PL217758B1 - Sposób otrzymywania złoża do chromatografii powinowactwa i zastosowanie otrzymanego tym sposobem złoża - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania złóż do chromatografii powinowactwa ze związanymi w niekowalencyjny i trwały sposób cząsteczkami lipopolisacharydu bakteryjnego. Uzyskane według wynalazku złoże może być wykorzystane w chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał przeciwko lipopolisacharydom. Szczególnie przydatne jest do oczyszczania przeciwciał skierowanych przeciwko labilnym epitopom lipopolisacharydów, które ulegały degradacji w dotąd używanych warunkach kowalencyjnego wiązania cząsteczek lipopolisacharydu do fazy stałej.

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania złoża do chromatografii powinowactwa i zastosowania tego złoża. W szczególności, wynalazek dotyczy trwałego i niekowalencyjnego sposobu wiązania lipopolisacharydów bakteryjnych do fazy stałej. Sposób według wynalazku znajduje zastosowanie w dziedzinie technik oczyszczania, zwłaszcza technik chromatograficznych, szczególnie do oczyszczania przeciwciał.

Lipopolisacharyd (LPS, endotoksyna) jest podstawowym składnikiem błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych. Cząsteczka LPS składa się z części lipidowej (lipid A), kotwiczącej go w błonie zewnętrznej, oraz z części cukrowych (rdzeń LPS oraz antygen O-swoisty), eksponowanych bezpośrednio do środowiska zewnętrznego. Cząsteczka ta jest niezbędna dla wzrostu i przeżywalności komórki bakteryjnej, zapewnia integralność ściany komórkowej i uodparnia ją na działanie szkodliwych czynników zewnętrznych, takich jak zbyt niskie bądź wysokie pH, detergenty, antybiotyki, sole żółciowe czy elementy układu odpornościowego organizmów wyższych. Jest też zasadniczym czynnikiem decydującym o wirulencji patogennych bakterii Gram-ujemnych i wzajemnych relacjach między saprofitycznymi bakteriami a organizmem gospodarza [1,2].

Lipid A posiada unikalną budowę [3], jest zarazem najbardziej konserwatywną strukturalnie częścią LPS. Szkielet cząsteczki tworzy disacharyd złożony z połączonych wiązaniem β1>6 dwóch fosforylowanych cząsteczek glukozaminy (D-GlcN). Dwucukier jest bezpośrednio acylowany (O- i N-acylowo) czterema cząsteczkami 3-hydroksylowych kwasów tłuszczowych (3-OH 14:0). Dodatkowa acylacja grup OH tych kwasów daje podstawniki acyloksyacylowe. Izolaty lipidów A rzadko stanowią pojedynczą frakcję. Modyfikacje podstawowej struktury polegają najczęściej na zmianach w ilości, charakterze i lokalizacji dodatkowych kwasów tłuszczowych (związanych do grupy 3-hydroksy) oraz polarnych podstawników. Często modyfikacje bywają niestechiometryczne, co powoduje znaczną heterogenność preparatów, np. u Salmonella część cząsteczek posiada dodatkowy łańcuch (16:0) acylujący grupę OH kwasu 3-hydroksylowego przyłączonego w pozycji 2 GlcN, w innych cząsteczkach część dodatkowych łańcuchów kwasu tetradekanowego (mirystynowego) jest zastąpiona przez kwas 2-hydroksytetradekanowy [4].

Antygen O-swoisty jest polisacharydem zbudowanym z powtarzających się jednostek oligosacharydowych, o wielkości od jednej do ośmiu reszt cukrowych. Antygen O-swoisty u bakterii pozbawionych otoczki stanowi główny antygen powierzchniowy, decydujący o serologicznej specyficzności. Cechuje go ogromna różnorodność i zmienność. Duża różnorodność możliwych struktur, jaką dają powszechnie spotykane cukry: glukoza, mannoza, galaktoza jest znacznie powiększona przez wykorzystanie cukrów o różnej długości łańcucha - od 4 do 10, form piranozowych i furanozowych, różnych stereoizomerów, modyfikacji chemicznych: funkcji deoksy, amino czy karboksylowej, estryfikacji, eteryfikacji, acetylacji, amidacji. Ponadto, występują też cukry rozgałęzione i składniki niecukrowe, np. reszty fosforanowe, aminokwasy. Do najczęściej spotykanych modyfikacji antygenów O-swoistych zalicza się O-acetylację, fosforyIację, bądź O-metylację. Inne grupy eterowe to np. grupa karboksyetylowa. Funkcje aminowe aminocukrów najczęściej są modyfikowane acetylem oraz innymi, mniej typowymi podstawnikami [5].

