CN110687291A - 一种柯萨奇病毒a16型病毒抗原检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种柯萨奇病毒A16型病毒抗原检测试剂盒，所述检测试剂盒是基于ELISA方法的检测试剂盒，所述试剂盒含有兔抗CA16多克隆抗体和柯萨奇病毒A16型病毒单克隆抗体16E1。本发明的试剂盒特异性强、灵敏度好、重复性佳，与肠道病毒地其他型别不存在交叉反应，又可以和CA16的多个亚型的抗原反应，具备广谱性，具有重要的实用意义。
Description
【技术领域】
本发明涉及病毒学、抗体药物技术领域，特别涉及一种柯萨奇病毒A16型病毒抗原检测试剂盒。
【背景技术】
手足口病作为我国丙类传染病之一，首发表现为发热和手、足、口腔出现皮疹、疱疹和小溃疡，部分患者会发展成为无菌性的脑炎、脑膜炎等重症表现，给中国带来了较大的疾病负担。目前，全球大部分地区均有手足口病例的相关报道，而亚太地区作为手足口病的高发地区，近年来受到了足够的重视。肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)是导致手足口病的主要病原体，虽然近年来柯萨奇病毒A6型(CA6)和柯萨奇病毒A10型(CA10)导致的手足口病不断增多，但是EV71和CA16感染与重症手足口病有明显的关联。
经过8年国内学者和生物制品公司的努力，在2016年由中国自主研制的EV71疫苗成功上市，这为手足口病防治工作的开展提供了基础。但是，CA16作为重症手足口病的另一较为重要的病原体，且 EV71与CA16共感染易导致疾病症状加重、延长病程，更易引起重症神经系统症状。而EV71与CA16混合或交替流行易导致病毒重组，增加了手足口病流行的复杂性。疫苗是控制手足口病流行的重要手段，2016年EV71全病毒灭活疫苗的成功上市后为CA16疫苗以及 EV71/CA16联合疫苗的研发提供了重要的技术支撑，但目前还缺乏能够预防CA16的疫苗。
CA16是小RNA病毒科肠道病毒属的成员，直径27～30nm，无包膜病毒，呈二十面体结构。为单股正链RNA病毒，基因组全长 7400bp，包含一个开放阅读框，编码多聚蛋白前体，蛋白前体被自身产生的水解酶切割为结构蛋白P1和非结构蛋白P2和P3。结构蛋白 P1主要编码由VP1、VP0、VP3组成的衣壳蛋白，VP0在病毒成熟过程中水解为VP2、VP4，其中VP4位于衣壳蛋白内部，VP1、VP2、 VP3分布在衣壳病毒的表面，组成五聚体。开放阅读框编码区两侧分别是5’和3’非编码区，5’非编码区由740个核苷酸组成，与病毒基因组的复制和翻译功能相关，3’非编码区包含PolyA尾，对于病毒的成功感染是必不可少的。
目前，中国国内在研CA16疫苗主要分为全病毒灭活疫苗与病毒样颗粒疫苗。疫苗有效性的发挥主要依赖于其诱导产生的体液免疫反应(即中和抗体)和细胞免疫反应。大量实验数据已表明福尔马林灭活的EV71/CA16疫苗和EV71/CA16 VLPs疫苗都能引起较好的中和抗体应答，继而产生的中和抗体可以和病毒的相应表位结合，从而阻断病毒与细胞表面的受体的结合。除此以外，VLP疫苗还可诱导产生细胞免疫应答，主要表现为IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10等Th1 型和Th2型细胞因子的升高。这提示灭活疫苗与VLPs都可作为联合疫苗的候选。
同时，研究表明肠道病毒存在许多型内、型间的交叉反应性，且不同型间较容易发生重组，比如EV71和CA16的基因组相似性高达 80％，拥有众多相同和相似表位，所以筛选出专一性针对CA16的中和性单抗变得比较困难，这极大制约了建立CA16的抗原检测系统。
