KR100402379B1 - 불활성화된호흡기신시튬바이러스백신 - Google Patents

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Abstract

면역원적 조성물로 면역화되는 사람 숙주내에서 사람의 호흡기 신시튬(RS) 바이러스 특이성 면역 반응을 생성할 수 있는 면역원적 조성물은, 세포 및 혈청 성분들이 실질적으로 없고 비-감염성, 비-면역강화성, 면역원적이고 보호적인, 정제된, 비활성화된 사람의 RS 바이러스를 포함한다. 바이러스는 백신성질 세포계에서 길러지고 수확된 바이러스는 비-변성적인 조건하에서 정제되어 세포 및 혈청 성분들이 실질적으로 없게한다. 정제된 RS 바이러스는 β-프로피오락톤, 비-이온성 세제, 특별히 n-옥틸-α-D-글루코피라노사이드과 n-옥틸-β-D-글루코파라노사이드, 또는 아스코르브산을 사용하여 비활성화된다. 면역원적 조성물은 사람 숙주로 생체내 주입을 위하여 백신으로서 형식화될 수 있다. 면역원적 조성물은 진단적인 응용에서 사용될 수도 있다.

Description

비활성화된 호흡기 신시튬 바이러스 백신
본 발명은 면역학에 관한 것으로서, 특히 비활성화된 호흡기 신시튬(RS) 바이러스 백신들에 관한 것이다.
관련된 출원들에 대한 참조
본 출원은 1993년 8월 6일에 출원되어 공동 출원 계류 중인 미국 특허 출원번호 제 08/102,742호의 일부 계속 출원이다.
발명의 배경
사람의 호흡기 신시들 바이러스는 유아들이나 어린이들 사이의 하부 기도 감염의 주요한 원인이다(참조자료 1 내지 3- 참조자료들의 리스트는 명세서의 끝에 보여지며 첨부된 이 참조자료들의 각각은 여기에 참고로 넣어졌다). 전세계적으로, 매년 6천 5백만명이 감염되고 그 결과로 160,000명이 죽는다(참조자료 4). 미국에서만도, 한 해에 100,000명의 어린이들이 RS 바이러스에 의한 폐렴이나 세기관지염 때문에 입원을 필요로 한다(참조자료 5, 6). 미국에서 매년 RS 바이러스에 감염된 어린이들을 입원시키거나 통원치료하는데 3억 4천만 달러가 넘는 비용이 들고 있다(참조자료 7). RS 바이러스 감염으로 인한 심각한 하부 기도 질병은 주로 2세 내지 6세의 어린이들에게서 발생하고 있다(참조자료 8). 미국에서 매년 대략 4,000명의 어린이들이 RS 바이러스와 파라인플렌쟈 타입 3 바이러스(PIV-3) 감염에 의하여 유발된 심각한 기도 질병의 합병증으로 죽는다. 세계보건기구(WHO)와 알레르기와 전염성 질병의 국립연구소(National Institute of Allergy and Infectious Disease, NIAID)의 백신 자문 위원회에서는 백신 개발에 있어서 RS 바이러스를 HIV 바이러스 다음으로 두 번째인 것으로 등급을 매겼다.
RS 바이러스는 뉴모바이러스 속(pneumovirus genus)의파라믹소바이러스과의 일원이다(참조자료 2). 두 개의 주요한 방어항원들은 막 퓨전(F)과 부착(G) 당단백질들이다(참조자료 9). F 단백질은 디설파이드-결합된 F1(48kDa) 및 F2(20kDa) 폴리펩티드 조각들로 단백질분해되는 68 kDa의 전구체분자(F0)로서 합성된다(참조자료 10). G 단백질(33 kDa)은 O-글리코실레이트되어 겉보기분자량이 90 kDa인 당단백질이 된다(참조자료 11). RS 바이러스의 두 개의 넓은 서브타입으로 A와 B가 정의되어있다(참조자료 12). 이러한 서브 타입들 간의 주요한 항원적인 차이점들은 G 당단백질에서 발견되었다(참조자료 7, 13).
안전하고 효과적인 RS 바이러스 백신이 절실히 요구된다. 이러한 RS 바이러스 백신들의 개발에 대한 접근법들은 바이러스를 포름알데히드로 비활성화, 추위-적응된 및/또는 온도-민감성 돌연변이 바이러스들의 분리, 및 바이러스의 방어항원들의 분리를 포함하고 있다. 임상 시도 결과들에 의하면, 살아있는 감쇠되고 포르말린-비활성화된 백신들은 RS 바이러스 감염에 대하여 접종받은 사람을 적절하게 보호하지 못하였다(참조자료 14 내지 16). 비강내로 투여된 추위-적응된 및/또는 온도-민감성 RS 바이러스 돌연변이들에 나타난 문제들은 임상적인 이환(罹患)상태, 유전적인 불안정성 및 과다감쇠 등의 문제들을 포함하고 있다(참조자료 17 내지19). 피하로 투여된 살아있는 RS 바이러스 백신 또한 효과가 없다(참조자료 20). 비활성화된 RS 바이러스 백신들은 전형적으로 포름알데히드를 비활성화제로서 사용함에 의하여 조제되어 왔다. 머피(Murphy) 등은 포르말린-비활성화된 RS 바이러스 백신으로 면역화된 유아들과 어린이들에서의 면역 반응에 대한 데이터들을 보고하였다(참조자료 21). 유아들(2 내지 6 월령)은 F 당단백질에 대한 높은 역가의 항체들을 발전시켰으나, G 단백질에 대하여는 부실한 반응을 보였다. 좀 더 나이가 든 경우(7내지 40 월령)의 개개인들은 RS 바이러스로 감염된 어린이들에 필적할 정도의 역가의 F와 G 항체들을 발전시켰다. 그러나, 유아들 및 어린이들은 모두 자연적인 RS 바이러스 감염들에 필적하는 나이의 사람들에서 발전시켰던 것보다 낮은 수준의 중화하는 항체들을 발전시켰다. 주요한 면역학적 RS 바이러스 단백질들인 F(퓨전) 및 G(부착) 단백질들에 대한 높은 역가의 항체들과 낮은 중화하는 항체 역가의 이러한 불균형적인 면역 반응은 부분적으로는 포르말린 처리에 의한 F 와 G 당단백질들에서의 주요한 에피토프들의 교체에 기인한 것일 것이다. 더욱이, 포르말린-비활성화된 RS 바이러스 백신을 맞은 몇몇 유아들은 후에 자연적인 RS 바이러스에 노출되었을 때, 비-면역된 경우보다 더 심각한 하부 기도 질병을 발전시켰다(참조자료 15, 16). 그러므로, 포르말린-비활성화된 백신들은 사람이 사용하기에는 적합하지 않은 것으로 여겨져 왔다.
포르말린-비활성화된 RS 바이러스 백신으로 면역화된 코튼-쥐들에서 변형된 면역 반응의 흔적이 또한 보여졌다(참조자료 22). 더욱이, 코튼 쥐들에서 RS 바이러스 포르말린-비활성화된 백신의 평가는 또한 살아있는 바이러스의도전(challenge)을 받았을 때, 면역화된 동물들이 증강된 폐 조직병리를 발전시켰음을 보였다(참조자료 23).
