CN1341858A - 柯萨奇病毒b免疫球蛋白抗体m酶免试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种柯萨奇病毒B1—6混合型抗体IgM ELISA试剂盒。该试剂盒可用于因柯萨奇病毒B感染致病的早期诊断,检测方法简便快速、成本低廉、灵敏度和特异性高,有较高的临床应用价值。本发明提供了制备方法。
Description
本发明涉及生物技术产品，具体涉及一种柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgM试剂盒及制备方法。
柯萨奇病毒B1-6对易感人群具有高度的传染性，儿童是最敏感的人群，病毒流行期儿童的感染率通常为10-20％家庭中所有敏感成员通常都被感染，因此，柯萨奇病毒B感染所致的相关疾病发病率较高，尤其柯萨奇病毒性心肌炎对儿童具有很大威胁和危害。临床的早期诊断和治疗有很重要意义。以往柯萨奇病毒B感染和致病的病原学确诊法是病毒分离，但这种方法的标本采集和处理较复杂，病毒分离程序烦琐，实验时间很长，因此病毒分离技术的早期诊断优势不大。而血清中特异性IgM抗体是病毒复制和早期感染的主要标志。
本发明的目的在于克服以往方法的不足之处，研制一种灵敏度和特异性高的诊断试剂盒。
本发明提供了一种柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgM ELISA试剂盒，该试剂盒用COXB病毒B1-6混合型抗原包被，兔抗人IgM联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的COXB病毒B1-6混合型抗体IgM，并且试剂盒由下列组成：预包被反应条 48孔 酶标记液 1瓶(3ml)样品稀释液 1瓶(6ml) 阳性对照 1支(200μl)阴性对照 1支(200μl) 20倍浓洗涤液1瓶(13ml)底物缓冲液甲 1瓶(3ml) 底物缓冲液乙1瓶(3ml)终止液 1瓶(3ml)
本发明的另一目的是提供了上述柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgM和IgG ELISA试剂盒的制备方法，该方法包括下列步骤：一、原材料及其规格(一)IgM试剂盒制备
COXB病毒B1-6混合抗原1∶1000
酶标板：华东理工大学ELISA测定CV(％)＜10％
阳性对照：诊断心肌炎患者血清，用本试剂盒测定A值＞0.8，放置-20℃备用。
阴性对照：选正常人血清，用本试剂盒测定A值＜0.09，放置-20℃备用。
酶标抗体：兔抗人IgM-HRP辣根过氧化物酶，RZ＞3.0 Sigma进口酶标记兔抗人IgM，双扩散1∶64。
小牛血清 杭州四季清厂生产。
其他试剂：
Na2CO3 A.R
NaHCO3 A.R
小牛血清 杭州四季清厂生产
Na2HPO4.12H2O A.R
NaH2PO4.2H2O A.R
NaCL A.R
Tweel-20 化学纯
甘油 化学纯
H2O2 A.R
柠檬酸.H2O A.R
TMB 熔点：168℃
EDTA A.R
H2SO4 A.R
Tris A.R
蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定
细胞及动物要求
(1)Hela细胞(ATCC CCL-2)
(2)新西兰大白兔2公斤左右二、包被抗原(COXB病毒B1-6混合抗原)的制备
(1)COX B病毒1-6型毒种来源：昆明生物所
(2)Hela细胞来源：中科院细胞所
(3)细胞传代：
①培养剂配制：PRMI1640基础培养过滤除菌，200ml基础培
养剂中含：牛血清10％
青霉素 4万单位
链霉素 4万单位
6％NaHCO3 4ml
3％谷氨酰胺 6ml
②胰酶(DT)配制：用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化
液，用分散、消化细胞。
③细胞传代：将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消
化，观察细胞已呈疏松网状，既倒去DT，加入营养液后，分
瓶培养培养3-5天。
(4)病毒的感染、培养、收毒和鉴定：
①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清
的洗液洗一次。
②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时。
③补充培养液，在37℃培养。
④逐日观察细胞：至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病毒。
⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定。
病毒滴定：用10倍的倍比稀释的方法进行病毒的稀释，病毒加入微量板中，每孔加50ul病毒，每个稀释度加4孔，然后加入细胞50ul，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病毒的TCID50；
病毒的鉴定：应用免疫电镜法；
应用中和试验方法(微量滴定法)
病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25ul/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25ul/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时。然后每孔内加Hela细胞50ul，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE；
(5)抗原的制备、浓缩和纯化：
①病毒灭活，
②去除病毒碎片：用冷冻离心的方法去除细胞碎片，
③初步浓缩、提纯：用PEG方法进行提纯，
④病毒的进一步纯化：用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在A280的分光光度计进行蛋白含量的测定；三、兔抗人IgM(u)制备
(1)人IgM(u)链的制备
(2)50ml正常人血清，50％及33％饱和硫酸铵各盐析1次，PH7.2PBS透析去盐，体积浓缩至30％。
(3)过Sephadex G200柱，PH8.0 0.2Nacl-0.1MTris缓冲液洗脱，分管收集，第一峰为19S IgM。
(4)双扩散法鉴定IgM纯度。
(5)10nM疏基乙醇4℃3h解离轻链，对PB透析24h。
(6)再过Sephadex G200柱，洗脱液同上，收集第一峰Ig(u)链。
(7)双扩散鉴定u链特异性。
(8)光密度法测定Ig(u)浓度。
(9)1mg/ml u链加等量福氏完全佐剂研钵中研磨乳化。
(10)每只兔背部多点注射1mg u链抗原，2周-1个月1次，共5-8次，双扩散效价达1∶64以上时采集血清。
(11)辛酸法纯化抗血清IgG部分蛋白定量。四、酶标记抗体制备
