ES2141065T5 - Preparacion de una vacuna de sub-unidades contra el virus respiratorio sincitial. - Google Patents
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Abstract
PROTEINAS DE FUSION (F), DE ENLACE (G) Y DE MATRIZ (M) DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO (RSV) QUE SE AISLAN Y PURIFICAN A PARTIR DEL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO POR EXTRACCION AL DETERGENTE SUAVE DE LAS PROTEINAS DEL VIRUS CONCENTRADO. ESTE PROCEDIMIENTO CONSISTE EN CARGAR LA PROTEINA EN UNA COLUMNA DE HIDROXIAPATITA U OTRA COLUMNA DE MATRIZ INTERCAMBIADORA DE IONES Y EN ELUIR LA PROTEINA CON UN TRATAMIENTO SUAVE CON SAL. DICHAS PROTEINAS F, G Y M, FORMULADAS EN FORMA DE COMPOSICIONES INMUNOGENAS, SON SEGURAS Y ALTAMENTE INMUNOGENAS Y PROTEGEN MODELOS ANIMALES PERTINENTES CONTRA LA ENFERMEDAD DEBIDA A LA INFECCION PROVOCADA POR EL VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO.
Description
Preparación de una vacuna de
sub-unidades contra el virus respiratorio
sincitial.
La presente invención se refiere al ámbito de la
inmunología y concierne particularmente a preparaciones de vacunas
contra la infección por el virus respiratorio sincitial.
El virus respiratorio sincitial humano es la
causa principal de las infecciones de las vías respiratorias
inferiores en los niños de pecho y niños jóvenes (referencias 1 a 3
- una lista de las referencias se encuentra al final de la
divulgación y cada una de las referencias de la lista se incorpora
aquí a título de referencia). A escala mundial se declaran cada año
65 millones de infecciones, que causan 160.000 muertes (referencia
4). Solo en USA puede que deban hospitalizarse 100.000 niños por
una neumonía y una bronquiolitis provocada por el virus RS en un
solo año (referencias 5, 6). Las asistencias en medio hospitalario y
las asistencias ambulatorias para los niños que tienen infecciones
por el virus RS cuestan anualmente más de 340 millones de dólares en
USA (referencia 7). La enfermedad grave de las vías respiratorias
inferiores debida a la infección por el virus RS aparece de manera
predominante en los niños de pecho con edades de dos a seis meses
(referencia 8). Aproximadamente 4.000 niños de pecho mueren cada
año en USA por las complicaciones que se derivan de enfermedades
graves de las vías respiratorias provocadas por una infección con el
virus RS y el virus Parainfluenza de tipo 3
(PIV-3). La Organización Mundial de la Salud (OMS) y
el comité consultivo para las vacunas del Instituto Nacional de la
Alergia y Enfermedad Infecciosa han clasificado el virus RS justo en
segunda posición tras el HIV para el desarrollo de una vacuna.
La estructura y la composición del RSV se ha
elucidado y descrito con detalle en el manual "Fields
Virology", B.N. Fields y col., Raven Press, N.Y. (1996), en
particular capítulo 44, páginas 1313-1351,
"Respiratory Syncytial Virus" por P. Collins, K. McIntosh y
R.M. Chanock (referencia 9).
Los dos antígenos importantes protectores del
RSV son las glicoproteínas de fusión de la envoltura (F) y de unión
(G) (referencia 10). La proteína F se sintetiza como una molécula
precursora (F_{0}) de alrededor de 68 kDa que se escinde de
manera proteolítica en fragmentos de polipéptidos F_{1} (alrededor
de 48 kDa) y F_{2} (alrededor de 20 kDa) unidos por un puente
disulfuro (referencia 11). La proteína G (alrededor de 33 kDa) se
O-glicosila en bruto, que conduce a una
glicoproteína de peso molecular aparente de alrededor de 90 kDa
(referencia 12). Se han definido dos grandes subtipos del virus RS
como A y B (referencia 13). Las mayores diferencias antigénicas
entre esos subtipos se encuentran en la proteína G mientras que la
glicoproteína F es más conservada (referencias 7, 14).
Además de la respuesta de anticuerpos generada
por las glicoproteínas F y G, se ha demostrado que las células T
citotóxicas humanas producidas por la infección por el RSV reconocen
la proteína F, la proteína de matriz M, la nucleoproteína N, y una
proteína pequeña hidrófoba SH y la proteína no estructural 1b del
RSV (referencia 15).
No se dispone de una vacuna segura y eficaz
contra el RSV y se requiere con toda urgencia. Las aproximaciones
sobre el desarrollo de vacunas contra el virus RS han incluido la
inactivación del virus con formalina (referencia 16), el
aislamiento de virus mutantes adaptados al frío y/o sensibles a la
temperatura (referencia 17) y las glicoproteínas F o G purificadas
(referencias 18, 19, 20). Los resultados de los ensayos clínicos han
demostrado que las vacunas vivas atenuadas o inactivadas por la
formalina no conseguían proteger de manera adecuada a los pacientes
vacunados contra la infección por el virus RS (referencia 21 a 23).
Los problemas encontrados con los mutantes del virus RS atenuado
adaptado al frío y/o sensible a la temperatura administrados por vía
intranasal incluyen una morbididad clínica, una inestabilidad
genética y una sobreatenuación (referencias 24 a 26). Una vacuna de
virus RS vivo administrada por vía subcutánea no es tampoco eficaz
(referencia 27). Las vacunas virales de RS inactivadas se han
preparado típicamente utilizando formaldehído como agente
inactivador. Murphy y cols. (referencia 28) han citado datos sobre
la respuesta inmune en los niños de pecho y niños inmunizados con
el virus RS inactivado con la formalina. Niños (con edades de 2 a 6
meses) desarrollan un contenido elevado de anticuerpos contra la
glicoproteína F, pero tienen una respuesta mediocre contra la
proteína G. Individuos mayores (con edades de 7 a 40 meses)
desarrollan contenidos de anticuerpos anti-F y
anti-G comparables a los de los niños que están
infectados con el virus RS. Sin embargo, los niños de pecho y los
niños desarrollan los dos grupos una proporción de anticuerpos
neutralizantes inferior a las de los individuos de edad comparable
que tienen infecciones naturales por el virus RS. La respuesta
inmune no equilibrada, con contenidos elevados de anticuerpos
contra las proteínas inmunogénicas principales F (fusión) y G
(unión) del virus RS pero un contenido bajo de anticuerpos
neutralizantes, puede ser debida en parte a las alteraciones de
epítopos importantes en las glicoproteínas F y G por el tratamiento
con la formalina. Además, algunos niños de pecho que reciben la
vacuna del virus RS inactivada con la formalina desarrollan una
enfermedad de las vías respiratorias inferiores más grave tras
exposición subsiguiente al virus RS natural que los individuos no
inmunizados (referencias 22, 23). Las vacunas de virus RS
inactivado con la formalina se han considerado, por tanto,
inaceptables para la utilización en el hombre.
La evidencia de una respuesta inmune aberrante
se ha observado igualmente en ratas del algodón inmunizadas con el
virus RS inactivado con formalina (referencia 29). Además, la
evaluación de la vacuna contra el RSV inactivado con formalina en
ratas del algodón muestra también que durante la infección con el
virus vivo los animales inmunizados desarrollan una histopatología
pulmonar aumentada (referencia 30).
El mecanismo de potenciación de la enfermedad
provocada por las preparaciones de vacuna a base de virus RS
inactivado con formalina queda por definir, pero es un obstáculo
mayor en el desarrollo de una vacuna eficaz contra el virus RS. La
potenciación puede ser debida en parte a la acción de la formalina
sobre las glicoproteínas F y G. Además, se ha sugerido un mecanismo
de la potenciación de la enfermedad no específico del virus RS, en
el que una respuesta inmunológica a los contaminantes celulares o
séricos presentes en la preparación de vacuna podría contribuir, en
parte, a la enfermedad exacerbada (referencia 31). En realidad, los
ratones y las ratas del algodón vacunados con un lisado de células
HEp-2 e infectados con el virus RS que ha crecido
sobre las células HEp-2 desarrollan una respuesta
inflamatoria pulmonar elevada.
