CN1103603C - 灭活的呼吸合胞体病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

一种能在用其免疫的宿主体内产生呼吸合胞体病毒特异性免疫应答的免疫原性组合物，该组合物包含基本不含细胞和血清组分的纯化灭活呼吸合胞体病毒，不具有感染性，不具有免疫强化作用，但具有免疫原性和预防作用。将病毒培养在疫苗级细胞系中，收获的病毒在非变性条件下纯化，以基本去除细胞和血清组分。这种纯化的呼吸合胞体病毒用β-丙醇酸内脂、非离子去污剂(特别是正辛基α-D-吡喃葡糖苷和正辛基β-D-吡喃葡糖苷)或抗坏血酸灭活。这种免疫原性组合物可以制成疫苗供体内给予人类宿主。这种免疫原性组合物也可以诊断上应用。

Description

灭活的呼吸合胞体病毒疫苗
                        发明领域
本发明涉及免疫学领域，特别是灭活呼吸合胞体(RS)病毒疫苗。
                        相关申请
本申请是于1993年8月6日提交的、共同未决的美国专利申请08/102,742号的部分继续申请。
                        发明背景
人呼吸合胞体病毒是引起婴儿和婴儿下呼吸道感染的主要病因(参考文献1至3-a，公开内容的末尾附有参考文献目录，而目录中的每篇文献都以引述方式引入本文)。全球每年发生6千5百万例感染，导致160,000例死亡(参考文献4)。仅在美国一地，每年就有100,000名儿童因为RS病毒引起的肺炎和细支气管炎需住院治疗(参考文献5至6)。美国每年用于为RS病毒感染儿童提供住院和巡访治疗的花费超过3亿4千万美元(参考文献7)。由RS病毒感染引起的严重下呼吸道疾病主要发生于2至6个月的婴儿(参考文献8)。在美国每年大约有4千婴儿死于RS病毒和3型副感冒病毒(PIV-3)感染引起的严重呼吸道疾病造成的并发症。世界卫生组织(WHO)及国立过敏及传染病研究院(NIAID)的疫苗咨询委员会已将RS病毒列为仅次于HIV的疫苗开发对象。
RS病毒是副粘液病毒科(Paramyxoviridae)肺病毒属的一个成员(参考文献2)。两个主要保护性抗原是被膜融合(F)及附着(G)糖蛋白(参考文献9)。F蛋白以68KDa前体分子(FO)形式合成，经蛋白水解分裂成二硫键连接的F1(48KDa)和F2(20KDa)多肽片段(参考文献10)。G蛋白(33KDa)被重度O-糖基化而生成表观分子量为90 KDa的糖蛋白(参考文献11)。已确定了RS病毒的二个主要的亚型：A型和B型(参考文献12)。这些亚型之间的主要抗原性区别存在于G糖蛋白上(参考文献7，13)。
尚无安全有效的RS病毒疫苗，因而这是迫切需要的。开发RS病毒疫苗的方法包括：用甲醛灭活病毒、分离冷适应和/或温度敏感突变株病毒以及分离病毒的保护性抗原。临床试验结果表明减毒活疫苗和福尔马林灭活疫苗都不能适当地预防被接种者的RS病毒感染(参考文献14至16)。用冷适应的和/或温度敏感RS病毒突变株进行鼻饲接种所遇到的问题包括临床发病、遗传不稳定性，以及过度减毒(参考文献17至19)。皮下给药活RS病毒疫苗也无效(参考文献20)。灭活的RS病毒疫苗的典型制备方法是使用甲醛作为灭活剂。Murphy等人(参考文献21)报道了关于经福尔马林灭活的RS病毒免疫的婴儿和儿童的免疫应答的资料。婴儿(2至6月龄)产生了高滴度的抗F糖蛋白抗体，但是对G蛋白应答微弱。较年长的个体(7至40月龄)产生的F和G抗体的滴度与感染了RS病毒的儿童接近。然而，婴儿和儿童产生的中和抗体的水平比感染了天然RS病毒的同龄个体低。免疫应答是不平衡的：对RS病毒的主要免疫原性蛋白F(融合)和G(附着)蛋白有高滴度的抗体，但是中和抗体的滴度很低，部分原因也许是经福尔马林处理时，F和G糖蛋白的重要抗原决定簇改变了。而且，与未经免疫的个体相比，一些接种过福尔马林灭活RS病毒疫苗的婴儿在此后感染天然RS病毒时，所患下呼吸道疾病更为严重(参考文献15，16)。因此，福尔马林灭活的RS病毒疫苗已被认定不能用于人类。
不正常的免疫应答的迹象也在用福尔马林灭活的RS病毒免疫的棉鼠中见到(参考文献22)。而且，在棉鼠体内评价RS病毒的福尔马林灭活疫苗的工作表明，当活病毒侵袭时，经免疫的动物发生了进一步的肺部组织病变(参考文献23)。
福尔马林灭活的RS病毒疫苗制剂的致使病情加重的机制尚有待确定，但是这已成为有效RS病毒疫苗制备的主要障碍。这种加重可能部分归因于福尔马林对F和G糖蛋白的作用。此外，提出了一种非RS病毒特异的病情加重的机制，即，针对疫苗制剂中出现的污染性细胞或血清组分的免疫应答，是疾病加重的部分原因(参考文献24)。确实，接种过HEp-2细胞裂解物，并用HEp-2细胞上生长的RS病毒侵染的小鼠和棉鼠，发生了强化的肺炎反应。