兔抗人IgM用过典酸钠法与辣根过氧化物酶偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存，效价＞1∶1000(方阵滴定法测定)五、酶标记兔抗人IgM浓度测定
采用方阵滴定法选择酶标记抗体工作浓度为1∶1000六、预包被抗原板的制备
(1)包被
Na2CO3 0.6g
Na2HCO3 1.58g
重蒸水 500ml
加入适量COXB病毒1-6混合型抗原，调整PH至9.5加入板条各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜后甩干。
(2)洗涤
Tris 2.42g
重蒸水 1000ml
加入板条各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复3次，以除去剩余抗原。
(3)封闭
蔗糖 100g
羊血清 25ml
0.1MPBS 1000ml
加入板条各孔中放入湿盒中(加盖)37℃2h，弃去液体，吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃。
(4)阳性对照制备
诊断心肌炎患者的血清，60℃放置1小时，除菌过滤，用本试剂盒测定A值＞0.8备用，分装。
(5)阴性对照的制备
正常人血清用本试剂盒测定A值0-0.09用万分之二硫柳汞防腐备用分装。
(6)酶标记抗体配制
30％小牛血清
兔抗人IgM-HRP 50％0.15MPBS
(稀释度1∶1000) 20％甘油
————→稀释20倍分装
(7)酶标记抗体稀释液
小牛血清 30ml
0.15MPBS 50ml
甘油 20ml
20％Tween-20 2.5ml
调PH至7.2
(8)底物液甲
Na2HPO4.12H2O1.7g
柠檬酸.H2O 0.5g
3％H2O2 200ul
重蒸水 100ul
调PH至5.0
(9)底物液乙
EDTA 17.5mg
柠檬酸.H2O 0.5g
重蒸水 100ml
加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25ul
(10)终止液
浓H2SO4 10ml
蒸馏水 80ml
(11)20X洗涤液
Tris 4.84g
重蒸水 100ml七、半成品的检定
(1)已包被板的检定：测定阳性血清CV(％)＜10％(n-10)
(2)稳定性检定：
①阴性对照和阳性对照+4℃-+8℃的稳定性检定
试剂盒内设定阴性对照及阳性对照均+4℃-+8℃放置9个月，再用该试剂盒测定吸光度在正常范围内。
②试剂盒37℃稳定性检定
装配前一星期将兔抗人IgM-HRP(1+100)(同一批兔抗人IgM-HRP检测一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各测定一次，并用兔抗人IgM-HRP置-20℃作对照，测得质控血清7天基本不变，则可以使用。
③特异性检定：用65份内控参比血清来检测半成品，阴性参比血清允许出现阳性1份，阳性参比血清允许出现阴性1份。
阴性内控血清组成：T1-3：HAV抗体阳性血清，T4-6：HCV抗体阳性血清：T7-9：HEV抗体阳性血清，T10-14：HBV表面抗体阳性血清，T15-24：CVB-IgM阴性血清，T25-27：类风湿因子阳性血清，T28-30：TB阳性血清，T31-33EBV阳性血清，T34-36CMV阳性血清，T37-39HVS阳性血清，T40-42Hpol阳性血清，T43-45TOXO阳性血清，45份特异性血清应允许1份为阳性。
阳性内控血清组成：Y1-20 CVB-IgM阳性血清，20份阳性血清，应允许1份为阴性，其余19份应检测为阳性。
(4)灵敏度血清
①组成：L1#按以下稀释度稀释：1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀释度稀释：1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀释度稀释：1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512
②判断标准：
L1#灵敏度应检测到1∶64
L2#灵敏度应检测到1∶128
L3#灵敏度应检测到1∶32
(5)精密性血清
将同一样品平行加样10孔，其检测值的变异系数小于15％(CV％＜15)。
(6)酶标抗体稀释液，底物液经过37℃细菌培养试验，发现无菌生长。八、试剂盒组装
(1)上述制备步骤所用试剂用过滤器除菌过滤后超净分装。
(2)试剂盒必需有外包装盒，海棉垫，塑料瓶6瓶，eppenkof管2支，包被板，说明书，内标签纸9张，外标贴纸1张，批号lot/EXP，48T/96T。九、成品检定
(1)物理检查
①药盒外包装，标签，批号，规格(48T/96T)有无遗漏。
②药盒内试剂瓶完整无渗漏，试剂瓶数和说明书无欠缺，标签完整，有效期应清楚明晰。
③药盒试剂(酶标抗体稀释液，底物液甲，底物液乙，洗涤液)核对PH值及溶液是否澄清。
(2)稳定性检定：
完全同半成品检定
(3)特异性检定：
完全同半成品检定。
(4)灵敏度：
完全同半成品检定。
(5)精密性
完全同半成品检定。
(6)抽样合格后，留下5个试剂盒剩余入库。
3个试剂盒
4℃ 2个 隔一个月测定1次
37℃1个 第一次隔三天测定1次，以后每星期测定1次，记录数据，绘制图表。
2个试剂盒留库备查十、保存与有效期
保存于2-8℃，自检定后合格之日起有效期为8个月。
ELISA法检测人血清中CVB1-6 IgM和CVB1-6 IgG试剂盒使用报告(上海中医科大学附属曙光医院提供)：一、材料：1、“柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgM(CVB1-6 IgM)检测试剂盒”、“柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgG(CVB1-6 IgG)检测试剂盒”均由上海新新医学生物工程公司提供。2、检测样品来自小儿、心内科及呼吸科等门诊及住院病人血样。二、方法
根据试剂盒规定用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定病人血清中的CXB1-6IgM和CVB1-6IgG，试验具体详见试剂盒操作说明书。三、结果
我们对1998年11月到2000年6月就诊病人随机抽样443例临床似诊心肌炎、上呼吸道感染、心肌病、下呼吸道感、冠心病等类型进行实验结果的分析调查，报告见表。
四、讨论
| 病名 | 人数 | IgM阳性数 (％) | IgG阳性数 (％) |
| 心肌炎 | 146 | 65 44.5％ | 82 56.2％ |
| 上感 | 218 | 39 17.9％ | 26 11.9％ |
| 心肌病 | 28 | 5 27.8％ | 6 33.3％ |
| 下感 | 29 | 5 17.2％ | 7 24.1％ |
| 冠心病 | 32 | 7 21.9％ | 9 28.1％ |
| 合计 | 443 | 121 27.3％ | 130 29.3％ |