Además, las glicoproteínas del virus RS
purificadas por cromatografía de inmunoafinidad utilizando la
elución a pH ácido son inmunogénicas y protectoras, pero inducen
también una inmunopotenciación en las ratas del algodón (referencias
29, 32).
En el artículo de Mary E. Ewasyshyn y Michel H.
Klein (Vaccine Research, volumen 2, número 4, 1993, páginas
263-272) referente a la prospección de una
inmunización contra el virus respiratorio sincitial, se ha
establecido que hay una necesidad urgente de desarrollar una vacuna
segura y eficaz capaz de proteger a los niños de pecho y los niños
jóvenes contra las infecciones graves de las vías respiratorias
provocadas por el virus respiratorio sincitial (RSV) y que todavía
no es posible elegir una estrategia que dé una preparación de vacuna
apropiada para la evaluación clínica en los niños de pecho
seronegativos. Esto necesitará la persecución continua de una
aproximación multifacetaria para el desarrollo de una vacuna contra
el RSV.
Se continúa explícitamente en tener necesidad de
preparaciones inmunogénicas, vacunas incluidas, que sean no
solamente eficaces para conferir una protección contra la enfermedad
provocada por el RSV, sino también que no produzcan efectos
secundarios indeseables, como una inmunopotenciación. Hay también
una necesidad de antígenos para el diagnóstico de la infección por
el RSV e inmunógenos para la generación de anticuerpos (anticuerpos
monoclonales incluidos) que reconozcan específicamente las proteínas
del RSV para una utilización, por ejemplo, en el diagnóstico de la
enfermedad provocada por el virus RS.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona la producción
de virus respiratorio sincitial (RSV) sobre una línea celular de
calidad vacuna, por ejemplo, células VERO, MRC5 o WI38, la
purificación del virus a partir de las cosechas de fermentador, la
extracción de proteínas F, G y M a partir del virus purificado y la
copurificación de las proteínas F, G y M sin incluir las etapas de
purificación por inmunoafinidad o afinidad sobre lectina de lenteja
o concanavalina A. En particular, el procedimiento de afinidad sobre
lectina, descrito, por ejemplo, en el documento WO 91/00104
(documento U.S. 07/773 949, presentado el 28 de junio 1990) cedido
al concesionario de la presente y cuya divulgación se incorpora
aquí a título de referencia, podría conducir al nuevo relanzamiento
del ligando en el
producto.
producto.
Además se suministra aquí, por primera vez, un
procedimiento para el coaislamiento y la copurificación de las
proteínas F, G y M del RSV y también composiciones inmunogénicas que
comprenden las mezclas copurificadas de las proteínas del RSV.
Las proteínas F, G y M coaisladas y
copurificadas del RSV son no pirógenas, no inmunopotenciadoras y
esencialmente exentas de contaminantes séricos y celulares. Las
proteínas aisladas y purificadas son inmunogénicas, exentas de todo
RSV infeccioso y de todo agente exterior.
Por consiguiente, en un aspecto de la invención
se suministra una mezcla coaislada y copurificada de la proteína
de fusión (F), de la proteína de unión (G) y de la proteína de
matriz (M) del virus respiratorio sincitial (RSV), donde la mezcla
está desprovista de lectina de lenteja, concanavalina A y
anticuerpos monoclonales, y la mezcla es obtenible por el método
que comprende las etapas de: hacer crecer el RSV sobre células en
un medio de cultivo; separar el virus desarrollado del medio de
cultivo; solubilizar al menos la proteína de fusión (F), la
proteína de unión (G) y la proteína de la matriz (M) del virus
separado; cargar las proteínas solubilizadas en una matriz de
hidroxiapatita y coeluir selectivamente las proteínas F, G y M.
La proteína de fusión (F) puede comprender
proteínas de fusión (F) multiméricas, que pueden incluir, cuando se
analizan en condiciones no reductoras, heterodímeros de
aproximadamente 70 kDa de peso molecular y formas dímeras y
trímeras.
La proteína de unión (G) puede comprender,
cuando se analiza en condiciones no reductoras, una proteína G
oligómera, una proteína G de aproximadamente 95 kDa de peso
molecular y una proteína G de aproximadamente 55 kDa de peso
molecular.
La proteína de matriz (M) puede comprender,
cuando se analiza en condiciones no reductoras, una proteína de
aproximadamente 28 a 34 kDa de peso molecular.
\newpage
La mezcla de proteínas suministrada en la
presente memoria, cuando se analiza por SDS-PAGE en
condiciones reductoras, puede comprender la proteína de fusión (F)
que comprende F_{1} de aproximadamente 48 kDa de peso molecular y
F_{2} de aproximadamente 23 kDa, la proteína de unión (G) que
comprende una proteína G de aproximadamente 95 kDa de peso
molecular y una proteína G de aproximadamente 55 kDa de peso
molecular y la proteína de matriz (M) que comprende una proteína M
de aproximadamente 31 kDa.
La mezcla suministrada según este aspecto de la
invención puede comprender las proteínas F, G y M en proporciones
relativas de:
F de 35 a 70% en peso;
G de 5 a 30% en peso;
M de 10 a 40% en peso.
Cuando se analiza por SDS-PAGE
en condiciones reductoras y por densitometría de barrido tras
coloración con plata, la relación de F_{1} de aproximadamente 48
kDa de peso molecular a F_{2} de aproximadamente 23 kDa de peso
molecular en esa mezcla puede ser aproximadamente entre 1:1 a 2:1.
La mezcla de proteínas F, G y M puede tener una pureza de al menos
alrededor de 75%, preferentemente al menos alrededor de 85%.
La mezcla suministrada en la presente memoria
según este aspecto de la invención, teniendo en cuenta el
procedimiento de aislamiento utilizado aquí como se ha descrito
anteriormente, está desprovista de anticuerpos monoclonales y
desprovista de lectina de lenteja y de concanavalina A.
Las proteínas de RSV obtenidas en la mezcla de
proteínas suministrada aquí están, en general, esencialmente no
desnaturalizadas por las condiciones suaves de preparación y pueden
comprender las proteínas de RSV de uno o de dos subtipos de RSV A y
RSV B.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se suministra una preparación inmunogénica que comprende
una cantidad inmunoeficaz de las mezclas suministradas en la
presente memoria.
Las composiciones inmunogénicas suministradas
aquí pueden formularse bajo forma de vacuna que contiene las
proteínas F, G y M para una administración in vivo a un
huésped, que puede ser un primate, específicamente un huésped
humano, para conferir una protección contra la enfermedad provocada
por el RSV.
Las composiciones inmunogénicas de la invención
pueden formularse bajo forma de micropartículas, de cápsulas, de
ISCOM o de liposomas. Las composiciones inmunogénicas pueden
comprender, además, al menos otro material inmunogénico o
inmunoestimulante, que puede ser al menos un adyuvante o al menos un
inmunomodulador, como citoquinas que incluyen la ILK.
El al menos un adyuvante puede elegirse entre el
grupo constituido por fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio,
QS21, Quil A o derivados o componentes de éstos, fosfato de calcio,
hidróxido de calcio, hidróxido de zinc, un análogo de glicolípido,
un éster octodecílico de un aminoácido, un dipéptido de muramilo,
polifosfaceno, una lipoproteína, matriz de ISCOM,
DC-Chol, DDA y otros adyuvantes y toxinas
bacterianas, componentes y derivados de éstos, como, por ejemplo,
descritos en el documento USSN 08/258 228 presentado el 10 de junio
de 1994, cedido al concesionario de la presente y cuya divulgación
se incorpora aquí a título de referencia (WO 95/34 323). En
circunstancias particulares, se desean adyuvantes que inducen una
respuesta Th1.
