ES2141065T3

ES2141065T3 - Preparacion de vacuna de sub-unidades contra el virus respiratorio sincitial.

Info

Publication number: ES2141065T3
Application number: ES97930274T
Authority: ES
Inventors: George A. Cates; Sonia E. Sanhueza; Raymond P. Oomen; Michel H. Klein
Original assignee: Aventis Pasteur Ltd; Aventis Pasteur SA
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd; Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1996-07-12
Filing date: 1997-07-11
Publication date: 2005-05-01
Anticipated expiration: 2017-07-11
Also published as: JP2000501418A; WO1998002457A1; CA2259594C; RU2243234C2; CN1145639C; EP1477494A1; NZ334115A; AU716378B2; DE69731659D1; US6020182A; EP0942928B1; EP0942928B2; BR9712970A; CN1230197A; AU3431197A; DE942928T1; DE69731659T3; HK1022704A1; EP0942928A1; ES2141065T5

Abstract

PROTEINAS DE FUSION (F), DE ENLACE (G) Y DE MATRIZ (M) DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO (RSV) QUE SE AISLAN Y PURIFICAN A PARTIR DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO POR EXTRACCION AL DETERGENTE SUAVE DE LAS PROTEINAS DEL VIRUS CONCENTRADO. ESTE PROCEDIMIENTO CONSISTE EN CARGAR LA PROTEINA EN UNA COLUMNA DE HIDROXIAPATITA U OTRA COLUMNA DE MATRIZ INTERCAMBIADORA DE IONES Y EN ELUIR LA PROTEINA CON UN TRATAMIENTO SUAVE CON SAL. DICHAS PROTEINAS F, G Y M, FORMULADAS EN FORMA DE COMPOSICIONES INMUNOGENAS, SON SEGURAS Y ALTAMENTE INMUNOGENAS Y PROTEGEN MODELOS ANIMALES PERTINENTES CONTRA LA ENFERMEDAD DEBIDA A LA INFECCION PROVOCADA POR EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO.

Description

Preparación de vacuna de sub-unidades contra el virus respiratorio sincitial.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere al ámbito de la inmunología y concierne particularmente a preparaciones de vacunas contra la infección por el virus respiratorio sincitial.

Plano secundario de la invención

El virus respiratorio sincitial humano es la causa principal de las infecciones de las vías respiratorias inferiores en los niños de pecho y niños jóvenes (referencias 1 a 3 - una lista de las referencias se encuentra al final de la divulgación y cada una de las referencias de la lista se incorpora aquí a título de referencia). A escala mundial se declaran cada año 65 millones de infecciones, que causan 160.000 muertes (referencia 4). Solo en USA puede que deban hospitalizarse 100.000 niños por una neumonía y una bronquiolitis provocada por el virus RS en un solo año (referencias 5, 6). Las asistencias en medio hospitalario y las asistencias ambulatorias para los niños que tienen infecciones por el virus RS cuestan anualmente más de 340 millones de dólares en USA (referencia 7). La enfermedad grave de las vías respiratorias inferiores debida a la infección por el virus RS aparece de manera predominante en los niños de pecho con edades de dos a seis meses (referencia 8). Aproximadamente 4.000 niños de pecho mueren cada año en USA por las complicaciones que se derivan de enfermedades graves de las vías respiratorias provocadas por una infección con el virus RS y el virus Parainfluenza de tipo 3 (PIV-3). La Organización Mundial de la Salud (OMS) y el comité consultivo para las vacunas del Instituto Nacional de la Alergia y Enfermedad Infecciosa han clasificado el virus RS justo en segunda posición tras el HIV para el desarrollo de una vacuna.

La estructura y la composición del RSV se ha elucidado y descrito con detalle en el manual "Fields Virology", B.N. Fields y col., Raven Press, N.Y. (1996), en particular capítulo 44, páginas 1313-1351, "Respiratory Syncytial Virus" por P. Collins, K. McIntosh y R.M. Chanock (referencia 9).

Los dos antígenos importantes protectores del RSV son las glicoproteinas de fusión de la envoltura (F) y de unión (G) (referencia 10). La proteína F se sintetiza como una molécula precursora (F_{0}) de alrededor de 68 kDa que se escinde de manera proteolítica en fragmentos de polipéptidos F_{1}(alrededor de 48 kDa) y F_{2}(alrededor de 20 kDa) unidos por un puente disulfuro (referencia 11). La proteína G (alrededor de 33 kDa) se O-glicosila en bruto, que conduce a una glicoproteína de peso molecular aparente de alrededor de 90 kDa (referencia 12). Se han definido dos grandes subtipos del virus RS como A y B (referencia 13). Las mayores diferencias antigénicas entre esos subtipos se encuentran en la proteína G mientras que la glicoproteína F es más conservada (referencias 7, 14).

Además de la respuesta de anticuerpos generada por las glicoproteínas F y G, se ha demostrado que las células T citotóxicas humanas producidas por la infección por el RSV reconocen la proteína F, la proteína de matriz M, la nucleoproteína N, y una proteína pequeña hidrófoba SH y la proteína no estructural 1b del RSV (referencia 15).

No se dispone de una vacuna segura y eficaz contra el RSV y se requiere con toda urgencia. Las aproximaciones sobre el desarrollo de vacunas contra el virus RS han incluido la inactivación del virus con formalina (referencia 16), el aislamiento de virus mutantes adaptados al frío y/o sensibles a la temperatura (referencia 17) y las glicoproteínas F o G purificadas (referencias 18, 19, 20). Los resultados de los ensayos clínicos han demostrado que las vacunas vivas atenuadas o inactivadas por la formalina no conseguían proteger de manera adecuada a los pacientes vacunados contra la infección por el virus RS (referencia 21 a 23). Los problemas encontrados con los mutantes del virus RS atenuado adaptado al frío y/o sensible a la temperatura administrados por vía intranasal incluyen una morbididad clínica, una inestabilidad genética y una sobreatenuación (referencias 24 a 26). Una vacuna de virus RS vivo administrada por vía subcutánea no es tampoco eficaz (referencia 27). Las vacunas virales de RS inactivadas se han preparado típicamente utilizando formaldehído como agente inactivador. Murphy y cols. (referencia 28) han citado datos sobre la respuesta inmune en los niños de pecho y niños inmunizados con el virus RS inactivado con la formalina. Niños (con edades de 2 a 6 meses) desarrollan un contenido elevado de anticuerpos contra la glicoproteína F, pero tienen una respuesta mediocre contra la proteína G. Individuos mayores (con edades de 7 a 40 meses) desarrollan contenidos de anticuerpos anti-F y anti-G comparables a los de los niños que están infectados con el virus RS. Sin embargo, los niños de pecho y los niños desarrollan los dos grupos una proporción de anticuerpos neutralizantes inferior a las de los individuos de edad comparable que tienen infecciones naturales por el virus RS. La respuesta inmune no equilibrada, con contenidos elevados de anticuerpos contra las proteínas inmunogénicas principales F (fusión) y G (unión) del virus RS pero un contenido bajo de anticuerpos neutralizantes, puede ser debida en parte a las alteraciones de epítopos importantes en las glicoproteínas F y G por el tratamiento con la formalina. Además, algunos niños de pecho que reciben la vacuna del virus RS inactivada con la formalina desarrollan una enfermedad de las vías respiratorias inferiores más grave tras exposición subsiguiente al virus RS natural que los individuos no inmunizados (referencias 22, 23). Las vacunas de virus RS inactivado con la formalina se han considerado, por tanto, inaceptables para la utilización en el
hombre.

La evidencia de una respuesta inmune aberrante se ha observado igualmente en ratas del algodón inmunizadas con el virus RS inactivado con formalina (referencia 29). Además, la evaluación de la vacuna contra el RSV inactivado con formalina en ratas del algodón muestra también que durante la infección con el virus vivo los animales inmunizados desarrollan una histopatología pulmonar aumentada (referencia 30).