目前，全国有多家企业在研CA16疫苗，而每家疫苗研发企业均在建立针对自己的产生毒株和工艺的抗原检测试剂盒，各家的结果差异较大，亟需建立一套统一的抗原检测试剂盒，以适应大多企业的中间产品和疫苗成品的检测需求。
【发明内容】
本发明的目的是针对当前CA16抗原检测系统空白的缺陷，提供一种CA16单克隆抗体，通过该单克隆抗体的应用，建立CA16抗原的体外检测方法及检测试剂盒，该试剂盒应当具有广谱性，能够与 CA16的其他型别的抗原反应，同时具有良好的特异性，不与EV71、CA6、CA10等病毒及其他型别病毒发生交叉反应。
为了实现上述目的，本发明提供一种柯萨奇病毒A16型病毒抗原检测试剂盒，所述检测试剂盒是基于ELISA方法的检测试剂盒，所述试剂盒含有兔抗CA16多克隆抗体和柯萨奇病毒A16型病毒单克隆抗体16E1。
本发明的柯萨奇病毒A16型病毒单克隆抗体16E1是由杂交瘤细胞株16E1产生，该杂交瘤细胞株于2019年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.C2019167，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
在本发明中，所述杂交瘤细胞16E1的构建方法包括以下步骤：
(1)小鼠免疫
对6-8周龄BALB/c雌鼠使用CA16病毒免疫原进行免疫，每隔 2周加强免疫一次，每次免疫前检测小鼠血清滴度，当小鼠血清滴度达到平台期后停止免疫，准备融合；
(2)融合杂交瘤的制备和筛选
(2.1)小鼠巨噬细胞的制备
将BALB/c小鼠处死，取腹腔细胞液溶解于HAT培养液或HT 培养液中，直至腹腔细胞在培养液中的终浓度为2×105个/mL；将细胞加入96孔细胞培养板，置培养箱培养，得到小鼠巨噬细胞；
(2.2)小鼠胸腺细胞的制备
将BALB/c小鼠处死，取出胸腺，将胸腺研磨后通过200目细胞筛，得到胸腺饲养细胞液；
(2.3)小鼠骨髓瘤细胞的制备
取小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0-Ag14(Sp2/0)，用20％FBS RPMI-1640 培养液培养，选处于对数生长期细胞，融合前将骨髓瘤细胞从培养瓶移入离心管，用RPMI-1640培养液洗3次，用RPMI-1640培养液重悬细胞，计数；
(2.4)免疫脾细胞的制备
取待融合的BALB/C小鼠，处死后收集血液制成抗血清作为抗体检测的阳性对照；取小鼠脾脏，过200目细胞筛网后用研磨棒挤压研磨，滴加RPMI-1640培养液静置3-5min，取上2/3部分悬液移入50 mL塑料离心管中；本步骤反复2–3次，然后用RPMI-1640培养液洗细胞3次，再用RPMI-1640培养液重悬细胞并计数，得到免疫脾细胞；
(2.5)使用PEG促融剂融合制备杂交瘤
将1mL的PEG-1500、10mL的RPMI-1640无血清培养基和200 mL完全培养基平衡至37℃；将步骤(2.3)制备的骨髓瘤细胞与步骤 (2.4)制备的脾细胞混合于50mL离心管内，其中脾细胞与骨髓瘤细胞的个数比为10:1，1500rpm离心8min，轻轻弹击管底，使细胞疏松成糊状；吸取0.8mL PEG加入离心管内，加入10mL 37℃的 RPM-1640完全培养液，温和搅拌，最后补加RPMI-1640培养液至 40mL，1000rpm离心5min；弃上清，取HT培养液将细胞吹散，之后加入HT培养液；将所得细胞加入96孔细胞培养板，每孔100μL，放入CO2培养箱中培养12h后，在每个孔中滴加100μL HAT完全培养基；5天后，用HT完全培养基给孔中的细胞上清换液，换液体积比为50-100％；9-14天后，吸取上清进行检测；
(2.6)杂交瘤的筛选
使用间接ELISA法进行筛选，包被纯化的CA16病毒抗原100ng/ 孔，加入细胞上清50μL检测，挑选出阳性克隆孔；