而且，在酸性pH洗脱，经免疫亲和层析纯化的RS病毒糖蛋白具有免疫原性和预防作用，但是同样在棉鼠体内诱导免疫强化(参考文献22，25)。
但依然明显地需要免疫原性制剂，包括既能有效地提供对RS病毒引起的疾病的预防作用，也不产生不期望的副作用(例如免疫强化)的疫苗。也需要用于诊断RSV感染的抗原和产生特异性识别RSV蛋白的抗体(包括单克隆抗体)的免疫原，以便用于例如诊断RS病毒引起的疾病。
最近的综述文章总结了本领域公认的制备RSV疫苗的方法(参考文献2、31至34)，其中没有一篇提出制备灭活的RSV疫苗。
                      发明概述
本发明提供了通过灭活纯化的RS病毒制备上述抗原和免疫原的新方法。
本发明的一个方面是提供一种制备免疫原性组合物的方法，这种免疫原性组合物能够在用其免疫的宿主，特别是人类宿主体内产生呼吸合胞体(RS)病毒特异性免疫应答。所述方法包含多个步骤。首先，把RS病毒培养在合适的细胞株上，然后收集病毒。收获的病毒在非变性条件下纯化，以产生基本上无细胞和血清组分的纯化病毒。然后用灭活剂灭活纯化的病毒，以制备一种不具有感染性、不具有免疫强化作用，但具有免疫原性的RS病毒。然后将这种病毒制成免疫原性组合物。
灭活剂可以是β-丙醇酸内酯；非离子去污剂，包括正辛基-α-D-吡喃葡糖苷及正辛基β-D-吡喃葡糖苷；或抗坏血酸。
对收获的病毒所进行的纯化步骤可以优选地用以下方法进行：微过滤除去细胞碎片，切向流超滤，特别是采用一种大约100KDa至300KDa额定分子量阻断膜除去血清组分，通过超速离心沉淀经超滤的材料以进一步除去血清组分，将沉淀物进行蔗糖密度梯度离心。另一种方法是，切向流超滤的保留液可以进行凝胶过滤，然后进行离子交换层析，以进一步除去血清组分。
本方法提供了一种新的免疫原性组合物。该组合物能在用其免疫的宿主体内产生RS病毒特异性免疫应答。该组合物构成本发明的另一方面。这种免疫原性组合物包括纯化的、灭活的、基本上不含细胞和血清组分的RS病毒及其载体，该病毒不具有感染性、不具有免疫强化作用，但却具有免疫原性和预防作用。这种免疫原性组合物可制成供人类宿主体内给药以保护人类免于RS病毒引起的疾病的疫苗。免疫原性组合物的载体可以包括一种佐剂。这种免疫原性组合物可以制成以注射、鼻饲或口服形式给药的疫苗。
本发明也提供了一种使宿主特别是人类宿主对由RS病毒引起的疾病免疫的方法，包括给予宿主有效量的本发明免疫原性组合物。以这种方式免疫的宿主可以从婴儿、幼龄儿童、孕妇、育龄妇女、老年人、免疫损伤个体及其他敏感人群中选择。
本发明提供的灭活病毒也可以用作诊断试剂检测RS病毒感染。所以，更进一步说，本发明包括测定与RS病毒蛋白起特异性反应的抗体在样品中存在的方法，包括以下步骤：
(a)将样品同本发明的免疫原性组合物接触，以产生包含有不具有感染性、不具有免疫强化作用，但具有免疫原性的RS病毒和样品中存在的与其起特异性反应的抗体的复合物；
(b)测定复合物的产生。
另外，本发明提出了一种测定RS病毒蛋白在样品中存在的方法，包括以下步骤：
(a)用本发明的免疫原性组合物免疫受试者以产生RS病毒蛋白特异性抗体；
(b)将样品和抗体接触，以产生包含在样品中存在的RS病毒蛋白和RS病毒蛋白特异性抗体的复合物；
(c)测定复合物的产生。
本发明进一步提供了一种诊断试剂盒，用以测定样品中和RS病毒蛋白特异性反应的抗体的存在，该试剂盒包括：
(a)本发明的免疫原性组合物；
(b)用于使不具有感染性、不具有免疫强化作用，但具有免疫原性的RS病毒和样品接触，以生成包含不具有感染性、不具有免疫强化作用，但具有免疫原性的RS病毒和样品中存在的所述抗体的复合物的工具；
(c)测定复合物生成的工具。
考虑到先有技术在RS病毒疫苗制备上的困难，令人惊讶的是本发明的方法提供的免疫原性组合物既具有免疫原性和预防能力，同时不具有感染性和免疫强化作用。
                         发明详述
在一方面，本发明涉及一种灭活的呼吸合胞体病毒在可用于人疫苗的条件下的制备。把RS病毒的A亚型或B亚型，在受控制的发酵罐中组织培养的疫苗级细胞株上进行培养，所述细胞株具体可以是VERO细胞。在收获病毒之后，病毒被纯化然后被灭活以生成灭活RS病毒疫苗。
细胞的培养