El mecanismo de potenciación de la enfermedad provocada por las preparaciones de vacuna a base de virus RS inactivado con formalina queda por definir, pero es un obstáculo mayor en el desarrollo de una vacuna eficaz contra el virus RS. La potenciación puede ser debida en parte a la acción de la formalina sobre las glicoproteínas F y G. Además, se ha sugerido un mecanismo de la potenciación de la enfermedad no específico del virus RS, en el que una respuesta inmunológica a los contaminantes celulares o séricos presentes en la preparación de vacuna podría contribuir, en parte, a la enfermedad exacerbada (referencia 31). En realidad, los ratones y las ratas del algodón vacunados con un lisado de células HEp-2 e infectados con el virus RS que ha crecido sobre las células Hep-2 desarrollan una respuesta inflamatoria pulmonar elevada.

Además, las glicoproteínas del virus RS purificadas por cromatografía de inmunoafinidad utilizando la elución a pH ácido son inmunogénicas y protectoras, pero inducen también una inmunopotenciación en las ratas del algodón (referencias 29, 32).

En el artículo de Mary E. Ewasyshyn y Michel H. Klein (Vaccine Research, volumen 2, número 4, 1993, páginas 263-272) referente a la prospección de una inmunización contra el virus respiratorio sincitial, se ha establecido que hay una necesidad urgente de desarrollar una vacuna segura y eficaz capaz de proteger a los niños de pecho y los niños jóvenes contra las infecciones graves de las vías respiratorias provocadas por el virus respiratorio sincitial (RSV) y que todavía no es posible elegir una estrategia que dé una preparación de vacuna apropiada para la evaluación clínica en los niños de pecho seronegativos. Esto necesitará la persecución continua de una aproximación multifacetaria para el desarrollo de una vacuna contra el RSV.

Se continúa explícitamente en tener necesidad de preparaciones inmunogénicas, vacunas incluídas, que sean no solamente eficaces para conferir una protección contra la enfermedad provocada por el RSV, sino también que no produzcan efectos secundarios indeseables, como una inmunopotenciación. Hay también una necesidad de antígenos para el diagnóstico de la infección por el RSV e inmunógenos para la generación de anticuerpos (anticuerpos monoclonales incluidos) que reconozcan específicamente las proteínas del RSV para una utilización, por ejemplo, en el diagnóstico de la enfermedad provocada por el virus RS.

Resumen de la invención

La invención proporciona la producción de virus respiratorio sincitial (RSV) sobre sobre una línea celular de calidad vacuna, por ejemplo, células VERO, MRC5 o WI38, la purificación del virus a partir de las cosechas de fermentador, la extracción de proteínas F, G y M a partir del virus purificado y la copurificación de las proteínas F, G y M sin incluir las etapas de purificación por inmunoafinidad o afinidad sobre lectina de lenteja o concanavalina A. En particular, el procedimiento de afinidad sobre lectina, descrito, por ejemplo, en el documento WO 91/00104 (documento U.S. 07/773 949, presentado el 28 de junio 1990) cedido al concesionario de la presente y cuya divulgación se incorpora aquí a título de referencia, podría conducir al nuevo relanzamiento del ligando en el producto.

Además se suministra aquí, por primera vez, un procedimiento para el coaislamiento y la copurificación de las proteínas F, G y M del RSV y también composiciones inmunogénicas que comprenden las mezclas copurificadas de las proteínas del RSV.

Las proteínas F, G y M coaisladas y copurificadas del RSV son no pirógenas, no inmunopotenciadoras y esencialmente exentas de contaminantes séricos y celulares. Las proteínas aisladas y purificadas son inmunogénicas, exentas de todo RSV infeccioso y de todo agente exterior.

Por consiguiente, en un aspecto de la invención se suministra una mezcla de la proteína de fusión (F), de la proteína de unión (G) y de la proteína de matriz (M) purificadas del virus respiratorio sincitial (RSV).

La proteína de fusión (F) puede comprender proteínas de fusión (F) multiméricas, que pueden incluir, cuando se analizan en condiciones no reductoras, heterodímeros de aproximadamente 70 kDa de peso molecular y formas dímeras y trímeras.

La proteína de unión (G) puede comprender, cuando se analiza en condiciones no reductoras, una proteína G oligómera, una proteína G de aproximadamente 95 kDa de peso molecular y una proteína G de aproximadamente 55 kDa de peso molecular.

La proteína de matriz (M) puede comprender, cuando se analiza en condiciones no reductoras, una proteína de aproximadamente 28 a 34 kDa de peso molecular.

La mezcla de proteína suministrada aquí, cuando se analiza por SDS-PAGE en condiciones reductoras, puede comprender la proteína de fusión (F) que comprende F_{1} de aproximadamente 48 kDa de peso molecular y F_{2} de aproximadamente 23 kDa, la proteína de unión (G) que comprende una proteína G de aproximadamente 95 kDa de peso molecular y una proteína G de aproximadamente 55 kDa de peso molecular y la proteína de matriz (M) que comprende una proteína M de aproximadamente 31 kDa.

La mezcla suministrada según este aspecto de la invención puede comprender las proteínas F, G y M en proporciones relativas de:

F de 35 a 70% en peso;

G de 5 a 30% en peso;

M de 10 a 40% en peso.

Cuando se analiza por SDS-PAGE en condiciones reductoras y por densitometría de barrido tras coloración con plata, la relación de F_{1} de aproximadamente 48 kDa de peso molecular a F_{2} de aproximadamente 23 kDa de peso molecular en esa mezcla puede ser aproximadamente entre 1:1 a 2:1. La mezcla de proteínas F, G y M puede tener una pureza de al menos alrededor de 75%, preferentemente al menos alrededor de 85%.

La mezcla suministrada aquí según este aspecto de la invención, teniendo en cuenta el procedimiento de aislamiento utilizado aquí como se ha descrito anteriormente, está desprovista de anticuerpos monoclonales y desprovista de lectina de lenteja y de concanavalina A.

Las proteínas de RSV obtenidas en la mezcla de proteínas suministrada aquí están, en general, esencialmente no desnaturalizadas por las condiciones suaves de preparación y pueden comprender las proteínas de RSV de uno o de dos subtipos de RSV A y RSV B.

De acuerdo con una forma de realización preferida de la invención, se suministra una mezcla coaislada y copurificada de proteínas no desnaturalizadas del virus respiratorio sincitial (RSV), constituida esencialmente por la proteína de fusión (F), la proteína de unión (G) y la proteína de matriz (M) del RSV, en donde la mezcla está exenta de lectinas de lenteja incluída la concanavalina A y exenta de anticuerpos monoclonales.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se suministra una preparación inmunogénica que comprende una cantidad inmunoeficaz de las mezclas suministradas aquí.

Las composiciones inmunogénicas suministradas aquí pueden formularse bajo forma de vacuna que contiene las proteínas F, G y M para una administración in vivo a un huésped, que puede ser un primate, específicamente un huésped humano, para conferir una protección contra la enfermedad provocada por el RSV.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden formularse bajo forma de micropartículas, de cápsulas, de ISCOM o de liposomas. Las composiciones inmunogénicas pueden comprender, además, al menos otro material inmunogénico o inmunoestimulante, que puede ser al menos un adyuvante o al menos un inmunomodulador, como citoquinas que incluyen la ILK.

El susodicho adyuvante puede elegirse entre el grupo constituido por fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, QS21, Quil A o derivados o componentes de éstos, fosfato de calcio, hidróxido de calcio, hidróxido de zinc, un análogo de glicolípido, un éster octodecílico de un aminoácido, un dipéptido de muramilo, polifosfaceno, una lipoproteína, matriz de ISCOM, DC-Chol, DDA y otros adyuvantes y toxinas bacterianas, componentes y derivados de éstos, como, por ejemplo, descritos en el documento USSN 08/258 228 presentado el 10 de junio de 1994, cedido al concesionario de la presente y cuya divulgación se incorpora aquí a título de referencia (WO 95/34 323). En circunstancias particulares, se desean adyuvantes que inducen una respuesta Th1.