Las composiciones inmunogénicas suministradas
aquí pueden formularse para comprender al menos un inmunógeno
suplementario que de manera adecuada puede comprender una proteína
del virus parainfluenza humano (PIV) de PIV-1,
PIV-2 y/o PIV-3, como las proteínas
F y HN de PIV. Sin embargo, otros inmunógenos, como los que
provienen de Chlamydia, de la polio, de la hepatitis B, de
la anatoxina diftérica, de la anatoxina tetánica, del influenza,
del haemophilus, de B. pertussis, de los neumococos, de las
micobacterias, de la hepatitis A y de Moraxella pueden
incorporarse también a las composiciones como vacunas polivalentes
(en combinación).
Un aspecto adicional de la invención suministra
un procedimiento de inducción de una respuesta inmune en un huésped
administrándole una cantidad inmunoeficaz de la composición
inmunogénica suministrada aquí. Preferentemente, la composición
inmunogénica se formula como una vacuna para la administración in
vivo al huésped y la administración al huésped, incluido el
hombre, confiere una protección contra la enfermedad provocada por
el RSV. La respuesta inmune puede ser humoral o ser una respuesta
inmune de mediación celular.
La presente invención proporciona, en un aspecto
suplementario de ésta, un procedimiento de producción de una vacuna
para la protección contra la enfermedad provocada por la infección
por el virus respiratorio sincitial (RSV), que comprende la
administración de la composición inmunogénica suministrada aquí a un
huésped prueba para determinar la cantidad y la frecuencia de
administración de ésta para conferir la protección contra la
enfermedad provocada por un RSV; y la formulación de la composición
inmunogénica bajo una forma apropiada para la administración a un
huésped tratado según la cantidad y la frecuencia de administración
determinadas. El huésped tratado puede ser un hombre.
La solicitud de invención divulga un
procedimiento de determinación de la presencia, en una muestra, de
anticuerpos específicos de las proteínas F, G o M del virus
respiratorio sincitial (RSV), que comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto de la muestra con la mezcla como se proporciona aquí para producir complejos que comprenden una proteína del virus respiratorio sincitial y uno cualquiera de dichos anticuerpos presentes en la muestra que reaccionan específicamente con esta proteína; y
- (b)
- determinar la producción de los complejos.
La solicitud de patente divulga también un
procedimiento de determinación de la presencia, en una muestra, de
una proteína F, G o M del virus respiratorio sincitial (RSV) que
comprende las etapas de:
- (a)
- inmunizar un sujeto con la composición inmunogénica como se proporciona aquí, para producir anticuerpos específicos de las proteínas F, G y M del RSV;
- (b)
- poner en contacto de la muestra con los anticuerpos para producir complejos que comprenden toda proteína de RSV presente en la muestra y los anticuerpos específicos de la proteína; y
- (c)
- determinar la producción de los complejos.
La solicitud de patente divulga también un kit
de diagnóstico para la determinación de la presencia de anticuerpos
en una muestra específicamente reactiva con la proteína F, G o M del
virus respiratorio sincitial, que comprende:
- (a)
- una mezcla como se proporciona aquí;
- (b)
- medios para la puesta en contacto de la mezcla con la muestra para producir complejos que comprenden una proteína del virus respiratorio sincitial y no importa cuál de dichos anticuerpos presentes en la muestra; y
- (c)
- medios de determinación de la producción de los complejos.
En un aspecto suplementario de la invención, se
proporciona un procedimiento de producción de anticuerpos
monoclonales específicos de las proteínas F, G o M del virus
respiratorio sincitial (RSV), que comprende:
- (a)
- la administración de una composición inmunogénica como se proporciona aquí a al menos un ratón para producir al menos un ratón inmunizado;
- (b)
- la eliminación de los linfocitos B de dicho ratón inmunizado;
- (c)
- la fusión de los linfocitos B procedentes de dicho ratón inmunizado con células de mielomas, produciendo de este modo hibridomas;
- (d)
- la clonación de los hibridomas que producen un anticuerpo anti-proteína de RSV elegido;
- (e)
- la puesta en cultivo de los clones que producen el anticuerpo anti-proteína de RSV elegido;
- (f)
- el aislamiento de los anticuerpos anti-proteína de RSV a partir de los cultivos elegidos.
La presente invención, en otro aspecto,
proporciona un procedimiento de producción de una mezcla coaislada
y copurificada de proteínas del virus respiratorio sincitial, que
comprende el crecimiento del RSV sobre células en un medio de
cultivo, la separación del virus cultivado del medio de cultivo, la
solubilización de al menos las proteínas F, G y M a partir del
virus separado; y el coaislamiento y la copurificación de las
proteínas de RSV solubilizadas.
El coaislamiento y la copurificación se efectúa
cargando las proteínas solubilizadas sobre una matriz de
hidroxiapatita y coeluyendo selectivamente las proteínas F, G y M.
El virus cultivado puede lavarse primero con urea para eliminar los
contaminantes sin eliminar sustancialmente las proteínas F, G y
M.
Las ventajas de la invención incluyen:
- -
- las mezclas coaisladas y copurificadas de las proteínas F, G y M del RSV;
- -
- las composiciones inmunogénicas que contienen esas proteínas;
- -
- los procedimientos de aislamiento de esas proteínas; y
- -
- estuches de diagnóstico para la identificación del RSV y de los huéspedes infectados por él.
La Fig. 1, que contiene las tablas a y b,
muestra un análisis por SDS-PAGE de una preparación
de sub-unidad A purificada de RSV utilizando geles
de acrilamida coloreados con plata, a la vez en condiciones
reductoras (tabla (a)) y no reductoras (tabla (b));
la Fig. 2, que contiene las tablas a, b, c y d,
muestra un análisis por western blot de una preparación de
sub-unidad purificada de RSV en condiciones
reductoras;
la Fig. 3, que contiene las tablas a, b, c y d,
muestra un análisis por western blot de una preparación de
sub-unidad purificada de RSV en condiciones no
reductoras; y
la Fig. 4 muestra un análisis por
SDS-PAGE de una preparación de
sub-unidad B purificada de virus RSV utilizando
geles de acrilamida coloreados con plata en condiciones
reductoras.
Como se ha discutido anteriormente, las
proteínas F, G y M de RSV son coaisladas y copurificadas a partir
del virus RS. El virus se cultiva sobre una línea celular de calidad
vacuna, como células VERO y células humanas diploides, tales como
MRC5 y WI38, y el virus cultivado se recoge. La fermentación se
puede efectuar en presencia de suero bovino fetal (FBS) y de
tripsina.
La cosecha viral se filtra y se concentra
después, típicamente utilizando una ultrafiltración de flujo
tangencial con una membrana de límite de peso molecular deseado y
se filtra por diálisis. El concentrado de la cosecha de virus se
puede centrifugar y desechar el sobrenadante. El fondo residual tras
la centrifugación puede en primer lugar lavarse con un tampón que
contiene urea para eliminar los contaminantes solubles dejando las
proteínas F, G y M sustancialmente inafectadas, y después
centrifugarse de nuevo. El fondo residual de la centrifugación se
extrae después con un detergente para solubilizar las proteínas F, G
y M a partir del fondo residual. Esta extracción por detergente se
puede efectuar resuspendiendo el fondo residual en el volumen de
origen del concentrado de la cosecha en un tampón de extracción que
contiene un detergente, como un detergente no iónico, incluido el
TRITON® X-100, un detergente no iónico que es
octadienilfenol (etilenglicol)_{10}. Otros detergentes
incluyen el octilglucósido y detergentes
Mega.
Mega.