疫苗级细胞株，例如非洲绿猴肾(VERO)细胞，一般培养在微载体小珠(Cytodex-1)上。一般将这种小珠置于缓冲液例如pH大约在6.9至8.2的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在室温下轻柔搅拌(30至50rpm)2至4小时使其溶胀。洗过的小珠在110℃至130℃灭菌30到60分钟，并置于细胞培养液例如CMRL 1969中，放入摇瓶或小的(2至10升)或大的(20至2000升)控制发酵罐中。然后用培养液，例如补充了小牛血清的CMRL 1969培养液中的疫苗级VERO细胞在容器里接种(例如0.5×105到2×105细胞/ml)。
RS病毒的培养
一旦细胞长满了大约80至90％(接种细胞3至5天后)，倾去培养上清液，用培养液例如CMRL 1969洗一遍，然后，用在不含小牛血清的CMRL 1969中的RS病毒感染细胞。在病毒吸附之后，被感染细胞用培养液洗涤，在感染之后的5至7天监测病毒的生长。
病毒的处理和浓缩
收获的病毒在非变性条件下纯化使其基本上不含细胞组分和血清组分。这种纯化可以以任何合适的方式进行。在一种这样的方法中，RS病毒上清液经微滤(0.22至8μm孔径滤膜)除去细胞碎片。然后澄清的病毒液用阻断分子量大约在100至300KDa之间的超滤膜进行切向流超滤使其浓缩以除去血清组分。
浓缩过的RS病毒进行进一步纯化，以作为抗原用于免疫原性制剂。一种方法是：浓缩过的病毒经超速离心而沉淀，超速离心的上清液被倾去，因而进一步除去血清组分。沉淀的病毒重悬于PBS或其他合适的基质中。浓缩过的病毒然后通过蔗糖密度梯度超速离心而纯化。另一种方法是，切向流超滤步骤中，保留液在经凝胶过滤之后，进行离子交换层析以进一步除去血清组分。生成的RS病毒材料经超速离心而再次沉淀。沉淀纯化的RS病毒可重悬于PBS中，储于-70℃备用。
病毒灭活
下一步是灭活纯化的RS病毒。这样的灭活使用能够使纯化病毒不具有感染性、不具有免疫强化作用，但具有免疫原性的物质来进行。本步骤中采用的灭活剂一般包括β-丙醇酸内酯、抗坏血酸或非离子去污剂。在灭活步骤中可采用的非离子去污剂可以是某些吡喃葡糖苷，包括正辛基-β-D-吡喃葡糖苷及正辛基-α-D-吡喃葡糖苷。
同提供一种不具有感染性、不具有免疫强化作用，但具有免疫原性的材料的愿望相一致的任何适合量的灭活剂以及任何期望的反应条件均可采用。
例如，RS病毒可以使用大约浓度为0.1％的β-丙醇酸内酯溶液灭活约30至120分钟，或用抗坏血酸灭活大约24小时，温度是37℃，要持续振荡。残留β-丙醇酸内酯可以通过用10,000至20,000分子量膜对PBS透析从灭活样品中除去。
棉鼠的免疫原性研究
该方法所提供的经纯化和灭活的RS病毒材料具有免疫原性和预防作用，同时又不具有感染性。这个结果是通过评定RS病毒物质在棉鼠体内的免疫原性而确定的，包括如下所述评定这些材料预防这些动物免受活RS病毒侵染的能力。本发明提供的疫苗制剂诱导RS病毒特异性中和抗体并预防棉鼠免受活病毒侵染。
显然对于本领域技术人员来说，本发明的各种实施方案在呼吸合胞病毒引起的疾病的接种预防、诊断、治疗以及免疫试剂的生产等领域有许多应用。关于此类应用的非限制性的进一步讨论，将在下面进一步叙述。
疫苗制备和应用
适于用作疫苗的免疫原性组合物，可以如本说明书所公开的那样，从灭活RSV制备。疫苗在受试者体内诱导免疫应答使其产生了抗RSV抗体。接种过的受试者被RSV侵染时，抗体和病毒结合并灭活病毒。
含有疫苗的免疫原性组合物可以制成注射剂、液体溶液或乳剂。灭活的RSV可与与其相容的药学上可接受的赋形剂混合。这些赋形剂包括：水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其混合物。另外免疫原性组合物及疫苗还可以包含辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、或用于提高其有效性的佐剂。实现佐剂效果的方法包括使用一些试剂，如氢氧化铝或磷酸盐(铝)，通常以0.05至0.1％浓度溶于磷酸盐缓冲液中使用。免疫原性组合物和疫苗可以通过皮下或肌肉注射肠胃外给药。另一种方法是，按本发明制备的免疫原性组合物，可以以能够在粘膜表面引起免疫应答的方式配制和给药，例如，免疫原性组合物可以通过经鼻或经口途径而在粘膜表面给药。此外，其他给药方法包括栓剂和口服制剂也都是可取的。对于栓剂，可以加入粘合剂和载体，例如，多聚(亚烷基)二醇和甘油三酯。口服制剂可含有通常采用的赋形剂，例如，药用级的糖精、纤维素以及碳酸镁。这些组合物可以呈溶液、混悬液、片剂、药丸、胶囊、持续释放制剂或粉剂形式，可以含有约1％至95％的本发明的灭活RSV。免疫原性制剂和疫苗以与剂型相适应的方式给药，给药量应能产生治疗效果、预防作用和免疫原性。给药的量取决于受试者，包括，例如，个体的免疫系统合成抗体的能力，以及需要时产生细胞介导的免疫应答的能力。所要求的活性成分的精确给药量取决于操作者的判断。然而，本领域的专业人员可以容易地确定合适的剂量范围。初次给药及增强免疫的合适方式也是变化的，但是可以包括初始给药后再后续给药。剂量也可以取决于给药途径并随宿主的体重而变化。