Las composiciones inmunogénicas suministradas aquí pueden formularse para comprender al menos un inmunógeno suplementario que de manera adecuada puede comprender una proteína del virus parainfluenza humano (PIV) de PIV-1, PIV-2 y/o PIV-3, como las proteínas F y HN de PIV. Sin embargo, otros inmunógenos, como los que provienen de Chlamydia, de la polio, de la hepatitis B, de la anatoxina diftérica, de la anatoxina tetánica, del influenza, del haemophilus, de B. pertussis, de los neumococos, de las micobacterias, de la hepatitis A y de Moraxella pueden incorporarse también a las composiciones como vacunas polivalentes (en combinación).

Un aspecto suplementario de la invención suministra un procedimiento de inducción de una respuesta inmune en un huésped administrándole una cantidad inmunoeficaz de la composición inmunogénica suministrada aquí. Preferentemente, la composición inmunogénica se formula como una vacuna para la administración in vivo al huésped y la administración al huésped, incluido el hombre, confiere una protección contra la enfermedad provocada por el RSV. La respuesta inmune puede ser humoral o ser una respuesta inmune de mediación celular.

La presente invención proporciona, en un aspecto suplementario de ésta, un procedimiento de producción de una vacuna para la protección contra la enfermedad provocada por la infección por el virus respiratorio sincitial (RSV), que comprende la administración de la composición inmunogénica suministrada aquí a un huésped prueba para determinar la cantidad y la frecuencia de administración de ésta para conferir la protección contra la enfermedad provocada por un RSV; y la formulación de la composición inmunogénica bajo una forma apropiada para la administración a un huésped tratado según la cantidad y la frecuencia de administración determinadas. El huésped tratado puede ser un hombre.

La solicitud de invención divulga un procedimiento de determinación de la presencia, en una muestra, de anticuerpos específicos de las proteínas F, G o M del virus respiratorio sincitial (RSV), que comprende las etapas de:

(a): puesta en contacto de la muestra con la mezcla como se proporciona aquí para producir complejos que comprenden una proteína del virus respiratorio sincitial y uno cualquiera de dichos anticuerpos presentes en la muestra que reaccionan específicamente con esta proteína; y

(b): determinación de la producción de los complejos.

La solicitud de patente divulga también un procedimiento de determinación de la presencia, en una muestra, de una proteína F, G o M del virus respiratorio sincitial (RSV) que comprende las etapas de:

(a): inmunización de un sujeto con la composición inmunogénica como se proporciona aquí, para producir anticuerpos específicos de las proteínas F, G y M del RSV;

(b): puesta en contacto de la muestra con los anticuerpos para producir complejos que comprenden toda proteína de RSV presente en la muestra y los anticuerpos específicos de la proteína; y

(c): determinación de la producción de los complejos.

La solicitud de patente divulga también un estuche de diagnóstico para la determinación de la presencia de anticuerpos en una muestra específicamente reactiva con la proteína F, G o M del virus respiratorio sincitial, que comprende:

(a): una mezcla como se proporciona aquí;

(b): medios para la puesta en contacto de la mezcla con la muestra para producir complejos que comprenden una proteína del virus respiratorio sincitial y no importa cuál de dichos anticuerpos presentes en la muestra; y

(c): medios de determinación de la producción de los complejos.

En un aspecto suplementario de la invención, se proporciona un procedimiento de producción de anticuerpos monoclonales específicos de las proteínas F, G o M del virus respiratorio sincitial (RSV), que comprende:

(a): la administración de una composición inmunogénica como se proporciona aquí a al menos un ratón para producir al menos un ratón inmunizado;

(b): la eliminación de los linfocitos B de dicho ratón inmunizado;

(c): la fusión de los linfocitos B procedentes de dicho ratón inmunizado con células de mielomas, produciendo de este modo hibridomas;

(d): el clonaje de los hibridomas que producen un anticuerpo anti-proteína de RSV elegido;

(e): la puesta en cultivo de los clones que producen el anticuerpo anti-proteína de RSV elegido;

(f): el aislamiento de los anticuerpos anti-proteína de RSV a partir de los cultivos elegidos.

La presente invención, en otro aspecto, proporciona un procedimiento de producción de una mezcla coaislada y copurificada de proteínas del virus respiratorio sincitial, que comprende el crecimiento del RSV sobre células en un medio de cultivo, la separación del virus cultivado del medio de cultivo, la solubilización de al menos las proteínas F, G y M a partir del virus separado; y el coaislamiento y la copurificación de las proteínas de RSV solubilizadas.

El coaislamiento y la copurificación pueden efectuarse cargando las proteínas solubilizadas sobre una matriz intercambiadora de iones, preferentemente una matriz de fosfato de calcio, específicamente una matriz de hidroxiapatita y coeluyendo selectivamente las proteínas F, G y M de la matriz intercambiadora de iones. El virus cultivado puede lavarse primero con urea para eliminar los contaminantes sin eliminar sustancialmente las proteínas F, G y M.

Las ventajas de la invención incluyen:

-: las mezclas coaisladas y copurificadas de las proteínas F, G y M del RSV;

-: las composiciones inmunogénicas que contienen esas proteínas;

-: los procedimientos de aislamiento de esas proteínas; y

-: estuches de diagnóstico para la identificación del RSV y de los huéspedes infectados por él.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1, que contiene las tablas a y b, muestra un análisis por SDS-PAGE de una preparación de sub-unidad A purificada de RSV utilizando geles de acrilamida coloreados con plata, a la vez en condiciones reductoras (tabla (a)) y no reductoras (tabla (b));

la Fig. 2, que contiene las tablas a, b, c y d, muestra un análisis por western blot de una preparación de sub-unidad purificada de RSV en condiciones reductoras;

la Fig. 3, que contiene las tablas a, b, c y d, muestra un análisis por western blot de una preparación de sub-unidad purificada de RSV en condiciones no reductoras; y

la Fig. 4 muestra un análisis por SDS-PAGE de una preparación de sub-unidad B purificada de virus RSV utilizando geles de acrilamida coloreados con plata en condiciones reductoras.

Descripción general de la invención

Como se ha discutido anteriormente, la invención proporciona las proteínas F, G y M de RSV coaisladas y copurificadas a partir del virus RS. El virus se cultiva sobre una línea celular de calidad vacuna, como células VERO y células humanas diploides, tales como MRC5 y WI38, y el virus cultivado se recoge. La fermentación se puede efectuar en presencia de suero bovino fetal (FBS) y de tripsina.

La cosecha viral se filtra y se concentra después, típicamente utilizando una ultrafiltración de flujo tangencial con una membrana de límite de peso molecular deseado y se filtra por diálisis. El concentrado de la cosecha de virus se puede centrifugar y desechar el sobrenadante. El fondo residual tras la centrifugación puede en primer lugar lavarse con un tampón que contiene urea para eliminar los contaminantes solubles dejando las proteínas F, G y M sustancialmente inafectadas, y después centrifugarse de nuevo. El fondo residual de la centrifugación se extrae después con un detergente para solubilizar las proteínas F, G y M a partir del fondo residual. Esta extracción por detergente se puede efectuar resuspendiendo el fondo residual en el volumen de origen del concentrado de la cosecha en un tampón de extracción que contiene un detergente, como un detergente no iónico, incluido el TRITON® X-100, un detergente no iónico que es octadienilfenol (etilenglicol)_{10}. Otros detergentes incluyen el octilglucósido y detergentes Mega.

Tras la centrifugación para eliminar las proteínas no solubles, el extracto de las proteínas F, G y M se purifica por procedimientos cromatográficos. El extracto puede en primer lugar aplicarse a una matriz de cromatografía de intercambio iónico para permitir el enlace de las proteínas F, G y M a la matriz permitiendo a las impurezas pasar a través de la columna. La matriz de cromatografía de intercambio iónico puede ser todo material cromatográfico deseado, en particular una matriz de fosfato de calcio, específicamente hidroxiapatita, aunque puedan utilizarse otros materiales, como la DEAE y la TMAE y otros.

