摩尔NaCl,1%Triton X-100中悬浮病毒沉淀,在室温下搅拌30分钟。在陶瓷羟磷灰石(II型,Bio-Rad实验室)的柱上加载可溶的蛋白质上清液,然后用5个体积的1毫摩尔磷酸钠,pH6.8,50毫摩尔NaCl,0.02%Triton X-100洗涤柱。通过用10个柱体积的1毫摩尔磷酸钠,pH6.8,400毫摩尔NaCl,0.02%Triton X-100洗脱得到来自含有F,G和M蛋白质的RSV亚型A的RSV亚基组合物。
实施例3:
这一实施例叙述了通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹从RSV亚型A得到的RSV亚基制剂。
通过12.5%的聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE分析如实施例2所述制备的RSV亚基组合物。在存在或缺乏2-巯基乙醇(还原试剂)电泳样品。用银染染色凝胶,检测病毒蛋白(图1,小组a和b)。制备复制凝胶的免疫影印,用F糖蛋白(图2,小组a和3,小组a)的小鼠单克隆抗体(mAb 5353C75),对G糖蛋白(图2,小组b和3,小组b),的小鼠单克隆抗体(mAb 131-2G),或抗RSV M肽(肽序列:LKSKNMLTTVKDLTMKTLNPTHDIIALCEFEN-(SEQ ID NO:1)(图2,小组c和3,小组c)的豚鼠抗血清(gp178),或抗整个RSV(图2,小组d和3,小组d)的山羊抗血清(Virostat#0605)探测。在还原条件下电泳的RSV亚基制剂的银染凝胶进行光密度分析表明组合物的分布如下:
G糖蛋白(95千道尔顿形式)=10%
F1糖蛋白(48千道尔顿)=30%
M蛋白质(31千道尔顿)=23%
F2糖蛋白(23千道尔顿)=19%
在非还原条件下F糖蛋白的迁移如分子量约为70千道尔顿杂二聚体(F0)以及更高的低聚物形式(二聚体和三聚体)(图3,小组a)。
实施例4:
这一实施例叙述了棉鼠中RSV亚基制剂的免疫原性。
用如实施例2中所述生产和用1.5毫克/剂量的矾或5微克/剂量的IscomatrixTM(Iscotec,瑞士)配制的RSV亚基制剂肌肉内注射(0天0.1毫升,28天1微克或10微克)免疫5个棉鼠的组。在41天得到血样样品,测试抗融合效价和中和效价。在43天用RSV经鼻内对小鼠免疫攻击,在4天后杀死。收集肺和鼻咽的灌洗液,测试RSV效价。如下面的表1和2所示诱导了强抗融合和中和抗体效价。另外,在上下呼吸道得到了抵抗病毒感染的完全保护,除了一个小鼠(下面的表3和4)。
实施例5:
这一实施例叙述了小鼠中的RSV亚基制剂的免疫原性。
用如实施例2所述生产和用1.5毫克/剂量矾,10微克/剂量IscomatrixTM,200微克/剂量含磷氮链聚合物(PCPP),或200微克/剂量DC-chol配制的各种剂量的RSV亚基制剂在0天和28天肌肉内(0.1毫升)免疫6个BALB/c小鼠的组。在下面的表5,6和7阐述了测试的各种制剂。在28天和42天得到血样,测试中和抗体效价和抗F抗体效价。在44天用RSV攻击小鼠,并在4天后杀死。取出肺,匀浆化,确定病毒效价。如下面的表5和6显示引发了强中和效价和抗F抗体效价。另外,得到的对病毒感染的完全保护,正如肺匀浆物和鼻洗液中病毒之不存在所显示(下面的表7)。
实施例6:
这一实施例叙述了在非洲绿猴中制备的RSV亚基的免疫原性。
用实施例2中所述制备的,用1.5毫克/剂量矾或50微克/剂量IscomatrixTM配制的RSV亚基制剂免疫(0天0.5毫升,21天100微克)肌肉内注射4个猴子的组。在21,35和49天获取血样,测试中和和抗F抗体效价。如下面表8和9所示得到强中和和抗F抗体效价。
实施例7:
这一实施例进一步叙述了在150升控制发酵罐中的哺乳动物活细胞或微珠上生产RSV的过程。
在150升含有3.5%胎牛血清的Iscove Modified Dulbecco培养基(IMDM)中加入疫苗级非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)直到在150升含有450克Cytodex-1小型载体小珠(3克/升)的生物反应器中的最后浓度为2×105个细胞/毫升(范围为1.5到3.5个细胞/毫升)。在细胞接种后,控制溶解的氧(40%空气饱和度(范围25到40%),pH(7.1±0.2)),搅拌(36±2rpm),和温度(37℃±0.5℃)。每天检测细胞开始附着于小珠,细胞生长(检测细胞数),和生长培养基的葡萄糖和乳酸水平的过程。在细胞开始生长后3到4天,细胞浓度为1.5到2.0×106个细胞/毫升时,发生Vero细胞培养物的感染。停止搅拌,允许微载体珠静止60分钟,在静止的小珠体积上面约3厘米放置排水管线,从生物反应器流干培养基。加入75升没有胎牛血清的IMDM(洗涤培养基),在36RPM搅拌混合物10分钟。终止搅拌,允许微载体珠静止30分钟。利用排水管线除去培养基,然后用没有胎牛血清的IMDM培养基充满75升(半体积)。
为了感染,以感染复数(M.O.I.)为0.001加入RSV亚型B的RSV接种物,在半体积时在36RPM搅拌2小时使细胞吸附病毒。然后在生物反应器中加入75升IMDM,直到最后体积为150升。在感染后,控制溶解氧(40%空气饱和度(范围10到40%)),pH(7.25±0.1),搅拌(36±2rpm)和温度(370±0.5℃)。在感染后,每天检测培养基中细胞生长(确定细胞数),葡萄糖和乳酸水平的变化过程,RSV F和G抗原和RSV的感染性。在感染后3天,终止搅拌,允许小型载体小珠静止60分钟,通过排水管线除去75升(50%)培养基,用新鲜培养基替代。感染后8天(7到9天),当观察到完全的病毒诱导的细胞病理作用(即细胞从小型载体小珠脱去,培养基不再消耗氧),终止搅拌,允许小型珠静止60分钟。从生物反应器中除去含有病毒的培养物液体,转移到贮存容器中。在生物反应器中加入75升没有胎牛血清的IMDM,在75rpm搅拌30分钟。允许微载体珠静止30分钟,从生物反应器中除去漂洗液体,在贮存容器中与收集的物质合并。
利用500或1000千道尔顿(k)超滤膜或替代地用0.45微摩尔微滤膜切向流动过滤(即,膜保留含有病毒的物质)浓缩收集的物质约20倍到最后体积10升。用10倍体积的磷酸盐pH7.2渗滤浓缩的物质。将渗滤的病毒浓缩物储藏在-70℃,然后进一步纯化。