本发明的免疫原性组合物中灭活RS病毒的浓度一般是约1％至95％。一种仅含有一种病原体的抗原性物质的疫苗是单价疫苗。含有几种病原体的抗原性物质的疫苗是复合疫苗，也属于本发明的范畴。这种复合疫苗含有例如来自于不同病原体、同一病原体的不同株或不同病原体的组合的物质。
免疫测定
本发明的灭活RSV制剂可以用作免疫原，以产生与RSV蛋白起特异性反应的抗体(包括单克隆抗体)，而RSV蛋白可作为抗原用于免疫测定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫吸附测定(RIA)以及其它非酶联抗体结合测定或本领域已知的检测细菌抗体的方法。在ELISA测定中，灭活的RSV被固定到选择的表面上，例如，能够结合蛋白的表面如聚苯乙烯微量滴定板的小孔。在经过洗涤以除去不完全吸附的病毒之后，可能有非特异性蛋白例如已知对测试样品为抗原性中性的牛血清白蛋白(BSA)溶液结合到选择的表面上。这样封闭了固定化表面的非特异吸附位点，因而减弱了由表面的非特异结合引起的背景。
固定化表面然后和样品例如临床材料或生物学材料相接触，以一种有利于形成免疫复合物(抗原/抗体)的方式进行测试。这可以包括以稀释剂如BSA溶液、牛γ球蛋白(BGG)  和/或磷酸盐缓冲液(PBS)/Tween稀释样品。然后将样品在例如25℃至37℃范围的温度下温育2至4小时。温育之后，洗涤接触过样品的表面以除去非免疫复合物物质。洗涤步骤包括用溶液洗涤，例如用PBS/Tween或硼酸缓冲液。在测试样品和结合的灭活RSV形成特异性免疫复合物并随之洗涤之后，免疫复合物形成的发生率甚至其数量，都可以通过将免疫复合物和对第一抗体特异的第二抗体相反应而测定。如果测试样品是人来源的，第二抗体则是对人免疫球蛋白特异的抗体，通常是IgG。为了提供测试手段，第二抗体可以有相关的活性如一种酶活性，可以在与合适的发色底物共温育时显色。通过测定生色的程度，例如使用可见光分光光度计，可以进行定量。
                         实施例
以上公开内容概括地描述了本发明。参阅下面的具体实施例将会获得更全面的理解。描述这些实施例的唯一目的是说明本发明，而不是企图限制本发明的范围。在有需要或便利的情况下要考虑形式的改变及等价物的替代。尽管叙述中采用了下位概念，但目的是为了描述而不是为了限制。
测定半数组织培养物感染剂量(TCID50/mL)、空斑及中和滴度的方法在公开内容中没有详尽描述，但在科技文献中有详尽的报道并为本领域专业人员所熟知。蛋白质浓度以双辛可宁酸(BCA)法测定，如PierceManual(23220，23225；Pierce Chemical Company，U.S.A.)所描述，该文献通过引述引入本文。
CMRL 1969培养基用于细胞培养和病毒培养。此项研究中所用细胞是疫苗级非洲绿猴肾细胞(VERO批号M6)，从Institut Mérieux获得。所用RS病毒是A亚型RS病毒(Long株和A2株)，从American TypeCulture Collection获得；以及称为Tracy和RSV-3-D1T的新近的A亚型临床分离物。在下面的实施例中用每种RSV都获得了相近的结果。
实施例1：本实施例描述了非洲绿猴肾(VERO，批号M6)细胞的培养。
将非洲绿猴肾细胞培养在微载体小珠(Cytodex-1，Pharmacia)上，小珠浓度是2.5g/L，在pH8.0的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液中室温轻柔搅拌(50rpm)溶胀3小时。温育之后，倾去PBS液，再用1.5L PBS冲洗小珠。倾去上清，用PBS定容至2L。微载体小珠于121℃灭菌45分钟，用CMRL 1969细胞培养基在大发酵罐(40L)中平衡。在培养容器中接种VERO M6细胞，培养基是补充了胎牛血清(终浓度是5％)的CMRL 1969。
实施例2：本实施例描述了RS病毒在组织培养物上的培养。