포르말린-비활성화된 RS 바이러스 백신 조제품에 의하여 유발되는 질병 강화(potentiation)의 메카니즘이 정의되어야 할 것으로 남아있지만 이는 효험있는 RS 바이러스 백신의 개발에 주요한 장애물이다. 그러한 강화는 부분적으로 F및 G 당단백질들에 대한 포르말린의 작용에 기인한 것이다. 부가적으로, 질병 강화의 비-RS 바이러스 특이성 메카니즘이 제안되었는데, 이는 백신 조제품에 존재하는 오염된 세포 또는 혈청 성분들에 대한 면역학적 반응이 부분적으로 악화된 질병에 기여할 수 있다는 것이다(참조자료 24). 참으로, HEp-2 세포들의 용해물(lysate)로 백신접종되고 HEp-2 세포들에 대하여 길러진 RS 바이러스에 의하여 도전받은 생쥐들 및 코튼 쥐들은 증강된 폐염증성 반응을 보였다.
더욱이, 산성 pH의 용출을 사용한 면역친화성 크로마토그래피에 의하여 정제된 RS 바이러스 당단백질들은 면역원적이고 보호적일 뿐만 아니라 코튼 쥐들에서 면역강화를 유도하였다(참조자료 22, 25).
RS 바이러스에 의하여 유발되는 질병에 대한 보호를 부여하는데 효험이 있을 뿐만 아니라 면역강화와 같은 원하지 않는 부작용을 유발하지 않는 백신들을 포함한, 면역학적인 조제약에 대한 필요성이 확실히 남아있다. 또한, RSV 감염을 진단하기 위한 항원들과, 예를 들어 RS 바이러스에 의하여 유발되는 질병의 진단에 사용하기 위한 RSV 단백질을 특이적으로 인지하는 항체들(모노크로날 항체들을 포함하여)을 생성하기 위한 면역원들이 또한 필요하다.
RSV 백신들의 개발에 대한 이 기술분야에서 인정된 접근법들은 최근의 개관 논문들에 요약되어 있는데(참조자료 2, 31 내지 35),이 논문들의 어느 것도 비활성화된 RSV 백신의 개발을 제안한 것이 없다.
발명의 요약
본 발명은 정제된 RS 바이러스의 비활성화에 의하여 그러한 항원들과 면역원들을 공급하는 새로운 접근 방식을 제공한다.
본 발명의 한 측면에서, 면역화된 숙주, 특히 사람 숙주에서, 호흡기 신시튬(RS) 바이러스 특이성 면역 반응을 보일 수 있는 면역원적 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 먼저 RS 바이러스가 적당한 세포계(cell line) 위에서 길러지고 바이러스들이 수확된다. 수확된 바이러스들은 비-변성 조건들하에서 정제되어 세포 및 혈청 성분들이 실질적으로 없는 정제된 바이러스가 생산된다. 그런 다음 정제된 바이러스는 비활성화제에 의하여 비활성화 되어 비-감염성, 비-면역강화성 및 면역원적인 RS 바이러스가 생산된다. 그런 다음 이 RS 바이러스는 면역원적 조성물로서 조제된다.
비활성화제는 β-프로피오락톤; n-옥틸-α-D글루코피라노사이드와 n-옥틸-β-D-글루코 피라노사이드를 포함한 비-이온성 세제; 또는 아스코르브산일 수 있다.
수확된 바이러스에 대하여 수행되는 정제 단계는 바람직하게는 세포 파편을 제거하는 마이크로여과, 혈청 성분들을 제거하는 접선방향흐름 초여과, 특히 약 100 내지 약 300 kDa의 명목상의 분자량을 가지는 차단 막을 사용하며, 초(ultra)원심분리에 의하여 초여과된 물질을 작은 덩어리(pellet)로 만들어 혈청 성분들을 더 제거하고, 작은 덩어리로 된 물질을 수크로스(sucrose)밀도 그레디언트 원심분리하는 단계에 의하여 달성될 수 있다. 다르게는, 접선방향흐름 초여과로부터 남아있는 물질은 겔 여과를 한 다음, 혈청 성분들을 더욱 제거하기 위하여 이온-교환 크로마토그래피를 할 수 있다.
이러한 과정은 그것에 의하여 숙주에서 RS 바이러스 특이성 면역 반응을 유발할 수 있는 새로운 면역원적 조성물을 제공하는데 이는 본 발명의 또 다른 측면이다. 그러한 면역원적 조성물은 세포 및 혈청 성분들이 실질적으로 없고 비-감염성, 비-면역강화성, 면역원적이고 보호적인, 정제되고 비활성화된 RS 바이러스와 이를 위한 캐리어를 포함한다. 이러한 면역원적 조성물은 RS 바이러스에 의해 야기되는 질병으로부터 사람을 보호하기 위해 사람숙주에 대한 생체내 투여를 위한 백신으로 조제될 수 있다. 이 면역원적 조성물을 위한 캐리어는 면역보강제를 포함할 수 있다. 그러한 면역원적 조성물은 비강 또는 구강으로 주사될 수 있는 형태로, 투여되어지는 백신으로서 조제될 수 있다.
본 발명은 또한 RS 바이러스에 의하여 유발되는 질병에 대하여 숙주, 특히 사람을 면역시키는 방법을 더 제공하는데, 이 방법은 본 발명에 의하여 제공된 면역원적 조성물의 효과적인 양을 숙주에 투여하는 단계를 포함한다. 그러한 과정에 의하여 면역화되는 숙주는 유아들, 어린이들, 임신부, 임신가능한 나이의 여자, 나이든 사람들, 면역타협적인 사람들 및 다른 감염되기 쉬운 사람들로부터 선택되어질 수 있다.
본 발명에서 제시된 비활성화된 RS 바이러스는 또한 RS 바이러스에 의한 감염을 알아내는 진단시약으로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 샘플내에서 RS 바이러스 단백질들과 특이적으로 반응하는 항체들의 존재를 결정하는 방법을 더 구비하고, 이 방법은,
(a) 본 발명에 의한 면역원적 조성물과 샘플을 접촉시켜서 비-감염성, 비-면역강화성 및 면역원적인 RS 바이러스와 이것과 특이적으로 반응하는 샘플내에 존재하는 어떠한 항체들을 포함하는 복합체들을 생성하는 단계; 및
(b) 이 복합체들의 생산을 결정하는 단계를 포함한다.
부가적으로, 본 발명은 샘플내에서의 RS 바이러스 단백질들의 존재를 결정하는 방법을 제공하며, 이 방법은,
(a) 대상을 본 발명에 의한 면역원적 조성물로 면역화하여 RS 바이러스 단백질들에 대해 특이성 있는 항체들을 생성하는 단계;
(b) 그 항체들과 샘플을 접촉시켜서 샘플내에 존재할 수 있는 어떠한 RS 바이러스 단백질들과 RS 바이러스 단백질-특이성 항체들을 포함하는 복합체들을 생성하는 단계; 및
(c) 복합체들의 생산을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 RS바이러스 단백질들과 특이적으로 반응하는 샘플내의 항체들의 존재를 결정하기 위한 진단도구(kit)을 더 제공하며, 이 도구는,
(a) 본 발명에 의한 면역원적 조성물;
(b) 비-감염성, 비-면역강화성 및 면역원적 RS 바이러스와 샘플을 접촉시켜서 비-감염성, 비-면역강화성 및 면역원적 RS 바이러스와 샘플내에 존재하는 어떠한 항체들을 포함하는 복합체들을 생성하는 수단; 및
(c) 복합체들의 생산을 결정하기 위한 수단을 포함한다.