实施例8:
这一实施例叙述了从RSV亚型B的病毒浓缩物纯化RSV亚基的过程。
在Sorvall SS-34离心机中,在4℃,在15,000RPM离心实施例7所述制备的病毒浓缩物30分钟。然后将病毒沉淀在1毫摩尔磷酸钠pH6.8,300毫摩尔NaCl,2%Triton X-100再悬浮,并在室温下搅拌30分钟。通过在15,000RPM,在Sorvall SS-34离心机,4℃离心除去不溶的病毒核心,将可溶的蛋白质上清液上陶瓷羟磷灰石柱(I型,Bio-Rad实验室),然后用10倍柱体积的1毫摩尔磷酸钠,pH6.8,10毫摩尔NaCl,0.02%Triton X-100洗涤。通过用10倍柱体积的1毫摩尔磷酸钠,pH6.8,600毫摩尔NaCl,0.02%Triton X-100洗脱得到含有F,G和M蛋白质的RSV亚基组合物。在某些情况下,首先稀释来自第一次陶瓷羟磷灰石柱的洗脱物到使NaCl浓度降低到更低的400毫摩尔NaCl,然后将稀释的亚基加到陶瓷羟磷灰石柱上(II型,Bio-Rad实验室)可以进一步纯化RSV亚基组合物。从这一柱中流出的是来自RSV亚型B的纯化RSV亚基组合物。
实施例9:
这一实施例叙述了对通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳从RSV亚型B得到的RSV亚基制剂的分析结果。
利用15.0%聚丙烯酰胺凝胶,通过SDS-PAGE分析实施例8中所述制备的RSV亚基制剂。在存在2巯基乙醇(还原试剂)时对样品电泳。用银染将凝胶染色,以便检测病毒蛋白质(图4)。在还原条件下对RSV亚基制剂的银染凝胶进行光密度分析表明蛋白质在组合物中的分布如下:
G糖蛋白(95千道尔顿形式)=21%
F1糖蛋白(48千道尔顿)=19%
M蛋白质(31千道尔顿)=22%
F2糖蛋白(23千道尔顿)=20%
公开物的概要
在本公开物的概要中,本发明提供了RSV的F,G和M蛋白质的共分离和纯化混合物,该混合物能够保护相关的动物模型抵抗RSV的感染。在本发明的范围内作一些修改是可能的。
表1-棉鼠中血清抗融合效价
组 | 平均效价(log2) | Std,Dev(log2) |
矶安慰剂 | 2.0 | 00 |
IscomatrixTM安慰剂 | 2.3 | 0.5 |
含有矾的1微克RSV亚基 | 8.0 | 1.0 |
含有矾的10微克RSV亚基 | 7.5 | 1.0 |
含有IscomatrixTM的1微克RSV亚基 | 10.4 | 1.3 |
含有IscomatrixTM的10微克RSV亚基 | 10.0 | 1.6 |
表2-棉鼠中的血清中和效价
组 | 平均效价(log2) | Std.Dev.(log2) |
矾安慰剂 | 2.0 | 0.0 |
IscomatrixTM安慰剂 | 2.0 | 0.0 |
含有矾的1微克RSV亚基 | 9.6 | 1.3 |
含有矾的10微克RSV亚基 | 10.0 | 1.4 |
含有IscomatrixTM的1微克RSV亚基 | 10.6 | 1.1 |
含有IscomatrixTM的10微克RSV亚基 | 11.2 | 1.1 |
表3-棉鼠中的肺洗液的RSV效价
组 | 平均效价(log10/g肺) | Std.Dev.(log10/g肺) |
矾安慰剂 | 3.8 | 0.4 |
IscomatrixTM安慰剂 | 3.7 | 0.5 |
含有矾的1微克RSV亚基 | 0.4 | 0.8 |
含有矾的10微克RSV亚基 | 0.0 | 0.0 |
含有IscomatrixTM的1微克RSV亚基 | 0.0 | 0.0 |
含有IscomatrixTM的10微克RSV亚基 | 0.0 | 0.0 |
表4-棉鼠中的鼻洗液RSV效价
组 | 平均效价(log10/g肺) | Std.Dev.(log10/g肺) |
矾安慰剂 | 3.2 | 0.5 |
IscomatrixTM安慰剂 | 3.1 | 0.3 |
含有矾的1微克RSV亚基 | 0.0 | 0.0 |
含有矾的10微克RSV亚基 | 0.0 | 0.0 |
含有IscomatrixTM的1微克RSV亚基 | 0.0 | 0.0 |
含有IscomatrixTM的10微克RSV亚基 | 0.0 | 0.0 |
表5-Balb/c小鼠中的血清中和效价
组 | 4星期放血 | 6星期放血 | ||
平均效价(log2) | Std.Dev.(log2) | 平均效价(log2) | Std.Dev(log2) | |
矾安慰剂 | 3.01 | 0.0 | 3.0 | 0.0 |
IscomatrixTM安慰剂 | 3.0 | 0.0 | 3.0 | 0.0 |
PCPP安慰剂(200微克) | ND | ND | 3.0 | 0.0 |
DC-Chol安慰剂(200微克) | ND | ND | 3.0 | 0.0 |
不含有佐药0.1微克RSV亚基 | ND | ND | 3.0 | 0.0 |
含有矾的0.1微克RSV亚基 | ND | ND | 10.3 | 0.9 |
含有矾的1微克RSV亚基 | 6.5 | 0.6 | 8.7 | 1.0 |
含有矾的10微克RSV亚基 | 8.0 | 1.1 | 9.5 | 1.1 |
含有IscomatrixTM1微克RSV亚基 | 8.2 | 0.8 | 13.2 | 1.0 |
含有IscomatrixTM10微克RSV亚基 | 10.4 | 1.3 | 13.4 | 0.6 |
含有PCPP(200微克)的1微克RSV亚基 | ND | ND | 15.0 | 0.6 |
含有DC-Chol(200微克)的0.5微克RSV亚基 | ND | ND | 11.7 | 1.1 |
1测试中的最小可检测效价
ND=没有确定
表6-在Balb/c小鼠中的血清抗F效价
组 | 4星期放血 | 6星期放血 | ||
平均效价(log3效价/100) | Std.Dev.(log2效价/100) | 平均效价(log2效价/100) | Std.Dev(log2效价/100) | |
矾安慰剂 | 0.5 | 1.2 | 0.0 | 0.0 |
IscomatrixTM安慰剂 | 1.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