目前柯萨奇病毒B组已发现6型(CVB1-6)，它可引起各种疾病，该病毒感染人体后，可引起各种症状，从轻度的心脏症状或上呼吸道感染到重度的中枢神经系统疾病，如心肌炎、心包炎、扩张性心肌病、肺炎、脑炎、肾炎、肝炎、糖尿病等。临床上绝大多数病毒性心肌炎是由柯萨奇病毒和埃可病毒(两者都属肠道病毒)感染引起。而柯萨奇B组病毒为人体患病毒性心肌炎的首位病原体。机体为了抵御柯萨奇B组病毒的感染，早期或在急性期会产生特异性CVB1-6IGM抗体。从实验检测结果的表中可看出临床似诊心肌炎146例中CVB1-6IgM阳性的有65例(65/146)占总数44.5％CVB！-6IgG阳性的有82例(82/146)占总数56.2％，除心肌炎外的其他病种297例中CVB IgM阳性56例(56/297)占总数18.9％，CVB1-6IgG阳性48例(48/297)占总数16.3％。总之，临床确诊心肌炎的病例出现CVB1-6IGM、IgG阳性率远大于其他病种，所以我们通过以上实验结果分析，体会到由上海新新医学生物工程公司研制《柯萨奇病毒B1-6混合型IgM检测试剂盒》、《柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgG检测试剂盒》能为临床诊断病毒性心肌炎提供比较可靠的实验室依据。
柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgM检测试剂盒，柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgG检测试剂盒临床考核总结报告(由上海新新医学生物工程公司提供)：
本公司研究和生产的“柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgM及IgG试剂盒”于1998年3月至2000年6月期间委托第二军医大学第一附属医院，上海第二医科大学附属新华医院和上海中医药大学附属曙光医院三家医疗单位作临床应用和考核，现每家医院均出具了详细的临床分析使用报告，本公司将此归纳总结如下；
三家医院共对1787份病例血清作了CVB1-6IgM抗体检测，其中心肌炎612人，心律失常247人，上感823人，心肌病44人，下感29人，冠心病32人，各病种CVB1-6IgM和IgG抗体阳性率见下表：病名 例数 IgM(+) ％ IgG(+) ％心肌炎 612 294 44.8 339 55.4心律失常 247 28 11.3 41 16.6上感 823 134 16.3 97 11.8心肌病 44 9 20.5 15 34.1下感 29 5 17.2 7 24.1冠心病 32 7 21.9 9 28.1
75份传染病性心肌炎相对比IgM阳性率分别为4％和69.1％IgG阳性率分别为4％和76.8％，统计处理差异非常显著，P＜0.01提示CVB感染是病毒性心肌炎的主要原因，CVB1-6IgM和IgG抗体的检测在病毒性心肌炎的诊断和治疗上有重要应用价值。
另一组210例病毒性心肌炎年龄分布的统计数据显示，年龄越小，病毒性心肌炎的发病率越高，且IgM抗体的阳性率也越高，而IgG抗体的阳性率随年龄的增长而增高，这提示，CVB感染后，年龄越小，病毒的潜伏期越短，发病越早。
上呼吸道感染中，CVB IgM和IgG的总体阳性率分别为16.3％和11.8％但将临床症状和血清指标结合分析，发现单纯呼吸道症状的上感中，IgM和IgG抗体的阳性率都只有0.92％，而呼吸道症状再伴有皮疹。胸痛或肌痛等症状时，IgM的阳性率升至27.9-46.75，IgG阳性率为16.3-33.3％，都与单纯呼吸道症状的阳性率有显著差异。因皮疹、胸痛、肌痛、咽峡炎等是CVB感染后的较特征性症状，故症状与抗体阳性率的一致说明本试剂盒的检测结果较正确。
不同病因引起的心律失常患者中，CVB抗体的阳性率有所差异，主要表现在由急性感染引起的心律失常，其CVB IgM和IgG抗体阳性率明显高于其它病因的心律失常抗体阳性率，这对进一步研究CVB感染与心律失常的发病关系有一定指导作用，也使CVB1-6IgM和IgG成为明确感染性心律失常病因的一项辅助检测指标。
本应用中检测了44例心肌病患者中的该项指标，IgM和IgG抗体阳性率分别为20.5％和34.1％从一份分类统计数据中可以看出，原发性心肌病的IgM和IgG抗体均高于特异性心肌病，这对进一步研究原发性心肌病的病因和致病机理提供了信息。
曙光医院的应用中还检测了29例下感(肺炎)和32例冠心病，这二类抗体也都有一定的阳性率，这提示肺炎和冠心病也与CVB感染有关，值得进一步加以关注。
三家医药经较长时间和大病例数的应用后，一致认为我们研制的CVB1-6IgM和IgG检测试剂盒质量可靠，操作简便，试剂稳定性好，测定结果正确，该试剂盒对病毒性心肌炎的诊断和合理治疗有特别的应用价值，对感染性心律失常和上感，心肌病的病因分析也能起到很大的作用，各病种及分类测定值与临床诊断结果一致，医院应用结果满意。
柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgM及IgG试剂盒使用报告(由第二军医大学第一附属医院提供)：
1998年3月至2000年6月期间，本院临床实验室对诊断为心肌炎、心律失常和上感的三种疾病共830例，同时作COXB1-6IgM和IgG抗体检测，旨在对这三种疾病与柯萨奇病毒感染间的关系作一探讨，检测用试剂盒由上海新新医学生物工程公司提供，检测步骤严格按试剂盒说明书进行，标本来源为本院小儿、心内和呼吸科门诊及住院病人血清。检测总结果见表一：
表一 三种疾病COXB1-6抗体阳性率病名 病例数 IgM(+) ％ IgG(+) ％心肌炎 256 128 50.0 142 55.5心律失常 247 28 11.3 41 16.6上感 327 40 12.2 27 8.3合计 830 196 23.6 210 25.3
表一中显示，心肌炎中有大约一半的病例可能系由COX病毒1-6型感染所引起，另按病因分类，心肌炎有的是明确疾病的并发症，如白核、结核、肝炎、腮腺炎等各种细胞或病毒感染后的心肌炎，这类心肌炎一般归纳为传染病性心肌炎。而有的心肌炎。原发疾病很不明确，临床拟诊为病毒性心肌炎者多数属这一类，我们将上述心肌炎按这二类病因分析统计，结果如下：
表二 心肌炎病因与COXB1-6抗体的关系病因 病例数 IgM(+) ％ IgG(+) ％传染病性心肌炎 75 3 4.0 3 4.0拟诊病毒性心肌炎 181 125 69.1 139 76.8
表二说明，疾病明确的并发症性心肌炎，COXB1-6抗体阳性率很低，而在无明确疾病引起的病毒性心肌炎中，COXB1-6抗体的阳性率很高，提示COX病毒感染是病毒性心肌炎的主要原因，COXB！-6IiM和IgG抗体的检测在病毒性心肌炎的诊断和治疗上有重要应用价值。
表一的247例心律失常患者中，COXB1-6IgM和IgG的阳性率分别只有11.3％和16.6％，但我们将心律失常按其病因分类后，可见器质性心脏病，药物，甲亢等引起的心律失常，其COCB1-6病毒感染与心律失常中，该抗体的阳性率分别高达25％和38.2％(表3)，说明COXB1-6病毒感染与心律失常也有较大关系，也已成为感染性心律失常的检测指标。