(2.7)杂交瘤细胞的克隆化
利用克隆培养方法选出杂交瘤细胞，重复克隆2–3次，直到 100％阳性后，得到所述杂交瘤细胞16E1。
根据一种优选的实施方式，所述包被抗体的包被浓度是 3.7μg/ml。
在本发明中，所述单克隆抗体16E1是被生物标记或化学标记的 (例如酶标记的或荧光标记的)，例如，所述标记可以是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶或葡糖氧化酶或荧光素、生物素、胶体金、碱性磷酸酶标记的。
在本发明中，所述基于ELISA方法的检测试剂盒还包含样本稀释液、酶稀释液、显色液A、显色液B和终止液和/或说明书。本领域技术人员根据ELISA检测方法，能够选择合适的样本稀释液、酶稀释液、显色液A、显色液B和/或终止液，在此不做赘述。
本发明的试剂盒采用16E1单克隆抗体和兔多克隆抗体作为酶标记第二抗体，针对CA16中和性表位，所测得的抗原含量可以较好地与免疫原性相关，便于建立体外检测方法，用于体内实验的替代，减少实验动物的使用。
经实验确认，本发明的试剂盒采用16E1单克隆抗体包被，此抗体与肠道病毒的其他型别不存在交叉反应，保证了试剂盒的特异性。
本试剂盒采用兔多克隆抗体作为酶标记第二抗体，能够最大限度的捕获抗原。
本试剂盒可以和CA16的多个亚型的抗原反应，具有广谱性。
由于肠道病毒存在非常明显的型内、型间的交叉反应性，比如 EV71和CA16的基因组的相似性达到了80％。而本单克隆抗体16E1 不与EV71、CA6、CA10等肠道病毒属其他型别病毒存在交叉反应，能很好避免交叉反应性对试剂盒建立的制约；此外，本试剂盒经过进一步的开发，还可用于手足口病的筛查、流行病调查等，具有重要的实用意义。
本发明的柯萨奇病毒A16型病毒单克隆抗体16E1是由杂交瘤细胞株16E1产生，该杂交瘤细胞株于2019年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.C2019167，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
【附图说明】
图1为实施例1的CA16兔多抗血清纯化后SDS-PAGE电泳图，其中第1泳道：预染蛋白marker；第2泳道：纯化多抗。
图2为实施例6的灵敏度和线性范围结果。
图3为实施例6的准确性结果。
图4为实施例7的适用性研究结果。
【具体实施方式】
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
以下实施例涉及以下材料或设备，这些材料或设备也是本领域技术人员根据现有技术的教导可以直接获得：
CA16病毒的来源为：
(1)CA16V-24株由北京科兴生物制品有限公司提供，本领域技术人员可以相同途径获得，毒株标本来源为浙江省杭州市。
(2)CA16/00190/B1b(GenBank No.MF177223)病毒由厦门大学于2011年分离获得，标本来源于台湾一份HFMD阳性的临床样本。
RPMI-1640培养液的组成为：培养基干粉(GIBCO-31800-105)、 L-谷氨酰胺(SIGMA-ALBRICH-G8540)和碳酸氢钠 (SIGMA-ALBRICH-S5761)。
FBS：GIBCO-10099-141
20％FBS RPMI-1640培养液是在RPMI-1640培养液基础上添加按总体积计20％FBS。
HT培养液是在RPMI-1640培养液的基础上添加了次黄嘌呤 (SIGMA-ALBRICH-H9377)和胸腺嘧啶脱氧核苷 (SIGMA-ALBRICH-T9250)。
HAT培养液是HT培养液的基础上添加了氨基喋呤 (SIGMA-ALBRICH-A5159)。