Rdzeniem LPS nazywa się oligosacharyd łączący lipid A oraz antygen O-swoisty. Porównanie poznanych dotąd struktur rdzeniowych dowodzi, że po lipidzie A jest to najbardziej konserwatywna część LPS. Charakteryzuje ją występowanie dwóch nietypowych cukrów: kwasu 3-deoksy-D-manno-2-oktulopiranozonowego (Kdo) i heptopiranozy (Hepp). Heptoza może występować w konfiguracji zarówno L-glicero-D-manno (L,D), jak i D-glicero-D-manno (D,D). Większość LPS-ów zawiera heptozę tylko w jednej formie, np. wyłącznie L,D heptozę posiadają rdzenie u E. coli, S. minnesota. Inne mogą zawierać obie formy (Proteus mirabilis, Yersinia enterocolytica) lub tylko D,D heptozę (niektóre bakterie fototroficzne). Znane są też gatunki zupełnie pozbawione heptozy - np. Bacteroides fragilis [184]. Niekiedy stwierdza się obecność aminokwasów w preparatach oligosacharydów rdzeniowych. Mogą one być związane amidowo z kwasami uranowymi - treonina u Rhodobacter sphaeroides, czasami stanowią grupy N-acylowe heksozami, np. alanina u Pseudomonas aeruginosa, jednak najczęściej występuje estrowo związana glicyna w oligosacharydach rdzeniowych.

Duże podobieństwo budowy części rdzeniowej u różnych bakterii skłoniło wielu badaczy do eksperymentów nad otrzymaniem przeciwciał i surowic zdolnych do reakcji krzyżowych z LPS-ami wielu gatunków bakterii. W badaniach wykorzystano między innymi mutanty pozbawione antygenu O (szorstkie). Poliklonalne surowice anty-rdzeniowe uzyskano immunizując zwierzęta komórkami E. coli

PL 217 758 B1

O111-mutant Rc i komórkami S. enterica - o chemotypie Re [6]. Lipopolisacharyd, czyli endotoksyna to główny czynnik indukcji stanu zapalnego w organizmie, stąd jest ważnym odczynnikiem do badań immunologicznych. Jest też ważną cząsteczką w diagnostyce i służy jako substrat do syntetycznych szczepionek koniugatowych.

W stanie techniki znane są sposoby oczyszczania przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom lipopolisacharydów, w których stosowane są warunki kowalencyjnego wiązania cząsteczek lipopolisacharydu do fazy stałej.

Jedna z koncepcji zapobiegania i leczenia sepsy wywołanej infekcjami bakteriami Gram-ujemnymi zakłada uzyskanie szeroko reagujących przeciwciał oraz odpowiednich szczepionek skierowanych równocześnie przeciwko lipopolisacharydom wielu gatunków bakterii. Warunkiem otrzymania takich przeciwciał jest znalezienie wspólnych, powszechnych epitopów w obrębie struktury LPS, na przykład takich, w skład których wchodzą niecukrowe składniki lipopolisacharydów. Składniki te występują szczególnie licznie w części rdzeniowej LPS. Należą do nich grupy fosforanowe, pirofosforanowe, etanolamina, pirofosfoetanolamina, grupy acylowe i inne. Zwykle występują one w ilościach niestechiometrycznych i często są chemicznie labilne, takie ugrupowania są łatwo tracone podczas ekstrakcji LPS z masy bakteryjnej, a także dalszych modyfikacji chemicznych, co utrudnia poznanie ich biologicznego znaczenia oraz uzyskanie przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom zawierającym takie podstawniki. Badania prowadzone przez Zgłaszającego doprowadziły do odkrycia glicyny jako niecukrowego podstawnika lipopolisacharydów. Glicyna jest związana z oligosacharydem rdzeniowym i jej występowanie w LPS jest zjawiskiem powszechnym. Uzyskano też istotne dane sugerujące jej udział w tworzeniu epitopu obecnego w lipopolisacharydach różnych bakterii Gram-ujemnych. Glicyna obecna w części rdzeniowej, wchodząca w skład wspólnego epitopu może być substratem do szczepionki o szerokim spektrum ochronnym [7].