表三 心律失常病因COXB1-6抗体的关系病名 例数 IgM(+) ％ IgG(+) ％器质性心脏病 74 2 2.7 3 4.1药物 21 1 4.8 2 9.5甲亢 38 2 5.3 4 10.5急性感染 76 19 25 29 7.9其它 38 4 10.5 3 38.2合计 247 28 11.3 41 16.6
上感一般由流感病毒或合胞病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、冠状病毒等引起，故COXB1-6IgM和IgG的抗体阳性率在上感的检测中一般不会太高，正如表一所示，其抗体阳性率分别只有12.2和8.3％，但我们结合上感的各种症状，分别统计分析，发现上感中只有一般呼吸道症状的，COXB1-6抗体阳性率则十分低，而呼吸道症状同时伴有皮疹、胸痛、肌痛等症时，该抗体的阳性率就明显增高(表四)，因此，对上感中出现皮疹和肌痛的病例作血清COXB1-6抗体检测，对明确COX病毒性上感的诊断有很大的作用。因皮诊、胸痛、肌痛和咽峡炎等是CVB感染后的较特征性症状，故症状与抗体阳性率的一致说明本试剂盒的检测结果较正确。
表四 上感症状与COXB1-6抗体的关系症状 病例数 IgM(+) ％ IgG(+) ％呼吸道症状 218 2 0.92 2 0.92呼吸道症，皮疹 43 12 27.9 7 16.3呼吸道症，胸痛，肌痛 36 12 33.3 8 22.2呼吸道症，皮疹，肌痛 30 14 46.7 10 33.3合计 327 40 12.2 27 8.3
经过较长时间和大病例数的应用，我们认为由上海新新医学生物工程公司生产的COXB1-6IgM和IgG试剂盒对明确临床病毒性心肌炎的诊断和采取正确的治疗方案具有重要作用，在感染性心律失常和上感的病因分析方面也有很高的应用价值，试剂稳定性好，操作简便，结果判定可靠。三种疾病的分类测定值与临床诊断结果一致，并且心肌炎中COXB1-6IgM阳性率低于IgG阳性率，而上感中IgM阳性率高于IgG，这又显示了疾病的潜伏期长短与IgM，IgG抗体的消长规律一致，因此，我们认为该试剂盒的检测结果正确，使用满意。
柯萨基病毒B1-6混合型抗体IgM及IgG检测试剂盒应用报告(由上海第二医科大学附属新华医院提供)：
柯萨基病毒于1948年在美国柯萨基地区分离不得名，属小RNA病毒，分A、B两组，B组病毒简称CVB在人类病毒性心肌炎、上呼吸道感染等疾病中占有重要地位。用“柯萨基病毒B1-6混合型抗体IgM检测试剂盒”和“柯萨基病毒B1-6混合型抗体IgG检测试剂盒”来检测和监视相关病人血清中的柯萨基病毒B1-6混合型抗体IgM、IgG对临床防治和研究CVB性心肌炎，上感等有实际意义。
资料和方法
一、临床资料
我们对1998年10月至2000年5月间的本院病毒性心肌炎、上呼吸道感染、心肌病共514例的检测结果进行分析。
二、检测用试剂盒由上海新新医学生物工程公司提供，系间接ELISA方法，具体按试剂盒说明书操作。
结果
一、临床诊断为病毒性心肌炎者共210例，其中CVB1-6IgM阳性101例，阳性率为48.1％，CVB1-6IgG阳性115例，阳性率54.8％，CVB1-6IgM和IgG共同阳性的81例，占38.6％，至少一项指标阳性者共135例，阳性率为64.3％。按年龄分布统计，阳性率见下表：年龄 病例 IgM(+) ％ IgG(+) ％＜5 81 44 54.3 39 48.15-15 65 33 50.8 35 53.816-25 38 15 39.5 23 60.526以上 26 9 34.6 18 69.2
210 101 48.1 115 54.8
测定统计数据显示，年龄越小，IgM抗体阳性率越高，但IgG抗体的阳性率随年龄增长而增高，这提示，CVB感染患者后，年龄越小，病毒的潜伏期越短，发病越早。
二、临床表现为上呼吸道感染者共278例，CVB1-6IgM阳性55例，阳性率19.8％IgG阳性44％，阳性率15.8％，IgM和IgG均阳性的有40例，占14.4％，至少一项指标阳性的共59例，阳性率为21.25。
三、临床诊断为心肌病者26例，其中原发性心肌病18例，特异性心肌病8例，明确的原发病因有糖尿病，甲亢、类风湿等，分类统计IgM和IgG抗体阳性率见下表：
例数 IgM(+) ％ IgG(+) ％原发性心肌病 18 3 16.7 7 38.9特异性心肌病 8 1 12.5 2 25合计 26 4 15.4 9 34.6
二种心肌病均是IgG抗体阳性率高于IgM，示心肌病的发病时间均较长。目前对原发性心肌病因还未研究清楚，一般认为家族性，围产期、克山病等有关，但本检测中原发性心肌病的CVB1-6IgG(+)率达到38.9％，这为该病的病因和致病机理研究提供了信息，本试剂盒为成为该领域研究和诊治的有效工具。
试剂盒的使用评价
由上海新新医学生物工程公司研制并提供的ELISA检测人血清柯萨基病B1-6混合型抗体IgM，IgG的试剂盒，灵敏、特异、稳定性好，操作简便，二年多来试剂盒未出现明显质量问题，为我们的科研和临床检验作出了贡献，由于柯萨基病毒不是特异性的致病因子，因此，本项研究中未能对该试剂盒的灵敏度和特异性作具体考核，但二年来应用的总体感觉，试剂盒较稳定，测定结果较符合理论值。目前，病毒性心肌炎发病率较高，因病毒分离培养技术复杂，需时很长，显然不能满足早期诊断需要，而本试剂盒操作简便、快速、测定结果正确，在柯萨基病毒性心肌炎的诊断方面具有独特的作用。检测结果也表明，上感和心肌病的发病可能也与柯萨基感染有关系，况且，上感与病毒性心肌炎间也有某种联系，它们间又均可呈现CVB1-6抗体阳性反应，因此，该试剂盒对进一步研究心肌炎，上感和心肌病等疾病，阐明它们的发病机理，对这些疾病的早期诊断和治疗都具有较高的应用价值。
本申请的柯萨奇病毒B1-6混合型抗体混合型抗体混合型IgMELISA试剂盒。其检测方法简便快速，收费低廉，灵敏度和特异性均较高，它是柯萨奇病毒B感染疾病早期诊断和鉴别诊断的可靠病因学指标，临床应用价值较高，有较明显的社会和经济效益。
实例1、检测COXB1-6IgM抗体试剂盒制备一、主要原材料1.Hela细胞 中科院细胞所2.Na2HPO4.12H2O 上海新华化工厂3.Nacl 上海试剂一厂4.Kcl 江苏常熟化工厂5.Cacl2 江苏常熟化工厂6.葡萄糖 成都化学试剂厂7.EDTA 上海试剂一厂8.水解乳蛋白 上海试剂二厂9.谷氨酸 上海试剂二厂10.谷氨酰胺 上海化学试剂分装厂11.L赖氨酸 上海生化所12.L精氨酸L组氨酸L蛋氨酸 上海试剂二厂13.小牛血清 杭州四季青生物材料工程公司14.胰蛋白酶 美国Sigma公司15.氯化铯 美国Sigma公司16.辣根过氧化物酶 美国Sigma公司17.TMB 上海东风试剂厂18.高碘酸钠 上海化学试剂分装厂19.硼氨化钾 上海试剂一厂20.酶标板 华东理工大学新分离技术研究室二、COXB1-6包被病毒抗原的制备1、COX B病毒1-6型毒种来源：昆明生物所2、Hela细胞来源：中科院细胞所3、细胞传代：①培养剂配制：PRMI1640基础培养过滤除菌，200ml基础培养剂中含：