Tras la centrifugación para eliminar las
proteínas no solubles, el extracto de las proteínas F, G y M se
purifica por procedimientos cromatográficos. El extracto se aplica
en primer lugar a una matriz de cromatografía de intercambio iónico
para permitir el enlace de las proteínas F, G y M a la matriz
permitiendo a las impurezas pasar a través de la columna. La matriz
de cromatografía de intercambio iónico es hidroxiapatita.
Las proteínas F, G y M unidas se coeluyen,
después, de la columna con un eluyente apropiado. Las proteínas
resultantes copurificadas F, G y M se pueden tratar además para
aumentar la pureza de éstas.
Las proteínas purificadas F, G y M utilizadas
aquí pueden estar bajo la forma de homo y heterooligómeros,
incluidos heterodímeros F:G e incluidos dímeros tetrámeros y
polímeros más elevados. Las preparaciones de proteínas de RSV
preparadas según este procedimiento no presentan evidencia alguna de
un agente extraño cualquiera, agente de adsorción sanguínea o virus
viviente.
Se inmunizan grupos de ratas del algodón por vía
intramuscular con las preparaciones proporcionadas aquí en
combinación con alumbre o Iscomatrix^{TM} como adyuvante. Se
obtienen contenidos elevados de anticuerpos antifusión y
neutralizantes, como se ha mostrado en las tablas I y II más
adelante. Se obtiene una protección completa contra la infección
por el virus en las vías respiratorias superiores e inferiores, como
se ha mostrado en las tablas III y IV más adelante.
Además, los grupos de ratones se inmunizan por
vía intramuscular con la preparación proporcionada aquí en
combinación con alumbre, Iscomatrix^{TM}, polifosfaceno y
DC-Chol como adyuvante. Se obtienen contenidos
elevados de anticuerpos neutralizantes y de anticuerpos
anti-F como se ha mostrado en las tablas V y VI más
adelante. Además, se obtiene una protección completa contra la
infección por el virus, como se ha mostrado por la ausencia de
virus en los homogeneizados de pulmones (tabla VII más
adelante).
Se inmunizan también grupos de monos con las
preparaciones suministradas aquí en combinación con alumbre o
Iscomatrix^{TM} como adyuvante. Se obtienen contenidos elevados de
anticuerpos neutralizantes y de anticuerpos anti-F,
como se ha mostrado en las tablas VIII y IX más adelante.
Los datos de inmunización de animales, generados
aquí, demuestran que, utilizando una extracción suave, por
detergente, de las proteínas importantes del RSV a partir del virus
y una elución salina suave de las proteínas a partir de la matriz
intercambiadora de iones, se obtienen mezclas copurificadas de las
proteínas F, G y M del RSV que son capaces de provocar una
respuesta inmune en modelos de animales, que confieren una
protección contra una infección por el RSV.
La invención se extiende a la mezcla coaislada y
copurificada de las proteínas F, G y M procedentes del virus
respiratorio sincitial, donde la mezcla está desprovista de lectina
de lenteja, concanavalina A y anticuerpos monoclonales, y la mezcla
es obtenible por el método que comprende las etapas de: hacer crecer
el RSV sobre células en un medio de cultivo; separar el virus
desarrollado del medio de cultivo; solubilizar al menos la proteína
de fusión (F), la proteína de unión (G) y la proteína de la matriz
(M) del virus separado; cargar las proteínas solubilizadas en una
matriz de hidroxiapatita y coeluir selectivamente las proteínas F, G
y M, para una utilización como sustancia farmacéutica como
ingrediente activo en una vacuna contra una enfermedad provocada
por la infección con el virus respiratorio sincitial.
En otro aspecto, la invención proporciona la
utilización de una mezcla coaislada y copurificada de las proteínas
F, G y M procedentes del virus respiratorio sincitial donde la
mezcla está desprovista de lectina de lenteja, concanavalina A y
anticuerpos monoclonales, y la mezcla es obtenible por el método que
comprende las etapas de: hacer crecer el RSV sobre células en un
medio de cultivo; separar el virus desarrollado del medio de
cultivo; solubilizar al menos la proteína de fusión (F), la proteína
de unión (G) y la proteína de la matriz (M) del virus separado;
cargar las proteínas solubilizadas en una matriz de hidroxiapatita y
coeluir selectivamente las proteínas F, G y M, para la preparación
de una composición de vacuna para la inmunización contra la
enfermedad provocada por la infección con el virus respiratorio
sincitial.
Está claro para el experto que las formas
diversas de realización de la invención tienen numerosas
aplicaciones en los ámbitos de la vacunación, del diagnóstico y del
tratamiento de las infecciones provocadas por el virus respiratorio
sincitial y de la generación de agentes inmunológicos.
Una discusión más amplia no limitante de esta
cuestión se presenta también a continuación.
Las composiciones inmunogénicas apropiadas para
utilizarse como vacunas pueden prepararse a partir de mezclas
coaisladas y copurificadas que comprenden las proteínas
inmunogénicas F, G y M del RSV, donde la mezcla está desprovista de
lectina de lenteja, concanavalina A y anticuerpos monoclonales, y la
mezcla es obtenible por el método que comprende las etapas de:
hacer crecer el RSV sobre células en un medio de cultivo; separar
el virus desarrollado del medio de cultivo; solubilizar al menos la
proteína de fusión (F), la proteína de unión (G) y la proteína de
la matriz (M) del virus separado; cargar las proteínas solubilizadas
en una matriz de hidroxiapatita y coeluir selectivamente las
proteínas F, G y M, como se divulga en la presente memoria. La
composición inmunogénica provoca una respuesta inmune que produce
anticuerpos, incluidos anticuerpos anti-RSV que
incluyen anticuerpos anti-F, anti-G
y anti-M. Esos anticuerpos pueden ser anticuerpos
que neutralizan el virus y/o anti-fusión.
Se pueden preparar vacunas que incluyen
composiciones inmunogénicas bajo forma de composiciones inyectables,
bajo forma de disoluciones líquidas, de suspensiones o de
emulsiones. El ingrediente o los ingredientes inmunogénicos activos
pueden mezclarse con excipientes aceptables farmacéuticamente que
son compatibles con ellos. Esos excipientes pueden incluir agua,
una disolución salina, dextrosa, glicerol, etanol y combinaciones de
éstos. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas pueden
contener además sustancias auxiliares, como agentes humectantes o
emulsionantes, agentes tamponadores o adyuvantes para aumentar la
eficacia de éstas. Las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden
administrarse por vía parenteral, por inyección subcutánea, por
inyección intradérmica o intramuscular. Como variante, las
composiciones inmunogénicas formadas de acuerdo con la invención
pueden formularse o liberarse de manera que se evoque una respuesta
inmune a nivel de las superficies mucosas. Por tanto, la
composición inmunogénica puede administrarse a nivel de las
superficies mucosas, por ejemplo por vía nasal u oral
(intragástrica). Como variante, se pueden desear otros modos de
administración que incluyen los supositorios y las formulaciones
orales. Para los supositorios, los enlazantes y suportes pueden
incluir, por ejemplo, polialcalenglicoles o triglicéridos. Esos
supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen
el(los) ingrediente(s) inmunogénico(s) en el
intervalo de alrededor de 0,5 a alrededor de 10%, preferentemente
alrededor de 1 a 2%. Las formulaciones orales pueden incluir
soportes utilizados normalmente como las calidades farmacéuticas de
sacarina, de celulosa y de carbonato de magnesio. Esas composiciones
pueden tomar la forma de disoluciones, de suspensiones, de
comprimidos, de píldoras, de cápsulas, de formulaciones de
liberación prolongada o de polvos y contienen alrededor de 1 a 95%
de ingrediente(s)
activo(s), preferentemente alrededor de 20 a alrededor de 75%.
activo(s), preferentemente alrededor de 20 a alrededor de 75%.
Las preparaciones inmunogénicas y las vacunas se
administran de una manera compatible con la formulación de
dosificación y en una cantidad tal que sea eficaz terapéuticamente,
inmunogénica y protectora. La cantidad a administrar depende del
sujeto a tratar, incluida por ejemplo la capacidad del sistema
inmune del individuo para sintetizar anticuerpos y, si fuese
necesario, para producir una respuesta inmune de mediación celular.