RPMI-1640完全培养液是在RPMI-1640培养液中加入按总体积计10％FBS。
HT完全培养液是在HT培养液中加入按总体积计10％FBS。
HAT完全培养液是在HAT培养液中加入按总体积计10％FBS。
在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为质量百分比，“：”均为重量比。
实施例1：CA16 HRP标记兔多克隆抗体的制备
将Vero细胞复苏后于36.5±0.5℃培养。细胞浓度达到0.1～10×106 /ml时，取CA16病毒(CA16V-24)按MOI 0.05～0.1感染Vero细胞，置 35.5±0.5℃培养2～4天，收获细胞上清，即为CA16收获液。CA16收获液澄清后用超滤膜浓缩5倍以上。然后进行分子筛层析和离子交换层析，检测波长为280nm，分别收集洗脱液和流穿液，即得纯化液，甲醛灭活后即得CA16疫苗原液。CA16纯化液经HPLC检测纯度在90％以上。检测抗原含量为13220U/ml，总蛋白质含量为6μg/ml。将此批原液作为免疫原。
免疫动物为新西兰大白兔2只，在背部皮下多点免疫，按照0， 2，3，4，5周免疫流程免疫5针。第1针剂量为6ml/只(免疫原与完全弗氏佐剂1：1混合)，第2-5针为2ml/只(免疫原与不完全弗氏佐剂1：1混合)。第5针后1周采血，3000rpm离心15min，分离血清，分别获得编号为24-1和24-2的血清数量分别为50ml。
按照CA16中和抗体滴度测定方法检测CA16兔多抗血清针对 CA16病毒种子的中和抗体滴度，结果见表1。
表1 兔抗CA16多抗血清中和抗体滴度
由表1可见，2份CA16兔多抗血清中和抗体滴度分别为1:6144 和1:384，24-1的中和抗体滴度远高于24-2的中和抗体滴度，故对 24-1批CA16兔多抗血清进行间接法抗体效价检测，检测结果见表2。
表2 CA16兔多抗血清间接酶联免疫法效价吸光度(450/630nm)结果
由表2结果可见，24-1批CA16兔多抗血清对于CA16间接法效价为106。
综合两份CA16兔多抗血清对CA16病毒的间接法效价和中和抗体滴度，选择编号为24-1的CA16兔多抗血清建立后续检测方法。
采用葡萄球菌蛋白A(SPA)方法对24-1号兔多抗进行纯化，并对纯化后的抗体进行SDS-PAGE鉴定，IgG的重链和轻链所占含量应不低于80％。电泳结果显示(见图1)，第1泳道：预染蛋白marker；第2泳道：纯化多抗。纯化后兔抗CA16多抗在约48KD与24KD左右有两条主蛋白条带，分别为IgG的重链与轻链。经凝胶成像仪扫描分析纯化抗体的纯度为：96.5％，纯度≥80％。将纯化得到24-1号多抗采用过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶，标记后加等体积甘油分装，-20℃保存。
实施例2：CA16单克隆抗体的选择
6株鼠源CA16的单克隆抗体均为厦门大学馈赠，包括1株线性中和表位的单抗11F12，4株构象中和表位的单抗，分别为16E1、9D7、 4E9、16F8，1株线性非中和表位的单抗19#。由于EV71病毒与CA16 病毒的序列相似性达到了95％以上，且有很多相同表位，所以使用的单抗必须只特异性的检测CA16抗原，而不与EV71抗原反应。此外，由于各企业的CA16毒株不同，使用的单抗必须能与国内大多数厂家的CA16原液发生较强反应。
选择方法如下：将EV71全病毒灭活抗原包被至酶标板上(浓度为1μg每孔)，然后分别加入上述6株单抗(使用浓度均为1μg每孔)，加入HRP标记羊抗鼠IgG，显色后检测450/630nm的OD值。结果发现19#与EV71的原液存在交叉反应，而其余五株单抗不与EV71 存在交叉反应。故不将19#作为候选单抗。