牛血清 10％
青霉素 4万单位
链霉素 4万单位
6％NaHCO3 4ml
3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制：用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化细胞；③细胞传代：将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消化，观察细胞已呈疏松网状，既倒去DT，加入营养液后，分瓶培养培养3-5天；4、病毒的感染、培养、收毒和鉴定：①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清的洗液洗一次；②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时；③补充培养液，在37℃培养；④逐日观察细胞：至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病毒；⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定；
病毒滴定：用10倍的倍比稀释的方法进行病毒的稀释，病毒加入微量板中，每孔加50ul病毒，每个稀释度加4孔，然后加入细胞50ul，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病毒的TCID50，本法培养病毒效价为TCID50＞10-5；病毒的鉴定：a.应用免疫电镜法；
b.应用中和试验方法(微量滴定法)
病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25ul/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25ul/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时。然后每孔内加Hela细胞50ul，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE；三、抗原的制备、浓缩和纯化：1、病毒灭活；2、去除病毒碎片：用冷冻离心的方法去除细胞碎片；3、初步浓缩、提纯：用PEG方法进行提纯；4、病毒的进一步纯化：用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在A280的分光光度计进行蛋白含量的测定；5、包被聚苯乙烯微孔板测定包被浓度和活性，1mg/ml病毒的包被浓度为1∶1000；四、兔抗人IgM(u)抗体的制备1、人IgM(r)链的制备。①30m1人脐带混合血清，50％及33％硫酸铵饱和度各盐析1次，PH7.2PBS透析去盐，体积浓缩至30％；②过sephadex G200柱PH8.0 0.2MNaCl-0.1MTr：s缓冲液洗脱，分管收集，第二峰为IgG。③双扩散法鉴定IgG纯度。④10mM巯基乙醇4℃3h解离轻链，对PBB透析24h。⑤再过sephadex G200柱，洗脱液同上，收集第一峰IgG(r)链。⑥双扩散鉴定r链特异性。⑦光密度法测定Ig(u)浓度。2、抗r链特异性抗体的制备。①1mg/ml r链加等量福氏完全佐剂研钵中研磨乳化。②每只羊背部多点注射3mg r链抗原，2周-1个月1次，共5-8次，双扩效价达1∶64以上时采集血清。③辛酸法纯化抗血清IgG部份，蛋白定量。五、兔抗人IgM(u)酶标记物的制备1、称5mg辣根过氧化物酶加0.5ml蒸馏水，再加0.5ml 60mM过碘酸钠液氧化15’4℃中；2、加0.16M 乙二醇0.5ml中止氧化，4℃30’；3、加10mg/ml羊抗人IgG(r)0.5ml，装袋对碳酸钠缓冲液透析过夜；4、加5mg/ml硼氢化钾0.2ml，4℃3h再装透析袋对PH7.2 0.01M PBS透析24h，换液4-5次；5、取出羊抗人IgG(r)-HRP作活性和效价测定，配成1mg/ml浓度时的工作效价为1∶2000；六、阴，阳性对照血清配制。
从病毒攻击的细胞保护试验筛选阴性和阳性对照血清，并将阳性血清定值。1、Hela细胞培养如2.3.3；2、用Hank’s液将病毒悬液稀释为100TCD50/0.1ml，每管中加0.5ml；3、各份人血清用Hank’s液作原倍，1∶2，1∶4，1∶16稀释，在上述管中每管加0.5ml，充分摇匀混合；4、放37℃水中作用1h；5、取出后接种细胞瓶，每管0.2ml，每稀释度接种4瓶，每瓶中补充维持液至总量为1ml；6、放37℃温箱培10天；7、以出现++以上细胞病变的培养瓶计算50％血清中和终点(以能保护50％组织培养细胞不产生病变的血清稀释度作为终点)；8、收集原倍血清尚出现100％细胞病变的血清继续做病毒滴度为100，10，2TCP50/0.1ml的病毒攻击细胞保护试验，原倍血清对2TCD50/0.1ml病毒攻击出现100％细胞病变的血清定为阴性血清，而将1∶8以上稀释度血清对100TCD50/0.1ml病毒攻击呈现50％细胞病变的血清定为阳性血清。对2TCD50/0.1ml病毒攻击出现50％细胞病变的血清抗体效价定为1单位/0.1ml；七、底物液配制甲液：1、各称磷酸氢二钠18.4克，柠檬酸5克，PM50mg放入容量瓶中，加双蒸水至1000ml，搅拌溶解后再加30％双氧水400ul；2、过滤除菌后分装小瓶；乙液：1、称EDTA150mg加入1000ml双蒸水中，加热溶解；2、上液冷却后加柠檬酸1.05克，再加用二甲亚砜溶解的TMB250mg。3、分装入黑色小瓶中备用；八、COXB1-6IgM抗体检测方法的建立。1、病毒抗原的包被
用20mmTris-Hcl液稀释COXB1-6病毒抗原为1∶1000浓度，各反应微孔中加0.1置4℃中24h，弃去上清液，拍干；2、取出已包被条孔，插入支架上，用胶布固定，以防脱落；3、各孔中滴加2滴(100ul)样品稀释液，然后分别加待检血清5ul，同时做阳性对照1孔，阴性对照1孔(各加50ul)，空白对照1孔(孔含样品稀释液2滴)；4、置37℃温箱中反应60分钟后，甩去孔内液体先在草纸上拍2-3下，然后用洗涤液洗5次，每次条孔加满洗涤液后停留30秒种，每次甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底。(10倍浓洗涤液1ml+9ml蒸馏水即为工作洗涤液)；5、各孔加酶标记液1滴(50ul)，置37℃中反应60分钟；6、同上彻底洗涤拍干；7、各孔滴加底物缓冲液甲、乙各1滴，置37℃中反应10-15分钟再每孔滴加终止液1滴，置酶标仪中450nm波长读数；8、结果判定：阴性对照A值×2.5＝临界值，凡待检标本孔A值大于临界值即为阳性。阴性对照小于0.08按0.08计算；九、灵敏度，特异性和精密度试验1、灵敏度测定
将细胞中和实验中滴定为效价64u/0.1ml( 640u/ml)，16u/0.1ml(160u/ml)及2u/0.1ml(20u/ml)的3份阳性血清用样品稀释液作不同浓度的稀释后，按实验操作方法作灵敏度测定，结果如下：