PCPP安慰剂(200微克) | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
DC-Chol安慰剂(200微克) | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
不含有佐药0.1微克RSV亚基 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
含有矾的0.1微克RSV亚基 | 7.0 | 1.0 | 12.4 | 0.9 |
含有矾的1微克RSV亚基 | 8.7 | 0.8 | 11.2 | 0.8 |
含有矾的10微克RSV亚基 | 9.7 | 0.8 | 12.3 | 1.0 |
含有IscomatrixTM1微克RSV亚基 | 8.5 | 0.6 | 13.3 | 0.5 |
含有IscomatrixTM10微克RSV亚基 | 10.0 | 0.0 | 13.0 | 0.0 |
含有PCPP(200微克)的1微克RSV亚基 | 10.2 | 0.8 | 14.0 | 0.7 |
含有DC-Chol(200微克)的0.5微克RSV亚基 | 9.7 | 1.4 | 13.0 | 1.0 |
表7-在Balb/c小鼠中肺病毒效价
组 | 平均效价(log10/g肺) | Std.Dev.(log10/g肺) |
矾安慰剂 | 4.1 | 0.2 |
IscomatrixTM安慰剂 | 3.5 | 0.1 |
PCPP安慰剂(200微克) | 5.2 | 0.2 |
DC-Chol安慰剂(200微克) | 5.0 | 0.3 |
不含有佐药0.1微克RSV亚基 | 5.3 | 0.1 |
含有矾的0.1微克RSV亚基 | <1.71 | 1.7 |
含有矾的1微克RSV亚基 | <1.7 | 1.7 |
含有矾的10微克RSV亚基 | <1.7 | 1.7 |
含有IscomatrixTM1微克RSV亚基 | <1.7 | 1.7 |
含有IscomatrixTM10微克RSV亚基 | <1.7 | 1.7 |
含有PCPP(200微克)的1微克RSV亚基 | <1.7 | 1.7 |
含有DC-Chol(200微克)的0.5微克RSV亚基 | <1.7 | 1.7 |
1测试中可检测的最小病毒效价
表8-在非洲绿猴中的血清中和效价
组 | 3血清放血 | 5星期放血 | 7星期放血 | |||
平均效价(log2) | Std.Dev(log2) | 平均效价(log2) | Std.Dev.(log2) | 平均效价(log2) | Std.Dev.(log2) | |
矾安慰剂 | 3.3 | 0.0 | 3.3 | 0.0 | 3.3 | 0.0 |
IscomatrixTM安慰剂 | 3.3 | 0.0 | 3.3 | 0.0 | 3.3 | 0.0 |
含有矾的100微克RSV亚基 | 11.3 | 1.3 | 14.6 | 1.3 | 11.5 | 1.4 |
含有IscomatrixTM的100微克RSV亚基 | 10.8 | 0.7 | 15.1 | 0.1 | 11.9 | 0.5 |
表9-非洲绿猴中的血清抗F效价
组 | 3血清放血 | 5星期放血 | 7星期放血 | |||
平均效价(log2效价/100) | Std.Dev(log2效价/100) | 平均效价(log2效价/100) | Std.Dev.(log2效价/100) | 平均效价(log2效价/100) | Std.Dev.(log2效价/100) | |
矾安慰剂 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
IscomatrixTM安慰剂 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
含有矾的100微克RSV亚基 | 6.5 | 1.9 | 9.3 | 1.0 | 9.0 | 1.2 |
含有IscomatrixTM的100微克RSV亚基 | 5.5 | 1.0 | 9.8 | 0.5 | 9.5 | 1.0 |
参考文献文献
1.Glezen,W.P.,Paredes,A.Allison,J.E.,Taber,L.H.和Frank.A.L.(1981).儿科学杂志,98,708-715。
2.Chanock,R.M.,Parrot,R.H.,Connors,M.,Collins,P.L.和Murphy,B.R.(1992)儿科学90,137-142。
3.Martin,A.J.Gardiner,P.S.和McQuillin,J.(1978).柳叶刀ii,1035-1038。
4.Robbins,A.,和Freeman,P.(1988)科学美国人259,126-133。
5.Glezen,W.P.,Taber,L.H.,Frank,A.L.和Kasel,J.A.(1986)美国儿童疾病杂志140,143-146。
6.Katz,S.L.优先确立的新疫苗开发项目,第一卷,华盛顿:国家学术出版社(1985)397-409。
7.Wertz,G.W.,Sullender,W.M.(1992)生物技术20,151-176。
8.McIntosh,K.和Chanock,R.M.(1990)病毒学领域(Fields,B.M和Knipe,D.M.编辑)1045-1075,Raven出版有限公司,纽约。
9.Collins,P.,McIntosh,K.,和Chanock,R.M.病毒学领域,Fields,B.N,Knipe,D.M.和Howley,P.M.,Lippincott-Raven出版社,纽约(1996)1313-1351。
10.Walsh,E.E.,Hall,C.B.,Briselli,M.,Brandisss,M.W.和Schlesinger,J.J.(1987)感染疾病杂志,155,1198-1204。
11.Walsh,E.E.,Hruska,J.(1983)病毒学杂志47,171-177。
12.Levine,S.,Kleiber-France,R.,和Paradiso,P.R.(1987)病毒遗传学杂志,69,2521-2524。