细胞一旦长满了约90％，倾去培养上清并用CMRL 1969培养基洗涤细胞。细胞在无外加胎牛血清的培养基中用RS病毒感染，其感染复数(moi)是0.001。37℃轻柔搅拌1小时使病毒吸附在细胞上。吸附之后，细胞用CMRL 1969洗涤一遍，用CMRL 1969培养基温育。感染10天后，收集培养液(收集物I)，如实施例3所述进行处理，加入20％蔗糖贮于-70℃。往发酵罐内加入CMRL 1969，将感染病毒的细胞继续温育4天以收集第二个病毒收集物(收集物II)。第二病毒收集物如实施例3所述进行处理。液体中感染性病毒的滴度用空斑测定法检测。
实施例3：本实施例描述了RS病毒的处理
把在感染10天和14天后收集的、来自于RS病毒感染的VERO细胞的病毒液(收集物I和II)分别进行处理。每一病毒收集物用5μm孔径滤膜(死端过滤)微滤以除去细胞碎片。澄清的病毒上清液用100KDa分子量阻断膜通过切向流超滤(Sartorius)进一步浓缩。RS病毒保留液贮于-70℃。
实施例4：本实施例描述了通过超速离心浓缩RS病毒。
把RS病毒保留液于4℃以45,000rpm离心2小时，所用转子是50.2Ti Beckman固定角度转子。弃去上清，将沉淀的病毒重悬于pH7.3的磷酸盐缓冲液中。
实施例5：本实施例描述了通过蔗糖密度梯度离心纯化RS病毒。
把重悬的沉淀病毒在10-60％(w/v)线性蔗糖梯度上通过差速区带离心(24,000rpm，2小时，Beckman SW 28转子)进行进一步纯化。从35-40％区带收集弥散的病毒带，用PBS稀释到10％蔗糖浓度。纯化的病毒用Beckman 50.2Ti转子，45,000rpm超速离心90分钟进行进一步浓缩。弃去上清。沉淀出的病毒重悬于PBS，使其蛋白浓度为大约1mg/mL，并贮于-70℃。纯化的RS病毒用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，并用抗RSV特异抗体进行免疫印迹分析，发现其纯度至少是约60％，可以认为是基本去除了细胞和血清组分。
实施例6：本实施例描述了通过凝胶过滤和层析纯化和浓缩RS病毒
如实施例3所述制备的来自RSV-3-D1T的病毒保留液通过凝胶过滤和柱层析纯化和浓缩如下：
来自实施例4的病毒保留液过一个凝胶过滤柱(Sephacrye S-500)，该柱已用含有10mM氯化钠和20％甘油的pH7.3的10mM磷酸钠缓冲液平衡，以除去主要污染物牛血清白蛋白(BSA)。病毒在用上述缓冲液平衡的离子交换柱(DE-52，Whatman)上进一步纯化和浓缩。树脂用平衡缓冲液洗脱，然后用五倍柱体积的含有100mM氯化钠和20％甘油的pH7.3的10mM磷酸钠缓冲液洗脱。在此步骤中洗脱出了经过凝胶过滤纯化的病毒级分中仍然出现的非病毒组分，主要是BSA。用50mM磷酸钠和1.5M氯化钠从柱上洗脱病毒。
实施例7：本实施例描述了用正辛基-β-D-吡喃葡糖苷(OG)灭活RS病毒。
如实施例5和6所述制备的RS病毒，用正辛基-β-D-吡喃葡糖苷(1％wt/vol)室温下处理两个小时灭活。将病毒样品对磷酸缓冲盐水透析，以从蛋白混合物中除去去污剂。灭活病毒的感染力通过TCID50测试而测定，没有检测到感染性病毒。
实施例8：本实施例描述了正辛基-β-D-吡喃葡糖苷(OG)灭活的RS病毒制剂的免疫原性。
取六周龄棉鼠肌肉注射30μg/kg如实施例6所述制备的、磷酸铝吸附的OG灭活的RS病毒，或不相关抗原(安慰剂)。一组动物被鼻内接种100μl的大约100倍棉鼠感染剂量(CRID50)的活RS病毒。在第28天，所有动物都被抽血，除接种了活病毒的动物之外的所有动物，都用和初次接种相同剂量的含佐剂抗原加强免疫。加强免疫一周后(第35天)，采集血清样品。测定了RS病毒特异性中和滴度，结果在下面所列表1中给出。(表在说明书的末端)。
从表中可看出，初次血样(28天)的数据证明OG灭活的RS病毒制剂诱导了强的初次免疫反应。在4周时用等剂量含佐剂OG灭活RS病毒加强免疫的动物血清，其第35天的中和抗体滴度和接种了活病毒的动物血清的中和抗体滴度接近。在此提供的数据证明OG灭活RS病毒具有高度的免疫原性。
实施例9：本实施例描述了OG灭活RS病毒制剂在经免疫的棉鼠体内诱导预防性应答又不引起肺病理加重的能力。
为了评价正辛基-β-D-吡喃葡糖苷灭活RS病毒制剂的预防能力，给棉鼠接种活的RS病毒或用两个30μg剂量的灭活RS病毒或不相关抗原(安慰剂)注射，然后鼻内感染(加强剂量后7天)大约100倍棉鼠感染剂量(CRID50)的、培养于Hep 2细胞中的RS病毒A2株。病毒感染后的第4天，杀死半数动物。取肺，洗灌肺，生成的液体用来分析肺部病毒滴度和白细胞计数(作为肺发炎的量度)。病毒侵染后的第7天，处死其余动物，取其肺分析病毒水平。同时确定肺支气管洗出细胞的存在。用苏木精和曙红染色石蜡切片进行肺切片的组织病理学研究。
