CN112430267B

CN112430267B - 鸡肠炎沙门菌的检测抗体以及检测方法

Info

Publication number: CN112430267B
Application number: CN202011250847.7A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 孟闯; 王晓海; 许莹; 潘志明; 康喜龙; 曹李妍; 胡茂志; 顾丹
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-11-11
Filing date: 2020-11-11
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2040-11-11
Also published as: CN112430267A

Abstract

本发明提供了一种鸡肠炎沙门菌的检测抗体以及检测方法，所述抗体包括重链和轻链，所述轻链包括三个互补决定区。本发明采用基于针对H:g抗原单抗的竞争ELISA方法，与现有技术相比，单抗的竞争ELSIA方法拥有更好的特异性，并缩短了检测时间，简化了检测步骤。

Description

鸡肠炎沙门菌的检测抗体以及检测方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，特别是涉及一种鸡肠炎沙门菌的检测抗体以及检测方法。

背景技术

肠炎沙门菌是一种泛嗜性的革兰氏阴性人兽共患致病菌，具有广泛的宿主谱。该菌主要引起畜禽的胃肠炎以及人类的肠炎和食物中毒。肠炎沙门菌不仅能引起家禽的致病并造成严重的经济损失，而且被污染的家禽产品作为肠炎沙门菌的携带者，通过食物链严重危害人类健康。禽沙门菌病已经成为公共卫生所关注的重要问题。目前规模化鸡场主要以肠炎沙门菌感染为主。为实现鸡场沙门菌病的净化，急需拥有一种灵敏、准确、快速的鸡肠炎沙门菌病诊断方法。

目前，血清学诊断是禽类沙门菌病的重要诊断依据之一。玻板凝集试验(Plateagglutination test，PAT)是国内普遍采用的禽类沙门菌抗体快速检测方法，但是PAT检出限较高，常有漏检现象，大批量检测耗时耗力，并且常用的检测抗原无法区分肠炎沙门菌阳性样品和鸡白痢沙门菌阳性样品，特异性较差。而以肠炎沙门菌鞭毛蛋白作为检测抗原能够很好地将两者区分开来。常用的商品化ELISA试剂盒(IDEXX)为基于重组鞭毛蛋白的间接ELISA方法，但是这种方法灵敏度和特异性都较差。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种鸡肠炎沙门菌的检测抗体以及检测方法，用于解决现有技术中鸡肠炎沙门菌检测灵敏度和特异性低的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于检测鸡肠炎沙门菌的抗体，所述抗体包括重链和轻链，所述轻链包括三个互补决定区，其氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1-3所示，所述重链包括三个互补决定区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。

进一步地，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步地，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明的另一方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如上所述抗体。

进一步地，所述多核苷酸中编码所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

进一步地，所述多核苷酸中编码所述重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明的另一方面提供了一种重组表达载体，所述表达载体中含有上述多核苷酸。

本发明的另一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有或者整合有上述重组表达载体。

本发明的另一方面提供了上述抗体、多核苷酸、重组表达载体以及宿主细胞用于检测鸡肠炎沙门菌的用途。

本发明的另一方面提供了一种鸡肠炎沙门菌竞争ELISA检测组合物，所述组合物包括如上所述的抗体。

进一步地，所述组合物还包括包被有鞭毛蛋白的固相载体、肠炎沙门菌阳性血清和阴性血清、包被液、封闭液。

进一步地，所述组合中还含有稀释液、洗涤液、TMB显色液、反应终止液等本领域人员采用竞争ELISA检测的一般实验材料。

进一步地，所述抗体为酶标抗体，所述酶标抗体为HRP标记的针对H:g表位的IgG抗体。

所述固相载体用于制备酶标板，所述酶标板的制备方法为：采用方阵滴定法，用包被液将制备的肠炎沙门菌鞭毛蛋白稀释，并加入酶标板各孔进行包被；然后用洗涤液洗涤后每孔加入封闭液进行封闭，再用洗涤液洗涤，接着加入酶标板稳定剂，继续进行包被；然后将板拍干，烘干得到包被有肠炎沙门菌鞭毛蛋白的酶标板。