13.Anderson,L.J.Hierholzer,J.C.,Tsou,C.,Hendry,R.M.,Fernie,B.F.,Stone,Y.和McIntosh,K.(1985),感染疾病杂志,151,626-633。
14.Johnson,P,R,Olmsted,R.A.,Prince,G.A.,Murphy,B.R.,Alling,D.W.,Walsh,E.E.和Collins,P.L.(1987)病毒学杂志61(10)3163-3166。
15.Cherrie,A.H.,Anderson,K.,Wertz,G.W.,和Openshaw,P.J.M.(1992)病毒学杂志66,2102-2110。
16.Kim,H.W.,Canchola,J.G.,Brandt,C.D.,Pyles,G.,Chanock,R.M.Jensen,K.,和Parrott,R.H.(1969)美国流行病学杂志89,422-434。
17.Firedewald,W.T.,Forsyth,B.R.,Smith,C.B.,Gharpure,M.S.,和Chanock,R.M.(1989)JAMA 204,690-694。
18.Walsh,E.E.,Brandriss,M.W.,Schlesinger,J.J.(1985)病毒遗传杂志66,409-415。
19.Walsh,E.E.,Schlesinger,J.J.和Brandriss,M.W.(1984)病毒遗传杂志65,761-766。
20.Routledge,E.G.,Willcocks,M.W.,Samsin,A.C.R.,Morgan,L.,Scott,R.,Amderson,J.J.,和Toms,G.L.(1988)病毒遗传杂志69,293-303。
21.Fulginiti,V.A.,Eller,J.J.,Sieber,O.F.,Joyner,I.W.,Minamitani,M.和Meiklejohn,G.(1969)美国儿科学杂志89(4)435-448。
22.Chin,J.,Magoffin,R.L.,Shearer,L.A.,Schieble,J.H.和Lennette,E.H.(1969)美国儿科学杂志89(4)449-463。
23.Kapikian,A.Z.,Mitchell,R.H.,Chanock,R.M.,Shvedoff,R.A.和Stewart,C.E.(1969)美国儿科学杂志89(4)405-421。
24.Kim,H.W.,Arrobio,J.O.,Pyles,G.,Brandt,C.D.Camargo,E.,Chanock,R.M.和Parrott,R.H.(1971)儿科学48,745-755。
25.Wright,P.F.,Belshe,R.B.,Kim,H.W.,Van Voris,L.P.和Chanock,R.M.(1982)免疫感染37(1),397-400。
26.Wright,P.F.,Chinozaki,T.和Fleet.W.(1976)儿科学杂志,88,931-936。
27.Belshe,R.B.,Van Voris,P.和Mufson,M.A.(1982)感染疾病杂志145,311-319。
28.Murphy,B.R.,Prince,G.A.,Walsh,E.E.,Kim,H.W.,Parrott,R.H.,Hemming V.G.,Rodriguez,W.J.,和Chanock,R.M.临床微生物杂志(1986),24(2),197-202。
29.Connors,M.,Collins,P.L.,Firestone,C.Y.,Sotnikov,A.V.,Waitze,A.,Davis,A.R.,Hung,P.P.,Chanock,R.M.,Murphy.B.(1992)疫苗,10,475-484。
30.Prince,G.A.,Jenson,A.B.,Hemming,V.G.,Murphy,E.R.,Walsh,E.E.,Horswood,R.L.和Chanock,R.L.(1986)病毒学杂志57(3),721-728。
31.Piedra,P.A.,Camussi,F.和Ogra,P.L.(1989)病毒遗传杂志70,325-333。
32.Walsh,E.E.,Hall,C.B.,Briselli,M.,Brandisss,M.W.和Schlesinger,J.J.(1987)感染疾病杂志155(6),1198-1204。
Claims (24)
1.呼吸道合胞体病毒(RSV)的纯化融合(F)蛋白质,附着(G)蛋白质和基质(M)蛋白质的混合物。
2.根据权利要求1要求保护的混合物,特征是所述的融合(F)蛋白质包含多聚体融合(F)蛋白质。
3.根据权利要求2要求保护的混合物,特征是,当在非还原条件下通过SDS-PAGE分析时,所述的多聚体融合(F)蛋白包括分子量约为70千道尔顿的异二聚体和二聚体和三聚体。
4.根据权利要求1到3的任何一个要求保护的混合物,特征是,当在非还原条件下通过SDS-PAGE分析时,所述的附着(G)蛋白质包括分子量约为95千道尔顿的G蛋白质和分子量约为55千道尔顿的G蛋白质,和低聚体G蛋白质。
5.根据权利要求1到3的任何一个要求保护的的混合物,特征是,当在非还原条件下通过SDS-PAGE分析时,所述的基质(M)蛋白质包括分子量约为28到34千道尔顿的M蛋白质。
6.根据权利要求1到3的任何一个要求保护的混合物,特征是,当通过还原SDS-PAGE分析时,所述的融合(F)蛋白质包括分子量约为48千道尔顿的F1和分子量约为23千道尔顿的F2,所述的附着(G)蛋白包括分子量约为95千道尔顿的G蛋白质和分子量约为55千道尔顿的G蛋白质,所述的基质(M)蛋白质包括分子量约为31千道尔顿的M蛋白质。
7.根据权利要求1到3的任何一个要求保护的混合物,特征是所述的F,G和M蛋白质以下面的比例存在:
F 35到70(重量)%
G 5到30(重量)%
M 10到40(重量)%。
8.根据权利要求7要求保护的混合物,特征是,当在还原条件下通过SDS-PAGE和银染分析时,通过扫描光密度,分子量约为48千道尔顿的F1和分子量约为23千道尔顿的F2的比例是1∶1到约2∶1。
9.根据权利要求1到3的任何一个要求保护的混合物,纯度约为75%。
10.根据权利要求1到3的任何一个要求保护的混合物,它不含单克隆抗体。