Lipopolisacharyd w środowisku wodnym tworzy opalizującą zawiesinę, jako substancja nierozpuszczalna w wodzie, ze względu na charakter lipidowy cząsteczek dodatkowo usieciowanych przez oddziaływanie funkcji fosforanowych i aminowych z jonami metali. Poprawienie rozpuszczalności i otrzymanie rozpuszczalnego w wodzie LPS w postaci homogennego i transparentnego roztworu można osiągnąć kilkoma sposobami, poprzez usunięcie metali dwuwartościowych. W niniejszym opisie patentowym rozpuszczalny LPS otrzymywano według opisanej procedury. Znane są również inne metody, jak elektrodializa stosowana do otrzymywania różnych soli LPS [9], użycie związku chelatującego, np. EDTA lub żelu Chelex do poprawienia rozdziału elektroforetycznego LPS i usuwania jonów paramagnetyków przy rejestracji widm NMR [10].

W świetle powyższego stanu techniki, obiektywnym problemem technicznym, wymagającym rozwiązania jest uzyskanie sposobu pozwalającego na otrzymanie przeciwciał i surowic zdolnych do reakcji krzyżowych z LPS-ami wielu gatunków bakterii. Dotychczas stosowane metody immobilizowania LPS metodami chemicznymi, np. wiązania do aktywowanego bromocyjanem żelu Sepharose 4B [8], powodują degradację labilnych struktur odpowiedzialnych za właściwości biologiczne.

Celem wynalazku jest uzyskanie labilnych struktur odpowiedzialnych za właściwości biologiczne endotoksyn, których zastosowanie umożliwia otrzymanie przeciwciał specyficznych wobec natywnych endotoksyn oczyszczanych na kolumnach z natywnymi endotoksynami.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania złoża do chromatografii powinowactwa ze związanymi w niekowalencyjny i trwały sposób cząsteczkami lipopolisacharydu bakteryjnego (LPS), charakteryzujący się tym, że przeprowadza się lipopolisacharyd w formę rozpuszczalną w wodzie, usuwa się z preparatu LPS dwuwartościowe jony metalu za pomocą chelatora, przeprowadza się preparat rozpuszczalnego lipopolisacharydu w formę kwaśną, rozpuszcza się formę kwaśną lipopolisacharydu w rozpuszczalniku organicznym i immobilizuje się w tym roztworze lipopolisacharyd na złożu posiadającym fazę stałą modyfikowaną grupami hydrofobowymi, przy czym cząsteczki lipopolisacharydu wiążą się hydrofobowo z łańcuchami alifatycznymi i wolne miejsca fazy stałej z immobilizowanym LPS są zablokowane BSA.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie tak uzyskanego złoża do otrzymywania przeciwciał skierowanym przeciwko lipopolisacharydom.

Korzystnie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie charakteryzujące się tym, że złoże wykorzystuje się do oczyszczania przeciwciał przeciwko labilnym epitopom lipopolisacharydów.

Oczyszczane na kolumnach z natywnymi endotoksynami przeciwciała znajdują zastosowanie nie tylko w diagnostyce i izolacji natywnych struktur lipopolisacharydowych, ale także unikalnych reagentów do badań immunochemicznych. Kolumny powinowactwa otrzymywane sposobem według

PL 217 758 B1 niniejszego wynalazku pozwalają na uzyskiwane przeciwciał dotychczas niedostępnych, o wąskiej swoistości, lub unikalne o szerokiej reaktywności. Wreszcie, kolumny powinowactwa sporządzane według niniejszego wynalazku pozwalają na izolację swoistych fagów i preparatów fagopochodnych specyficznych dla immobilizowanych receptorów. Dotychczas takie narzędzie nie było dostępne ze względu na degradację labilnych receptorów fagowych przy immobilizacji.

W niniejszym opisie otrzymane sposobem według wynalazku złoże powinowactwa, składające się z fazy stałej ze związanym do niej w sposób trwały i niekowalencyjny lipopolisacharydem, może służyć do izolacji przeciwciał, zwłaszcza skierowanych przeciwko epitopom zwierającym labilne podstawniki, takie jak glicynę.