Las proteínas F, G y M unidas se coeluyen, después, de la columna con un eluyente apropiado. Las proteínas resultantes copurificadas F, G y M se pueden tratar además para aumentar la pureza de éstas.

Las proteínas purificadas F, G y M utilizadas aquí pueden estar bajo la forma de homo y heterooligómeros, incluidos heterodímeros F:G e incluidos dímeros tetrámeros y polímeros más elevados. Las preparaciones de proteínas de RSV preparadas según este procedimiento no presentan evidencia alguna de un agente extraño cualquiera, agente de adsorción sanguínea o virus viviente.

Se inmunizan grupos de ratas del algodón por vía intramuscular con las preparaciones proporcionadas aquí en combinación con alumbre o Iscomatrix^{TM} como adyuvante. Se obtienen contenidos elevados de anticuerpos antifusión y neutralizantes, como se ha mostrado en las tablas I y II más adelante. Se obtiene una protección completa contra la infección por el virus en las vías respiratorias superiores e inferiores, como se ha mostrado en las tablas III y IV más adelante.

Además, los grupos de ratones se inmunizan por vía intramuscular con la preparación proporcionada aquí en combinación con alumbre, Iscomatrix^{TM}, polifosfaceno y DC-Chol como adyuvante. Se obtienen contenidos elevados de anticuerpos neutralizantes y de anticuerpos anti-F como se ha mostrado en las tablas V y VI más adelante. Además, se obtiene una protección completa contra la infección por el virus, como se ha mostrado por la ausencia de virus en los homogeneizados de pulmones (tabla VII más adelante).

Se inmunizan también grupos de monos con las preparaciones suministradas aquí en combinación con alumbre o Iscomatrix^{TM} como adyuvante. Se obtienen contenidos elevados de anticuerpos neutralizantes y de anticuerpos anti-F, como se ha mostrado en las tablas VIII y IX más adelante.

Los datos de inmunización de animales, generados aquí, demuestran que, utilizando una extracción suave, por detergente, de las proteínas importantes del RSV a partir del virus y una elución salina suave de las proteínas a partir de la matriz intercambiadora de iones, se obtienen mezclas copurificadas de las proteínas F, G y M del RSV que son capaces de provocar una respuesta inmune en modelos de animales, que confieren una protección contra una infección por el RSV.

La invención se extiende a la mezcla de las proteínas F, G y M procedentes del virus respiratorio sincitial para una utilización como sustancia farmacéutica como ingrediente activo en una vacuna contra una enfermedad provocada por la infección con el virus respiratorio sincitial.

En otro aspecto, la invención proporciona la utilización de las proteínas F, G y M procedentes del virus respiratorio sincitial para la preparación de una composición de vacuna para la inmunización contra la enfermedad provocada por la infección con el virus respiratorio sincitial.

Está claro para el experto que las formas diversas de realización de la invención tienen numerosas aplicaciones en los ámbitos de la vacunación, del diagnóstico y del tratamiento de las infecciones provocadas por el virus respiratorio sincitial y de la generación de agentes inmunológicos.

Una discusión más amplia no limitante de esta cuestión se presenta también a continuación.

1. Preparación y utilización de la vacuna

Las composiciones inmunogénicas apropiadas para utilizarse como vacunas pueden prepararse a partir de mezclas que comprenden las proteinas inmunogénicas F, G y M del RSV como se divulga aquí. La composición inmunogénica provoca una respuesta inmune que produce anticuerpos, incluidos anticuerpos anti-RSV que incluyen anticuerpos anti-F, anti-G y anti-M. Esos anticuerpos pueden ser anticuerpos que neutralizan el virus y/o anti-fusion.

Se pueden preparar vacunas que incluyen composiciones inmunogénicas bajo forma de composiciones inyectables, bajo forma de disoluciones líquidas, de suspensiones o de emulsiones. El ingrediente o los ingredientes inmunogénicos activos pueden mezclarse con excipientes aceptables farmacéuticamente que son compatibles con ellos. Esos excipientes pueden incluir agua, una disolución salina, dextrosa, glicerol, etanol y combinaciones de éstos. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas pueden contener además sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores o adyuvantes para aumentar la eficacia de éstas. Las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden administrarse por vía parenteral, por inyección subcutánea, por inyección intradérmica o intramuscular. Como variante, las composiciones inmunogénicas formadas de acuerdo con la invención pueden formularse o liberarse de manera que se evoque una respuesta inmune a nivel de las superficies mucosas. Por tanto, la composición inmunogénica puede administrarse a nivel de las superficies mucosas, por ejemplo por vía nasal u oral (intragástrica). Como variante, se pueden desear otros modos de administración que incluyen los supositorios y las formulaciones orales. Para los supositorios, los enlazantes y suportes pueden incluir, por ejemplo, polialcalenglicoles o triglicéridos. Esos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el(los) ingrediente(s) inmunogénico(s) en el intervalo de alrededor de 0,5 a alrededor de 10%, preferentemente alrededor de 1 a 2%. Las formulaciones orales pueden incluir soportes utilizados normalmente como las calidades farmacéuticas de sacarina, de celulosa y de carbonato de magnesio. Esas composiciones pueden tomar la forma de disoluciones, de suspensiones, de comprimidos, de píldoras, de cápsulas, de formulaciones de liberación prolongada o de polvos y contienen alrededor de 1 a 95% de ingrediente(s) activo(s), preferentemente alrededor de 20 a alrededor de 75%.

Las preparaciones inmunogénicas y las vacunas se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea eficaz terapéuticamente, inmunogénica y protectora. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, incluida por ejemplo la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos y, si fuese necesario, para producir una respuesta inmune de mediación celular. Las cantidades precisas de ingredientes activos necesarios a administrar dependen del juicio médico. Sin embargo se pueden determinar fácilmente intervalos de dosificación por el experto y pueden ser del orden de microgramos a miligramos de ingrediente(s) activo(s) por vacunación. Los regímenes apropiados para la administración inicial y las dosis de revacunación son también variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida por administraciones de revacunación subsiguientes. La dosificación puede depender también de la vía de administración y variará según la talla del huésped.

La concentración del ingrediente proteico activo en una composición inmunogénica de acuerdo con la invención es en general de alrededor de 1 a 95%. Una vacuna que contiene el material antigénico de solamente un patógeno es una vacuna monovalente. Las vacunas que contienen el material antigénico de varios patógenos son vacunas combinadas y forman parte también de la invención. Esas vacunas combinadas contienen, por ejemplo, el material de diversos patógenos o de varias cepas del mismo patógeno o combinaciones de diversos patógenos. En la invención, como se ha señalado anteriormente, las proteínas F, G y M del RSV A y del RSV B se combinan en una sola composición inmunogénica multivalente que puede contener también otros inmunógenos.

Se puede mejorar significativamente la inmunogenicidad si los antígenos se coadministran con adyuvantes. Los adyuvantes aumentan la inmunogenicidad de un antígeno, pero no son necesariamente inmunogénicos por sí mismos. Los adyuvantes pueden actuar reteniendo el antígeno localmente cerca del sitio de administración para producir un efecto de depósito facilitando una liberación lenta prolongada del antígeno a las células del sistema inmune. Los adyuvantes pueden atraer también a las células del sistema inmune hacia el depósito de antígeno y estimular a esas células para provocar las respuestas inmunes.