11.根据权利要求1到3的任何一个要求保护的混合物,它不合小扁豆凝集素和伴刀豆球蛋白A。
12.根据权利要求1到3的任何一个要求保护的混合物,特征是所述的RSV蛋白质是非变性的。
13.根据权利要求1到3的任何一个要求保护的混合物,特征是所述的RSV蛋白质来自亚型RSV A和RSV B之一或两者。
14.根据权利要求1到3的任何一个要求保护的混合物,它是共分离和共纯化的。
15.呼吸道合胞体病毒(RSV)的共分离和共纯化的非变性蛋白质的混合物,基本包括RSV的融合(F)蛋白质,附着(G)蛋白质和基质(M)蛋白质,其中混合物无凝集素并且无单克隆抗体。
16.含有免疫有效量的权利要求1到3和15的任何一个要求保护的混合物的免疫原性组合物。
17.根据权利要求16要求保护的免疫原性组合物,进一步至少包括另外一个免疫原。
18.根据权利要求17中要求保护的免疫原性组合物,特征是所述的至少一个另外的免疫原至少含有选自PIV-1,PIV-2和PIV-3的组的人副流感病毒(PIV)蛋白质。
19.产生呼吸道合胞体病毒(RSV)的共分离和共纯化蛋白质混合物的方法,特征是包括步骤:
在培养基中的细胞上生长RSV;
从培养基中分离生长病毒;
至少增溶来自分离病毒的融合(F)蛋白质,附着(G)蛋白质和基质(M)蛋白质;和
共分离和共纯化增溶的RSV的F,G和M蛋白质。
20.根据权利要求19中要求保护的方法,特征是所述的共分离和共纯化步骤如下产生:
将增溶蛋白加载到离子交换基质;和
选择性地从离子交换基质共洗脱F,G和M蛋白质。
21.根据权利要求20中要求保护的方法,特征是所述的离子交换基质是羟磷灰石基质。
22.根据权利要求19到21的任何一个中要求保护的方法,特征是在增溶步骤之前,用脲洗涤所述的生长病毒,以便除去污染而基本不除去F,G和M蛋白质。
23.呼吸道合胞体病毒(RSV)的纯化的融合(F)蛋白质,附着(G)蛋白质和基质(M)蛋白质的混合物,在制备用于抵抗呼吸道合胞体病毒感染引起的疾病的疫苗中用途。
24.纯化的呼吸道合胞体病毒的融合(F)蛋白质,附着(G)蛋白质和基质(M)蛋白质的混合物制备用于免疫抵抗呼吸道合胞体病毒感染引起的疾病的疫苗组合物中的用途。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/679,060 | 1996-07-12 | ||
US08/679,060 US6020182A (en) | 1996-07-12 | 1996-07-12 | Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1230197A CN1230197A (zh) | 1999-09-29 |
CN1145639C true CN1145639C (zh) | 2004-04-14 |
Family
ID=24725423
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB97197862XA Expired - Fee Related CN1145639C (zh) | 1996-07-12 | 1997-07-11 | 呼吸道合胞体病毒亚基疫苗制剂 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6020182A (zh) |
EP (2) | EP1477494A1 (zh) |
JP (1) | JP2000501418A (zh) |
CN (1) | CN1145639C (zh) |
AT (1) | ATE282633T1 (zh) |
AU (1) | AU716378B2 (zh) |
BR (1) | BR9712970A (zh) |
CA (1) | CA2259594C (zh) |
DE (2) | DE942928T1 (zh) |
ES (1) | ES2141065T5 (zh) |
GR (1) | GR990300042T1 (zh) |
HK (1) | HK1022704A1 (zh) |
NZ (1) | NZ334115A (zh) |
RU (1) | RU2243234C2 (zh) |
WO (1) | WO1998002457A1 (zh) |
Families Citing this family (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6020182A (en) * | 1996-07-12 | 2000-02-01 | Connaught Laboratories Limited | Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation |
US20020136739A1 (en) * | 1996-07-12 | 2002-09-26 | Cates George A. | Subunit respiratory syncytial virus preparation |
US6017694A (en) * | 1997-12-19 | 2000-01-25 | American Cyanamid Company | Methods of screening for modulators of respiratory syncytial virus matrix protein interaction |
NZ512980A (en) * | 1998-12-17 | 2003-07-25 | Aventis Pasteur | Multivalent immunogenic composition containing RSV subunit composition and influenza virus preparation |
GB9909077D0 (en) * | 1999-04-20 | 1999-06-16 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compositions |
WO2001006429A1 (en) * | 1999-07-15 | 2001-01-25 | Shea Robert S | Method of sequencing chronic disease testing, reporting and evaluation |