方法灵敏度测定检测 抗体效价u/ml血清 640 320 160 80 40 30 20 15 10 5 2.5阳性血清1 ＞2* ＞2 1.89 1.48 0.96 0.54 0.36 0.24 0.13 0.09 0.10阳性血清2 ＞2 ＞2 1.74 1.28 0.97 0.65 0.40 0.23 0.14阳性血清3 0.42 0.27 0.15 0.10 0.09
*A450值
阴性血清测定值
1 2 3 4 5 6
0.07 0.10 0.11 0.06 0.09 0.13
A阴性平均值为0.093，阳性临界值＝0.093×2.5＝0.233
则本检测方法对3份阳性血清的检测灵敏度分别为15u/ml，5u/ml和15u/ml，平均为11.7u/ml2、特异性测定
将细胞中和实验中判为阴性的血清20份按实验操作方法测定，结果如下：
待检血清测定值：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 100.06 0.14 0.09 0.10 0.11 0.10 0.13 0.07 0.06 0.1211 12 13 14 15 16 17 18 10 200.05 0.09 0.12 0.11 0.09 0.07 0.09 0.13 0.12 0.10
用6份小牛血清液按实验操作方法测定的A值分别为：
0.09 0.12 0.10 0.11 0.05 0.08
平均值为0.092 阳性临界值＝0.092×2.5＝0.23
则上面20份细胞中和实验阴性血清用本ELISA法测定也全部阴性，特异性100％。3、精密度测定
取实验吸光度分别为高中低A值的3份阳性血清做精密度试验，批内试验为每份血清同时做10个复孔，批间试验为每份血清间隔2-3天，实验1次，共测定6次，结果如下：
批内试验：
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X S CV(％)1 1.38 1.40 1.35 1.36 1.41 1.37 1.40 1.39 1.36 1.41 1.383 0.022 1.62 0.86 0.76 0.76 0.78 0.81 0.83 0.80 0.79 0.84 0.87 0.81 0.039 4.83 0.26 0.28 0.26 0.27 0.27 0.31 0.25 0.30 0.27 0.24 0.271 0.021 7.7
平均批内CV＝4.7％
批间试验
1. 2 3 4 5 6 X S CV1 1.39 1.50 1.30 1.40 1.42 1.25 1.38 0.089 6.42 0.84 0.72 0.75 0.91 0.83 0.71 0.79 0.079 103 0.25 0.30 0.27 0.24 0.23 0.30 0.265 0.030 11.3
平均批间CV＝9.2％十、稳定性试验1、三批试剂盒于2-8℃保存的稳定性试验
检验报告一第980519批试剂盒 制备日期1998年5月12日
有效期 1998年11月19日
| A450Nm | 98.5.20 | 98.6.20 | 98.7.22 | 98.8.20 | 98.9.19 | 98.10.18 | 98.11.19 | 98.11.20 | 99..1.20 |
| 药盒阴性对照 | 0.052 | 0.054 | 0.049 | 0.055 | 0.060 | 0.055 | 0.056 | 0.045 | 0.041 |
| 阴性标本 | 0.074 | 0.070 | 0.074 | 0.069 | 0.072 | 0.077 | 0.070 | 0.063 | 0.051 |
| 药盒标准抗原 | 0.652 | 0.642 | 0.650 | 0.655 | 0.638 | 0.659 | 0.638 | 0.627 | 0.610 |
| 阳性标本 | 0.540 | 0.518 | 0.527 | 0.537 | 0.517 | 05300 | 0.524 | 0.516 | 0.507 |
检验报告二第980603批试剂盒 制备日期1998年5月29日
有效期1998年12月3日
| A450Nm | 98.6.4 | 98.7.4 | 98.8.4 | 98.9.5 | 98.10.4 | 98.11.6 | 98.12.5 | 99.1.4 | 99..2.4 |
| 药盒阴性对照 | 0.056 | 0.057 | 0.048 | 0.052 | 0.054 | 0.0547 | 0.045 | 0.041 | 0.040 |
| 阴性标本 | 0.059 | 0.050 | 0.059 | 0.063 | 0.055 | 0.055 | 0.042 | 0.044 | 0.043 |
| 药盒标准抗原 | 0.759 | 0.750 | 0.740 | 0.741 | 0.737 | 0.730 | 0.728 | 0.720 | 0.721 |
| 阳性标本 | 0.453 | 0.455 | 0.459 | 0.450 | 0.444 | 0.437 | 0.430 | 0.433 | 0.428 |
检验报告三第980615批试剂盒 制备日期1998年6月8日
有效期1998年12月15日
2、三批试剂盒置37℃温箱中保存的稳定性试验。
| A450Nm | 98.6.16 | 98.7.16 | 98.8.15 | 98.9.1 | 98.10.18 | 98.11.17 | 98.12.18 | 99.1.17 | 99..2.25 |
| 药盒阴性对照 | 0.038 | 0.040 | 0.043 | 0.038 | 0.045 | 0.040 | 0.037 | 0.035 | 0.035 |
| 阴性标本 | 0.055 | 0.054 | 0.047 | 0.049 | 0.051 | 0.054 | 0.048 | 0.046 | 0.045 |
| 药盒标准抗原 | 0.752 | 0.740 | 0.747 | 0.734 | 0.743 | 0.732 | 0.730 | 0.727 | 0.725 |
| 阳性标本 | 0.511 | 0.518 | 0.496 | 0.490 | 0.504 | 0.476 | 0.472 | 0.471 | 0.460 |
第980519批试剂盒
| A450 | 0天 | 一天 | 二天 | 三天 | 四天 | 五天 | 六天 | 七天 |
| 药盒阴性对照药盒阳性对照 | 0.0520.743 | 0.0490.748 | 0.0460.737 | 0.0430.735 | 0.0400.730 | 0.0390.722 | 0.0330.710 | 0.0300.630 |
第980603批试剂盒
| A450 | 0天 | 一天 | 二天 | 三天 | 四天 | 五天 | 六天 | 七天 |
| 药盒阴性对照 | 0.058 | 0.050 | 0.051 | 0.045 | 0.043 | 0.038 | 0.035 | 0.034 |