Se han utilizado agentes o adyuvantes inmnoestimulantes durante numerosos años para mejorar las respuestas inmunes de los huéspedes, por ejemplo, a las vacunas. Adyuvantes intrínsecos, como los lipopolisacáridos, son normalmente los componentes de las bacterias matadas o atenuadas utilizadas como vacunas. Adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que se formulan para aumentar las respuestas inmunes del huésped. Por tanto, se han indentificado adyuvantes que aumentan la respuesta inmune a los antígenos liberados por vía parenteral. Sin embargo, algunos de esos adyuvantes son tóxicos, y pueden provocar efectos secundarios indeseados, que les hacen inutilizables para la utilización en el hombre y en numerosos animales. De hecho, solo el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (denominados colectivamente alumbre) se utilizan rutinariamente como adyuvantes en las vacunas para el hombre y los animales. La eficacia del alumbre en el aumento de las respuestas de anticuerpos a las anatoxinas diftérica y tetánica está bien establecida y una vacuna HBsAg contiene alumbre como adyuvante. Aunque la utilidad del alumbre está bien establecida para ciertas aplicaciones, ello tiene sus límites. Por ejemplo, el alumbre es ineficaz para la vacunación contra el influenza y no provoca habitualmente respuesta inmune de mediación celular. Los anticuerpos provocados por los antígenos con un adyuvante de alumbre son principalmente del isotipo IgG1 en el ratón, lo que puede no ser óptimo para la protección por algunos agentes de vacunación.

Una gran serie de adyuvantes intrínsecos puede provocar respuestas inmunes potentes contra los antígenos. Incluyen saponinas complejadas con los antígenos de proteína de membrana (complejo inmunoestimulante), polímeros Pluronic con aceites minerales, micobacterias matadas en aceites minerales, el adyuvante incompleto de Freund, productos bacterianos, como el dipéptido de muramilo (MDP), y lipopolisacáridos (LPS) así como el lípido A y liposomas.

Para inducir de manera eficaz respuestas inmunes humorales (HIR) y una inmunidad de mediación celular (CMI), se emulsifican frecuentemente los inmunógenos en adyuvantes. Numerosos adyuvantes son tóxicos, induciendo granulomas, inflamaciones agudas y crónicas (adyuvante completo de Freund, FCA), una citolisis (saponinas y polímeros Pluronic) y una pirogenicidad, una artritis y una uveitis anterior (LPS y MDP). Aunque el FCA sea un adyuvante excelente y se utilice ampliamente en investigación, no está autorizado para la utilización en las vacunas para el hombre o el animal por motivo de su toxicidad.

2. Inmunoensayos

Las proteínas F, G y M del RSV de la presente invención son útiles como inmunógenos para la generación de anticuerpos contra éstas, como antígenos en inmunoensayos que incluyen las dosificaciones por el método E.L.I.S.A. (ELISA), los RIA y otras ensayos de enlace de anticuerpos no unidos a una enzima o procedimientos conocidos en la técnica para la detección de anticuerpos. En el ensayo ELISA, la proteína F, G o M elegida o una mezcla de proteínas se inmoviliza sobre una superficie elegida, por ejemplo una superficie capaz de enlazarse a las proteínas como los pozos de una placa para microvaloración de poliestireno. Tras lavado para eliminar el material adsorbido incompletamente, se puede enlazar a la superficie elegida una proteína no específica, como una disolución de albúmina sérica de bovino (BSA), que se conoce por ser antigénicamente neutra en lo que concierne a la muestra de la prueba. Eso permite el bloqueo de los sitios de adsorción no específicos sobre la superficie de inmovilización y reduce, por tanto, el ruido de fondo provocado por el enlace no específico de proteínas presentes en los antisueros sobre la superficie.

La superficie de inmovilización se pone después en contacto con una muestra, como materiales clínicos o biológicos, para ser probados de manera que conduzca a la formación de complejos inmunes (antígeno/anticuerpo). Ello puede incluir la dilución de la muestra con diluyentes, como disoluciones de BSA, de gammaglobulina de bovino (BGG) y/o de tampón fosfato salino (PBS)/Tween. La muestra se deja después incubar durante alrededor de 2 a 4 horas, a temperaturas como del orden de alrededor de 25ºC a 37ºC. Tras incubación, la superficie en contacto con la muestra se lava para eliminar el material no inmunocomplejado. El procedimiento de lavado puede incluir el lavado con una disolución, como PBS/Tween o un tampón borato. Tras la formación de los inmunocomplejos específicos entre la muestra de prueba y la proteína enlazada y el subsiguiente lavado, la aparición, e incluso la cantidad, de la formación de inmunocomplejos se puede determinar sometiendo el inmunocomplejo a un segundo anticuerpo que tiene una especificidad para el primer anticuerpo. Si la muestra de prueba es de origen humano, el segundo anticuerpo es un anticuerpo que tiene una especificidad para las inmunoglobulinas humanas y las IgG en general. Para definir medios de detección, el segundo anticuerpo puede tener una actividad asociada como una actividad enzimática, que general, por ejemplo, un desarrollo de color durante la incubación con un sustrato cromógeno apropiado. Se puede obtener después la cuantificación midiendo el grado de generación de color utilizando, por ejemplo, un espectrofotómetro.

Ejemplos

La divulgación anterior describe la invención de modo general. Se puede obtener una comprensión más completa por referencia a los ejemplos específicos siguientes. Esos ejemplos se describen solamente a título de ilustración y no se destinan a limitar el marco de la invención. Se tienen en cuenta cambios en la forma y la sustitución de equivalentes como puedan sugerirlo o hacerlo práctico las circunstancias. Aunque se hayan utilizado aquí términos específicos, se supone que esos términos tienen un sentido descriptivo y no un objetivo de limitación.

Los procedimientos de determinación de la dosis_{50} (TCID_{50}/ml) infecciosa de cultivo celular, los contenidos de las placas y de neutralización, descritos no explícitamente en esta divulgación, se describen ampliamente en la literatura científica y bien en el marco de las competencias del experto. Las concentraciones en proteínas se determinan por el procedimiento del ácido bicinconínico (BCA) como describe el Pierce Manual (23 220, 23 225; Pierce Chemical Company, USA), incorporado aquí a título de referencia.

Los medios de cultivo CMRL 1969 y el medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) se utilizan para los cultivos celulares y el crecimiento del virus. Las células utilizadas en este estudio son células ce riñones de mono verde de Africa de calidad vacuna (VERO lote M6) obtenidas en el Instituto Mérieux. Los virus RS utilizados son los virus RS de subtipo A (cepas larga y A2) obtenidos en el American Type Culture Collection (ATCC), un aislado clínico reciente de subtipo A de RSV y un aislado clínico reciente de subtipo B del Baylor College de Medicina.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la producción de RSV sobre una línea celular de mamífero sobre bolas de microsoportes en un fermentador controlado de 150 l.

Se añadieron células de riñones de monos verdes de Africa de calidad vacuna (VERO), en una concentración de 10^{5} células/ml, a 60 l de medio CMRL 1969, pH 7,2 en un biorreactor de 150 l que contenía 360 g de bolas microsoportes de Cytodex-1 y se agitaron durante 2 horas. Se añaden 60 l suplementarios de CMRL 1969 para dar un volumen total de 120 l. Se añade suero fetal bovino para alcanzar una concentración final de 3,5%. Se añade glucosa en una concentración final de 3 g/l y se añade L-glutamina en una concentración final de 0,6 g/l. Se controlan el oxígeno disuelto (40%), el pH (7,2), la agitación (36 r/min) y la temperatura (37ºC). Se controlan el crecimiento de las células, los contenidos de glucosa, de lactato y de glutamina. En el día 4, el medio de cultivo se drena del fermentador y se añaden 100 l del medio E199 (sin suero fetal bovino) y se agitan durante 10 minutos. El fermentador se drena y llena de nuevo con 120 l de E199.

Se añade un inóculo de RSV de subtipo A de una multiplicidad de infección (M.O.I) de 0,001 y se mantiene después el cultivo durante 3 días antes de que un tercio a una mitad del medio sea drenado y reemplazado con medio fresco. En el día 6 post-infección, se para la agitación y se dejan sedimentar las bolas. El fluido de cultivo viral se drena y se filtra a través de un filtro de 20 \mum, después un filtro de 3 \mum previo a todo tratamiento ulterior.

La cosecha viral clarificada se concentra 75 a 150 veces utilizando la ultrafiltración de flujo tangencial con membranas de 300 NMWL y se filtra por diálisis con una disolución salina de tampón fosfato que contenía 10% de glicerol. El concentrado viral se almacena congelado a -70ºC antes de toda purificación ulterior.