感染后第4天的肺RS病毒滴度在表2中总结。注射了不相关蛋白制剂的安慰剂对照动物，支持每克肺组织中6.6log10 TCID50单位病毒的复制。以OG灭活的RS病毒制剂免疫的动物，其肺部没有检测到病毒。这些结果证明了OG灭活RS病毒的预防能力。在所有测试的动物肺中，其第7天的RS病毒肺部滴度都很低(未给出数据)。这并不意外，因为通常到感染后7天时RS病毒从肺中清除出去。
用OG灭活的RS病毒制剂免疫的动物的肺灌洗细胞计数(表3)，比用不相关蛋白制剂(安慰剂)接种的动物的肺细胞计数明显降低。进一步说，在第7天，OG灭活RS病毒接种动物的细胞计数并不明显不同于安慰剂对照组计数，由于第7天的肺灌洗细胞计数并不明显高于安慰剂对照组计数，可以推断OG灭活RS病毒制剂在免疫动物遭受活病毒侵袭之后并不引起肺部炎症的加剧。
苏木精和曙红染色切片显示，被给予不相关蛋白制剂(安慰剂)的动物的肺具有最大的感染和炎症的指征，而以活病毒或OG灭活RS病毒制剂免疫的棉鼠肺则感染和炎症的迹象很小。结果总结在表8中。
基于这些结果，可以推断OG灭活的RS病毒制剂可以诱导预防性免疫应答，而并不促使肺部病理加剧。
实施例10：本实施例描述用β-丙醇酸内酯(BPL)灭活RS病毒。
把灭活剂β-丙醇酸内酯(0.1％w/v，溶于蒸馏水)通过用0.22Am孔径滤膜过滤而灭菌。如实施例5所述制备的纯化RS病毒和灭活剂以1∶1(v/v)比例混合，并在37℃持续振荡温育2小时。然后将病毒样品于4℃对PBS透析过夜以除去残留BPL，所用的透析膜是12000分子量阻断膜。处理过的病毒样品的感染力以空斑测试法评估。没有检测到具有感染性的病毒。透析过的样品贮于-70℃。
实施例11：本实施例描述了β-丙醇酸内酯灭活RS病毒的免疫原性和预防能力，以及该灭活病毒不引起肺病理加重。
取六周龄雌性棉鼠，肌肉注射10μg/kg β-丙醇酸内酯灭活的、吸附在磷酸铝上的RS病毒。安慰剂对照动物则用PBS加磷酸铝免疫。一组动物还鼻内灌注100CRID50的RS病毒。在第28天从动物体内取血，除用活病毒免疫的棉鼠外，其余动物都用同一剂量抗原制剂加强免疫。在第84天取血清样品测定RS病毒特异性中和滴度。为评价灭活RS病毒制剂预防动物免受活病毒侵袭的能力，将棉鼠用大约100CRID50的从棉鼠肺收集的RS病毒Tracy分离物鼻内感染。感染4天之后，处死动物，取肺，洗涤后测定所得到的液体的肺RS病毒滴度。
表4中总结了在用β-丙醇酸内酯灭活RS病毒免疫的动物血清中RS病毒特异性中和滴度。初次采血(第28天)的结果证明β-丙醇酸内酯灭活RS病毒制剂诱导了良好的初次免疫应答。而且，在4周时用等剂量的灭活RS病毒加强免疫的动物血清所具有的中和抗体的滴度，与接种活病毒的动物的滴度接近。
β-丙醇酸内酯灭活病毒制剂也能有效地预防棉鼠免受RS病毒侵袭，如表5所示的肺RS病毒滴度所证明。因此，用两个剂量的β-丙醇酸内酯灭活RS病毒制剂免疫的动物可以预防活RS病毒侵袭。肺病毒滴度的降低与用活病毒免疫的棉鼠体内测得的降低(0.6log10/g肺)接近。
按上面实施例9的方法，确定了β-丙醇酸内酯灭活的RSV制剂加重的肺病理。
这些研究的结果表明：β-丙醇酸内酯灭活RS病毒具有高度的免疫原性和预防作用。
实施例12：本实施例描述了用抗坏血酸灭活RS病毒。
抗坏血酸(10mg/mL)和硫酸铜(0.5mg/mL)溶液通过经0.22μm孔径滤膜过滤而灭菌。将按实施例5纯化的病毒与这些溶液混合，使得抗坏血酸的终浓度为1mg/mL，硫酸铜的终浓度为50μg/mL(4份病毒和上述溶液各0.5份)，混合物于37℃振荡温育24小时。
用空斑测试法评定经处理的病毒样品的感染性，未检测到具有感染性的病毒。透析后的样品贮于-70℃。
实施例13：本实施例描述了抗坏血酸灭活RS病毒的免疫原性和预防能力及该病毒不引起肺病理加重。
给棉鼠(5-8周龄)肌肉注射10μg/kg含磷酸铝佐剂的抗坏血酸灭活RSV(AAI-RSV)或磷酸铝对照(磷酸铝加PBS)。另一组动物鼻内接种约100倍棉鼠感染剂量(CRID50)(100μl)的活RS病毒。在第28天，从所有动物体内取血，除接种活病毒的动物外，所有其他动物都用与首次接种所用相同剂量的含助剂抗原进行加强免疫。加强免疫一周后(第35天)再次采集血清样品。测定RS病毒特异性中和滴度，结果在下表6中给出。