Las cantidades precisas de ingredientes activos necesarios a
administrar dependen del juicio médico. Sin embargo se pueden
determinar fácilmente intervalos de dosificación por el experto y
pueden ser del orden de microgramos a miligramos de
ingrediente(s)
activo(s) por vacunación. Los regímenes apropiados para la administración inicial y las dosis de revacunación son también variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida por administraciones de revacunación subsiguientes. La dosificación puede depender también de la vía de administración y variará según la talla del huésped.
activo(s) por vacunación. Los regímenes apropiados para la administración inicial y las dosis de revacunación son también variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida por administraciones de revacunación subsiguientes. La dosificación puede depender también de la vía de administración y variará según la talla del huésped.
La concentración del ingrediente proteico activo
en una composición inmunogénica de acuerdo con la invención es en
general de alrededor de 1 a 95%. Una vacuna que contiene el material
antigénico de solamente un patógeno es una vacuna monovalente. Las
vacunas que contienen el material antigénico de varios patógenos son
vacunas combinadas y forman parte también de la invención. Esas
vacunas combinadas contienen, por ejemplo, el material de diversos
patógenos o de varias cepas del mismo patógeno o combinaciones de
diversos patógenos. En la invención, como se ha señalado
anteriormente, las proteínas F, G y M del RSV A y del RSV B se
combinan en una sola composición inmunogénica multivalente que
puede contener también otros inmunógenos.
Se puede mejorar significativamente la
inmunogenicidad si los antígenos se coadministran con adyuvantes.
Los adyuvantes aumentan la inmunogenicidad de un antígeno, pero no
son necesariamente inmunogénicos por sí mismos. Los adyuvantes
pueden actuar reteniendo el antígeno localmente cerca del sitio de
administración para producir un efecto de depósito facilitando una
liberación lenta prolongada del antígeno a las células del sistema
inmune. Los adyuvantes pueden atraer también a las células del
sistema inmune hacia el depósito de antígeno y estimular a esas
células para provocar las respuestas inmunes.
Se han utilizado agentes o adyuvantes
inmnoestimulantes durante numerosos años para mejorar las respuestas
inmunes de los huéspedes, por ejemplo, a las vacunas. Adyuvantes
intrínsecos, como los lipopolisacáridos, son normalmente los
componentes de las bacterias matadas o atenuadas utilizadas como
vacunas. Adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que se
formulan para aumentar las respuestas inmunes del huésped. Por
tanto, se han identificado adyuvantes que aumentan la respuesta
inmune a los antígenos liberados por vía parenteral. Sin embargo,
algunos de esos adyuvantes son tóxicos, y pueden provocar efectos
secundarios indeseados, que les hacen inutilizables para la
utilización en el hombre y en numerosos animales. De hecho, solo el
hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (denominados
colectivamente alumbre) se utilizan rutinariamente como adyuvantes
en las vacunas para el hombre y los animales. La eficacia del
alumbre en el aumento de las respuestas de anticuerpos a las
anatoxinas diftérica y tetánica está bien establecida y una vacuna
HBsAg contiene alumbre como adyuvante. Aunque la utilidad del
alumbre está bien establecida para ciertas aplicaciones, ello tiene
sus límites. Por ejemplo, el alumbre es ineficaz para la vacunación
contra el influenza y no provoca habitualmente respuesta inmune de
mediación celular. Los anticuerpos provocados por los antígenos con
un adyuvante de alumbre son principalmente del isotipo IgG1 en el
ratón, lo que puede no ser óptimo para la protección por algunos
agentes de vacunación.
Una gran serie de adyuvantes intrínsecos puede
provocar respuestas inmunes potentes contra los antígenos. Incluyen
saponinas complejadas con los antígenos de proteína de membrana
(complejo inmunoestimulante), polímeros Pluronic con aceites
minerales, micobacterias matadas en aceites minerales, el adyuvante
incompleto de Freund, productos bacterianos, como el dipéptido de
muramilo (MDP), y lipopolisacáridos (LPS) así como el lípido A y
liposomas.
Para inducir de manera eficaz respuestas inmunes
humorales (HIR) y una inmunidad de mediación celular (CMI), se
emulsifican frecuentemente los inmunógenos en adyuvantes. Numerosos
adyuvantes son tóxicos, induciendo granulomas, inflamaciones agudas
y crónicas (adyuvante completo de Freund, FCA), una citolisis
(saponinas y polímeros Pluronic) y una pirogenicidad, una artritis
y una uveitis anterior (LPS y MDP). Aunque el FCA sea un adyuvante
excelente y se utilice ampliamente en investigación, no está
autorizado para la utilización en las vacunas para el hombre o el
animal por motivo de su toxicidad.
Las proteínas F, G y M del RSV de la presente
invención son útiles como inmunógenos para la generación de
anticuerpos contra éstas, como antígenos en inmunoensayos que
incluyen las dosificaciones por el método E.L.I.S.A. (ELISA), los
RIA y otras ensayos de enlace de anticuerpos no unidos a una enzima
o procedimientos conocidos en la técnica para la detección de
anticuerpos. En el ensayo ELISA, la proteína F, G o M elegida o una
mezcla de proteínas se inmoviliza sobre una superficie elegida, por
ejemplo una superficie capaz de enlazarse a las proteínas como los
pozos de una placa para microvaloración de poliestireno. Tras lavado
para eliminar el material adsorbido incompletamente, se puede
enlazar a la superficie elegida una proteína no específica, como una
disolución de albúmina sérica de bovino (BSA), que se conoce por
ser antigénicamente neutra en lo que concierne a la muestra de la
prueba. Eso permite el bloqueo de los sitios de adsorción no
específicos sobre la superficie de inmovilización y reduce, por
tanto, el ruido de fondo provocado por el enlace no específico de
proteínas presentes en los antisueros sobre la superficie.
La superficie de inmovilización se pone después
en contacto con una muestra, como materiales clínicos o biológicos,
para ser probados de manera que conduzca a la formación de complejos
inmunes (antígeno/anticuerpo). Ello puede incluir la dilución de la
muestra con diluyentes, como disoluciones de BSA, de gammaglobulina
de bovino (BGG) y/o de tampón fosfato salino (PBS)/Tween. La
muestra se deja después incubar durante alrededor de 2 a 4 horas, a
temperaturas como del orden de alrededor de 25ºC a 37ºC. Tras
incubación, la superficie en contacto con la muestra se lava para
eliminar el material no inmunocomplejado. El procedimiento de lavado
puede incluir el lavado con una disolución, como PBS/Tween o un
tampón borato. Tras la formación de los inmunocomplejos específicos
entre la muestra de prueba y la proteína enlazada y el subsiguiente
lavado, la aparición, e incluso la cantidad, de la formación de
inmunocomplejos se puede determinar sometiendo el inmunocomplejo a
un segundo anticuerpo que tiene una especificidad para el primer
anticuerpo. Si la muestra de prueba es de origen humano, el segundo
anticuerpo es un anticuerpo que tiene una especificidad para las
inmunoglobulinas humanas y las IgG en general. Para definir medios
de detección, el segundo anticuerpo puede tener una actividad
asociada como una actividad enzimática, que general, por ejemplo,
un desarrollo de color durante la incubación con un sustrato
cromógeno apropiado. Se puede obtener después la cuantificación
midiendo el grado de generación de color utilizando, por ejemplo,
un espectrofotómetro.
La divulgación anterior describe la invención de
modo general. Se puede obtener una comprensión más completa por
referencia a los ejemplos específicos siguientes. Esos ejemplos se
describen solamente a título de ilustración y no se destinan a
limitar el marco de la invención. Se tienen en cuenta cambios en la
forma y la sustitución de equivalentes como puedan sugerirlo o
hacerlo práctico las circunstancias. Aunque se hayan utilizado aquí
términos específicos, se supone que esos términos tienen un sentido
descriptivo y no un objetivo de limitación.