Złoże takie znaleźć może także inne zastosowania wykorzystujące lipopolisacharyd związany niekowalencyjnie do fazy stałej bez utraty labilnych podstawników. Złoża z immobilizowanymi niekowalencyjnie lipopolisacharydami znajdą wiele zastosowań w biotechnologii, medycynie, farmacji, diagnostyce. Immobilizacja natywnych endotoksyn jest niezbędna w przypadkach, gdy zachodzi potrzeba zachowania labilnych wiązań kwasów sjalowych, reszt acetylowych, estrów fosforanowych i innych. Takie labilne grupy występują w endotoksynach Neisseria, Haemophilus, Shigella i wielu innych, stosowanych jako substraty do szczepionek koniugatowych. Kolumny powinowactwa sporządzane według niniejszego wynalazku służą do szybkiej izolacji przeciwciał, pozwalając w ciągu kilku godzin przeprowadzić całą procedurę przygotowania kolumny i oczyszczenia przeciwciał. Kolumny służą do jednoetapowego oczyszczania przeciwciał monoswoistych oraz monoklonalnych, antyendotoksynowych, jak też antyglikolipidowych. Procedura przygotowania kolumn według wynalazku nie wymaga odczynników i niebezpiecznych reagentów, np. bromocyjanu. Sposób według niniejszego wynalazku jest prosty, tani, wydajny, ekonomiczny, bezpieczny, daje trwały i nietoksyczny produkt, gotowy do bezpośredniego zastosowania i wdrożenia technologicznego oraz szerokiej komercjalizacji.

W wynalazku ujawniono sposób wytwarzania fazy stałej modyfikowanej lipopolisacharydem immobilizowanym w sposób niekowalencyjny i w warunkach nieuszkadzających labilnych podstawników. Labilne podstawniki endotoksyn często uczestniczą w oddziaływaniach z przeciwciałami i fagami, dlatego labilne epitopy wchodzą w skład szczepionek i diagnostyków. Labilne epitopy są ważnymi determinantami i służą do konstrukcji syntetycznych szczepionek koniugatowych. Lipopolisacharyd jest nierozpuszczalny w wodzie i w środowisku wodnym tworzy zawiesinę. Nowością wynalazku jest otrzymywanie lipopolisacharydu rozpuszczalnego w wodzie i niektórych rozpuszczalnikach organicznych, warunkujące immobilizację LPS do żelu. Ujawniony sposób polega na przeprowadzeniu lipopolisacharydu w formę rozpuszczalną w wodzie, a także w rozpuszczalnikach organicznych oraz immobilizacji takiej formy LPS na fazie stałej. Metoda przeprowadzania lipopolisacharydu w formę rozpuszczalną opiera się na oddziaływaniu lipopolisacharydu z czynnikami ułatwiającymi najpierw dysocjację kompleksów lipopolisacharydowych w wodzie, następnie usunięcie z preparatu LPS jonów metali dwuwartościowych przy pomocy czynnika chelatującego oraz przeprowadzenie lipopolisacharydu w postać rozpuszczalną w rozpuszczalniku organicznym. Nieoczekiwanie, stwierdzono, że tylko rozpuszczalna forma LPS silnie i stabilnie się immobilizuje do hydrofobowego żelu. Natywny LPS nie ulega efektywnej immobilizacji i słabo wiąże się do żelu oraz jest łatwo wypłukiwany, prawdopodobnie tworzy on superstrukturalne agregaty w roztworze wodnym. Stwierdzono, że postać rozpuszczalna w odczynniku organicznym warunkuje immobilizację tak przygotowanego lipopolisacharydu na fazie stałej modyfikowanej łańcuchami alkilowymi. Dotychczas immobilizowano LPS metodami chemicznymi, które powodują degradacje labilnych struktur odpowiedzialnych za właściwości biologiczne, np. metoda wiązania do aktywowanego bromocyjanem żelu Sepharose 4B [8]. Nowością wynalazku jest ponadto użycie BSA do blokowania wolnych miejsc na żelu. Białko to jest naturalnym nośnikiem kwasów tłuszczowych, stosowane jest w testach ELISA, w niniejszym wynalazku zostało z powodzeniem wykorzystane do trwałego, stabilnego blokowania wolnych miejsc złoża powinowactwa. Dzięki tej właściwości BSA, następuje stabilne wiązanie się do łańcuchów alifatycznych LPS do żelu, dodatkowo stabilizujące układ chromatograficzny LPS-C1 8. Istotnym elementem wynalazku jest również obserwacja, że LPS rozpuszczalne w DMSO, w wodzie albo innym rozpuszczalniku organicznym ulega immobilizacji do żelu w tym samym środowisku DMSO lub innego rozpuszczalnika organicznego.