进一步的，所述包被液可以为pH 7.2的磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为pH 7.2的PBST溶液；所述的封闭液为5％脱脂奶粉；所述稀释液为含有1％BSA的PBS溶液；所述的反应终止液为1mol/L的H₂SO₄溶液。

本发明的另外一个方面提供了一种检测鸡肠炎沙门菌抗体的试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的检测组合物。

进一步地，所述试剂盒中还含有其他可以用于检测的辅助试剂或者材料，例如产品说明书或者操作手册。

本发明的另外一个方面提供了一种鸡肠炎沙门菌抗体的竞争ELISA检测方法，所述方法包括采用包括如上所述抗体用来检测鸡肠炎沙门菌。

进一步地，所述方法具体包括以下步骤：

(1)将待检测抗原用包被液稀释，用洗涤液洗涤，封闭，洗涤；

(2)滴加用封闭液稀释后的肠炎沙门菌阴性血清和阳性血清分别与用稀释液稀释的HRP标记的针对H:g表位的抗体，孵育后洗涤；

(3)加入显色液，显色后加入终止液，检测吸光度值，分析结果。

进一步地，所述方法具体可以为以待检测抗原(肠炎沙门菌鞭毛蛋白)采用方阵滴定法，用包被液将其稀释后，加入酶标板各孔，包被后用洗涤液洗涤；每孔再加入封闭液封闭后用洗涤液洗涤；将用封闭液稀释后的肠炎沙门菌阴性血清和阳性血清分别与用稀释液稀释的HRP标记的针对H:g表位的抗体1:1混合后加入各孔中，孵育后用洗涤液洗涤；最后每孔加入TMB显色液，避光显色后，向每孔加入反应终止液，用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度值；计算抑制率PI＝(1-血清样品的OD450 nm值/空白对照的OD450 nm)×100％，PI≥35％为阳性，PI＜35％为阴性。

进一步的，所述包被液为pH 7.2的磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为pH 7.2的PBST溶液；所述稀释液为含有1％BSA的PBS溶液；所述的反应终止液为1mol/L的H₂SO₄溶液。

进一步的，所述抗原包被浓度为5.8μg/mL；包被时间为20h；封闭时间为3h。

进一步的，肠炎沙门菌阴性血清和阳性血清的稀释度为1:8；HRP标记的H:g表位的抗体的稀释倍数为1:2000。

进一步的，将用稀释液稀释后的肠炎沙门菌阴性血清和阳性血清分别与用稀释液稀释的HRP标记的针对H:g表位的抗体1:1混合后加入各孔中，于37℃孵育，孵育时间为30min；每孔再加入TMB显色液，于37℃孵育，孵育时间为10min。

进一步的，分析结果是指计算抑制率PI＝(1-血清样品的OD450 nm值/空白对照的OD450nm)×100％，血清样品的PI≥35％时判为阳性；PI＜35％时判为阴性。

如上所述，本发明的鸡肠炎沙门菌的检测抗体以及检测方法，具有以下有益效果：

本发明为基于针对H:g抗原单抗的竞争ELISA方法。与现有技术相比，单抗的竞争ELSIA方法拥有更好的特异性，并缩短了检测时间，简化了检测步骤。此外，该试剂盒与D群沙门菌检测试剂盒的联用能有效鉴别鸡白痢沙门菌的感染。因此，本发明为肠炎沙门菌抗体的检测提供了一种灵敏快捷的检测方法，为肠炎沙门菌的防控和鸡白痢沙门菌的净化提供了一种重要的检测手段。