US7371392B2 (en) | 2000-02-02 | 2008-05-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Cd40 ligand adjuvant for respiratory syncytial virus |
FR2806912B1 (fr) * | 2000-04-04 | 2004-07-23 | Fond Mondiale Rech Et Preventi | UTILISATION DE PROTEINES gp120 ET gp160 MODIFIEES DANS LA BOUCLE V3 DU VIH-1 POUR LA PREPARATION DE COMPOSITIONS VACCINALES ET FORMULATIONS LES CONTENANT |
US20040022800A1 (en) * | 2000-07-31 | 2004-02-05 | Mark Parrington | Respiratory syncytial virus vaccine |
AU2001281614A1 (en) * | 2000-08-07 | 2002-02-18 | Aventis Pasteur Limited | Stabilization of immunogens derived from paramyxoviruses |
CA2426312C (en) * | 2000-10-18 | 2014-01-14 | Ralph A. Tripp | Compositions and methods for modulating rsv infection and immunity |
US7118888B2 (en) | 2001-09-28 | 2006-10-10 | University Of South Florida Board Of Trustees | Gene expression vaccine |
EP1409014B8 (en) * | 2001-12-20 | 2007-04-25 | Sanofi Pasteur Limited | Immunogenic compositions comprising an antigen and a purified m protein from respiratory syncytial virus |
AU2003225281A1 (en) | 2002-04-30 | 2003-11-17 | University Of South Florida | Materials and methods for prevention and treatment of rna viral diseases |
US7595303B1 (en) | 2002-09-05 | 2009-09-29 | University Of South Florida | Genetic adjuvants for immunotherapy |
EP1603940A2 (en) * | 2003-03-18 | 2005-12-14 | Wyeth Holdings Corporation | Process for increasing rsv surface glycoprotein yields using a mutant strain of rsv |
NZ585589A (en) * | 2007-10-25 | 2012-07-27 | Trellis Bioscience Inc | Anti-rsv g protein antibodies |
SI2285408T1 (sl) | 2008-06-05 | 2019-02-28 | Ablynx N.V. | Aminokislinska zaporedja usmerjena proti proteinom ovojnicam virusa in polipeptidi, ki zaporedja vsebujejo za zdravljenje virusnih bolezni |
SG172022A1 (en) * | 2008-12-09 | 2011-07-28 | Novavax Inc | Modified rsv f proteins and methods of their use |
JP6081196B2 (ja) | 2009-06-05 | 2017-03-01 | アブリンクス エン.ヴェー. | 気道感染症の予防及び/又は治療のためのヒト呼吸器合胞体ウイルス(hRSV)に指向性を有する改良アミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド |
PT3178490T (pt) * | 2009-07-15 | 2022-06-30 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Composições de proteína f de rsv e métodos para produção das mesmas |
BR112012008173B1 (pt) * | 2009-10-06 | 2021-12-07 | Medimmune Ltd | Anticorpo monoclonal humano recombinante, sintético ou isolado ou uma parte funcional do mesmo que se liga especificamente à proteína f do vírus sincicial respiratório, sequência de ácido nucleico isolada ou um equivalente funcional da mesma, vetor, combinação, composição farmacêutica, usos dos mesmos e método para produzir um anticorpo ou parte funcional do mesmo |