| 药盒阳性对照 | 0.752 | 0.747 | 0.738 | 0.730 | 0.723 | 0.714 | 0.701 | 0.684 |
第980615批试剂盒
| A450 | 0天 | 一天 | 二天 | 三天 | 四天 | 五天 | 六天 | 七天 |
| 药盒阴性对照药盒阳性对照 | 0.0450.736 | 0 0440.740 | 0.0400.734 | 0.0370.729 | 0.0300.720 | 0.0310.720 | 0.0300.690 | 0.0280.674 |
Claims (2)
1、一种柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgM试剂盒，其特征在于该试剂盒用COXB病毒B1-6混合型抗原包被，兔抗人IgM联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的COXB病毒B1-6混合型抗体IgM，并且试剂盒由下列组成：预包被反应条 48孔 酶标记液 1瓶(3ml)样品稀释液 1瓶(6ml) 阳性对照 1支(200l)阴性对照 1支(200μl) 20倍浓洗涤液1瓶(13ml)底物缓冲液甲 1瓶(3ml) 底物缓冲液乙 1瓶(3ml)终止液 1瓶(3ml)
2、一种如权利要求1所述的一种柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgM试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：一、原材料及其规格(一)IgM试剂盒制备
COXB病毒B1-6混合抗原1∶1000
酶标板：华东理工大学ELISA测定CV(％)＜10％
阳性对照：诊断心肌炎患者血清，用本试剂盒测定A值＞0.8，放置-20℃备用；
阴性对照：选正常人血清，用本试剂盒测定A值＜0.09，放置-20℃备用；
酶标抗体：兔抗人IgM-HRP辣根过氧化物酶，RZ＞3.0 Sigma进口：
酶标记兔抗人IgM，双扩散1∶64；
小牛血清 杭州四季清厂生产；
其他试剂：
Na2CO3 A.R
NaHCO3 A.R
小牛血清 杭州四季清厂生产
Na2HPO4.12H2O A.R
NaH2PO4.2H2O A.R
NaCL A.R
Tweel-20 化学纯
甘油 化学纯
H2O2 A.R
柠檬酸.H2O A.R
TMB 熔点：168℃
EDTA A.R
H2SO4 A.R
Tris A.R
蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定
细胞及动物要求
(1)Hela细胞(ATCC CCL-2)
(2)新西兰大白兔 2公斤左右二、包被抗原(COXB病毒B1-6混合抗原)的制备
(1)COX B病毒1-6型毒种来源：昆明生物所
(2)Hela细胞来源：中科院细胞所
(3)细胞传代：
①培养剂配制：PRMI1640基础培养过滤除菌，200ml基础培
养剂中含：牛血清10％
青霉素 4万单位
链霉素 4万单位
6％NaHCO3 4ml
3％谷氨酰胺 6ml
②胰酶(DT)配制：用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化
液，用分散、消化细胞；
③细胞传代：将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消
化，观察细胞已呈疏松网状，既倒去DT，加入营养液后，分
瓶培养培养3-5天；
(4)病毒的感染、培养、收毒和鉴定：
①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清
的洗液洗一次；
②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时；
③补充培养液，在37℃培养；
④逐日观察细胞：至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病毒；
⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定；
病毒滴定：用10倍的倍比稀释的方法进行病毒的稀释，病毒加入微量板中，每孔加50ul病毒，每个稀释度加4孔，然后加入细胞50ul，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病毒的TCID50；
病毒的鉴定：应用免疫电镜法；
应用中和试验方法(微量滴定法)
病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25ul/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25ul/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时。然后每孔内加Hela细胞50ul，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE；
(5)抗原的制备、浓缩和纯化：
①病毒灭活，
②去除病毒碎片：用冷冻离心的方法去除细胞碎片，
③初步浓缩、提纯：用PEG方法进行提纯，
④病毒的进一步纯化：用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在A280的分光光度计进行蛋白含量的测定；三、兔抗人IgM(u)制备
(1)人IgM(u)链的制备
(2)50ml正常人血清，50％及33％饱和硫酸铵各盐析1次，PH7.2PBS透析去盐，体积浓缩至30％；
(3)过Sephadex G200柱，PH8.0 0.2Nacl-0.1MTris缓冲液洗脱，分管收集，第一峰为19S IgM；
(4)双扩散法鉴定IgM纯度；
(5)10mM疏基乙醇4℃3h解离轻链，对PB透析24h；
(6)再过Sephadex G200柱，洗脱液同上，收集第一峰Ig(u)链；
(7)双扩散鉴定u链特异性；
(8)光密度法测定Ig(u)浓度；
(9)1mg/ml u链加等量福氏完全佐剂研钵中研磨乳化；
(10)每只兔背部多点注射1mg u链抗原，2周-1个月1次，共5-8次，双扩散效价达1∶64以上时采集血清；
(11)辛酸法纯化抗血清IgG部分蛋白定量；四、酶标记抗体制备
兔抗人IgM用过典酸钠法与辣根过氧化物酶偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存，效价＞1∶1000(方阵滴定法测定)五、酶标记兔抗人IgM浓度测定
采用方阵滴定法选择酶标记抗体工作浓度为1∶1000六、预包被抗原板的制备
(1)包被
Na2CO3 0.6g
Na2HCO3 1.58g
重蒸水 500ml
加入适量COXB病毒1-6混合型抗原，调整PH至9.5加入板条各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜后甩干。