该表中给出的第一次取血(第28天)的结果证明，抗坏血酸灭活RSV制剂诱导出很强的初次免疫应答。另外，第二次免疫获得的结果表明，这些动物的血清的中和抗体滴度与用活病毒接种的动物血清的结果接近。
实施例14：本实施例描述了抗坏血酸灭活RS病毒制剂在经过免疫的棉鼠体内诱导预防性应答的能力
棉鼠用活RS病毒接种或用两个10μg剂量的AAI-RSV或安慰剂对照(PBS+磷酸铝)接种。加强免疫7天后，动物用约100CRID50的培养于Hep2细胞中的RS病毒A2株感染。病毒感染后的第四天，将半数的动物处死。取其肺进行灌洗，测定所得液体的肺病毒滴度。如前所述进行组织病理学分析。测得安慰剂对照动物肺组织中的肺病毒滴度为每克肺组织4.0log10TCID50单位(表7)。在用抗坏血酸灭活RS病毒制剂免疫的棉鼠的肺中没有检测到任何病毒。这些结果证明了抗坏血酸灭活RS病毒(AAI-RSV)疫苗制剂预防RS病毒感染同时又不引起肺病理加重的预防能力。
用抗坏血酸灭活RS病毒(AAI-RSV)免疫的动物血清中的RS病毒特异性中和滴度总结于表6。第一次取血(第28天)的结果证明，抗坏血酸灭活RS病毒制剂诱导出良好的初次免疫应答。另外，4周时用灭活疫苗加强免疫的动物血清的中和抗体滴度与用活病毒接种的动物血清的结果接近。
表7给出的肺RS病毒滴度表明，抗坏血酸灭活病毒制剂还能有效预防棉鼠被RS病毒感染。因此，用两个剂量的抗坏血酸灭活RS病毒制剂免疫的动物预防了活RS病毒感染。肺病毒滴度的降低与用活RS病毒免疫的棉鼠接近，并且未回收到病毒。
这些数据表明，AAI-RSV制剂能够在受免疫动物的血清中诱导出病毒特异性中和抗体，并预防棉鼠的活病毒感染。
                       公开内容概要
概括来讲，本发明提供了一种能在其免疫宿主中产生RS病毒特异性免疫应答的新的免疫原性组合物，该组合物包括纯化的灭活RS病毒。本发明还提供了制备及使用该组合物的方法。在本发明的范围内可以做一些修改。
表1：用OG灭活RS病毒免疫的棉鼠血清中的RS病毒中和抗体滴度
免疫原     病毒中和滴度(log2/0.05mL)1
    免疫后28天     免疫后35天
安慰剂     0.0(0.0)     0.0(0.0)
活RS病毒     4.0(0.0)     4.2(1.1)
OG灭活RS病毒     4.0(0.7)     4.4(0.5)
1 4个样品的GMT值，标准差在括号( )中。
表2：用OG灭活RS病毒免疫的棉鼠肺中的RS病毒滴度
免疫原           肺病毒滴度(GMTlog10/g肺±S.D.)1   P值(t检验)
安慰剂            4.6(0.5)      ---
活RS病毒            1.5(1.0)     ＜0.001
OG灭活RS病毒            1.0(0.0)     ＜0.001
1 4个样品的GMT值，标准差在括号( )中。
表3：用OG灭活RS病毒免疫并经RS病毒感染
     的棉鼠支气管灌洗液的肺细胞计数
免疫原          肺细胞计数1
    感染后4天     感染后7天
安慰剂     24(5)     27(14)
活RS病毒     2(1)     9(2)
OG灭活RS病毒     6(2)     30(17)
1   4个样品的GMT值，标准差在括号( )里。
      表4：用β-丙醇酸内酯灭活RS病毒免疫的
         棉鼠血清中的RS病毒中和抗体滴度
免疫原     病毒中和滴度(log2/0.05mL)1
    免疫后28天   免疫后84天
安慰剂     2.5(0.60)     1.3(1.2)
活RS病毒     7.7(1.2)     6.7(0.6)
β-丙醇酸内酯灭活RS病毒     5.0(0.7)     6.0(0.0)
1  4个样品的GMT值，标准差在括号( )里。
表5：用β-丙醇酸内酯灭活的RS病毒免疫的棉鼠肺中的RS病毒滴度
免疫原     肺病毒滴度1
安慰剂      4.3(0.5)
活RS病毒      0.6(1.0)
β-丙醇酸内酯灭活RS病毒      0.6(1.0)
1 GMT值。标准差在括号( )内。
表6：用抗坏血酸灭活RS病毒免疫的棉鼠血清中的RS病毒中和抗体滴度
免疫原     病毒中和滴度(log2/0.05mL)1
    免疫后28天     免疫后35天
安慰剂     2.6(0.5)     2.4(0.5)
活RS病毒     9(0)     8.8(0.5)