Czynnikiem ułatwiającym dysocjację kompleksów lipopolisacharydowych w wodzie korzystnie jest detergent, np. siarczan dodecylu (SDS). Czynnikiem usuwającym jony dwuwartościowe, sieciujące lipopolisacharyd, korzystnie jest kwas etylenodiaminotetraoctowy (wersenowy, EDTA), złoże stałej fazy typu Chelex lub proces elektrodializy. Postacią rozpuszczalną natywnego lipopolisacharydu korzystnie są jego sole (np. sól sodowa, sól tertbutyloaminowa), forma lipopolisacharydu kwaśnego LPS

PL 217 758 B1

H⁺ lub lipopolisacharyd poddany modyfikacji chemicznej (np. N-acetylacji). Rozpuszczalnikiem służącym do rozpuszczenia odpowiedniej formy lipopolisacharydu korzystnie jest woda, metanol, dimetylosulfotlenek, dichlorometan lub acetonitryl. Fazą stałą do immobilizacji rozpuszczalnej formy LPS korzystnie jest żel krzemionkowy ze związanymi kowalencyjnie grupami alkilowymi, korzystnie oktadecylowymi.

Sposób przeprowadzania lipopolisacharydu w postać rozpuszczalną w wodzie, jako substratu do żelu do chromatografii powinowactwa, obejmuje usuwanie z preparatu lipopolisacharydowego jonów metali dwuwartościowych, przy czym preparat lipopolisacharydu najpierw traktowany jest roztworem detergentu, korzystnie detergentu jonowego, na przykład siarczanu dodecylu, a następnie traktowany substancją chelatującą, usuwającą jony metali dwuwartościowych, korzystnie substancją typu kwasu wielokarboksylowego (np. EDTA) lub złożem typu Chelex na bazie żywicy syntetycznej, lub poddany innemu procesowi prowadzącemu do usunięcia jonów dwuwartościowych metali z preparatu (np. elektrodializie).

Podczas usuwania detergentu oraz czynnika chelatującego, lipopolisacharyd wytrąca się z roztworu za pomocą rozpuszczalnika organicznego, korzystnie etanolu, a następnie wytrącony preparat rozpuszczalnego lipopolisacharydu suszy się bez wykorzystania procesu liofilizacji.

Lipopolisacharyd przeprowadza się w postać kwaśną, przy czym roztwór lipo polisacharydu w postaci rozpuszczalnej w wodzie traktuje się czynnikiem, wymieniającym w obojętnej soli lipopolisacharydu jony metalu jednowartościowego (Na⁺, K⁺) na kwaśne protony (H⁺), korzystnie złożem jonowymiennym typu kationitu na bazie żywicy syntetycznej. Jednorodny roztwór lipopolisacharydu sporządza się korzystnie w polarnym rozpuszczalniku, zwłaszcza rozpuszczalniku organicznym, przy czym w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w wodzie lub dimetylosulfotlenku (DMSO, sulfotlenku dimetylu), rozpuszczona zostaje forma kwaśna lipopolisacharydu.

Podczas otrzymywania fazy stałej z immobilizowanym lipopolisacharydem modyfikowany lipopolisacharyd rozpuszcza się w rozpuszczalniku, korzystnie w wodzie lub dimetylosulfotlenku, wiąże się do fazy stałej przez dodanie złoża do roztworu LPS. Faza stała posiada powierzchnię modyfikowaną grupami hydrofobowymi, korzystnie łańcuchami alkilowymi typu łańcuchów oktadecylowych C18, poprzez hydrofobowe wiązania pomiędzy łańcuchami kwasów tłuszczowych lipopolisacharydów a grupami hydrofobowymi fazy stałej. Fazę stałą z immobilizowanym LPS blokuje się przy pomocy BSA.