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra el procedimiento de purificación de la sub-unidad de RSV a partir de un concentrado viral de RSV de subtipo A.

Una disolución de poli(etilenglicol)-8000 al 50% se añade a una alícuota de concentrado de virus preparado como se ha descrito en el ejemplo 1 para dar una concentración final de 6%. Después de agitación a temperatura ambiente durante 1 hora, la mezcla se centrífuga a 15000 r/min durante 30 min en un rotor Sorvall SS-34 a 4ºC. El fondo residual viral se pone después en suspensión en fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8, urea 2 M, NaCl 0,15 M, se agita durante 1 hora a temperatura ambiente y después se centrífuga de nuevo a 15000 r/min durante 30 min en un rotor Sorvall SS-34 a 4ºC. El fondo residual viral se pone después en suspensión en fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8, NaCl 50 mM, 1% de Triton X-100 y se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente. El corazón del virus insoluble se retira por centrifugación a 15000 r/min durante 30 min en un rotor Sorval SS-34 a 4ºC. El sobrenadante de proteína soluble se aplica a una columna de hidroxiapatita cerámica (tipo II, Bio-Rad Laboratories) y la columna se lava después con cinco veces el volumen de la columna de fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8, NaCl 50 mM, 0,02% de Triton X-100. La composición de la sub-unidad de RSV procedente del subtipo A del RSV, que contiene las proteínas F, G y M, se obtiene eluyendo la columna con 10 veces el volumen de la columna de fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8, NaCl 400 mM, 0,02% de Triton X-100.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra el análisis de la preparación de la sub-unidad de RSV obtenida a partir del subtipo A de RSV por electroforesis sobre gel de poli(acrilamida)-SDS (SDS-PAGE) y por inmunoimpresión.

La composición de la sub-unidad de RSV preparada como se ha descrito en el ejemplo 2 se analiza por SDS-PAGE utilizando geles de acrilamida al 12,5%. Las muestras se someten a una electroforesis en presencia y en ausencia de 2-mercaptoetanol (agente reductor). Los geles se colorean con plata para detectar las proteínas virales (Fig. 1, tabla a y b). Las inmunoimpresiones de los geles similares se preparan y sondean con un anticuerpo monoclonal de ratón (mAb 5353C75) para la glicoproteína F (Fig. 2, tabla a y 3, tabla a) o con un anticuerpo monoclonal de ratón (mAb 131-2G) para la glicoproteína G (Fig. 2, tabla b y 3, tabla b) o un antisuero de cobayo (gp178) contra un péptido M de RSV (secuencia peptídica: LKSKNMLTTVKDLTMKTLNPTHDIIALCEFEN - SEQ ID Nº 1) (Fig 2, tabla c y 3, tabla c) o un antisuero de cabra (Virostat nº 0605) contra el RSV entero (Fig. 2, tabla d y 3, tabla d). El análisis densitométrico del gel, coloreado con plata, de la preparación de la sub-unidad de RSV en condiciones reductoras indica una distribución de la composición como sigue:

Glicoproteína G (forma de 95 kDa) = 10%

Glicoproteína F_{1} (48 kDa) = 30%

Proteína M (31 kDa) = 23%

Glicoproteína F_{2} (23 kDa) = 19%

La glicoproteína F migra, en condiciones no reductoras, como un heterodímero de aproximadamente 70 kDa (F_{0}) así como formas oligoméricas superiores (dímeros y trímeros) (Fig. 3, tabla a).

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la inmunogenicidad de la preparación de la sub-unidad de RSV en la rata del algodón.

Se inmunizan grupos de cinco ratas del algodón por vía intramuscular (0,1 ml en los días 0 y 28 con 1 \mug o 10 \mug de la preparación de la sub-unidad de RSV, producida como se describe en el ejemplo 2 y formulada con 1,5 mg/dosis de alumbre o 5 \mug/dosis de Iscomatrix^{TM} (Iscotec, Suecia). Se obtienen muestras sanguíneas en el día 41 y se prueba para los contenidos de anticuerpos anti-fusión y neutralizantes. Las ratas se infectan por vía intranasal en el día 43 con el RSV y se sacrifican cuatro días más tarde. Se recogen los lavados de los pulmones y de la naso-faringe y se prueban para los contenidos de RSV. Se inducen contenidos elevados de anticuerpos anti-fusión y de neutralización como se muestra en las tablas I y II más adelante. Además, se obtiene la protección completa contra la infección por el virus a excepción de una rata, por las vías respiratorias superiores e inferiores (tablas III y IV más adelante).

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra la inmunogenicidad de la preparación de la sub-unidad del RSV en el ratón.

Se inmunizan grupos de seis ratones BALB/c por vía intramuscular (0,1 ml) en los días 0 y 28 con diversas dosis de la preparación de la sub-unidad de RSV, producida como se describe en el ejemplo 2 y formulada con 1,5 mg/dosis de alumbre, 10 \mug/dosis de Iscomatrix^{TM}, 200 \mug/dosis de polifosfaceno (PCPP) o 200 \mug/dosis de DC-Chol. Las diversas preparaciones probadas se dan en las tablas V, VI y VII más adelante. Se obtienen muestras sanguíneas en los días 28 y 42 y se prueban para el contenido de anticuerpos de neutralización y los contenidos de anticuerpos anti-F. Los ratones son inducidos en el día 44 con RSV y sacrificados cuatro días más tarde. Se retiran los pulmones y se homogeneizan para determinar los contenidos de virus. Se provocan contenidos elevados de anticuerpos de neutralización y de anticuerpos anti-F como se muestra en las tablas V y VI más adelante. Además, se obtiene una protección completa contra la infección por el virus, como se muestra por la ausencia de virus en los triturados de pulmones y los lavados nasales (tabla VII más adelante).

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la inmunogenicidad de la preparación de sub-unidad de RSV en monos verdes de Africa.

Se inmunizan grupos de cuatro monos por vía intramuscular (0,5 ml en los días 0 y 21 con 100 \mug de la preparación sub-unidad de RSV producida como se describe en el ejemplo 2 y formulada con 1,5 mg/dosis de alumbre o 50 \mug/dosis de Iscomatrix^{TM}). Se obtienen muestras sanguíneas en los días 21, 35 y 49 y se prueban respecto a los contenidos de anticuerpos de neutralización y de anticuerpos anti-F. Se inducen cantidades elevadas de anticuerpos de neutralización y de anticuerpos anti-F como se muestra en las tablas VIII y IX más adelante.

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra aún más la producción de RSV sobre una línea celular de mamífero sobre microbolas en un fermentador controlado de 150 l.

Se añaden células de riñones de monos verdes de Africa de calidad vacuna (células VERO) a 150 l de medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) que contiene 3,5% de suero fetal de bovino, pH 7,2, a una concentración final de 2 x 10^{5} células/ml (intervalo de 1,5 a 3,5 células/ml), en un biorreactor de 150 l que contiene 450 g de bolas microsoportes de Cytodex-1 (3 g/l). Tras inoculación de las células, se controlan el oxígeno disuelto (40 por ciento de saturación de aire (intervalo de 25 a 40%)), el pH (7,1 \pm 0,2), la agitación (36 \pm 2 r/min) y la temperatura (37ºC \pm 0,5ºC). La unión inicial de las células a las bolas, el crecimiento de las células (determinación del número de células) y las proporciones de los medios de crecimiento de glucosa y de lactato se controlan sobre una base cotidiana. La infección del cultivo de las células VERO aparece tres días tras el comienzo del crecimiento de las células cuando la concentración de las células está en el intervalo de 1,5 a 2,0 x 10^{6}células/ml. Se para la agitación y se dejan sedimentar las bolas microsoportes durante 60 minutos y el medio de cultivo se drena del biorreactor utilizando una línea de drenaje colocada aproximadamente 3 cm por encima del volumen de las bolas sedimentadas. Se añaden setenta y cinco litros de IMDM sin suero fetal de bovino (medio de lavado) y la mezcla se agita a 36 r/min durante 10 minutos. Se para la agitación y se dejan sedimentar las bolas microsoportes durante 30 minutos. Se retira el medio de lavado utilizando la línea de drenaje y después se llena el biorreactor a 75 l (medio volumen) con IMDM sin suero fetal de bovino.