附图说明

图1为在竞争ELISA中不同血清的抑制率；

图2a为SDS-PAGE分析结果；

图2b为Western blot分析结果；

图3为在竞争ELISA中不同血清稀释度对抑制率的影响；

图4为在竞争ELISA中不同包被液的抑制率；

图5为不同包被温度和时间对对P/N值的影响；

图6为在竞争ELISA中不同封闭液的抑制率；

图7为不同封闭时间对P/N值的影响；

图8为酶标抗体的不同孵育时间对P/N值的影响；

图9为不同显色时间对P/N值的影响；

图10为在竞争ELISA中不同浓度酶标抗体和不同浓度抗原反应的P/N值；

图11为单抗竞争ELISA检测鸡血清ROC分析曲线；

图12为在竞争ELISA中不同浓度未酶标抗体的抑制率；

图13为固相载体在37℃保存不同时间对检测结果的影响；

图14为酶标抗体在37℃保存不同时间对检测结果的影响；

图15为各对照血清在37℃保存不同时间对检测结果的影响；

图16为试剂盒4℃保存不同时间对OD450的影响结果。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989andThird edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，JohnWiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS INENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1：酶标抗体的制备

取9-10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，每只400-500μL，注射7-10天后，将处于对数生长期的杂交瘤细胞(分泌针对H:g抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞12E3)使用无菌PBS洗涤两遍后，重悬细胞于PBS溶液中，并将细胞的浓度调整为1×10⁶个/mL，腹腔注射小鼠，每只200μL，注射细胞7-10天后可观察小鼠出现腹部明显增大、被毛凌乱、行动不便时可采集腹水。将腹水送去南京金斯瑞生物科技有限公司进行纯化和HRP的标记，取回酶标抗体于-70℃保存。

经鉴定，结果表明，单克隆抗体轻链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如SEQID NO.1所示，具体为：RASESVDSSGNSFMH。

轻链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：LASNLES。

轻链可变区互补决定区3(CDR3)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：QQTNEDPPT。

重链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：RYWMS。

重链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：EINPDSSTINYTPSLKD。

重链可变区互补决定区3(CDR3)氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：PRADYGNAWFAY。

轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：METDTLLLWVLLLWVPGSTGNIVLTQSPVFLAVSLGQRATISCRASESVDSSGNSFMHWYQQKPGQVPKLLICLASNLESGVPARFSGSGSRTDFNLTIDPVEADDAATYYCQQTNEDPPTFGGGTRLEIK

编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTAACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGTTTTTTTGGCTGTGTCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTCTGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGGTACCCAAACTCCTCATCTGTCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCAACCTCACCATTGATCCTGTGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAACTAATGAGGATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAGGCTGGAAATCAAA

重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示：

MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLESGGGQVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARPRADYGNAWFAYWGQGTLVTVSA

编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：

ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTGTTGCTCTTTTAAAAGGGGTCCAGTGTGAGGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGTGGCCAGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATATTGGATGAGTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCAGATAGCAGTACGATAAACTACACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTGCAAGACCGAGGGCCGACTATGGTAACGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTTGTCACTGTCTCTGCA

实施例2：鞭毛蛋白的提取

2.1鞭毛蛋白的诱导表达

复苏实验室冻存的肠炎沙门菌C50041，使用三区划线的方法，将菌接种于LB平板上，37℃培养箱中培养12h；挑取单菌落接种于4mL M-broth培养基中，共接种3管，37℃静置培养16-18h；培养完成后，以1:100扩大培养，即取10mL菌液接种到1L培养基中，培养于3L大锥形瓶中，37℃静置培养16-18h。

2.2鞭毛蛋白的提取

将菌液4℃，500g离心20min，倒去上清；加入5mL PBS溶液将菌液重悬，用1N HCl调节悬浮液的pH至2.0-3.0；将悬浮液分装于1.5mL EP管中，每管分装1mL，置于30℃，150rpm摇床中振荡30min；将EP管于4℃4000rpm离心10min，将上清转移到新的EP管中；继续在4℃8000rpm离心5min，将上清转移到新的EP管中；继续在4℃10000rpm离心5min，将上清转移到新的EP管中；继续在4℃12000rpm离心5min，将上清转移到新的50mL离心管中；用1N NaOH将上清pH调至7.2，将上清液转移到透析袋中(透析袋经含有1mM EDTA的2％(m/V)NaHCO₃溶液煮沸10min，SW清洗三次后，煮沸10min)，置于PBS缓冲液中透析4h，每隔80min更换一次PBS缓冲液，最后收集透析袋中的溶液，并于-70℃保存。通过SDS-PAGE和Western-blot检测确认蛋白的纯度。结果如图2a和2b所示。