Przykłady przeprowadzenia preparatów endotoksyn w postać rozpuszczalną w rozpuszczalnikach organicznych, wiązania takiej formy do fazy stałej i wykorzystanie powstałej fazy powinowactwa do oczyszczania przeciwciał anty-LPS.

P r z y k ł a d 1.

W przykładzie tym tworzono chromatograficzne złoże powinowactwa do oczyszczania przeciwciał uzyskanych przeciwko szorstkiemu lipopolisacharydowi E. coli K12 C600. Próbkę liofilizowanego LPS E. coli K12 C600 (20 mg) rozpuszczano w 2 ml 2% SDS, następnie dodawano 0,2 ml 0,5M EDTA i po 10 min. wirowano przez 20 min. przy 5000 rpm. Osad odrzucano, a do roztworu LPS dodawano 4 objętości etanolu, schładzano do -20°C i wirowano (5000 rpm, 20 min). Uzyskany osad zawieszono w mieszanie etanol - woda 3:1, ponownie wirowano (5000 rpm, 20 min), procedurę powtarzano dwukrotnie. Po ostatnim wirowaniu supernatant zlewano a osad suszono w eksykatorze. Wysuszony osad rozpuszczano w wodzie (2 ml) i przepuszczono przez kolumienkę wypełnioną złożem Dowex 50W X8 (2 ml) zrównoważoną jonami H⁺, po czym kolumienkę płukano wodą MiliQ do obojętnego odczynu eluatu. Zebrany eluat liofilizowano, następnie rozpuszczano w DMSO (5 ml) i do otrzymanego roztworu dodawano złoże krzemionkowe SilicaGel C18, całość inkubowano 18 godz. z ciągłym mieszaniem. Lipopolisacharyd niezwiązany do złoża odpłukiwano przy pomocy DMSO i następnie 50% metanolem.

P r z y k ł a d 2.

Przykład ten dotyczy tworzenia chromatograficznego złoża powinowactwa do oczyszczania przeciwciał uzyskanych przeciwko lipopolisacharydowi E. coli K12 C600, gdzie czynnikiem usuwającym dwuwartościowe jony metali z preparatu LPS był żel Chelex zrównoważony jonami Na⁺. Liofilizowaną próbkę LPS E. coli K12 C600 (20 mg) rozpuszczano w 2 ml 2% SDS, wirowano (20 min, 5000 rpm), przepuszczano przez kolumienkę (1 ml) ze złożem Chelex, którą następnie płukano przy pomocy 5 ml wody. Strącanie etanolem oraz pozostała część procedury były identyczne, jak podano w przykładzie 1.

PL 217 758 B1

P r z y k ł a d 3.

Przykład ten dotyczy tworzenia chromatograficznego złoża powinowactwa do oczyszczania przeciwciał uzyskanych przeciwko lipopolisacharydowi E. coli K12 C600, gdzie fazą stałą do wiązania lipopolisacharydu był żel octyl-Sepharose CL-4B, natomiast pozostała procedura była identyczna, jak podana w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 4.

Przykład ten dotyczy tworzenia chromatograficznego złoża powinowactwa do oczyszczania przeciwciał uzyskanych przeciwko lipopolisacharydowi E. coli K12 C600, gdzie rozpuszczalną formą lipopolisacharydu była sól tertbutyloaminowa (TBA) LPS, natomiast pozostała procedura była identyczna, jak podana w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 5.

Przykład ten dotyczy tworzenia chromatograficznego złoża powinowactwa do oczyszczania przeciwciał uzyskanych przeciwko lipopolisacharydowi E. coli K12 C600, gdzie rozpuszczalną formę lipopolisacharydu rozpuszczano w metanolu i następnie przeprowadzano procedurę wiązania LPS do złoża SilicaGel C18, pozostała procedura była identyczna, jak podana w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 6.

Przykład ten dotyczy tworzenia chromatograficznych złóż powinowactwa do oczyszczania przeciwciał, w której do tworzenia formy rozpuszczalnej lipopolisacharydu użyto dwu lipopolisacharydów pochodzących od H. alvei PCM 1186 oraz H. alvei PCM 1189, pozostała procedura była identyczna, jak podana w przykładzie 1.

Otrzymanymi złożami zawieszonymi w 50% metanolu wypełniono dwie kolumienki o wymiarach ₃

0,5x5,0 cm (1 cm³). Kolumienki płukano wodą i PBS, następnie każdą przepłukano 10 ml roztworu 1%

BSA w PBS a następnie PBS do zaniku absorbancji przy λ = 280 nm.