RS 백신 조제약들에 관한 종래 기술의 어려움을 고려하여 볼 때, 비-감염성이고 비-면역강화성이면서 면역원성과 보호적인 능력을 보이는 면역원적 조성물을 제공하는 본 발명에 의한 공정들은 놀라운 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 사람의 백신으로 사용되기에 적합한 조건들하에서 비활성화된 호흡기 신시튬 바이러스의 제조에 관련된다. RS 바이러스, 서브타입들 A 또는 B는 백신성질(quality) 세포계, 특히 VERO 세포들일 것인 세포계 위의 제어된 발효기(fermenter)들 내에서 조직배양으로 길러진다. 바이러스들을 수확한 후에,바이러스들은 정제되고 그런 다음 비활성화된 RS 바이러스 백신을 생성하기 위하여 비활성화된다.
세포들의 증식
아프리카 녹색 원숭이 신장 (VERO) 세포들과 같은, 백신성질 세포계들은 일반적으로 마이크로캐리어 비드들(Cytodex-1)위에서 길러진다. 그러한 비드들은 일반적으로, pH가 약 6.9 내지 8.2인 포스페이트 완충된 살린(PBS)과 같은 완충된 용액내에서 칼슘 및 마그네슘 없이 상온에서 2 내지 4시간동안 느린 교반(30 내지 50 rpm)에 의하여 부풀려진다. 세척된 비드들은 30 내지 60분 동안 110℃ 내지 130℃에서 멸균되고, 스피너 플라스크들 또는 작거나(2 내지 10ℓ ) 큰(20 내지 2000ℓ) 제어된 배양기내에서 CMRL 1969와 같은 세포배양매질내의 상태에 둔다. 그런 다음, 용기는 태아 소 혈청(fetal bovine serum; FBS)으로 보충된 CMRL 1969 백신성질 VERO 세포들로 파종된다(예를 들어, ㎖당 0.5×105내지 2×105세포들).
RS 바이러스 증식
일단 세포들이 대략 80 내지 90% 융합하면(세포파종이후 3 내지 5일), 배양 상층액을 따르지고 세포들은 CMRL 1969와 같은 배양매질로 한 번 세척한다. 그런 다음 세포들은 FBS가 없이 CMRL 1969 내에서 RS 바이러스로 감염된다. 바이러스 흡착 후에, 감염된 세포들은 배양매질내에서 세척되고 감염후 5 내지 7일 동안 바이러스 증식이 모니터된다.
바이러스 프로세싱과 농축
그런 다음 수확된 바이러스는 비-변성 조건들 하에서 정제되어 세포 및 혈청 성분들이 실질적으로 없도록 한다. 그러한 정제는 어떠한 형편에 맞는 방식에 의하여 수행될 수 있다. 그러한 방식 중에 하나에서, RS 바이러스 상층액이 마이크로여과(0.22 내지 8㎛의 구멍 크기의 필터들)되어 세포파편들이 제거된다. 그런 다음, 정화된 바이러스성 용액은 약 100 내지 300 kDa의 분자량 차단을 가지는 초여과 막을 사용하는 접선방향흐름 초여과에 의하여 농축되어 혈청 성분들이 제거될 수 있다.
농축된 RS 바이러스는 면역원적인 제조들에서 항원들로서 사용되기 위하여 더욱 정제된다. 한 과정에서, 농축된 바이러스는 초원심분리에 의하여 작은 덩어리로 될 것이며, 초원심분리에 의한 상층액이 버려져서 혈청 성분들이 추가로 제거된다.작은 덩어리로 된 바이러스는 PBS 또는 다른 적당한 매질내에서 다시 부유된다. 그런 다음, 농축된 바이러스는 수크로스밀도 그레디언트 초원심분리에 의하여 정제된다. 다르게는, 접선방향흐름 초여과 단계로부터의 남아있는 물질은 겔 여과 후에 이온-교환 크로마트그래피되어 혈청 성분들이 더 제거된다. 결과적인 RS 바이러스 물질은 초원심분리에 의하여 더 작은 덩어리로 될 것이다. 작은 덩어리로 된 정제된 RS 바이러스는 PBS내에서 다시 부유될 것이며, 미결정인 사용을 위하여 -70℃에서 저장될 수 있다.
바이러스 비활성화
다음으로 정제된 RS 바이러스는 비활성화된다. 이러한 비활성화는 정제된 바이러스를 비-감염성, 비-면역강화성 및 면역원적인 형태로 제공하는 물질들을 이용하여 달성된다. 이 단계에서 사용되는 비활성화제는 일반적으로 β-프로피오락톤, 아스코르브산 또는 비-이온성 세제를 포함한다. 비활성화 단계에서 사용될 수 있는 비-이온성 세제들로는 n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드와 n-옥틸-α-D-글루코피라노사이드를 포함하는 글루코피라노사이드들이 있다.
비활성화 시료의 어떠한 편리한 양과 어떠한 원하는 반응 조건들이 비-감염성, 비-면역강화성 및 면역원적인 물질을 제공하기 위한 요구에 일치하게 사용될 수 있다.
예로서, RS 바이러스는 약 30 내지 120분 동안의 β-프로피오락톤(BPL) 또는 약 24 시간동안의 아스코르브산의 약 0.1% 용액을 약 37℃에서 일정하게 흔들어 비활성화될 수 있다. 남아있는 BPL은 10,000 내지 20,000 분자량 막을 사용하는 PBS에 대한 투석법에 의하여 비활성화된 샘플로부터 제거될 수 있다.
코튼 쥐들의 면역원성 연구들
이러한 과정에 의하여 제공된 정제되고 비활성화된 RS 바이러스 물질은 비-감염성이면서 면역원적이고 보호적이다. 이러한 결과는 아래에서 보고되는 바와 같이, 살아있는 RS 바이러스 도전으로부터 코튼쥐들을 보호하는 능력을 포함하여 이 코튼쥐들에서 RS 바이러스 물질들의 면역원성의 평가에 의하여 결정되었다. 여기서 제공된 백신 조제품들은 RS 바이러스 특이성 중화 항체들을 유도하고 코튼쥐들을 살아있는 바이러스의 도전으로부터 보호하였다.
이 기술분야에서 숙련된 사람에게는 본 발명의 여러 가지 실시예들이 백신접종, 진단, 호흡기 신시튬 바이러스에 의하여 유발된 질병들의 치료 및 면역학적 시약들의 생성의 분야들에서 많은 응용들을 가지는 것이 명백하다. 그러한 사용들의 비-제한적인 논의가 아래에 기술되어 있다.
백신 제조와 용도
백신들로서 사용되기 적합한 면역원적 조성물들은 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 비활성화된 RSV로부터 만들어질 수 있다. 백신은 항-RSV 항체들을 생산하는 피험자(subject)에서 면역 반응을 유도한다. 만약 백신접종된 피험자가 RSV에 의하여 도전 받았다면, 항체들이 바이러스에 결합하여 바이러스를 비활성화시킨다.