2.3鞭毛蛋白浓度的测定

使用Pierce Rapid Gold BCA快速蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。4倍稀释后，OD562的读值为0.415，通过BCA试剂盒绘制的标准曲线y＝0.7665x+0.1177，计算出鞭毛蛋白的浓度为1.55mg/mL。

实施例3：ELISA反应最佳条件的确立与诊断方法的建立

3.1抗原包被浓度和酶标抗体稀释度的确定

采用方阵滴定法，用包被液(pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)将实施例2最后收集的透析溶液稀释至终浓度分别为6、7、8μg/mL，每孔加入100μL，每个稀释度重复两排，置于4℃包被过夜；然后用洗涤液(pH 7.2的PBST溶液)洗涤3次，每次5min；每孔加入200μL封闭液(1％BSA-PBS)于37℃封闭2h；用洗涤液洗涤3次，每次5min；将酶标抗体按1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600进行倍比稀释后分别与用1％BSA-PBS溶液按1:10稀释的肠炎沙门菌阴性血清、阳性血清和1％BSA-PBS溶液1:1混合，取100μL分别加入各孔中，于37℃孵育2h；用洗涤液洗涤6次，每次5min；最后每孔加入100μL的TMB显色液，于37℃避光显色10min，并向每孔加入50μL的反应终止液(1mol/L的H₂SO₄溶液)，用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度值(OD450nm)，计算PI＝(1-血清样品的OD450nm值/空白对照的OD450nm)×100％，

选择P(阳性对照抑制率)/N(阴性对照抑制率)值较大，抗原和酶标抗体使用较少，阴性抑制率较低时的抗原浓度和血清稀释度作为抗原包被浓度和血清稀释度。当鞭毛蛋白包被浓度为7μg/mL，酶标抗体稀释度为1:1600时，多方面因素最符合要求。故确定抗原包被浓度为7μg/mL，酶标抗体稀释度为1:1600。

3.2血清稀释度的确定

按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃过夜且洗涤后，每孔加入200μL封闭液(1％BSA-PBS)于37℃封闭2h；用洗涤液洗涤后，将按1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128倍比稀释的肠炎沙门菌阴性血清、阳性血清和1％BSA-PBS溶液分别与1:1600稀释的酶标抗体1:1混合，每孔100μL，作两个重复孔，37℃孵育2h；洗涤后加入TMB显色并加入终止液。读取OD450nm，计算PI＝(1-血清样品的OD450nm值/空白对照的OD450nm)×100％，比较P/N值并观察阴性对照和阳性对照抑制率的变化趋势，选择合适的血清稀释度。

结果如图3所示，由于阳性对照的抑制率从1:8开始显著下降，为保证该方法的检测灵敏度，选择血清的最佳稀释度为1:8。

3.3包被液的确定

分别使用4组不同的包被液按照最佳抗原浓度对抗原进行稀释后包被酶标板：组1为pH5.0的柠檬酸缓冲液、组2为pH7.2的磷酸盐缓冲液、组3为pH9.6的碳酸盐缓冲液、组4为pH13.0的0.1M/L的NaOH，4℃过夜且洗涤后，加入封闭液封闭。洗涤后加入最适血清稀释度的阴阳性血清和1％BSA-PBS溶液与1:1600稀释的酶标抗体1:1的混合液进行孵育，洗涤后加入TMB显色并加入终止液。读取OD450nm，计算PI＝(1-血清样品的OD450nm值/空白对照的OD450nm)×100％，比较各组的P/N值，选择P/N值最大时的封闭液。

结果如图4所示，组1、组2、组3和组4的P/N值分别为4.38、6.30、3.78和1.49。使用PBS作为包被液时P/N值最大，因此将PBS作为最佳包被液。

3.4包被条件的确定

使用最佳抗原浓度包被酶标板，按照不同的包被时间和温度分为5组：组1为4℃24h、组2为4℃20h、组3为4℃16h、组4为4℃12h、组5为37℃2h。洗涤后，加入封闭液封闭。洗涤后加入最适血清稀释度的阴阳性血清和1％BSA-PBS溶液与1:1600稀释的酶标抗体1:1的混合液进行孵育，洗涤后加入TMB显色并加入终止液。读取OD450nm，计算PI＝(1-血清样品的OD450nm值/空白对照的OD450nm)×100％，比较各组P/N值，选择P/N值最大的包被条件作为最适包被条件。