其余五株单抗按照上述方法检测与四家不同企业的CA16疫苗原液(10μg/ml)的反应性，实验结果显示只有16E1能与四家企业的 CA16原液发生较强的反应，结果见表3(OD值大于1.6以上认为达到了反应的平台期，表明单抗的反应性较好)。
此外，还检测了上述五株中和单抗对CA16原型株G10和流行株 190、731的中和能力。检测方法如下：将上述单抗的使用浓度稀释至10mg/ml并稀释100倍，进行2倍梯度稀释(1：100～1：12800)，分别将CA16毒株(100CCID50/50μl)与上述稀释后的单抗1：1混合孵育2h后加入RD细胞中，35℃培养7d后观察CPE，并计算单抗的中和效价。结果见表4，显示16E1的中和能力较强。最终选择16E1 为检测用单抗。
表3 ELISA方法检测单抗与不同疫苗原液反应OD值
表4 单抗中和CV-A16毒株的能力
上述六株单抗的制备方法如下：
(1)小鼠免疫
CA16病毒的免疫：对6-8周龄BALB/c雌鼠，使用CA16病毒 (GenBankNo.MF177223)免疫原进行免疫，每隔2周加强免疫一次，每次免疫前采集200μL眼框静脉血或20μL尾静脉血以备滴度测定。当小鼠血清滴度达到平台期后，停止免疫，休息两个月后进行融合。
(2)融合杂交瘤的制备和筛选
1、小鼠巨噬细胞的制备：将一只6周龄左右的BALB/c小鼠处死，自来水冲洗后，浸泡于75体积％乙醇溶液中5min；取出小鼠并充分暴露腹部，用无菌镊子提起腹膜，将腹膜中央处剪一小口，用1 mL吸管通过小口向腹腔内注入适量HT培养液，用吸管小心在腹腔内搅动，最后吸出培养液于离心管中。将腹腔细胞液溶解于HAT培养液或HT培养液中，使终浓度为2×105/mL；将细胞加入96孔细胞培养板，置培养箱培养，也可直接与融合细胞混合后添加到96孔细胞培养板中。
2、小鼠胸腺细胞的制备：将一只13天龄左右的BALB/c小鼠引颈处死，自来水冲洗，浸泡于75％乙醇溶液中5min。将小鼠放入超净工作台，暴露胸腔，取出乳白色的胸腺。将胸腺研磨后通过200目细胞筛，得到胸腺饲养细胞液。
3、小鼠骨髓瘤细胞的制备：取小鼠骨髓瘤细胞株 Sp2/0-Ag14(Sp2/0)，这种细胞株易培养、融合率高，是目前最理想的融合细胞，用20％FBS RPMI-1640培养液培养骨髓瘤细胞。当细胞数在104-106/mL时，细胞呈对数生长，此时细胞浑圆透亮、大小均一、边缘清晰、排列整齐、呈半致密分布。一般在细胞处于对数生长中期时(约1×105-5×105/mL)，可按1:5–1:10的比例进行稀释传代。选处于生长旺盛、形态良好的对数生长期细胞供融合用，融合骨髓瘤细胞的活细胞数应达95％以上。融合前将骨髓瘤细胞从培养瓶移入离心管，用RPMI-1640培养液洗3次(1000rpm，5min)，然后用 RPMI-1640培养液重悬细胞，计数。一般从融合前5天开始复苏小鼠骨髓瘤细胞，每次融合约需6瓶35cm2 Sp2/0细胞。
4、免疫脾细胞的制备：取待融合的BALB/C小鼠，致死后收集血液制成抗血清，可作为抗体检测的阳性对照。自来水冲洗小鼠并浸泡于75％乙醇溶液中5min；取出脾脏，用剪刀将其剪成小块放于200 目细胞筛网上，再用研磨棒(注射器内芯)挤压研磨。用吹管滴加RPMI-1640培养液。补加适量的RPMI-1640培养液，静置3-5min，取上2/3部分悬液移入50mL塑料离心管中。上述过程反复2–3次。用RPMI-1640培养液洗细胞3次(1000rpm离心10min)，然后用 RPMI-1640培养液重悬细胞并计数。