Los procedimientos de determinación de la
dosis_{50} (TCID_{50}/ml) infecciosa de cultivo celular, los
contenidos de las placas y de neutralización, descritos no
explícitamente en esta divulgación, se describen ampliamente en la
literatura científica y bien en el marco de las competencias del
experto. Las concentraciones en proteínas se determinan por el
procedimiento del ácido bicinconínico (BCA) como describe el Pierce
Manual (23 220, 23 225; Pierce Chemical Company, USA), incorporado
aquí a título de referencia.
Los medios de cultivo CMRL 1969 y el medio de
Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) se utilizan para los cultivos
celulares y el crecimiento del virus. Las células utilizadas en este
estudio son células ce riñones de mono verde de África de calidad
vacuna (VERO lote M6) obtenidas en el Instituto Mérieux. Los virus
RS utilizados son los virus RS de subtipo A (cepas larga y A2)
obtenidos en el American Type Culture Collection (ATCC), un aislado
clínico reciente de subtipo A de RSV y un aislado clínico reciente
de subtipo B del Baylor College de Medicina.
Este ejemplo ilustra la producción de RSV sobre
una línea celular de mamífero sobre bolas de microsoportes en un
fermentador controlado de 150 l.
Se añadieron células de riñones de monos verdes
de África de calidad vacuna (VERO), en una concentración de
10^{5} células/ml, a 60 l de medio CMRL 1969, pH 7,2 en un
biorreactor de 150 l que contenía 360 g de bolas microsoportes de
Cytodex-1 y se agitaron durante 2 horas. Se añaden
60 l suplementarios de CMRL 1969 para dar un volumen total de 120
l. Se añade suero fetal bovino para alcanzar una concentración final
de 3,5%. Se añade glucosa en una concentración final de 3 g/l y se
añade L-glutamina en una concentración final de 0,6
g/l. Se controlan el oxígeno disuelto (40%), el pH (7,2), la
agitación (36 r/min) y la temperatura (37ºC). Se controlan el
crecimiento de las células, los contenidos de glucosa, de lactato y
de glutamina. En el día 4, el medio de cultivo se drena del
fermentador y se añaden 100 l del medio E199 (sin suero fetal
bovino) y se agitan durante 10 minutos. El fermentador se drena y
llena de nuevo con 120 l de E199.
Se añade un inóculo de RSV de subtipo A de una
multiplicidad de infección (M.O.I) de 0,001 y se mantiene después
el cultivo durante 3 días antes de que un tercio a una mitad del
medio sea drenado y reemplazado con medio fresco. En el día 6
post-infección, se para la agitación y se dejan
sedimentar las bolas. El fluido de cultivo viral se drena y se
filtra a través de un filtro de 20 \mum, después un filtro de 3
\mum previo a todo tratamiento ulterior.
La cosecha viral clarificada se concentra 75 a
150 veces utilizando la ultrafiltración de flujo tangencial con
membranas de 300 NMWL y se filtra por diálisis con una disolución
salina de tampón fosfato que contenía 10% de glicerol. El
concentrado viral se almacena congelado a -70ºC antes de toda
purificación ulterior.
Este ejemplo ilustra el procedimiento de
purificación de la sub-unidad de RSV a partir de un
concentrado viral de RSV de subtipo A.
Una disolución de
poli(etilenglicol)-8000 al 50% se añade a una
alícuota de concentrado de virus preparado como se ha descrito en
el ejemplo 1 para dar una concentración final de 6%. Después de
agitación a temperatura ambiente durante 1 hora, la mezcla se
centrífuga a 15000 r/min durante 30 min en un rotor Sorvall
SS-34 a 4ºC. El fondo residual viral se pone
después en suspensión en fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8, urea 2 M,
NaCl 0,15 M, se agita durante 1 hora a temperatura ambiente y
después se centrífuga de nuevo a 15000 r/min durante 30 min en un
rotor Sorvall SS-34 a 4ºC. El fondo residual viral
se pone después en suspensión en fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8,
NaCl 50 mM, 1% de Triton X-100 y se agita durante 30
minutos a temperatura ambiente. El corazón del virus insoluble se
retira por centrifugación a 15000 r/min durante 30 min en un rotor
Sorval SS-34 a 4ºC. El sobrenadante de proteína
soluble se aplica a una columna de hidroxiapatita cerámica (tipo II,
Bio-Rad Laboratories) y la columna se lava después
con cinco veces el volumen de la columna de fosfato de sodio 1 mM,
pH 6,8, NaCl 50 mM, 0,02% de Triton X-100. La
composición de la sub-unidad de RSV procedente del
subtipo A del RSV, que contiene las proteínas F, G y M, se obtiene
eluyendo la columna con 10 veces el volumen de la columna de
fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8, NaCl 400 mM, 0,02% de Triton
X-100.
Este ejemplo ilustra el análisis de la
preparación de la sub-unidad de RSV obtenida a
partir del subtipo A de RSV por electroforesis sobre gel de
poli(acrilamida)-SDS
(SDS-PAGE) y por inmunoimpresión.
La composición de la sub-unidad
de RSV preparada como se ha descrito en el ejemplo 2 se analiza por
SDS-PAGE utilizando geles de acrilamida al 12,5%.
Las muestras se someten a una electroforesis en presencia y en
ausencia de 2-mercaptoetanol (agente reductor). Los
geles se colorean con plata para detectar las proteínas virales
(Fig. 1, tabla a y b). Las inmunoimpresiones de los geles similares
se preparan y sondean con un anticuerpo monoclonal de ratón (mAb
5353C75) para la glicoproteína F (Fig. 2, tabla a y 3, tabla a) o
con un anticuerpo monoclonal de ratón (mAb 131-2G)
para la glicoproteína G (Fig. 2, tabla b y 3, tabla b) o un
antisuero de cobayo (gp178) contra un péptido M de RSV (secuencia
peptídica: LKSKNMLTTVKDLTMKTLNPTHDIIALCEFEN - SEQ ID Nº 1) (Fig 2,
tabla c y 3, tabla c) o un antisuero de cabra (Virostat nº 0605)
contra el RSV entero (Fig. 2, tabla d y 3, tabla d). El análisis
densitométrico del gel, coloreado con plata, de la preparación de la
sub-unidad de RSV en condiciones reductoras indica
una distribución de la composición como sigue:
Glicoproteína G (forma de 95 kDa) = 10%
Glicoproteína F_{1} (48 kDa) = 30%
Proteína M (31 kDa) = 23%
Glicoproteína F_{2} (23 kDa) = 19%
La glicoproteína F migra, en condiciones no
reductoras, como un heterodímero de aproximadamente 70 kDa (F_{0})
así como formas oligoméricas superiores (dímeros y trímeros) (Fig.
3, tabla a).
Este ejemplo ilustra la inmunogenicidad de la
preparación de la sub-unidad de RSV en la rata del
algodón.
Se inmunizan grupos de cinco ratas del algodón
por vía intramuscular (0,1 ml en los días 0 y 28 con 1 \mug o 10
\mug de la preparación de la sub-unidad de RSV,
producida como se describe en el ejemplo 2 y formulada con 1,5
mg/dosis de alumbre o 5 \mug/dosis de Iscomatrix^{TM} (Iscotec,
Suecia). Se obtienen muestras sanguíneas en el día 41 y se prueba
para los contenidos de anticuerpos anti-fusión y
neutralizantes. Las ratas se infectan por vía intranasal en el día
43 con el RSV y se sacrifican cuatro días más tarde. Se recogen los
lavados de los pulmones y de la naso-faringe y se
prueban para los contenidos de RSV. Se inducen contenidos elevados
de anticuerpos anti-fusión y de neutralización como
se muestra en las tablas I y II más adelante. Además, se obtiene la
protección completa contra la infección por el virus a excepción de
una rata, por las vías respiratorias superiores e inferiores
(tablas III y IV más adelante).