백신들을 포함하는 면역원적 조성물들은 액체 용액들 또는 에멸션과 같이 주사될 수 있는 형태로 제조 될 수 있다. 비활성화된 RSV는 이것에 적합한 약리학적으로 받아들여질 수 있는 부형제들과 혼합될 수 있다. 그러한 부형제들은 물, 살린, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 이것들의 조합들을 포함할 수 있다. 면역원적 조성물들과 백신들은 습윤제 또는 에멀션화제들, pH 완충제들, 또는 그것들의 효과를 증강시키는 면역보강제와 같은 보조 물질들을 더 함유할 수 있다. 면역 보강 효과를 달성하는 방법들은 일반적으로 포스페이트 완충된 살린내에서 0.05 내지 0.1 퍼센트 용액으로 사용되는 알루미늄 하이드록사이드 또는 포스페이트(alum)와 같은 작용제들의 사용을 포함한다. 면역원적 조성물들과 백신들은 피하로 또는 근육내로, 비경구적으로 투여될 수 있다. 다르게는, 본 발명에 의하여 형성된 면역원적 조성물들은 점막표면들에서 면역 반응을 일으키는 방식으로 조제되고 전달될 수 있다. 따라서, 이러한 면역원적 조성물은 예를 들어 코나 입의 경로를 통해 점막표면들에 투여될 수 있다. 다르게는, 좌약과 경구 제제품(formulation)을 포함한 다른 방식의 투여가 가능하다. 좌약의 경우, 결합제들(binder) 및 케리어들은 예를 들어 폴리알칼렌 글리콜들 또는 트리글리세라이드들을 포함한다. 경구 제제품들은 예를 들어 약리학적인 등급들의 사카린, 셀룰로스 및 마그네슘 카보네이트와 같은 시초물들(incipients)을 포함할 수 있다. 이러한 조성물들은 용액, 서스펜션, 정제, 환제, 캡슐, 지속방출제제품 또는 분말의 형태를 가질 수 있고, 본 명세서에서 제시된 비활성화된 RSV를 약 1 내지 95% 함유할 수 있다. 면역원적 조제물들 및 백신들은 투여량공식(dosage formulation)에 적합한 방식으로, 치료학적으로 효과적이며, 보호적이고 면역원적인 양으로 투여된다. 투여되는 양은, 예를 들어 항체들을 합성하는 그리고 필요하다면 세포-매개된 면역 반응을 생성하는 개인의 면역시스템의 능력을 포함하여, 처리되는 피험자에 따라 다르다. 투여하는데 필요한 활성적인 성분의 정확한 양들은 개업의사의 판단에 달려 있다. 그러나, 이 기술의 숙련된 사람은 적절한 투여량 범위를 쉽게 정할 수 있다. 초기의 투여와 추가 투여량의 적합한 체제들(regime) 또한 가변적이나, 초기의 투여와 뒤따르는 후속 투여들을 포함한다. 투여량 또한 투여경로에 따라 달라질 수 있고, 숙주의 크기에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 따른 면역원적 조성물내의 비활성화된 RS 바이러스의 농도는 약 1 내지 95%이다. 단지 하나의 병원균의 항원물질을 함유하는 백신은 1가의 백신이다. 여러 가지 병원균들의 항원물질을 함유하는 백신들은 조합된 백신들이며 이것 또한 본 발명에 속한다. 그러한 조합된 백신들은 예를 들어, 다양한 병원균들로부터의 또는 동일한 병원균의 여러 가지 계통들로부터의 또는 다양한 병원균들의 조합으로부터의 물질을 포함한다.
면역검정
본 발명에 의한 비활성화된 RSV 조제품들은 효소결합면역흡착검정들(ELISA), RIA들 및 다른 효소미결합(non-enzyme linked)항체결합검정들 또는 박테리아성 항체들을 알아내는 기술에서 알려진 절차들을 포함하는 면역 효력검정들에서의 항원들처럼 RSV 단백질들과 특이적으로 반응하는 (단일 클론 항체들을 포함한) 항체들의 발생을 위한 면역원들로서 유용하다. ELISA 검정들에서, 비활성화된 RSV는, 예를 들어 폴리스티렌 마이크로역가 플레이트의 웰들과 같은 단백질을 결합할 수 있는 표면과 같은, 선택된 표면에 고정된다. 불완전하게 흡착된 바이러스를 제거하기 위하여 세척한 후에, 시험 샘플에 대하여 항원적으로 중성인 것으로 알려진 소혈청알부민(BSA)의 용액과 같은 비특이성 단백질은 선택된 표면에 결합될 수 있다. 이것은 고정된 표면에 비특이성 흡수부위들의 블로킹을 허용하고 따라서 그 표면에 대해 비특이성 결합들에 의해 야기되는 배경을 감소시킨다.
그런 다음, 고정된 표면은 면역 복합체(항원/항체) 형성에 도움이 되는 방식으로 시험되게 하기 위하여, 임상적인 또는 생물학적인 물질들과 같은 샘플들과 접촉된다. 이것은, BSA, 소의 감마 글로불린(BGG) 및/또는 포스페이트 완충된 살린(PBS)/Tween의 용액들과 같은 희석제들로 샘플들을 희석시키는 것을 포함한다. 그런 다음, 샘플들은 약 25℃ 내지 37℃와 비슷한 온도에서 2 내지 4시간동안 배양된다. 배양 후에, 샘플접촉된 표면은 세척되어 비-면역복합체 물질을 제거하게 된다. 세척 과정은 PBS/Tween 또는 보레이트 완충액과 같은 용액으로 세척하는 것을 포함한다. 시험 샘플과 결합된 비활성화된 RSV사이의 특이성 면역복합체들의 형성 후에, 뒤이어 세척하여, 면역복합체 형성의 출현, 및 그 양까지도 이 면역복합체를 1차 항체에 대해 특이성을 갖는 제 2의 항체를 겪게 함으로써 결정될 것이다. 시험 샘플이 사람의 것이라면, 제 2항체는 사람의 면역글로불린들과 일반적으로 IgG에 대하여 특이성을 가지는 항체이다. 검출수단을 제공하기 위하여, 제 2항체는 예를 들어, 적절한 색소원 기질로 배양하였을 때 발색현상을 발생하는 효소활성과 같은 관련된 활성을 가질 것이다. 그런 다음, 정량화는 예를 들어, 가시광선 스펙트라 스펙트로포토미터를 사용하여 발색정도를 측정함에 의하여 달성될 것이다.
전술의 개시내용은 본 발명을 일반적으로 기술한 것이다. 다음의 특정한 실시예들을 참조하여 본 발명을 더욱 완벽하게 이해할 수 있다. 이러한 실시예들은 단지 설명을 위한 것이지, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 형태의 변경들 및 치환하는 등가물들은 상황에 따라서 에상될 수 있는 것이다. 여기서 특정 용어가 사용된다하더라도, 그러한 용어들은 설명을 위한 것이지 제한을 위한 것은 아니다.