抗坏血酸灭活RS病毒     8.6(0.6)     8.4(0.6)
1  4个样品的GMT，标准差在括号( )内。
表7：用抗坏血酸灭活RS病毒免疫的棉鼠肺中的RS病毒滴度
免疫原     肺病毒滴度(GMTlog10/g肺±S.D.)1
安慰剂                4±0.27
活RS病毒                 0±0
抗坏血酸灭活病毒                 0±0
1  6个样品的GMT值，标准差在括号( )里。
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Claims (17)

1.一种能够在用其免疫的人类宿主体内产生人呼吸合胞体病毒特异性免疫应答的免疫原性组合物，包括纯化的灭活人呼吸合胞体病毒和其载体，所述病毒不含细胞和血清组分，且不具有感染性、不具有免疫强化作用，但具有免疫原性和可预防作用。
2.权利要求1的组合物，该组合物被制成供体内给予人类宿主以预防人类由人呼吸合胞体病毒引起的疾病。
3.权利要求1或2的组合物，其中所说的载体还包括一种佐剂。
4.权利要求1至3中任一项的组合物，它被配制成供以注射形式、鼻内、口服、或粘膜表面给药的制剂。
5.一种制备能够在用其免疫的人类宿主体内产生人呼吸合胞体病毒特异性免疫应答的不具有免疫强化作用的免疫原性组合物的方法，该方法包括：
在一种细胞系中培养人呼吸合胞体病毒以产生一种培养病毒；
收获所说的培养病毒以产生收获的病毒；
在非变性条件下纯化所说的收获的病毒以产生不含细胞和血清组分的纯化病毒；
用灭活剂灭活所说的纯化病毒，得到一种不具有感染性、不具有免疫强化作用，但具有免疫原性的呼吸合胞体病毒；
将所说的不具有感染性、不具有免疫强化作用但具有免疫原性的呼吸合胞体病毒制成所说的免疫原性组合物。
6.权利要求5的方法，其中所说的灭活剂是β-丙醇酸内酯、非离子去污剂或抗坏血酸。
7.权利要求6的方法，其中所说的非离子去污剂选自正辛基-α-D-吡喃葡糖苷和正辛基-β-D-吡喃葡糖苷。
8.权利要求5至7中任一项的方法，其中所说的细胞系是疫苗级连续细胞系。
9.权利要求8的方法，其中所说的连续细胞系是VERO细胞系。
10.权利要求5至9中任一项的方法，其中所说病毒的培养是在微载体珠存在下进行的。
11.权利要求5至10中任一项的方法，其中所说的培养病毒的收获是通过从所说培养步骤中收集培养液进行的，所说收集的培养液进行所说的纯化步骤。
12.权利要求5至11中任一项的方法，其中所说的纯化步骤是如下进行的：微滤去除细胞碎片，切向流超滤去除血清组分，然后或者(a)通过超速离心沉淀超滤物以进一步去除血清组分，并对沉淀物进行蔗糖密度梯度离心，或者(b)凝胶过滤以进一步去除血清组分，并进行离子交换层析以进一步去除血清组分。
13.权利要求12的方法，其中所说的切向流超滤采用一种约100至300KDa额定分子量阻断膜进行。
14.一种测定样品中存在的与人呼吸合胞体病毒蛋白特异反应的抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将样品和权利要求1至4中任一项的免疫原性组合物接触，以生成复合物，该复合物包含不具有感染性、不具有免疫强化作用但具有免疫原性的呼吸合胞体病毒和样品中存在的所说的与之特异反应的抗体；
(b)测定该复合物的产生。
15.一种用于测定样品中与人呼吸合胞体病毒蛋白特异性反应的抗体存在的诊断试剂盒，该试剂盒包括：
(a)权利要求1-4中任一项的免疫原性组合物；
(b)用于使不具有感染性、不具有免疫强化作用，但具有免疫原性的呼吸合胞体病毒与样品接触，以产生包含不具有感染性、不具有免疫强化作用但具有免疫原性的呼吸合胞体和样品中存在的所说抗体的复合物的工具；
(c)用于测定复合物产生的工具。
16.一种纯化的灭活人呼吸合胞体病毒，它不含有细胞和血清组分，当用于免疫原性组合物中时，不具有感染性、不具有免疫强化作用，但具有免疫原性和预防作用。
17.一种纯化的灭活人呼吸合胞体病毒在制备一种在用其免疫的人类宿主体内产生人呼吸合胞体病毒特异性免疫应答的免疫原性组合物中的应用，所述病毒不含有细胞和血清组分，不具有感染性、不具有免疫强化作用，但具有免疫原性和预防作用。
CN94193703A 1993-08-06 1994-08-04 灭活的呼吸合胞体病毒疫苗 Expired - Lifetime CN1103603C (zh)

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