Przed chromatografią powinowactwa izolowano z surowic anty-LPS immunoglobuliny poprzez wysalanie octanem amonu. Wysalan ie immunoglobulin z surowicy prowadzono następująco: 5 ml surowicy króliczej anty-Hafhia alvei 1186 lub anty-Hafhia alvei PCM 1189 rozcieńczono 10 ml PBS. Ciągle mieszając małymi porcjami dodawano 4,8 g siarczanu amonu. Po dodaniu ostatniej porcji surowicę inkubowano przez 60 minut w łaźni lodowo-wodnej. Następnie precypitat wirowano przy 10000 g w 5°C przez 30 minut. Osad rozpuszczano w 5 ml PBS i dializowano w 4°C do PBS oraz do PBS z dodatkiem 0,02% azydku sodu.

Wysolone przeciwciała oczyszczano następnie w chromatografii powinowactwa. Na kolumnę z fazą ze związanym LPS natywnym nanoszono dializowane preparaty odpowiednich wysolonych przeciwciał. Niezwiązane białka odpłukiwano za pomocą PBS (frakcja 1), przeciwciała o powinowactwie do antygenu eluowano przy użyciu 3M KSCN w PBS (frakcja 2). Frakcje nr 2 z obu kolumn dializowano do PBS i zagęszczano poprzez ultrafiltrację.

Specyficzność otrzymanych przeciwciał analizowano w teście ELISA gdzie płytki testowe opłaszczono lipopolisacharydami H. alvei PCM 1186 oraz H. alvei PCM 1189 i mierzono powinowactwo otrzymanych przeciwciał (frakcje 2 po chromatografii na obu kolumnach) do immobilizowanych lipopolisacharydów. Przeciwciała wykazywały wysokie powinowactwo do lipopolisacharydów w układach homogennych (odpowiednio przeciwciała a-1186 z LPS H alvei PCM 1186 oraz przeciwciała a-1189 z LPS H. alvei PCM 1189), podczas gdy nie wykazano reaktywności krzyżowej otrzymanych przeciwciał z tymi lipopolisacharydami.

P r z y k ł a d 7.

Przykład ten dotyczy oczyszczania specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom lipopolisacharydów zawierającym labilne podstawniki glicynowe. Użyto dwu preparatów li popolisacharydu E. coli K12 C600: natywnego, oraz poddanego procedurze usuwania glicyny (lipopolisacharyd rozpuszczony w wodzie w stężeniu 0,5 mg/ml poddawano działaniu roztworu amoniaku w wodzie o pH 12 przez 12 godzin w temperaturze pokojowej, następnie oczyszczano na złożu Sephadex G-25

Superfine w wodzie i liofilizowano). Procedura tworzenia chromatograficznego złoża powinowactwa do oczyszczania przeciwciał jest identyczna do podanej w przykładzie 1. Otrzymanymi złożami zawie₃ szonymi w 50% metanolu wypełniono dwie kolumienki o wymiarach 0,5x5,0 cm (1 cm³). Kolumienki płukano wodą i PBS, następnie każdą przepłukano 10 ml roztworu 1% BSA w PBS a następnie PBS do zaniku absorbancji przy λ = 280 nm.

Wysalanie przeciwciał z surowicy prowadzono następująco. 10 ml surowicy króliczej otrzymanej przeciwko całym komórkom bakteryjnym E. coli K12 C600 rozcieńczano 10 ml PBS. Ciągle mieszając małymi porcjami dodawano 9,6 g siarczanu amonu. Po dodaniu ostatniej porcji, surowicę inkubowano

PL 217 758 B1 minut w łaźni lodowo-wodnej z ciągłym mieszaniem. Następnie, precypitat wirowano przy 3000 g w 25°C przez 30 minut. Osad rozpuszczano w 5 ml PBS i dializowano do PBS w 4°C.