조직 배양 감염성 투여량50(TCID50/㎖), 플라크 및 중화 역가들을 결정하는 방법들은 본 명세서에 명쾌하게 설명되어 있지 않으나, 과학적 문헌에 널리 보고되어 있는 것이고 본 발명이 속하는 분야에서 숙련자들의 범위내에 있다. 단백질 농도들은, 참조자료에 포함되어 있는 피어스 매뉴얼(23220, 23225; 피어스 화학 회사, 미국)내에 설명된 바와 같은, 비친코닌산(bicinchoninic acid; BCA) 방법에 의하여 결정되었다.
CMRL 1969 배양 매질은 세포배양과 바이러스 증식을 위하여 사용되었다. 본 연구에서 사용된 세포들은 메리욱스() 인스티튜트로부터 얻어진 백신성질 아프리카녹색원숭이 신장세포들(VERO lot M6)이다. 사용된 RS 바이러스들은 미국 타입 배양 수집(American Type Culture Collection, ATCC)으로부터 얻어진 RS 바이러스 서브타입 A(긴 A2 계통들)와 트레이시(Tracy)와 RSV-3-DIT로 표시되는 최근 서브타입 A 임상적 분리물들이다. 각 RSV에 대한 다음의 실시예들에서 비교가능한 결과들이 얻어졌다.
실시예 I: 이 실시예는 아프리카녹색원숭이 신장 (VERO, lot M6) 세포들의 증식을 설명한다.
아프리카녹색원숭이 신장 (VERO) 세포들이 마이크로캐리어 비드들(Cytodex-1, Pharmacia) 위에서 길러졌다. 2.5g/L의 농도에서 사용된 비드들은 칼슘과 마그네슘이 없이, pH 8.0 포스페이트 왼충된 살린 (PBS) 내에서 상온에서 3시간 동안 천천히 교반(50rpm)시켜 부풀려졌다. 이러한 배양기간 후에 PBS 용액을 따르고 비드들은 1.5L PBS을 사용하여 한 번 세척되었다. 상층액은 따라내고 PBS의 부피는 2L가 되도록 한다. 마이크로캐리어 비드들은 45분 동안 121℃에서 살균되고, 대형(40L) 발효기내의 CMRL 1969 세포 배양 매질내에서 조절되었다. 배양 용기는, 태아 소의 혈청이 보충된(5% 최종농도) CMRL 1969 배양 매질내의 VERO, M6 세포들로 파종되었다(105세포/㎖).
실시예 II:이 실시예는 조직 배양에서 RS 바이러스의 증식을 설명하는 것이다.
일단 세포들이 90퍼센트 합류에 이르면, 배양 상층액은 따라내고 세포들을 CMRL 1969 배양 매질로 세척한다. 세포들을, 외생첨가된 (exogenously-added) FBS가 없는 배양 매질내에서 0.001의 감염중복도(multiplicity of infection, moi)로 RS 바이러스로 감염시킨다. 바이러스는 부드럽게 저어주면서 37℃에서 1시간동안 세포들에 흡수되도록 한다. 흡수기간 후에, 세포들은 CMRL 1969로 한번 세척되고, CMRL 1969 배지로 배양된다. 감염 뒤 열흘 후에, 배양액은 수확되고(수확 I), 실시예 III에서 설명된 바와 같이 처리되고 20% 수크로스의 존재 하에 -70℃에서 저장된다. 그런 다음, CMRL 1969가 발효기로 첨가되고, 바이러스-감염된 세포들은 부가적으로 4일 동안 배양되어 제 2바이러스 수확(수확 II)을 얻는다. 그런 다음, 이러한 제 2바이러스 수확은 실시예 Ⅲ에서 설명된 바와 같은 과정을 거친다. 용액에 존재하는 감염성 바이러스의 역가는 플라크 검정에 의하여 모니터되었다.
실시예 Ⅲ: 이 실시예는 RS 바이러스의 프로세싱을 설명하는 것이다.
감염후 10일 및 14일 후에 수집된 RS바이러스-감염된 VERO 세포들로부터의 바이러스성 액체(수확 I,Ⅱ)는 별도로 프로세싱된다. 각 바이러스 수확은 5㎛ 구멍 크기 필터를 사용하여 마이크로필터(막힌 끝 여과)되어 세포 파편들을 제거한다. 정화된 바이러스 상층액은, 100 kDa 분자량차단 막을 사용하여 접선방향흐름 초여과에 의하여 더욱 농축된다. RS 바이러스 잔여물은 -70℃에서 저장되었다.
실시예 Ⅳ: 이 실시예는 초여과에 의한 RS바이러스의 농축을 설명하는 것이다.
RS 바이러스 잔여물은 4℃에서 2시간동안, 50.2 Ti 베크만 고정된 각 로터를 사용하여 45,000 rpm에서 원심분리되었다. 상층액은 버려지고 덩어리진 바이러스는 포스페이트 완충된 살린(PBS) pH 7.3내에서 재부유되었다.
실시예 V: 이 실시예는 수크로스 밀도 그레디언트 원심분리에 의한 RS 바이러스의 정제를 설명하는 것이다.
재부유된 덩어리진 바이러스는 선형 10-60% (w/v) 수크로스 그레디언트들위의 비율 지역 원심분리(베크만 SW 28 로터, 24,000×rpm에서 2시간)에 의하여 더욱 정제되었다. 35-40% 지역으로부터 수확된 확산 바이러스 밴드는 PBS내에서 희석되어 수크로스 농도가 최종 10%가 된다. 정제된 바이러스는, 베크만 50.2 Ti 로터내에서 45,000 rpm으로 90분 동안 초원심분리에 의하여 더욱 농축된다. 상층액은 버린다. 덩어리진 바이러스는 PBS에서 재부유되어 단백질의 농도가 약 1mg/㎖가 되도록 하고, -70℃에서 저장된다. 정제된 RS 바이러스는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 항-RSV 특이성 항체들을 사용한 면역빨아들이기(immunoblotting)에 의하여 분석되었고, 적어도 약 60%의 순도를 가지는 것으로 밝혀졌는데, 이는 세포와 혈청 성분들이 실질적으로 없는 것으로 여겨진다.
실시예 VI: 이 실시예는 겔 여과와 크로마토그래피에 의한 RS 바이러스의 정제와 농축을 설명하는 것이다.
실시예 Ⅲ에서 설명된 바에 따라서 준비된 RSV-3-DIT로부터의 바이러스 잔여물은 다음과 같이 겔 여과와 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제되고 농축된다.
실시예 IV로부터의 바이러스 잔여물은 10mM 염화나트륨과 20% 글리세롤을 함유하는 10mM 인산나트륨 버퍼, pH 7.3내에서 평형화된 겔 여과칼럼(Sephacrye S-500)을 통과하여 주요한 오염물질인 소 혈청 알부민(BSA)을 제거한다. 바이러스는 상기한 버퍼내에서 평형화된 이온교환칼럼(DE-52, Whatman)에서 더욱 정제되고 농축된다. 수지는 평형 버퍼로 세척되고, 그런 다음 10mM 인산나트륨 pH 7.3, 100mM 염화나트륨 및 20% 글리세롤을 함유하는 버퍼의 5배 칼럼 부피로 세척된다. 이러한 단계에서, 겔 여과에 의하여 정제된 바이러스 부분 내에 아직도 존재하는 주로 BSA인 비-바이러스성 성분들이 용출된다. 바이러스는 50 mM 인산나트륨와 1.5M 염화나트륨을 사용하여 칼럼으로부터 용출되었다.