Para la infección, se añade un inóculo de RSV de subtipo B de RSV a una multiplicidad de infección (M.O.I.) de 0,001 y se efectúa la adsorción del virus a las células en medio volumen durante 2 horas con agitación a 36 r/min. Se añaden setenta y cinco litros de IMDM al biorreactor a un volumen final de 150 l. Tras la infección se controlan el oxígeno disuelto (40 por ciento de saturación de aire (intervalo de 10-40%), el pH (7,25 \pm 0,1), la agitación
(36 \pm 2 r/min) y la temperatura (37ºC \pm 0,5ºC). Tras la infección, el medio de crecimiento de las células (determinación del número de células), las proporciones de glucosa y de lactato, los antígenos F y G de RSV y la infectividad del RSV se controlan sobre una base cotidiana. En el día 3 después de la infección se para la agitación, se dejan sedimentar las bolas microsoportes durante 60 minutos, y se retiran 75 l (50%) del medio por la vía de la línea de drenaje y se reemplazan con medio fresco de nueva aportación. Ocho horas (intervalo de siete a nueve horas) tras la infección, cuando el efecto citopatógeno inducido por el virus es observado (es decir, cuando las células se separan de las bolas microsoportes y el oxígeno no se consume ya por el cultivo), se para el agitador y se dejan sedimentar las bolas de microvaloración durante 60 minutos. El fluido de cultivo que contiene el virus se retira del biorreactor y se transfiere a un frasco de espera. Se añaden setenta y cinco litros de IMDM sin suero fetal de bovino al biorreactor y se agita a 75 r/min durante 30 minutos. Se dejan sedimentar las bolas microsoportes durante 30 minutos, se retira del biorreactor el fluido de enjuague y se combina con el material recogido en el frasco de espera.

El material recogido se concentra aproximadamente 20 veces por ultrafiltración de flujo tangencial (es decir, que el material que contiene el virus se retiene por la membrana) utilizando una membrana de ultrafiltración de 500 ó 1000 kilodaltons (K) o como variante una membrana de microfiltración de 0,45 \muM a un volumen final de 10 l. El material concentrado se filtra por diálisis con 10 volúmenes de disolución salina tamponada por fosfato, pH 7,2. El concentrado viral filtrado por diálisis se almacena congelado a -70ºC antes de la purificación ulterior.

Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra el procedimiento de purificación de la sub-unidad del RSV a partir de un concentrado viral del subtipo B del RSV.

Un concentrado de virus, preparado como se describe en el ejemplo 7, se centrífuga a 15000 r/min durante 30 min en un rotor Sorvall SS-34 a 4ºC. El fondo residual viral se pone después en suspensión en fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8, NaCl 300 mM, 2% de Triton X-100, y se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente. El corazón del virus insoluble se retira por centrifugación a 15000 r/min durante 30 min en un rotor Sorvall SS-34 a 4ºC. El sobrenadante de proteína soluble se aplica a una columna de hidroxiapatita cerámica (tipo I, Bio-Rad Laboratories) y la columna se lava después con diez veces el volumen de la columna de fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8, NaCl 10 mM, 0,02% de Triton X-100. La composición de sub-unidad de RSV que contiene la proteína F, G y M se obtiene por elución de la columna con 10 veces el volumen de la columna de fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8, NaCl 600 mM, 0,02% de Triton X-100. En ciertos casos la composición de la sub-unidad de RSV se purifica aún diluyendo primero el eluato procedente de la primera columna de hidroxiapatita cerámica para rebajar la concentración de NaCl a NaCl 400 mM y aplicando después la sub-unidad diluida sobre una columna de hidroxiapatita cerámica (tipo II, Bio-Rad Laboratories). El flujo de esta columna es la composición de sub-unidad purificada de RSV procedente del subtipo B del RSV.

Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra el análisis de la preparación de la sub-unidad de RSV obtenida a partir del subtipo B del RSV por electroforesis sobre gel de poli(acrilamida)-SDS (SDS-PAGE).

La composición de la sub-unidad de RSV preparada como se describe en el ejemplo 8 se analiza por SDS-PAGE utilizando un gel de acrilamida al 15,0%. La muestra se somete a una electroforesis en presencia de 2-mercaptoetanol (agente reductor). El gel se colorea con plata para detectar las proteínas virales (Fig. 4). El análisis densitométrico del gel coloreado con plata de la preparación de la sub-unidad de RSV en condiciones reductoras indica una distribución de composición de las proteínas como sigue:

Glicoproteína G (forma de 95 kDa) = 21%

Glicoproteína F_{1}(48 kDa) = 19%

Proteína M (31 kDa) = 22%

Glicoproteína F_{2} (23 kDa) = 20%

Resumen de la divulgación

Como resumen de esta divulgación, la invención proporciona una mezcla coaislada y copurificada de las proteínas F, G y M de RSV que es capaz de proteger contra el RSV en modelos animales pertinentes. Son posibles modificaciones en el marco de la invención.

TABLA I Contenidos séricos de anticuerpos anti-fusión en ratas del algodón

1

TABLA II Contenidos séricos de neutralización en ratas del algodón

2

TABLA III Contenidos de RSV en los lavados pulmonares en ratas del algodón

3

TABLA IV Contenidos de RSV en los lavados nasales en ratas del algodón

4

TABLA V Contenidos séricos de neutralización en ratones Balb/c

5

TABLA VI Contenidos séricos anti-F en ratones Balb/c

6

TABLA VII Contenidos virales en el pulmón en ratones Balb/c

7

TABLA VIII Contenidos séricos de neutralización en monos verdes de Africa

8

TABLA IX Contenidos séricos anti-F en monos verdes de Africa

9

Referencias

1. W.P. Glezen, A. Paredes, J.E. Allison, L.H. Taber y A.L. Frank (1981). J. Pediatr. 98, 708-715.

2. R.M. Chanock, R.H. Parrot, M. Connors, P.L. Collins et B.R. Murphy (1992) Pediatrics 90, 137-142.

3. A.J. Martin, P.S. Gardiner y J. McQuillin (1978), Lancel ii, 1035-1038.

4. A. Robbins y P. Freeman (1988) Sci. Am. 259, 126-133.

5. W.P. Glezen, L.H. Taber, A.L. Frank y J.A. Kasel (1986) Am. J. Dis. Child. 140, 143-146.

6. S.L. Katz, New vaccine development establishing priorities. Vol. 1. Washington: National Academic Press. (1985) pp. 397-409.

7. G.W. Wertz, W.M. Sullender (1992) Biotech. 20, 151-176.

8. K. McIntosh y R.M. Chanock (1990) en Fields Virology (editores B.M. Fields et D.M. Knipe) pp. 1045-1075, Raven Press, Ltd., New York.

9. P. Collins, K. McIntosch y R.M. Chanock en "Fields Virology", editado por B.N. Fields, D.M. Knipe y P.M. Howley, Lippincott-Raven Press, New York, (1996) pp. 1313-1351.

10. E.E. Walshv, C.B. Hall, M. Briselli, M.W. Brandiss y J.J. Schlesinger, (1987) J. Infect. Dis. 155, 1198-1204.

11. E.E. Walsh, J. Hruska (1983) J. Virol. 47, 171-177.

12. S. Levine, R. Kleiber-France y P.R. Paradiso (1987) J. Gen. Virol. 69, 2521-2524.

13. L.J. Anderson, J.C. Hierholzer, C. Tsou, R.M. Hendry, B.F. Fernie, Y. Stone y K. McIntosh (1985), J. Infect. Dis. 151, 626-633.

14. P.R. Johnson, R.A. Olmsted, G.A. Prince, B.R. Murphy, D.W. Alling, E.E. Walsh y P.L. Collins (1987) J. Virol. 61 (10), 3163-3166.