EP2516623B1 (fr) * | 2009-12-23 | 2016-10-05 | Sanofi Pasteur | Procede de culture de cellules adherentes |
CN102199198A (zh) * | 2011-03-28 | 2011-09-28 | 北京交通大学 | 人呼吸道合胞病毒f蛋白的纯化方法 |
MY171498A (en) | 2012-08-01 | 2019-10-15 | Bavarian Nordic As | Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
US9738689B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-08-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Prefusion RSV F proteins and their use |
CN112851766A (zh) | 2013-03-13 | 2021-05-28 | 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) | 融合前rsv f蛋白和其用途 |
JP6479305B2 (ja) * | 2013-07-12 | 2019-03-06 | 株式会社Umnファーマ | ウイルス様粒子の精製方法 |
WO2015084838A1 (en) * | 2013-12-02 | 2015-06-11 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Recombinant respiratory syncytial virus g protein fragments |
RU2746280C1 (ru) * | 2020-08-03 | 2021-04-12 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины" (ФИЦ ФТМ) | Штамм респираторно-синцитиального вируса RSV/Novosibirsk/66Hl/2018 для использования в диагностике респираторно-синцитиальной вирусной инфекции и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3689622T2 (de) * | 1986-01-14 | 1994-06-16 | Univ North Carolina | Impfstoffe gegen menschliche respiratorische viren. |
GB8914968D0 (en) * | 1989-06-29 | 1989-08-23 | Connaught Lab | Production of virus and purification of viral envelope proteins for vaccine use |
WO1994027636A1 (en) * | 1993-05-25 | 1994-12-08 | American Cyanamid Company | Adjuvants for vaccines against respiratory syncytial virus |
US20030072774A1 (en) | 1994-06-10 | 2003-04-17 | Diane M. Gajewczyk | Proteinaceous adjuvants |
US6020182A (en) * | 1996-07-12 | 2000-02-01 | Connaught Laboratories Limited | Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation |
-
1996
- 1996-07-12 US US08/679,060 patent/US6020182A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-07-11 GR GR990300042T patent/GR990300042T1/el unknown
- 1997-07-11 NZ NZ334115A patent/NZ334115A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-07-11 WO PCT/CA1997/000497 patent/WO1998002457A1/en active IP Right Grant
- 1997-07-11 RU RU99102812/13A patent/RU2243234C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-07-11 DE DE0942928T patent/DE942928T1/de active Pending
- 1997-07-11 US US09/214,605 patent/US6309649B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-11 CN CNB97197862XA patent/CN1145639C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-11 BR BR9712970-4A patent/BR9712970A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-07-11 AU AU34311/97A patent/AU716378B2/en not_active Ceased
- 1997-07-11 CA CA002259594A patent/CA2259594C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 AT AT97930274T patent/ATE282633T1/de active