结果如图5所示，组1、组2、组3、组4和组5的P/N值分别为4.39、5.62、4.63、4.84和3.31。4℃包被20h时P/N值最大，因此将4℃和20h作为最佳包被温度和时间。

3.5封闭液的确定

按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃过夜且洗涤后，分别加入6组不同的封闭液：组1为1％的BSA、组2为2％的BSA、组3为5％的BSA、组4为5％的脱脂奶、组5为5％的FBS、组6为10％的FBS进行封闭。洗涤后加入最适血清稀释度的阴阳性血清和1％BSA-PBS溶液与1:1600稀释的酶标抗体1:1的混合液进行孵育，洗涤后加入TMB显色并加入终止液。读取OD450nm，计算PI＝(1-血清样品的OD450nm值/空白对照的OD450nm)×100％，比较各组的读值和P/N值，选择P/N值最大时的封闭液。

结果如图6所示，组1、组2、组3、组4、组5和组6的P/N值分别为2.09、2.11、2.27、3.69、2.31和2.22。经5％脱脂奶封闭后的ELISA板洗涤后无颗粒状沉淀物，且相比较P/N值最大，因此将5％脱脂奶作为最佳封闭液。

3.6封闭时间的确定

按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃过夜且洗涤后，每孔加入200μL 5％的脱脂奶，按照37℃孵育时间不同分成4组：组1为2h、组2为2.5h、组3为3h、组4为3.5h进行封闭。洗涤后用最适血清稀释度的阴阳性血清和1％BSA-PBS溶液与1:1600稀释的酶标抗体1:1的混合液进行孵育，洗涤后加入TMB显色并加入终止液。读取OD450nm，计算PI＝(1-血清样品的OD450nm值/空白对照的OD450nm)×100％，比较各组的读值和P/N值，选择P/N值最大时的封闭液时间作为最适封闭时间。

结果如图7所示，组1、组2、组3和组4的P/N值分别为2.62、2.75、3.46和2.85。5％脱脂奶封闭3h后P/N值最大，因此将封闭3h作为最佳封闭时间。

3.7孵育时间的确定

按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭3h，加入最适血清稀释度的阴阳性血清和1％BSA-PBS溶液与1:1600稀释的酶标抗体1:1的混合液，按照37℃孵育时间不同分成4组：组1为30min、组2为60min、组3为90min、组4为120min。洗涤后加入TMB显色并加入终止液。读取OD450nm，计算PI＝(1-血清样品的OD450nm值/空白对照的OD450nm)×100％，选择P/N值最大时的血清反应时间为最适孵育时间。

结果如图8所示，组1、组2、组3和组4的P/N值分别7.90、3.85、7.85和7.09。当在37℃孵育30min和90min时P/N值均显著高于60min，且两者没有显著性差异，因此选择孵育时间更短的30min作为最佳孵育时间。

3.8显色时间的确定

按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭3h，加入最适血清稀释度的阴阳性血清和1％BSA-PBS溶液与1:1600稀释的酶标抗体1:1的混合液，37℃孵育30min。洗涤后加入TMB显色，按照37℃孵育时间不同分成6组：组1为4min、组2为6min、组3为8min、组4为10min、组5为12min、组6为15min。加入终止液终止反应。读取OD450nm，计算PI＝(1-血清样品的OD450nm值/空白对照的OD450nm)×100％，选择P/N值最大时的显色时间为最适显色时间。

结果如图9所示，组1、组2、组3、组4、组5和组6的P/N值分别为5.53、4.93、5.17、5.90、5.43和4.23。当在37℃孵育10min时P/N值最高，且OD450nm值接近1.0，因此选择显色时间10min作为最佳显色时间。