Este ejemplo ilustra la inmunogenicidad de la
preparación de la sub-unidad del RSV en el
ratón.
Se inmunizan grupos de seis ratones BALB/c por
vía intramuscular (0,1 ml) en los días 0 y 28 con diversas dosis de
la preparación de la sub-unidad de RSV, producida
como se describe en el ejemplo 2 y formulada con 1,5 mg/dosis de
alumbre, 10 \mug/dosis de Iscomatrix^{TM}, 200 \mug/dosis de
polifosfaceno (PCPP) o 200 \mug/dosis de DC-Chol.
Las diversas preparaciones probadas se dan en las tablas V, VI y VII
más adelante. Se obtienen muestras sanguíneas en los días 28 y 42 y
se prueban para el contenido de anticuerpos de neutralización y los
contenidos de anticuerpos anti-F. Los ratones son
inducidos en el día 44 con RSV y sacrificados cuatro días más
tarde. Se retiran los pulmones y se homogeneizan para determinar los
contenidos de virus. Se provocan contenidos elevados de anticuerpos
de neutralización y de anticuerpos anti-F como se
muestra en las tablas V y VI más adelante. Además, se obtiene una
protección completa contra la infección por el virus, como se
muestra por la ausencia de virus en los triturados de pulmones y los
lavados nasales (tabla VII más adelante).
Este ejemplo ilustra la inmunogenicidad de la
preparación de sub-unidad de RSV en monos verdes de
África.
Se inmunizan grupos de cuatro monos por vía
intramuscular (0,5 ml en los días 0 y 21 con 100 \mug de la
preparación sub-unidad de RSV producida como se
describe en el ejemplo 2 y formulada con 1,5 mg/dosis de alumbre o
50 \mug/dosis de Iscomatrix^{TM}). Se obtienen muestras
sanguíneas en los días 21, 35 y 49 y se prueban respecto a los
contenidos de anticuerpos de neutralización y de anticuerpos
anti-F. Se inducen cantidades elevadas de
anticuerpos de neutralización y de anticuerpos
anti-F como se muestra en las tablas VIII y IX más
adelante.
Este ejemplo ilustra aún más la producción de
RSV sobre una línea celular de mamífero sobre microbolas en un
fermentador controlado de 150 l.
Se añaden células de riñones de monos verdes de
África de calidad vacuna (células VERO) a 150 l de medio de
Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) que contiene 3,5% de suero
fetal de bovino, pH 7,2, a una concentración final de 2 x 10^{5}
células/ml (intervalo de 1,5 a 3,5 células/ml), en un biorreactor de
150 l que contiene 450 g de bolas microsoportes de
Cytodex-1 (3 g/l). Tras inoculación de las células,
se controlan el oxígeno disuelto (40 por ciento de saturación de
aire (intervalo de 25 a 40%)), el pH (7,1 \pm 0,2), la agitación
(36 \pm 2 r/min) y la temperatura (37ºC \pm 0,5ºC). La unión
inicial de las células a las bolas, el crecimiento de las células
(determinación del número de células) y las proporciones de los
medios de crecimiento de glucosa y de lactato se controlan sobre
una base cotidiana. La infección del cultivo de las células VERO
aparece tres días tras el comienzo del crecimiento de las células
cuando la concentración de las células está en el intervalo de 1,5
a 2,0 x 10^{6} células/ml. Se para la agitación y se dejan
sedimentar las bolas microsoportes durante 60 minutos y el medio de
cultivo se drena del biorreactor utilizando una línea de drenaje
colocada aproximadamente 3 cm por encima del volumen de las bolas
sedimentadas. Se añaden setenta y cinco litros de IMDM sin suero
fetal de bovino (medio de lavado) y la mezcla se agita a 36 r/min
durante 10 minutos. Se para la agitación y se dejan sedimentar las
bolas microsoportes durante 30 minutos. Se retira el medio de lavado
utilizando la línea de drenaje y después se llena el biorreactor a
75 l (medio volumen) con IMDM sin suero fetal de bovino.
Para la infección, se añade un inóculo de RSV de
subtipo B de RSV a una multiplicidad de infección (M.O.I.) de 0,001
y se efectúa la adsorción del virus a las células en medio volumen
durante 2 horas con agitación a 36 r/min. Se añaden setenta y cinco
litros de IMDM al biorreactor a un volumen final de 150 l. Tras la
infección se controlan el oxígeno disuelto (40 por ciento de
saturación de aire (intervalo de 10-40%), el pH
(7,25 \pm 0,1), la agitación (36 \pm 2 r/min) y la temperatura
(37ºC \pm 0,5ºC). Tras la infección, el medio de crecimiento de
las células (determinación del número de células), las proporciones
de glucosa y de lactato, los antígenos F y G de RSV y la
infectividad del RSV se controlan sobre una base cotidiana. En el
día 3 después de la infección se para la agitación, se dejan
sedimentar las bolas microsoportes durante 60 minutos, y se retiran
75 l (50%) del medio por la vía de la línea de drenaje y se
reemplazan con medio fresco de nueva aportación. Ocho horas
(intervalo de siete a nueve horas) tras la infección, cuando el
efecto citopatógeno inducido por el virus es observado (es decir,
cuando las células se separan de las bolas microsoportes y el
oxígeno no se consume ya por el cultivo), se para el agitador y se
dejan sedimentar las bolas de microvaloración durante 60 minutos.
El fluido de cultivo que contiene el virus se retira del biorreactor
y se transfiere a un frasco de espera. Se añaden setenta y cinco
litros de IMDM sin suero fetal de bovino al biorreactor y se agita a
75 r/min durante 30 minutos. Se dejan sedimentar las bolas
microsoportes durante 30 minutos, se retira del biorreactor el
fluido de enjuague y se combina con el material recogido en el
frasco de espera.
El material recogido se concentra
aproximadamente 20 veces por ultrafiltración de flujo tangencial (es
decir, que el material que contiene el virus se retiene por la
membrana) utilizando una membrana de ultrafiltración de 500 o 1000
kilodaltons (K) o como variante una membrana de microfiltración de
0,45 \muM a un volumen final de 10 l. El material concentrado se
filtra por diálisis con 10 volúmenes de disolución salina tamponada
por fosfato, pH 7,2. El concentrado viral filtrado por diálisis se
almacena congelado a -70ºC antes de la purificación ulterior.
Este ejemplo ilustra el procedimiento de
purificación de la sub-unidad del RSV a partir de un
concentrado viral del subtipo B del RSV.
Un concentrado de virus, preparado como se
describe en el ejemplo 7, se centrífuga a 15000 r/min durante 30
min en un rotor Sorvall SS-34 a 4ºC. El fondo
residual viral se pone después en suspensión en fosfato de sodio 1
mM, pH 6,8, NaCl 300 mM, 2% de Triton X-100, y se
agita durante 30 minutos a temperatura ambiente. El corazón del
virus insoluble se retira por centrifugación a 15000 r/min durante
30 min en un rotor Sorvall SS-34 a 4ºC. El
sobrenadante de proteína soluble se aplica a una columna de
hidroxiapatita cerámica (tipo I, Bio-Rad
Laboratories) y la columna se lava después con diez veces el volumen
de la columna de fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8, NaCl 10 mM, 0,02%
de Triton X-100. La composición de
sub-unidad de RSV que contiene la proteína F, G y M
se obtiene por elución de la columna con 10 veces el volumen de la
columna de fosfato de sodio 1 mM, pH 6,8, NaCl 600 mM, 0,02% de
Triton X-100. En ciertos casos la composición de la
sub-unidad de RSV se purifica aún diluyendo primero
el eluato procedente de la primera columna de hidroxiapatita
cerámica para rebajar la concentración de NaCl a NaCl 400 mM y
aplicando después la sub-unidad diluida sobre una
columna de hidroxiapatita cerámica (tipo II,
Bio-Rad Laboratories). El flujo de esta columna es
la composición de sub-unidad purificada de RSV
procedente del subtipo B del RSV.