15. A.H. Cherrie, K. Anderson, G.W. Wertz y P.J.M. Openshaw (1992) J. Virology 66, 2102-2110.

16. H.W. Kim, J.G. Canchola, C.D. Brandt, G. Pyles, R.M. Chanock, K. Jensen y R.H. Parrott (1969) Amer. J. Epidemiology 89, 422-434.

17. W.T. Firedewald, B.R. Forsyth, C.B. Smith, M.S. Gharpure y R.M. Chanock (1968) JAMA 204, 690-694.

18. E.E. Walsh, M.W. Brandriss, J.J. Schlesinger (1985) J. Gen. Virol. 66, 409-415.

19. E.E. Walsh, J.J. Schlesinger y M.W. Brandriss (1984) J. Gene. Virol. 65, 761-766.

20. E.G. Routledge, M.M. Willcocks, A.C.R. Samson, L. Morgan, R. Scott, J.J. Anderson y G.L. Toms (1988) J. Gen. Virology 69, 293-303.

21. V.A. Fulginiti, J.J. Eller, O.F. Sieber, I.W. Joyner, M. Minamitani y G. Meiklejohn (1969) Am. J. Epidemiol. 89 (4), 435-448.

22. J. Chin, R.L. Magoffin, L.A. Shearer, J.H. Schieble y E.H. Lennette (1969) Am. J. Epidemiol. 89 (4), 449-463.

23. A.Z. Kapikian, R.H. Mitchell, R.M. Chanock, R.A. Shvedoff y C.E. Stewart (1969) Am. J. Epidemiol. 89 (4), 405-421.

24. H.W. Kim, J.O. Arrobio, G. Pyles, C.D. Brandt, E. Camargo, R.M. Chanock y R.H. Parrott (1971) Pediatrics 48, 745-755.

25. P.F. Wright, R.B. Belshe, H.W. Kim, L.P. Van Voris y R.M. Chanock (1982) Infect. Immun. 37 (1), 397-400.

26. P.F. Wright, T. Chinozaki y W. Fleet (1976) J. Pediatr. 88, 931-936

27. R.B. Belshe, P. Van Voris y M.A. Mufson (1982) J. Infect. Dis. 145, 311-319.

28. B.R. Murphy, G.A. Prince, E.E. Walsh, H.W. Kim, R.H. Parrott, V.G. Hemming, W.J. Rodriguez y R.M. Chanock, J. Clin. Microbiol. (1986), 24 (2), 197-202.

29. M. Connors, P.L. Collins, C.Y. Firestone, A.V. Sotnikov, A. Waitze, A.R. Davis, P.P. Hung, R.M. Chanock, B. Murphy (1992) Vaccine, 10, 475-484.

30. G.A. Prince, A.B. Jenson, V.G. Hemming, E.R. Murphy, E.E. Walsh, R.L. Horswood y R.L. Chanock (1986b) J. Virol. 57 (3), 721-728.

31. P.A. Piedra, F. Camussi y P.L. Ogra (1989) J. Gen. Virol. 70, 325-333.

32. E.E. Walsh, C.B. May, M. Briselli, M.W. Brandiss y J.J. Schlesinger (1987) J. Infect. Dis. 155 (6), 1198-1204.

Claims

1. Mezcla de proteina de fusión (F), de proteína de unión (G) y de proteína de matriz (M) purificadas del virus respiratorio sincitial (RSV).

2. Mezcla de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha proteína de fusión (F) comprende proteínas de fusión multiméricas.

3. Mezcla de acuerdo con la reivindicación 2, en la que, cuando se analiza por SDS-PAGE en condiciones no reductoras, dicha proteína de fusión (F) multimérica incluye heterodímeros de aproximadamente 70 kDa de peso molecular y formas dímeras y trímeras.

4. Mezcla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que, cuando se analiza por SDS-PAGE en condiciones no reductoras, dicha proteína de unión (G) comprende una proteína G de aproximadamente 95 kDa de peso molecular y una proteína G de aproximadamente 55 kDa de peso molecular y una proteína oligomérica.

5. Mezcla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que, cuando se analiza por SDS-PAGE en condiciones no reductoras, dicha proteína de matriz (M) comprende una proteína M de aproximadamente 28 a 34 kDa de peso molecular.

6. Mezcla de acuerdo con la reivindicación 1 en la que, cuando se analiza por SDS-PAGE en condiciones reductoras, dicha proteína de fusión (F) comprende F_{1} de aproximadamente 48 kDa de peso molecular y F_{2} de aproximadamente 23 kDa de peso molecular, dicha proteína de unión (G) comprende una proteína G de aproximadamente 95 kDa de peso molecular y una proteína G de aproximadamente 55 kDa de peso molecular, y dicha proteína de matriz (M) comprende una proteína M de aproximadamente 31 kDa de peso molecular.

7. Mezcla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la que las proteínas F, G y M se presentan en las proporciones relativas de:

F de 35 a 70% en peso;

G de 5 a 30% en peso;

M de 10 a 40% en peso;

8. Mezcla de acuerdo con la reivindicación 7 en la que, cuando se analiza por SDS-PAGE en condiciones reductoras y se colorea con plata, la relación de F_{1} de aproximadamente 48 kDa de peso molecular a F_{2} de aproximadamente 23 kDa de peso molecular es entre 1:1 a 2:1 por densitometría de barrido.

9. Mezcla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que es al menos pura en el 75%.

10. Mezcla de acuerdo con la reivindicación 1, que está desprovista de anticuerpos monoclonales.

11. Mezcla de acuerdo con la reivindicación 1, que está desprovista de lectina de lenteja y de concanavalina A.

12. Mezcla de acuerdo con la reivindicación 1 en la que dichas proteínas de RSV son no desnaturalizadas.

13. Mezcla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la que dichas proteínas de RSV provienen de uno o de los dos subtipos RSV A y RSV B.

14. Mezcla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que es coaislada y copurificada.

15. Mezcla coaislada y copurificada de proteínas no desnaturalizadas del virus respiratorio sincitial (RSV), constituida fundamentalmente por la proteína de fusión (F), de la proteína de unión (G) y de la proteína de matriz (M) del RSV, en la que la mezcla está exenta de lectinas y está exenta de anticuerpos monoclonales.

16. Composición inmunogénica que comprende una cantidad inmunoeficaz de la mezcla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. Composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 16 que además comprende al menos un inmunógeno suplementario.

18. Composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 17, en la que dicho inmunógeno suplementario comprende al menos una proteína del virus para-influenza humano (PIV) elegido entre el grupo constituido por PIV-1, PIV-2 y PIV-3.

19. Procedimiento de producción de una mezcla coaislada y copurificada de proteínas del virus respiratorio sincitial (RSV), que comprende las etapas de:

crecimiento de RSV sobre células en un medio de cultivo;

separación del virus cultivado del medio de cultivo;

solubilización de al menos la proteína de fusión (F), la proteína de unión (G) y la proteína de matriz (M) del virus separado; y

coaislamiento y copurificación de las proteínas F, G y M solubilizadas de RSV.

20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19 en el que dichas etapas de coaislamiento y de copurificación se efectúan por:

la carga de las proteínas solubilizadas sobre una matriz intercambiadora de iones; y

la coelución selectiva de las proteínas F, G y M de la matriz intercambiadora de iones.

21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicha matriz intercambiadora de iones es una matriz de hidroxiapatita.

22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, en el que dicho virus cultivado se lava con urea para eliminar los contaminantes sin eliminación sustancial de las proteínas F, G y M antes de dicha etapa de solubilización.

23. Mezcla de la proteína de fusión (F), de la proteína de unión (G) y de la proteína de matriz (M) purificadas del RSV para la utilización como sustancia farmacéutica en una vacuna contra una enfermedad provocada por la infección con el virus respiratorio sincitial.

24. Utilización de una mezcla de la proteína de fusión (F), de la proteína de unión (G) y de la proteína matriz (M) purificadas del RSV para la preparación de una composición de vacunación para la inmunización contra una enfermedad provocada por la infección con el RSV.