3.9抗原包被浓度和酶标抗体稀释度的进一步优化

采用方阵滴定法，用最佳包被液将抗原稀释至终浓度分别为5.8、6.2、6.6、7μg/mL，每孔加入100μL，每个稀释度重复两排，置于4℃包被20h；然后用洗涤液(pH 7.2的PBST溶液)洗涤3次，每次5min；每孔加入200μL最佳封闭液于37℃封闭3h；用洗涤液洗涤3次，每次5min；将酶标抗体按1:1600、1:2000、1:2400、1:2800进行稀释后分别与用1％BSA-PBS溶液按1:10稀释的肠炎沙门菌阴性血清、阳性血清和1％BSA-PBS溶液1:1混合，取100μL分别加入各孔中，于37℃孵育30min；用洗涤液洗涤6次，每次5min；最后每孔加入100μL的TMB显色液，于37℃避光显色10min，并向每孔加入50μL的反应终止液(1mol/L的H2SO4溶液)，用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度值，计算PI＝(1-血清样品的OD450nm值/空白对照的OD450nm)×100％。选择空白对照孔的OD450nm值在1.0左右，且P/N值最大时的抗原浓度和血清稀释度作为最适抗原包被浓度和血清稀释度。

结果如图10所示，当鞭毛蛋白抗原包被浓度为5.8μg/mL，酶标抗体稀释度为1:2000时，空白对照OD450mm值接近1.0，且P/N值最大。确定最适抗原包被浓度为5.8μg/mL，酶标抗体最佳稀释度为1:2000。

3.10ELISA操作程序

竞争ELISA工作表格

实施例4：竞争ELISA诊断试剂盒阈值的确定

选取了100支肠炎沙门菌的阳性血清和100支肠炎沙门菌阴性血清，并用建立好的竞争ELISA方法进行检测，计算每支血清的抑制率。使用SPSS软件进行ROC曲线分析，结果如图11所示，结合Youden’s index(表1)，选择Youden’s index最大时抑制率作为该方法的阈值。

表1 200份样品的尤登指数分析结果

结果显示，抑制率为35％是有最大的Youden’s index，所以选择35％作为该方法的阈值。

实施例5：竞争ELISA诊断试剂盒检测限的确定

将没标记的针对H:g抗原的单克隆抗体稀释至36.4μg/ml，并将其倍比稀释后与1:2000稀释的酶标抗体1:1混合后，使用建立好的竞争ELISA方法进行检测，计算每个稀释度的单克隆抗体的抑制率。通过抑制率和单克隆抗体的浓度绘制趋势线，并根据阈值计算出该方法的检测限。

结果如图12所示，将阈值y＝0.35代入趋势线方程y＝0.2655ln(x)+0.4831，R²＝0.9827。结果显示，该方法的检测线为0.56μg/ml。

实施例6：竞争ELISA诊断试剂盒的特异性试验

用建立好的方法分别检测鼠伤寒沙门菌阳性血清、鸡白痢沙门菌阳性血清、印第安纳沙门菌阳性血清、鸡伤寒沙门菌阳性血清、婴儿沙门菌阳性血清、肠炎沙门菌阳性血清、新城疫阳性血清、禽流感阳性血清、变形奇异杆菌阳性血清和传染性法氏囊病阳性血清共10种鸡群中常见沙门菌阳性血清和常见禽类疾病阳性血清，确定是否存在交叉反应，以检验ELISA方法的特异性。

结果如图1所示，除肠炎沙门菌阳性血清的抑制率高于阈值外，其余均低于阈值。因此，结果只有肠炎沙门菌阳性血清检测为阳性。由此可知：该试剂盒具有较高的特异性。

实施例7：竞争ELISA诊断试剂盒的重复性试验

7.1重复性试验

7.1.1批内可重复性试验

对同一批抗原包被的板子用建立的竞争ELISA方法连续3天检测相同的10份阳性血清样本，进行批内重复性检验，检测结果的变异系数在4.04％-10.85％之间。

表2不同样品的批内稳定性结果

7.1.2批间可重复性试验

取不同批次包被的板子在相同条件下用建立的ELISA方法检测另外12份阳性血清样本，进行批间重复性检验，检测结果的变异系数在2.57％-13.94％之间。

表3不同样品的批间稳定性结果

7.1.3不同操作者的重复性试验

分别由操作者A、操作者B、操作者C三位不同的操作者使用建立好的竞争ELISA方法来检测12份肠炎沙门菌阳性血清和19份阴性血清，检测结果一致且变异系数在0.8％-12.5％之间。