5、使用PEG促融剂融合制备杂交瘤：融合前先将1mL的 PEG-1500、10mL的RPMI-1640培养液和200mL-RPMI-1640完全培养液平衡至37℃。将制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于50mL离心管内(1×108脾细胞和1×107骨髓瘤细胞，约10:1)，1500rpm离心8min，轻轻弹击管底，使细胞疏松成糊状。吸取0.8mL PEG加入离心管内，在60s内加完，边加边轻轻搅拌。随即加入10mL预温至 37℃的RPMI-1640完全培养液，温和搅拌。最后补加RPMI-1640 培养液至40mL，1000rpm离心5min。弃上清，取少量HT培养液将细胞吹散，之后将准备好的HT培养液加入。将细胞加入96孔细胞培养板，每孔100μL，放入CO2培养箱中培养。12h后，配置HAT完全培养液，每个孔中滴加100μL。5天后，用HT完全培养液给孔中的细胞上清进行50-100％的换液。9-14天后，吸取上清进行检测。
6、杂交瘤的筛选：依据现有技术使用间接ELISA筛选，包被纯化的CA16病毒抗原100ng/孔，加入细胞上清50μL检测，并挑选出阳性克隆孔。
7、杂交瘤细胞的克隆化：在筛选出的含阳性上清的培养孔中通常是二个以上的杂交瘤集落。其中有的集落可能不分泌抗体或分泌非实验所要的抗体。因此，须利用克隆培养方法把它们分开，选出所需的杂交瘤细胞。最常用的克隆培养方法是有限稀释法。先把细胞按一定浓度进行梯度稀释，然后接种到96孔细胞培养板中，尽可能使孔内只有一个细胞生长。将杂交瘤单克隆阳性细胞株重复克隆2–3次，直到100％阳性后认为得到稳定克隆株。
(3)单抗腹水的诱导
1、取BALB/c小鼠2-3只，腹腔注入0.5mL液体石蜡油。
2、1周后，处理对数生长期的杂交瘤细胞，1000rpm离心5min，弃上清液。用无血清培养液悬浮杂交瘤细胞，并将细胞数调至(1-2) ×106/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。
3、7-10天，小鼠腹部明显膨大后，引颈处死小鼠。将小鼠用自来水冲洗，浸泡于75％乙醇中5min。使小鼠腹部朝上，用注射针头将小鼠四肢固定于解剖台板。用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，然后从两边向小鼠背部方向剪开，用大镊子撕开皮肤，充分暴露腹部。用无菌眼科镊子提起腹膜，在腹膜中央处剪一小口，然后用1mL吸管通过小口吸出腹腔内全部腹水。将所有腹水混合放入离心管中， 3000rpm离心20min，之后收集上清。
(4)单抗腹水的纯化:将腹水用辛酸-饱和硫酸铵沉淀和ProteinA 亲和层析纯化(购自美国GE公司)，获得纯化的单克隆抗体16E1。
实施例3：抗原检测体系的确定
比较了三种常用的ELISA检测体系，分别为：
体系1：兔多抗+抗原+16E1(鼠源)+羊抗兔HRP
体系2：16E1(鼠源)+抗原+兔多抗+羊抗兔HRP
体系3：16E1(鼠源)+抗原+兔多抗HRP。
分别采取棋盘法摸索合适的使用浓度，抗原为按照实施例1生产的CA16疫苗原液。
在满足本底要求的情况下，体系1的灵敏度只能达到125ng/ml，不能满足检测需求；体系2的灵敏度最高，能达到1ng/ml；体系3 的灵敏度能达到12.5ng/ml。由于体系3的检测步骤较少，能缩短检测时间，故选择体系3建立检测方法。
实施例4：配置CA16病毒抗原ELISA检测试剂盒
(1)样本稀释液
小牛血清 100ml
0.01M PBS 900ml
Proclin 300 0.5ml
(2)浓缩洗液(20×)
(3)水解酪蛋白
酪蛋白 100g
Proclin 300 1ml
加纯化水至 1000ml
(4)酶稀释液
(5)终止液
浓硫酸 112ml
纯化水 888ml
(6)显色液A
(7)显色液B
(8)HRP标记的兔抗CA16多抗
分装实施例1中制备的HRP标记的CA16兔多抗5μL。