실시예 Ⅶ: 이 실시예는 n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드(OG)에 의한 RS 바이러스의 비활성화를 설명하는 것이다.
실시예 V와 Ⅵ에서 설명된 바에 따라서 준비된 RS 바이러스는 n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드(1% 질량/부피)로 상온에서 2시간 동안 처리함에 의하여 비활성화된다. 그런 다음, 바이러스성 샘플은 인산염 완충된 살린에 대하여 투석되어 단백질 혼합물로부터 세제를 제거한다. 비활성화된 바이러스의 감염성은 TCID50검정에 의하여 테스트되었고 감염성 바이러스가 검출되지 않았다.
실시예 Ⅷ: 이 실시예는 n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드(OG)-비활성화된 RS 바이러스 조제물의 면역원성을 설명하는 것이다.
6주된 코튼 쥐들이 실시예 VI에 설명된 바에 따라서 제조된 인산알루미늄 흡착된 OG-비활성화된 RS 바이러스 또는 관계없는 항원(플라시보)의 30㎍/kg으로 근육내로 주사되었다. 일단의 동물들이, 100㎕내에 살아있는 RS 바이러스의 약 100 코튼 쥐 감염성 투여량들(CRID50)로 비강내로 접종되었다. 28일째, 모든 동물들이 채혈되고 살아있는 바이러스가 주어진 것들을 제외한 모두가 초기 접종에서 사용된 것과 동일한 투여량의 보강된 항원을 사용하여 추가 주사되었다. 추가 주사 후 일주일(35일 째)에 혈청 샘플들이 얻어졌다. RS 바이러스 특이성 중화 역가들이 결정되었고 아래에 도시된 표 1에 제시되어 있다. (표들은 명세서의 끝에 제시되어있다).
이 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 첫 번째 채혈(28일 째)로부터 얻어진 데이터는 OG-비활성화된 RS 바이러스 조제물이 강한 주요한 면역 반응을 유발하는 것을 증명했다. 동등한 투여량의 면역보강된 OG-비활성화된 RS 바이러스로 4주째 추가 주사된 동물들로부터의 혈청들은 35일째에, 살아있는 바이러스로 접종된 동물들의 혈청들에서 얻어지는 것들에 필적하는 중화 항체 역가들을 가졌다. 여기에 제시된 데이터는 OG-비활성화된 RS 바이러스가 매우 면역원적이라는 것을 증명한다.
실시예 IX: 이 실시예는 면역화된 코튼 쥐들내에서 증강된 폐 병리를 야기함 없이, 보호적인 반응을 유도하는 OG-비활성화된 RS 바이러스 조제물의 능력을 설명하는 것이다.
n-옥틸-β-d-글루코피라노사이드-비활성화된 RS 바이러스 조제물의 보호적인 능력을 평가하기 위하여, 살아있는 RS 바이러스로 접종되거나 두번의 30㎍ 투여량의 비활성화된 RS 바이러스 또는 관계없는 항원(플라시보)이 주사된 코튼 쥐들이, Hep2 세포들내에서 길러진 A2 계통의 RS 바이러스의 약 100 코튼 쥐 감염성 투여량들(CRID50)에 의하여 비강내로 도전되었다(추가 주사 후 7일째). 바이러스 도전 후 4일째에, 이 동물들의 반이 죽임을 당했다. 그들의 폐가 제거되었고, 세척되고 결과적인 용액들이 폐 바이러스 역가들 및 백혈구 수(폐 염증의 지수로서) 둘 다를 위해 평가되었다. 바이러스 도전 후 7일째에, 남아있는 동물들이 희생되어 그들의 폐가 제거되고 바이러스 레벨들을 위하여 평가되었다. 폐 세기관지 세척 세포들의 존재 또한 결정되었다. 조직병리가 파라핀절편들의 헤마톡실린 및 에오신 착색들을 사용하여 폐절편들에 대해 수행되었다.
도전 후 4일째의 폐 RS 바이러스 역가들이 표 2에 정리되었다. 관련없는 단백질 조제물이 주입된 플라시보 대조군 동물들은 폐조직의 그램 당 6.6 log10TCID50단위의 바이러스 복제를 입증하였다. OG-비활성화된 RS 바이러스 조제물로 면역화된 동물들의 폐들에서는 바이러스가 검출되지 않았다. 이러한 결과들은 OG-비활성화된 RS 바이러스의 보호능력을 증명한다. 시험된 모든 폐들에서 7일째에 RS 바이러스 폐 역가들(데이터는 보여지지 않음)이 최소였다. 이것은, RS 바이러스가 일반적으로 도전 후 7일에는 폐로부터 제거되므로, 예기치 않은 것은 아니다.
OG-비활성화된 RS 바이러스 조제물로 면역화된 동물들의 폐 세척 세포 카운트들(표 3)은 관계없는 단백질 조제물(플라시보)로 접종된 동물들이 폐로부터의 세포 카운트들보다 훨씬 낮았다. 더욱이, OG-비활성화된 RS 바이러스 접종된 동물들로부터 7일째 세포 카운트들은 플라시보 대조군 카운트들과 크게 다르지 않았다. 7일째 폐 세척 세포 카운트들은 플라시보 대조군 카운트들보다 그리 크지 않기 때문에, OG-비활성화된 RS 바이러스 조제물은, 살아있는 바이러스 도전을 받은 후의 면역화된 동물들에서 증강된 폐 염증을 유발하지는 않는다는 결론을 내릴 수 있다.
헤마톡실린 및 에오신 착색된 절편들에 의하면, 관계없는 단백질 제제약(플라시보)이 주어진 동물들의 폐들은 감염 및 염증의 최고지수들을 가졌으며, 반면에 살아있는 바이러스 또는 OG-비활성화된 RS 바이러스 조제물로 면역화된 코튼 쥐들의 폐들은 감염이나 염증의 최소 증상을 가졌다. 그 결과들은 표 8에 요약되어 있다.
이러한 결과들에 기초하여, OG-비활성화된 RS 바이러스 조제물은 악화된 폐 병리를 유발함 없이 보호적인 면역 반응을 유발할 수 있다고 결론내릴 수 있다.
실시예 X: 이 실시예는 β-프로피오락톤(BPL)을 이용한 RS 바이러스의 비활성화를 설명하는 것이다.
비활성화제인, β-프로피오락톤(증류수 내의 0.1% w/v)이 0.22Am 구멍크기의 필터를 통하여 여과됨에 의하여 살균되었다. 실시예 V에서 설명된 바 처럼 준비된 RS 바이러스는 비활성화 시료와 1:1비율(v/v)로 혼합되고 일정하게 흔들면서 37℃에서 2시간동안 배양되었다. 이 바이러스 샘플은 12000분자량 차단막을 사용하여 PBS에 대하여 4℃에서 밤새도록 더 투석되어 남아있는 BPL을 제거하였다. 처리된 바이러스 샘플의 감염성은 플라크 검정으로 평가되었고 감염된 바이러스는 검출되지 않았다. 투석된 샘플은 -70℃에서 저장되었다.