Na kolumnę ze związanym LPS natywnym nanoszono preparat dializowanych przeciwciał. Niezwiązane białka odpłukiwano za pomocą PBS (frakcja 1). Przeciwciała o niskim powinowactwie do antygenu odpłukiwano za pomocą 25% glikolu etylenowego w PBS (frakcja 2), przeciwciała o wysokim powinowactwie do antygenu eluowano przy użyciu 3M KSCN w PBS (frakcja 3). Frakcję 3 dializowano do PBS, zagęszczano poprzez ultrafiltrację i nanoszono na kolumnę z fazą do której związano LPS poddany procedurze usuwania glicyny. Chromatografię prowadzono jak poprzednio, otrzymując trzy frakcje. Przeciwciała we frakcji 1, nie wiążącej się do LPS deglicylowanego, posiadały powinowactwo do epitopów zawierających w swojej strukturze glicynę.

Piśmiennictwo

1. Schletter J., Heine H., Ulmer A.J., Rietschel E.T. (1995), Molecular mechanisms of endotoxin activity. Arch Microbiol, 164,383-389.

2. Rietschel E.T., Kirikae T., Schade F.U., Ulmer AJ., Holst O., Brade H., SchmidtG., Mamat U., Grimmecke H.D., Kusumoto S. (1993), The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity. Immunobiology, 187, 169-190.

3. Rietschel E.T., Wollenweber H.W., Russa R., Brade H., Zahringer U. (1984), Concepts of the chemical structure of lipid A. Rev Infect Dis, 6,432-438.

4. Zahringer U., Lindner B., Rietschel E.T. (1994), Molecular structure of lipid A, the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharides. Adv Carbohydr Chem Biochem, 50,211-276.

5. Wilkinson S.G. (1996), Bacterial lipopolysaccharides themes and variations. Prog Lipid Res, 35,283-343.

6. Rietschel E.T., Brade H., Holst O., Brade L., Muller L.S., Mamat U., Zahringer U., Beckmann F., Seydel U., Brandenburg K., Ulmer A.J., Mattem T., Heine H., Schletter J., Loppnow H., Schonbeck U., Flad H.D., Hauschildt S., Schade U.F., Di Padova F., Kusumoto S., Schumann R.R. (1996), Bacterial endotoxin: Chemical constitution, biological recognition, host response, and immunological detoxification. Curr Top Microbiol Immunol, 216, 39-81.

7. Gamian A., Mieszała M., Boratyński J., Sposób wytwarzania szczepionki koniugatowej o szerokiej swoistości przeciwbakteryjnej, Zgł. Pat. Nr 328280 z dn. 31. 08. 1998 r., Patent PL nr 192872 z dnia 27. 03. 2006.

8. Romanowska E, Ługowski C, Mulczyk M. (1976), Lipopolysaccharide immuneadsorbents and their application to affinity chromatography of O- antibodies and specific phages. FEBS Lett, 66, 82-85.

9. Galanos C., Luderitz 0. (1975), Electrodialysis of lipopolysaccharides and their conversion to uniform salt forms, Eur J Biochem, 54, 603-610.

10. Mansson M., Bauer S.H.J., Hood D.W., Richards J.C., Moxon E.R., Schweda E.K.H. (2001), A new structural type for Haemophilus influenzae lipopolysaccharide. Structural analysis of the lipopolysaccharide from nontypeable Haemophilus influenzae strain 486, Eur J Biochem, 268, 2148-2159.

Claims (3)

1. Sposób otrzymywania złoża do chromatografii powinowactwa ze związanymi w niekowalencyjny i trwały sposób cząsteczkami lipopolisacharydu bakteryjnego (LPS), znamienny tym, że przeprowadza się lipopolisacharyd w formę rozpuszczalną w wodzie, usuwa się z preparatu LPS dwuwartościowe jony metalu za pomocą chelatora, przeprowadza się preparat rozpuszczalnego lipopolisacharydu w formę kwaśną, rozpuszcza się formę kwaśną lipopolisacharydu w rozpuszczalniku organicznym i immobilizuje się w tym roztworze lipopolisacharyd na złożu posiadającym fazę stałą modyfikowaną grupami hydrofobowymi, przy czym cząsteczki lipopolisacharydu wiążą się hydrofobowo z łańcuchami alifatycznymi i wolne miejsca fazy stałej z immobilizowanym LPS są zablokowane BSA.

2. Zastosowanie złoża uzyskanego według zastrz. 1 do otrzymywania przeciwciał przeciwko lipopolisacharydom.

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że złoże wykorzystuje się do oczyszczania przeciwciał przeciwko labilnym epitopom lipopolisacharydów.