(2)洗涤
Tris 2.42g
重蒸水 1000ml
加入板条各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复3次，以除去剩余抗原。
(3)封闭
蔗糖 100g
羊血清 25ml
0.1MPBS 1000ml
加入板条各孔中放入湿盒中(加盖)37℃2h，弃去液体，吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃；
(4)阳性对照制备
诊断心肌炎患者的血清，60℃放置1小时，除菌过滤，用本试剂盒测定A值＞0.8备用，分装；
(5)阴性对照的制备
正常人血清用本试剂盒测定A值0-0.09用万分之二硫柳汞防腐备用分装；
(6)酶标记抗体配制
30％小牛血清
兔抗人IgM-HRP 50％0.15MPBS
(稀释度1∶1000) 20％甘油
————→稀释20倍分装
(7)酶标记抗体稀释液
小牛血清 30ml
0.15MPBS 50ml
甘油 20ml
20％Tween-20 2.5ml
调PH至7.2
(8)底物液甲
Na2HPO4.12H2O 1.7g
柠檬酸.H2O 0.5g
3％H2O2 200ul
重蒸水 100ul
调PH至5.0
(9)底物液乙
EDTA 17.5mg
柠檬酸.H2O 0.5g
重蒸水 100ml
加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25ul
(10)终止液
浓H2SO4 10ml
蒸馏水 80ml
(11)20X洗涤液
Tris 4.84g
重蒸水 100ml七、半成品的检定
(1)已包被板的检定：测定阳性血清CV(％)＜10％(n-10)
(2)稳定性检定：
①阴性对照和阳性对照+4℃-+8℃的稳定性检定
试剂盒内设定阴性对照及阳性对照均+4℃-+8℃放置9个月，再用该试剂盒测定吸光度在正常范围内；
②试剂盒37℃稳定性检定
装配前一星期将兔抗人IgM-HRP(1+100)(同一批兔抗人IgM-HRP检测一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各测定一次，并用兔抗人IgM-HRP置-20℃作对照，测得质控血清7天基本不变，则可以使用；
③特异性检定：用65份内控参比血清来检测半成品，阴性参比血清允许出现阳性1份，阳性参比血清允许出现阴性1份；
阴性内控血清组成：T1-3：HAV抗体阳性血清，T4-6：HCV抗体阳性血清：T7-9：HEV抗体阳性血清，T10-14：HBV表面抗体阳性血清，T15-24：CVB-IgM阴性血清，T25-27：类风湿因子阳性血清，T28-30：TB阳性血清，T31-33EBV阳性血清，T34-36CMV阳性血清，T37-39HVS阳性血清，T40-42Hpol阳性血清，T43-45TOXO阳性血清，45份特异性血清应允许1份为阳性；
阳性内控血清组成：Y1-20 CVB-IgM阳性血清，20份阳性血清，应允许1份为阴性，其余19份应检测为阳性；
(4)灵敏度血清
①组成：L1#按以下稀释度稀释：1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀释度稀释：1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀释度稀释：1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512
②判断标准：
L1#灵敏度应检测到1∶64
L2#灵敏度应检测到1∶128
L3#灵敏度应检测到1∶32
(5)精密性血清
将同一样品平行加样10孔，其检测值的变异系数小于15％(CV％＜15)；
(6)酶标抗体稀释液，底物液经过37℃细菌培养试验，发现无菌生长；八、试剂盒组装
(1)上述制备步骤所用试剂用过滤器除菌过滤后超净分装；
(2)试剂盒必需有外包装盒，海棉垫，塑料瓶6瓶，eppenkof管2支，包被板，说明书，内标签纸9张，外标贴纸1张，批号lot/EXP，48T/96T；九、成品检定
(1)物理检查
①药盒外包装，标签，批号，规格(48T/96T)有无遗漏；
②药盒内试剂瓶完整无渗漏，试剂瓶数和说明书无欠缺，标签完整，有效期应清楚明晰；
③药盒试剂(酶标抗体稀释液，底物液甲，底物液乙，洗涤液)核对PH值及溶液是否澄清；
(2)稳定性检定：
完全同半成品检定
(3)特异性检定：
完全同半成品检定
(4)灵敏度：
完全同半成品检定
(5)精密性
完全同半成品检定
(6)抽样合格后，留下5个试剂盒剩余入库
3个试剂盒
4℃ 2个 隔一个月测定1次
37℃1个 第一次隔三天测定1次，以后每星期测定1次，记录数据，绘制图表；
2个试剂盒留库备查十、保存与有效期
保存于2-8℃，自检定后合格之日起有效期为8个月。
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| CN 00125096 CN1341858A (zh) | 2000-09-07 | 2000-09-07 | 柯萨奇病毒b免疫球蛋白抗体m酶免试剂盒及制备方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102590504A (zh) * | 2012-01-31 | 2012-07-18 | 上海尧浩生物技术有限公司 | CoxBIgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒 |
| CN111999495A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-11-27 | 北京贝尔生物工程股份有限公司 | 一种磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法 |
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2000
- 2000-09-07 CN CN 00125096 patent/CN1341858A/zh active Pending
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| CN102590504B (zh) * | 2012-01-31 | 2015-01-14 | 上海尧浩生物技术有限公司 | CoxBIgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒 |
| CN111999495A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-11-27 | 北京贝尔生物工程股份有限公司 | 一种磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法 |
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