실시예 XI: 이 실시예는 β-프로피오락톤-비활성화된 RS 바이러스의 면역원성 및 방어능력과 이것이 증강된 폐 병리를 유발하지 않는다는 것을 설명하는 것이다.
6주된 암컷 코튼 쥐들이 인산알루미늄에 흡수된 BPL-비활성화된 RS 바이러스 10㎍/kg으로 근육내로 주입되었다. 플라시보 대조군 동물들은 인산 알루미늄을 더한 PBS로 면역되었다. 또한, 일단의 동물들이 RS 바이러스의 100 CRID50으로 비강내로 주입되었다. 28일째, 동물들은 채혈되고, 살아있는 바이러스로 면역화된 코튼 쥐들을 제외하고 항원 형성의 동일한 투여량으로 추가 자극되었다. 혈청 샘플들이 84일째에 얻어졌고 RS바이러스-특이성 중화 역가들이 결정되었다. 비활성화된 RS 바이러스 조제물이 살아있는 바이러스의 도전으로부터 동물들을 보호하는 능력을 평가하기 위하여, 코튼 쥐들이 코튼 쥐 폐들로부터 수확된 RS 바이러스 트레이시분리물의 약 100 CRID50으로 비강내로 도전되었다. 바이러스 도전 4일 후, 동물들이 희생되어, 그들의 폐들이 제거되며, 세척되고 결과적인 액체들이 폐 RS 바이러스 역가들을 위하여 평가되었다.
BPL-비활성화된 RS 바이러스로 면역화된 동물들의 혈청내의 RS바이러스-특이성 중화 역가들이 표 4에 요약되어 있다. 첫 번째 채혈(28일 째)로부터의 결과들에 의하면, BPL-비활성화된 RS 바이러스 제제물은 좋은 초기 면역 반응을 유도하는 것이 증명되었다. 더욱이, 4주에 비활성화된 RS 바이러스의 동등한 투여량으로 추가 주사된 동물들로부터의 혈청이 살아있는 바이러스로 접종된 동물들내에서 얻어지는 것에 필적할만한 중화 항체 역가들을 가졌다.
표 5에 제시된 폐 RS 바이러스 역가들에 의하여 알 수 있는 바와 같이, BPL-비활성화된 바이러스 조제물은 또한 코튼 쥐들을 RS 바이러스의 도전으로부터 보호하는데 효과적인 것을 알 수 있다. 따라서, EPL-비활성화된 RS 바이러스 조제물의 2배의 투여량으로 면역화된 동물들은 살아있는 RS-바이러스 도전으로부터 보호되었다. 폐 바이러스 역가의 감소는 살아있는 RS 바이러스로 면역화된(0.6log10/g폐) 코튼 쥐들에서 보였던 것에 필적한다.
β-프로피오락톤-비활성화된 RSV 조제물에 대한 증강된 폐 병리는 위의 실시예 IX에서와 같이 결정되었다.
이러한 연구들로부터 얻어지는 결과들은 BPL-비활성화된 RS 바이러스가 매우 면역원적이며 보호적이라는 것을 보여준다.
실시예 XII: 이 실시예는 아스코르브산으로 RS 바이러스의 비활성화를 설명하는 것이다.
아스코르브산의 용액(10mg/㎖)과 황산구리용액(0.5mg/㎖)이 0.22㎛ 구멍 크기의 필터를 통한 여과에 의하여 살균되었다. 실시예 VI에서 설명된 바와 같이 정제된 바이러스가 이러한 용액들과 혼합되어 1mg/㎖ 아스코르브산과 50㎍/㎖ 황산구리로 된 최종농도(각 용액의 4 편의 바이러스와 0.5 편의 바이러스)가 되고 그 혼합물은 흔들면서 24시간동안 37℃에서 배양되었다.
처리된 바이러스 샘플의 감염성은 플라크 검정에서 평가되었고 감염성 바이러스가 발견되지 않았다. 투석된 샘플은 -70℃에서 저장되었다.
실시예 XⅢ: 이 실시예는 아스코르브산-비활성화된 RS 바이러스의 면역원성과 보호능력을 설명하고 이것이 증강된 폐 병리를 유발하지 않는다는 것을 설명하는 것이다.
코튼 쥐들(5 내지 8주된)이 인산알루미늄 또는 플라시보 대조군(알루미늄 더하기 PBS)으로 보조된 아스코르브산 비활성화된 RSV(AAI-RSV) 10㎍/kg으로 근육내로 주사되었다. 또 다른 그룹의 동물들이 살아있는 RS 바이러스의 약 100마리 코튼 쥐들의 감염투여량들(CRID50) (100㎕내)로 비강내로 접종되었다. 28일째, 모든 동물들이 채혈되었고, 살아있는 바이러스가 주어졌던 것들을 제외한 모든 동물들이 초기 접종에 사용되었던 보강된 항원의 동일한 투여량을 사용하여 추가 주사되었다. 혈청 샘플들이 또한 추가 주사 1주 후에(35일 째) 취해졌다. RS 바이러스-특이성 중화 역가들이 결정되었고 아래의 표 6에 나타나있다.
이 표에 나타낸 첫 번째 채혈(28일 째)로부터 얻어진 결과들에 의하면, 아스코르브산 비활성화된 RSV 제제물이 강한 초기면역반응을 유도하는 것을 알 수 있다. 더욱이, 제 2면역화 후에 얻어진 결과들에 의하면, 이러한 동물들의 혈청들은 살아있는 바이러스로 접종된 동물들의 혈청들에서 얻어지는 것들에 필적하는 중화 항체 역가들을 가졌다는 것을 알 수 있다.
실시예 XIV: 이 실시예는 아스크로빅 산-비활성화된 RS 바이러스 제제물이 면역화된 코튼 쥐들내에서 보호 반응을 유도하는 능력을 설명하는 것이다.
코튼 쥐들은 살아있는 RS 바이러스로 접종되거나 또는 AAI-RSV의 2개의 10㎍ 투여량들 또는 플라시보 대조군(PBS+알루미늄)으로 주사되었다. 추가 주사 7일 후, 동물들은 Hep2 세포들에서 길러진 A2 계통의 RS 바이러스의 약 100 CRID50으로 도전을 받았다. 바이러스 도전 4일 후에, 동물들의 반이 죽임을 당했다. 그들의 폐가 제거되며, 세척되고 결과적인 액체들이 양쪽의 폐 바이러스 역가들을 위하여 평가되었다. 조직병리가 앞에서 설명된 바와 같이 수행되었다. 플라시보 대조군 동물들의 폐 조직에서의 폐 바이러스 역가들은 폐 조직 그램 당 4.0 log10TCID50단위로 밝혀졌다(표 7). 아스코르브산 비활성화된 RS 바이러스 조제물로 면역화된 코튼 쥐들의 폐에서는 바이러스가 발견되지 않았다. 이러한 결과들은 아스코르브산 비활성화된 RS 바이러스(AAI-RSV) 백신 조제물이 폐 병리의 증강을 유도함이 없이 RS 바이러스 도전으로부터 보호하는 보호능력을 증명하는 것이다.