Este ejemplo ilustra el análisis de la
preparación de la sub-unidad de RSV obtenida a
partir del subtipo B del RSV por electroforesis sobre gel de
poli(acrilamida)-SDS
(SDS-PAGE).
La composición de la sub-unidad
de RSV preparada como se describe en el ejemplo 8 se analiza por
SDS-PAGE utilizando un gel de acrilamida al 15,0%.
La muestra se somete a una electroforesis en presencia de
2-mercaptoetanol (agente reductor). El gel se
colorea con plata para detectar las proteínas virales (Fig. 4). El
análisis densitométrico del gel coloreado con plata de la
preparación de la sub-unidad de RSV en condiciones
reductoras indica una distribución de composición de las proteínas
como sigue:
Como resumen de esta descripción, la invención
proporciona una mezcla coaislada y copurificada de las proteínas F,
G y M de RSV, donde la mezcla está desprovista de lectina de
lenteja, concanavalina A y anticuerpos monoclonales, y la mezcla es
obtenible por el método que comprende las etapas de: hacer crecer el
RSV sobre células en un medio de cultivo; separar el virus
desarrollado del medio de cultivo; solubilizar al menos la proteína
de fusión (F), la proteína de unión (G) y la proteína de la matriz
(M) del virus separado; cargar las proteínas solubilizadas en una
matriz de hidroxiapatita y coeluir selectivamente las proteínas F, G
y M, que es capaz de proteger contra el RSV en modelos animales
pertinentes. Son posibles modificaciones en el marco de la
invención.
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Claims (18)
1. Mezcla coaislada y copurificada de la
proteína de fusión (F), de la proteína de unión (G) y de la proteína
de matriz (M) del virus respiratorio sincitial (RSV), donde la
mezcla está desprovista de lectina de lenteja, concanavalina A y
anticuerpos monoclonales, y la mezcla es obtenible por el método que
comprende las etapas de: hacer crecer el RSV sobre células en un
medio de cultivo;
separar el virus desarrollado del medio de
cultivo;
solubilizar al menos la proteína de fusión (F),
la proteína de unión (G) y la proteína de la matriz (M) del virus
separado;
cargar las proteínas solubilizadas en una matriz
de hidroxiapatita; y
coeluir selectivamente las proteínas F, G y
M.
2. La mezcla de la reivindicación 1, en la que
dicha proteína de fusión (F) comprende proteínas de fusión (F)
multiméricas.
3. La mezcla de la reivindicación 2 en la que,
cuando se analiza mediante SDS-PAGE en condiciones
no reductoras, dicha proteína de fusión (F) incluye heterodímeros
de aproximadamente 70 kDa de peso molecular y formas dímeras y
trímeras.
4. La mezcla reivindicada en una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en la que, cuando se analiza mediante
SDS-PAGE en condiciones no reductoras, dicha
proteína de unión (G) comprende una proteína G de aproximadamente
95 kDa de peso molecular y una proteína G de aproximadamente 55 kDa
de peso molecular y una proteína oligomérica.
5. La mezcla reivindicada en una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en la que, cuando se analiza mediante
SDS-PAGE en condiciones no reductoras, dicha
proteína de matriz (M) comprende una proteína M de aproximadamente
28 a 34 kDa de peso molecular.
6. La mezcla reivindicada en la reivindicación
1, en la que cuando se analiza mediante por SDS-PAGE
en condiciones reductoras, dicha proteína de fusión (F) comprende
F_{1} de aproximadamente 48 kDa de peso molecular y F_{2} de
aproximadamente 23 kDa, dicha proteína de unión (G) comprende una
proteína G de aproximadamente 95 kDa de peso molecular y una
proteína G de aproximadamente 55 kDa de peso molecular y dicha
proteína de matriz (M) comprende una proteína M de aproximadamente
31 kDa.
7. La mezcla reivindicada en la reivindicación
1, en la que dichas proteínas están presentes en proporciones
relativas de:
F de 35 a 70% en peso;
G de 5 a 30% en peso;
M de 10 a 40% en peso.
8. La mezcla reivindicada en la reivindicación
7, en la que, cuando se analiza por SDS-PAGE en
condiciones reductoras y por densitometría de barrido tras
coloración con plata, la relación de F_{1} de aproximadamente 48
kDa de peso molecular a F_{2} de aproximadamente 23 kDa de peso
molecular está entre 1:1 a 2:1.
9. La mezcla reivindicada en una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8 que tiene una pureza de al menos
75%.
10. La mezcla reivindicada en la reivindicación
1, en la que dichas proteínas RSV están no desnaturalizadas.
11. La mezcla reivindicada en una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, en la que dichas proteínas RSV son de
uno o de dos subtipos de RSV A y RSV B.
12. Una composición inmunogénica que comprende
una cantidad inmunoeficaz de la mezcla reivindicada en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. La composición inmunogénica reivindicada en
la reivindicación 12, que comprende además al menos un inmunógeno
adicional.
14. La composición inmunogénica reivindicada en
la reivindicación 13, en la que al menos un inmunógeno adicional
comprende al menos una proteína del virus parainfluenza humano (PIV)
seleccionada del grupo que comprende PIV-1,
PIV-2 y PIV-3.
15. Un método para producir una mezcla coaislada
y copurificada de proteínas del virus respiratorio sincitial (RSV),
que comprende las etapas de:
hacer crecer el RSV sobre células en un medio de
cultivo;
separar el virus desarrollado del medio de
cultivo;
solubilizar al menos la proteína de fusión (F),
la proteína de unión (G) y la proteína de la matriz (M) del virus
separado;
cargar las proteínas solubilizadas en una matriz
de hidroxiapatita y
coeluir selectivamente las proteínas F, G y M de
la matriz de intercambio iónico.
16. El método reivindicado en la reivindicación
15, en el que dicho virus desarrollado se lava con urea para
eliminar los contaminantes sin eliminación sustancial de las
proteínas F, G y M antes de dicha etapa de solubilización.
17. Una mezcla coaislada y copurificada de la
proteína de fusión (F), de la proteína de unión (G) y de la
proteína de matriz (M) del RSV, en la que la mezcla está exenta de
lectina de lenteja, concanavalina A y anticuerpos monoclonales y la
mezcla es obtenible por el método que comprende las etapas de:
hacer crecer el RSV sobre células en un medio de
cultivo;
separar el virus desarrollado del medio de
cultivo;
solubilizar al menos la proteína de fusión (F),
la proteína de unión (G) y la proteína de la matriz (M) del virus
separado;
cargar las proteínas solubilizadas en una matriz
de hidroxiapatita y
coeluir selectivamente las proteínas F, G y M de
la matriz de intercambio iónico.
para la utilización como sustancia farmacéutica
en una vacuna contra una enfermedad provocada por la infección con
el virus respiratorio sincitial.
18. El uso de una mezcla coaislada y
copurificada de la proteína de fusión (F), de la proteína de unión
(G) y de la proteína matriz (M) del RSV, en donde la mezcla está
desprovista de lectina de lenteja, concanavalina A y anticuerpos
monoclonales, y la mezcla es obtenible por el método que comprende
las etapas de:
hacer crecer el RSV sobre células en un medio de
cultivo;
separar el virus desarrollado del medio de
cultivo;
solubilizar al menos la proteína de fusión (F),
la proteína de unión (G) y la proteína de la matriz (M) del virus
separado;
cargar las proteínas solubilizadas en una matriz
de hidroxiapatita y
coeluir selectivamente las proteínas F, G y M de
la matriz de intercambio iónico.
para la preparación de una composición de
vacunación para la inmunización contra una enfermedad provocada por
la infección con el RSV.
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