- 1997-07-11 EP EP04018160A patent/EP1477494A1/en not_active Withdrawn
- 1997-07-11 ES ES97930274T patent/ES2141065T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 JP JP10505475A patent/JP2000501418A/ja active Pending
- 1997-07-11 EP EP97930274A patent/EP0942928B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-11 DE DE69731659T patent/DE69731659T3/de not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-03-21 HK HK00101725A patent/HK1022704A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69731659T3 (de) | 2009-06-18 |
WO1998002457A1 (en) | 1998-01-22 |
DE69731659T2 (de) | 2006-03-02 |
RU2243234C2 (ru) | 2004-12-27 |
NZ334115A (en) | 2000-06-23 |
ES2141065T1 (es) | 2000-03-16 |
EP1477494A1 (en) | 2004-11-17 |
GR990300042T1 (en) | 2000-01-31 |
US6020182A (en) | 2000-02-01 |
CA2259594C (en) | 2003-11-11 |
DE942928T1 (de) | 2000-03-02 |
CN1230197A (zh) | 1999-09-29 |
CA2259594A1 (en) | 1998-01-22 |
EP0942928A1 (en) | 1999-09-22 |
HK1022704A1 (en) | 2000-08-18 |
EP0942928B2 (en) | 2008-08-13 |
DE69731659D1 (de) | 2004-12-23 |
ATE282633T1 (de) | 2004-12-15 |
ES2141065T5 (es) | 2009-02-16 |
JP2000501418A (ja) | 2000-02-08 |
EP0942928B1 (en) | 2004-11-17 |
ES2141065T3 (es) | 2005-05-01 |
AU3431197A (en) | 1998-02-09 |
US6309649B1 (en) | 2001-10-30 |
AU716378B2 (en) | 2000-02-24 |
BR9712970A (pt) | 2001-08-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1145639C (zh) | 呼吸道合胞体病毒亚基疫苗制剂 | |
CN1285608C (zh) | 副流感病毒糖蛋白和疫苗 | |
US20080248057A1 (en) | Multivalent immunogenic composition containing RSV subunit compostion and influenza virus preparation | |
CN109970851A (zh) | Ccv病毒m蛋白的单抗及其制备方法、免疫胶体金试纸条的制备方法 | |
AU3231695A (en) | Antigenic peptides derived from the g protein of rsv for type- and subtype-specific diagnosis of respiratory syncytial virus (rsv) infection | |
US20050089525A1 (en) | Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation | |
CN1103603C (zh) | 灭活的呼吸合胞体病毒疫苗 | |
US7223410B1 (en) | Inactivated respiratory syncytial viral vaccines | |
US20040265326A1 (en) | Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation | |
CA2436126A1 (en) | Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation | |
RU2250260C1 (ru) | ШТАММ Feline coronavirus, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИН И ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО ПЕРИТОНИТА КОШЕК | |
AU2002325713A1 (en) | Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation | |
CN105319361A (zh) | 拟穴青蟹呼肠孤病毒胶体金免疫层析试剂条及其制备方法、使用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1022704 Country of ref document: HK |
|
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20040414 Termination date: 20130711 |