아스코르브산-비활성화된 RS 바이러스(AAI-RSV)로 면역화된 동물들의 혈청내의 RS 바이러스-특이성 중화 역가들이 표 6에 요약되어있다. 첫 번째 채혈(28일 째)로부터의 결과들은 아스코르브산-비활성화된 RS 바이러스 조제물이 좋은 초기면역반응을 유도한다는 것을 증명하였다. 더욱이, 4주에 비활성화된 백신으로 추가 주사된 동물들로부터의 혈청들은 살아있는 바이러스로 접종된 동물들에서 얻어진 것에 필적하는 중화 항체 역가들을 가졌다.
표 7에 나타낸 폐 RS 바이러스 역가들에 의하면, 아스코르브산-비활성화된 바이러스 조제물은 또한 코튼 쥐들을 RS 바이러스 도전으로부터 보호하는데 효과적이라는 것을 알 수 있다. 따라서, 아스코르브산-비활성화된 RS 바이러스 조제물의 2배 투여량들로 면역화된 동물들은 살아있는 RS 바이러스 도전으로부터 보호되었다. 폐 바이러스 역가들의 감소는 살아있는 RS 바이러스로 면역화된 코튼 쥐들에서 보였던 것에 필적하며 어떠한 바이러스도 재생되지 않았다.
이러한 데이터에 기초하여, AAI-RSV 조제물은 면역화된 동물들의 혈청내에 바이러스 특이성 중화 항체를 유도할 수 있으며, 코튼 쥐들을 살아있는 바이러스 도전으로부터 보호한다는 것을 알 수 있다.
개시의 요약
본 개시를 요약하면, 본 발명은, 정제된 비활성화된 RS바이러스를 포함하는, RS바이러스 특이성 면역 반응을 유도할 수 있는 신규한 면역원적 조성물과 그들의제조방법들과 사용법을 제공한다. 변형들이 본 발명의 범위 내에서 가능하다.
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참조문헌들

Claims (14)

  1. 면역원성 조성물로 면역화되는 사람 숙주내에서 사람의 호흡기 신시튬 (RS) 바이러스 특이성 면역반응을 생성할 수 있는 면역원성 조성물에 있어서, 세포주에서 증식 및 수확되고, 비변성된 조건들하에 정제되어 세포 및 혈청 성분들이 실질적으로 없으며, 베타-프로피오락톤, n-옥틸-알파-D-글루코피라노사이도와 n-옥틸-베타-D-글루코피라노사이드로 구성된 비 이온성세제 또는 아스코르브산에서 선택된 불활성화제에 의하여 불활성화된 사람의 호흡기 신시튬 (RS) 바이러스, 및 그것을 위한 캐리어를 포함하는 면역원성 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 사람의 RS 바이러스에 의하여 유발되는 질병으로부터 사람을 보호하기 위하여 사람 숙주에 대해 생체내로 투여하기 위한 백신으로서 제제화(formulation)되는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 캐리어는 보조제(adjuvant)를 더 포함하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 주사될 수 있는 형태로, 코속으로, 입속으로 또는 점막 표면으로 투여 될 수 있도록 제제화되는 조성물.
  5. 면역원성 조성물로 면역화되 는 사람 숙주내에서, 사람의 호흡기 신시튬(RS)바이러스 특이성 면역 반응을 생산할 수 있는, 비-면역 강화성, 면역원성 조성물을 제조하는 방법에 있어서,
    증식된 바이 러스를 생성하기 위하여 세포주에서 사람의 RS 바이러스를 증식시키는 단계;
    수확된 바이러스를 생성하기 위하여 상기 증식된 바이러스를 수확하는 단계;
    세포 및 혈청 성분들이 실질적으로 없는 정제된 바이러스를 생성하기 위하여 비-변성 조건들하에서 상기 수확된 바이러스를 정제하는 단계;
    비-감염성, 비-면역잠재성 및 면역원성 인 RS 바이러스를 제공하기 위하여 베타-프로피오락톤, n-옥틸-알파-D-글루코피라노사이도와 n-옥틸-베타-D-글루코피라노사이드로 구성된 비이온성세제 또는 아스코르브산에서 선택된 비활성화제로 상기 정제된 바이러스를 불활성화시키는 단계; 및
    상기 비-감염성, 비-면역강화성이고 면역원성인 RS 바이러스를 상기 면역원성 조성물로서 제재화하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 세포주는 백신성질의 연속적인 세포주인 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 연속적 인 세포주는 VERO 세포주인 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 바이러스의 상기 증식은 마이크로캐리어 비드들의 존재 하에서 달성되는 방법.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 증식된 바이러스의 상기 수확은 상기 증식시키는 단계로부터 의 배양액을 수집함에 의해 달성되고 수집된 배약액은 상기 정제하는 단계가 행해지는 방법.
  10. 제 5항에 있어서, 상기 정제하는 단계는 세포파편을 제거하기 위한 마이크로여과, 혈청성분들을 제거하기 위한 접선방향 흐름 초여과, 그리고 그 다음의 (a) 혈청성분들을 더 제거하기 위하여 초원심분리에 의하여 초여과된 물질을 덩어리지게 하는 단계 및 덩어리진 물질을 수크로스 밀도구배 원심분리되게 하는 단계, 또는 (b) 혈청성분들을 더 제거하기 위한 겔 여과 및 부가적으로 혈청성분들을 제거하기 위한 이온-교환 크로마토그래피하는 단계에 의하여 달성되는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 접선방향 흐름 초여과는 100 내지 300 kDa 분자량 차단 막을 사용하여 달성되는 방법.
  12. 사람의 RS바이러스 단백질들과 특이적으로 반응하는 샘플내 항체들의 존재를 결정하는 진단도구에 있어서,
    (a) 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물;
    (b) 비-감염성, 비-면역강화성 및 면역원성인 RS바이러스와 샘플을 접촉시켜, 비-감염성, 비-면역강화성 및 면역원성 RS바이러스와 샘플내에 존재하는 상기항체들을 포함하는 복합체들을 생성하는 수단; 및
    (c) 상기 복합체들의 생성을 결정하는 수단을 포함하는 진단도구.
  13. 세포주에서 증식 및 수확되고, 비변성된 조건들 하에 정제되어 세포 및 혈청 성분들이 실질적으로 없으며, 베타-프로피오락톤, u-옥틸-알파-D-글루코피라노사이도와 n-옥틸-베타-D-글루코피라노사이드로 구성된 비이온성세제 또는 아스코르브산에서 선택된 불활성화제에 의하여 불활성화된 비감염성, 비면역강화성, 면역원성 및 보호적인 면역원성 조성물에 사용되는 사람의 호흡기 신시튬 바이러스.
  14. 사람의 RS바이러스 특이성 면역 반응을 그 바이러스로 면역화된 사람 숙주에서 생성하기 위한 면역원성 조성물의 제조방법에 있어서, 세포주에서 증식 및 수확되고, 비변성된 조건들 하에 정제되어 세포 및 혈청 성분들이 실질적으로 없으며, 베타-프로피오락톤, n-옥틸-알파-D-글루코피라노사이도와 n-옥틸-베타-D-글루로피라노사이드로 구성된 비이온성세제 또는 아스코르브산에서 선택된 불활성화제에 의하여 불활성화된, 비감염성, 비면역강화성, 면역원성 및 보호적인 사람의 호흡기 신시튬(RS) 바이러스를 이용하는 면역원성 조성물의 제조방법.
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