(9)酶标板的包被；将前述制备的纯化的抗CA16的单克隆抗体16E1作为包被抗体，以最佳包被浓度3.7μg/ml(用0.05M pH9.6 的碳酸盐缓冲液稀释)，每孔100μl加于96孔聚苯乙烯酶标板(coastar) 孔内，并于4℃下放置14-20h，弃去包被液，用洗液(0.01M PBS，0.05％Tween20)，拍干；加入封闭液(10％兰州民海小牛血清，0.01M PBS)200μl/孔，于37℃孵箱封闭1h，弃去封闭液，拍干，室温条件下自然干燥4h，真空封装，得到抗CA16单克隆抗体包被板。
除上述的HRP标记CA16多抗需在-20℃保存外，其余试剂盒内物品均为2-8℃保存。
实施例5：检测试剂盒的说明书
本检测方法操作的SOP如下：
1.用样本稀释液将2000U/ml的CA16国家抗原标准品稀释至 200、100、50、25、12.5U/ml，将待检测样品稀释至适当系列浓度(2 倍稀释)；
2.每孔加入100μl系列浓度的抗原标准品、阴性对照(样本稀释液)、系列浓度的待测样本，均做双复孔，37℃孵育1h；
3.用1：20倍稀释后的洗液洗板5次，拍干；
4.将酶标多抗进行1：4000倍稀释，每孔加100μl，37℃孵育1h；
5.按步骤3方法进行洗板；
6.每孔加入显色液A、显色液B各50μl，37℃孵育10min；
7.加入终止液(2M H2SO4)，50μl/孔，在酶标仪上读取450/630nm 的OD值。
按照以下方法计算抗原含量：
(1)将CA16国家抗原参考品系列浓度的抗原含量对双复孔OD 值均值采用Excel进行散点作图，添加趋势线，选择“显示公式”和“显示R2值”，要求R2值≥0.98试验结果方才有效；
(2)按照Statistical Analysis软件双平行线法规定的格式建立 Excel文件，用Statistical Analysis软件的Parallel Line Assay，再 Response下面选择Log(y)，然后选择要统计的Excel文件，结果显示为Parallel和Lineality两项均符合要求(即右上角不出现“﹡﹡”)时，方可统计结果。样本的CA16抗原含量＝CA16国家抗原标准品的浓度×Relative Potency。
上述操作程序和/或抗原含量的计算方法可作为本发明试剂盒的说明书而成为试剂盒的一部分。
实施例6：验证上述试剂盒的线性范围、线性、特异性、灵敏度、准确性、精密度和重复性
(1)特异性试验：
将EV71病毒、甲肝病毒(HAV)、脊髓灰质炎病毒(IPV)抗原稀释至1000ng/ml和100ng/ml，CA16国家抗原标准品稀释至200ng/ml和 50ng/ml，连同原倍浓度MEM培养基、DMEM培养基、10％小牛血清(FBS)，按照实施例5的方法进行试验，结果见表5。
表5 特异性试验结果
以上结果表明本检测体系只特异性检测CA16，而不与其他肠道病毒等反应。
(2)灵敏度和线性范围测试
将CA16国家抗原标准品稀释至200U/ml，然后以2倍梯度稀释至100、50、25、12.5U/ml，按照实施例5的方法进行实验，最终得到的线性结果如图2所示。
本发明的试剂盒灵敏度为12.5U/ml，线性范围为12.5-200U/ml，实验结果表明本发明的试剂盒具有良好的灵敏度和线性范围。
(3)准确性：
将国家标准品2ug/ml稀释至浓度为150U/ml，50U/ml，20U/ml 作为高中低浓度的待测样本，单人按照实施例5重复实验6次，计算高中低三个浓度的回收率，结果如图3所示。
其中，回收率的计算方法是实测值/理论值×100％。
图3结果表明，高中低三个浓度的回收率在80-110％之间，处于可接受范围。
(4)中间精密度：
不同的操作员在不同时间，选择150U/ml，50U/ml，20U/ml的国家抗原标准品作为待测样本，按照实施例5板间各重复试验3次，计算双人CV值，结果见表6.