由此可知：本试剂盒具有很好的重复性。

实施例8：竞争ELISA诊断试剂盒的符合性试验

8.1实验室样品的符合性试验

使用肠炎沙门菌的感染SPF雏鸡制备得到肠炎沙门菌阳性血清132份，从SPF鸡体内直接采血的方法得到肠炎沙门菌阴性血清136份。用建立的竞争ELISA方法评价这批背景明确的沙门菌阴、阳性血清。结果除4份肠炎沙门菌阳性血清ELISA结果判定为阴性和3份肠炎沙门菌阴性血清ELISA结果判定为阳性外，其余261份样本结果均吻合，总体符合率为97.4％。

8.2与商品化试剂盒的符合率试验

使用IDEXX公司的Salmonella Enteritidis Antibody Test kit试剂盒和建立好的竞争ELISA方法共同检测256份临床样品，结果显示有5份样品两种方法均检测为阳性，240份样品均检测为阴性，总体符合率为95.7％。

8.3与PAT的符合率实验

使用PAT和建立好的竞争ELISA方法共同检测90份临床样品，结果显示有24份样品两种方法均检测为阳性，64份样品均检测为阴性，总体符合率为97.8％。

实施例9：竞争ELISA诊断试剂盒的热稳定性试验

9.1热稳定性试验

9.1.1包被有鞭毛蛋白的固相载体的热稳定性试验结果

将包被有鞭毛蛋白抗体的反应板放置在37℃，分别在第1、2、3、5、7、10、15、20和25天对反应板进行检测。

检测结果如图13，阴阳性对照和空白对照的变异系数均小于15％。由此可知：包被有鞭毛蛋白的固相载体的热稳定性良好。

9.1.2酶标抗体的热稳定性试验结果

使用Candor公司的HRP-ProtectorTM对酶标抗体进行稀释，稀释比为50:1。将稀释好的酶标抗体放入37℃进行加速破坏。在第1、3、5、7、10、15、20和25天对酶标抗体进行检测。

检测结果如图14，阴阳性对照和空白对照的变异系数均小于15％。由此可知：酶标抗体具有较好的热稳定性。

9.1.3阴阳性对照热稳定性试验结果

使用1％BSA-PBS溶液和Candor公司的HRP-ProtectorTM对阴阳性血清进行稀释，三者的稀释比为：13:1:2。将稀释好的阴阳性血清放入37℃进行加速破坏。在第1、3、5、7、10、15、20、25天对阴阳性血清进行检测。

检测结果如图15，阴阳性对照和空白对照的变异系数均小于15％。由此可知：标准品具有较好的热稳定性。

实施例10：竞争ELISA诊断试剂盒的保质期试验

分别在保存1、5、10、15和30天的时候对三个不同批次的竞争ELISA诊断试剂盒进行检测，而后每隔15天检测一次，直至保存期满300天。读取每次检测的阳、阴性对照和空白对照的OD450。

检测结果如图16，表明其批间和批内的变异系数均小于15％。由此可知：竞争ELISA诊断试剂盒稳定性良好，保质期大于300天。

实施例11:应用测试之一

采用本发明所述的检测鸡肠炎沙门菌抗体的试剂盒对北京某规模化养鸡场4、5、6、7、8、9、10月份祖代鸡样品进行检测，检测结果如下：

表4某鸡场不同月份样品检测结果

结果表明：该养殖场的总的阳性率为1.16％，表明该试剂盒在肠炎沙门菌流行不严重的养殖场也能有效检测到肠炎沙门菌，试剂盒的敏感性较好。

实施例12：应用测试之二

用法国ID.vet公司的鸡D群沙门菌抗体检测试剂盒和本发明所述的检测鸡肠炎沙门菌抗体的试剂盒共同检测其中77份肠炎沙门菌感染血清和65份鸡白痢沙门菌感染血清。结果如表5和表6所示：

表5两种试剂盒联合检测肠炎沙门菌感染血清

表6两种试剂盒联合检测鸡白痢沙门菌感染血清

由此可知：鸡白痢沙门菌总的检出率为98.5％。两种试剂盒的联合使用能很好地区分鉴别出鸡白痢沙门菌的感染。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 鸡肠炎沙门菌的检测抗体以及检测方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Ser Gly Asn Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Pro Thr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Tyr Trp Met Ser

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Pro Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser

35 40 45

Val Asp Ser Ser Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Val Pro Lys Leu Leu Ile Cys Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Asn

85 90 95

Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu

115 120 125

Glu Ile Lys

130

<210> 8

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60

aacattgtgc tgacccaatc tccagttttt ttggctgtgt ctctggggca gagggccacc 120

atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttctggca atagttttat gcactggtac 180

cagcagaaac caggacaggt acccaaactc ctcatctgtc ttgcatccaa cctagaatct 240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaacct caccattgat 300

cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaactaatga ggatcctccg 360

acgttcggtg gaggcaccag gctggaaatc aaa 393

<210> 9

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Asp Phe Gly Leu Ile Phe Phe Ile Val Ala Leu Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

Gln Cys Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Gln Val Gln Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser

35 40 45

Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro

65 70 75 80

Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

85 90 95

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Pro Arg Ala Asp Tyr Gly Asn Ala Trp Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210> 10

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggattttg ggctgatttt ttttattgtt gctcttttaa aaggggtcca gtgtgaggtg 60

aagcttctcg agtctggagg tggccaggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt 120

gcagcctcag gattcgattt tagtagatat tggatgagtt gggtccggca ggctccaggg 180

aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca gtacgataaa ctacacgcca 240

tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca aaaatacgct gtacctgcaa 300

atgagcaaag tgagatctga ggacacagcc ctttattact gtgcaagacc gagggccgac 360

tatggtaacg cctggtttgc ttactggggc caagggactc ttgtcactgt ctctgca 417

Claims

1.一种用于检测鸡肠炎沙门菌的抗体，其特征在于：所述抗体包括重链和轻链，所述轻链包括三个互补决定区CDR1-3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示，所述重链包括三个互补决定区CDR1-3，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.一种多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸编码如权利要求1-2任一项所述抗体。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸中编码所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述多核苷酸中编码所述重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

5.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体含有如权利要求3或4所述多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞中含有或者整合有如权利要求5所述重组表达载体。

7.如权利要求1-2任一项所述抗体、如权利要求3或者4所述多核苷酸、如权利要求5所述重组表达载体、或如权利要求6所述宿主细胞在非诊断目的的检测鸡肠炎沙门菌中的应用。

8.一种用于鸡肠炎沙门菌竞争ELISA检测组合物，其特征在于，所述组合物中含有如权利要求1-2任一项所述抗体。

9.根据权利要求8所述组合物，其特征在于，所试组合物还包括包被有鞭毛蛋白的固相载体、肠炎沙门菌阳性血清/阴性血清、包被液、封闭液、稀释液、洗涤液、TMB显色液、或反应终止液中任一种或几种。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于：所述抗体为酶标抗体，所述酶标抗体为HRP标记。

11.一种非诊断目的的鸡肠炎沙门菌抗体的竞争ELISA检测方法，所述方法包括采用如权利要求1-2任一项所述抗体用来检测鸡肠炎沙门菌。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：

(2)封闭液稀释后的肠炎沙门菌阴性血清和阳性血清分别与用稀释液稀释的HRP标记的所述抗体，加至(1)抗原中，孵育后洗涤；

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述方法还包括以下技术特征中的任一种或几种：

a)所述包被液为pH 7.2的磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为pH 7.2的PBST溶液；所述稀释液为含有1％BSA的PBS溶液；所述的反应终止液为1mol/L的H₂SO₄溶液；

b)所述抗原包被浓度为5.8μg/mL，包被时间为20h，封闭时间为3h；

c)肠炎沙门菌阴性血清和阳性血清的稀释度为1:8；HRP标记的所述抗体的稀释倍数为1:2000。