表6 中间精密度结果
其中，CV％的计算方法是标准差/平均值×100％。
以上结果表明，双人重复试验中变异系数<15％，具有较好的中间精密度。
(5)重复性：
选择150U/ml，50U/ml，20U/ml的国家抗原标准品作为待测样本，按照实施例5单人重复实验6次，计算CV值，结果见表7.
表7 重复性结果
CV的计算方法同上。
以上结果表明，CV值在控制在10％以内，具有良好的重复性。
(6)耐用性：
单人检测，高中低浓度选择150U/ml，50U/ml，20U/ml，分别对孵育时间和孵育温度做出改变，结果见表8、表9。
表8 孵育时间的影响
表9 孵育温度的影响
以上结果表明在浓度范围20-150U/ml、孵育温度37-39℃范围内，回收率均在80％-120％之间，表明本发明的试剂盒的耐用性满足要求。
实施例7：评价该试剂盒的适用性。
将试剂盒分发给国内7家CA16疫苗生产企业，分别按照SOP 检测本企业的CA16疫苗原液。7家企业所用毒株包括B1a、B1b和 B2b三个亚型。按照实施例5判断原则评价各家原液的适用性。各家双平行线法检测结果如图4。结果表明本试剂盒能够用于国内7家企业CA16原液抗原含量的定量检测。
以上结果表明，本发明的试剂盒特异性强、灵敏度好、重复性佳，与肠道病毒地其他型别不存在交叉反应，又可以和CA16的多个亚型的抗原反应，具有广谱性。
本发明的试剂盒经过进一步的开发，还可用于手足口病的筛查、流行病调查等，具有重要的实用意义。
Claims (8)
1.一种柯萨奇病毒A16型病毒抗原检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒是基于ELISA方法的检测试剂盒，所述试剂盒含有兔抗CA16多克隆抗体和柯萨奇病毒A16型病毒单克隆抗体16E1。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述单克隆抗体是杂交瘤细胞株16E1产生，该杂交瘤细胞株于其保藏编号为CCTCC No. C2019167，保藏日期为2019年8月1日，保藏于单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.C2019167，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述包被抗体16E1的使用浓度是3.7μg/ml。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述兔抗CA16多克隆抗体含有IgG的重链和轻链含量不低于80％。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述兔抗CA16多克隆抗体的效价为106，其使用浓度为1：4000。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒还包括样本稀释液、浓缩洗液、水解酪蛋白、酶稀释液、显色液A、显色液B和酶标板。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于所述样本稀释液包括小牛血清100ml、0.01M PBS 900ml、Proclin 3000.5ml；
所述浓缩洗液(20×)包括NaH2PO4·2H2O 2.96g、Na2HPO4·12H2O 29.0g、NaCl 234g、Tween-2020ml，加纯化水至1000ml；
所述水解酪蛋白包括酪蛋白100g、Proclin 3001ml，加纯化水至1000ml；
所述酶稀释液包括小牛血清100ml、水解酪蛋白100ml、Proclin300100μl、Tween-2050μl，加纯化水至1000ml；
所述终止液包括浓硫酸112ml、纯化水888ml；
所述显色液A包括醋酸钠27.2g、柠檬酸3.2g、30％H2O20.6ml，加双蒸水至1000ml；
所述显色液B包括TMB 0.4g、EDTA-Na20.4g、柠檬酸1.9g、甘油100ml，加双蒸水至1000ml。
8.根据权利要求5所述的兔抗CA16多克隆抗体，其特征还在于所述多克隆抗体被辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶或葡糖氧化酶或荧光素、生物素、胶体金或碱性磷酸酶标记。
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