CN110684104A - 柯萨奇病毒a组16型单克隆抗体16e1及其制备方法 - Google Patents

柯萨奇病毒a组16型单克隆抗体16e1及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种柯萨奇病毒A组16型单克隆抗体16E1，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株16E1产生，该杂交瘤细胞株于2019年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.C2019167。本发明的16E1单克隆抗体具备良好的特异性，不与肠道病毒的其他型别发生交叉反应，对不同来源的CA16病毒具有良好的广谱性，具有优秀的应用意义。

Description

柯萨奇病毒A组16型单克隆抗体16E1及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及病毒学、抗体药物技术领域，特别涉及一种柯萨奇病毒A组16型单克隆抗体16E1、产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株和所述细胞株的构建方法及应用。
【背景技术】
手足口病作为我国丙类传染病之一，首发表现为发热和手、足、口腔出现皮疹、疱疹和小溃疡，部分患者会发展成为无菌性的脑炎、脑膜炎等重症表现，给中国带来了较大的疾病负担。目前，全球大部分地区均有手足口病例的相关报道，而亚太地区作为手足口病的高发地区，近年来受到了足够的重视。肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)是导致手足口病的主要病原体，虽然近年来柯萨奇病毒A组6型(CA6)和柯萨奇病毒A组10型(CA10)导致的手足口病不断增多，但是EV71和CA16感染与重症手足口病有明显的关联。
CA16是小RNA病毒科肠道病毒属的成员，直径27～30nm，无包膜病毒，呈二十面体结构。为单股正链RNA病毒，基因组全长 7400bp，包含一个开放阅读框，编码多聚蛋白前体，蛋白前体被自身产生的水解酶切割为结构蛋白P1和非结构蛋白P2和P3。结构蛋白 P1主要编码由VP1、VP0、VP3组成的衣壳蛋白，VP0在病毒成熟过程中水解为VP2、VP4，其中VP4位于衣壳蛋白内部，VP1、VP2、 VP3分布在衣壳病毒的表面，组成五聚体。开放阅读框编码区两侧分别是5’和3’非编码区，5’非编码区由740个核苷酸组成，与病毒基因组的复制和翻译功能相关，3’非编码区包含PolyA尾，对于病毒的成功感染是必不可少的。
病毒抗原含量的检测是疫苗生产过程质控的重要手段，但目前仍缺乏统一的CA16抗原检测试剂盒。而CA16单克隆抗体是保证试剂盒特异性和准确性的重要组成部分。
【发明内容】
本发明的目的是针对当前CA16抗原检测系统空白的缺陷，提供一种CA16单克隆抗体，通过该单克隆抗体的应用，建立CA16抗原的体外检测方法及检测试剂盒，该试剂盒应当具有广谱性，能够与 CA16的其他型别的抗原反应，同时具有良好的特异性，不与EV71、CA6、CA10等病毒及其他型别病毒发生交叉反应。
为了实现上述目的，本发明提供一种柯萨奇病毒A16型病毒单克隆抗体16E1，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株16E1产生，该杂交瘤细胞株于2019年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. C2019167，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
本发明还提供上述杂交瘤细胞16E1的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)小鼠免疫
对6-8周龄BALB/c雌鼠使用CA16病毒免疫原进行免疫，每隔 2周加强免疫一次，每次免疫前检测小鼠血清滴度，当小鼠血清滴度达到平台期后停止免疫，准备融合；
(2)融合杂交瘤的制备和筛选
(2.1)小鼠巨噬细胞的制备
将BALB/c小鼠处死，取腹腔细胞液溶解于HAT培养液或HT 培养液中，直至细胞在培养液中的终浓度为2×105个/mL；将细胞加入96孔细胞培养板，置培养箱培养，得到小鼠巨噬细胞；
(2.2)小鼠胸腺细胞的制备
将BALB/c小鼠处死，取出胸腺，将胸腺研磨后通过200目细胞筛，得到胸腺饲养细胞液；
(2.3)小鼠骨髓瘤细胞的制备
取小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0-Ag14(Sp2/0)，用20％FBS RPMI-1640 培养液培养，选处于对数生长期细胞，融合前将骨髓瘤细胞从培养瓶移入离心管，用RPMI-1640培养液洗3次，用RPMI-1640培养液重悬细胞，计数；
(2.4)免疫脾细胞的制备
取待融合的BALB/C小鼠，处死后收集血液制成抗血清作为抗体检测的阳性对照；取小鼠脾脏，过200目细胞筛网后用研磨棒挤压研磨，滴加RPMI-1640培养液静置3-5min，取上2/3部分悬液移入50 mL塑料离心管中；本步骤反复2–3次，然后用RPMI-1640培养液洗细胞3次，再用RPMI-1640培养液重悬细胞并计数，得到免疫脾细胞；
(2.5)使用PEG促融剂融合制备杂交瘤
将1mL的PEG-1500、10mL的RPMI-1640无血清培养基和200 mL完全培养基平衡至37℃；将步骤(2.3)制备的骨髓瘤细胞与步骤 (2.4)制备的脾细胞混合于50mL离心管内，其中脾细胞与骨髓瘤细胞的个数比为10:1，1500rpm离心8min，轻轻弹击管底，使细胞疏松成糊状；吸取0.8mL PEG加入离心管内，加入10mL 37℃的 RPM-1640完全培养液，温和搅拌，最后补加RPMI-1640培养液至 40mL，1000rpm离心5min；弃上清，取HT培养液将细胞吹散，之后加入HT培养液；将所得细胞加入96孔细胞培养板，每孔100μL，放入CO2培养箱中培养12h后，在每个孔中滴加100μL HAT完全培养基；CO2培养箱中培养5天后，用HT完全培养基给孔中的细胞上清换液，换液体积比为50-100％；9-14天后，吸取上清进行检测；
(2.6)杂交瘤的筛选
使用间接ELISA法进行筛选，包被纯化的CA16病毒抗原100ng/ 孔，加入细胞上清50μL检测，挑选出阳性克隆孔；
(2.7)杂交瘤细胞的克隆化
利用克隆培养方法选出杂交瘤细胞，重复克隆2–3次，直到 100％阳性后，得到所述杂交瘤细胞16E1。
本发明还提供上述单克隆抗体16E1在柯萨奇病毒A16型病毒抗原检测中的应用。
经实验确认，本发明的16E1单克隆抗体与肠道病毒的其他型别不存在交叉反应，具备良好的特异性。此外，该单抗可以和CA16的多个亚型的抗原反应，具有广谱性。
由于肠道病毒存在非常明显的型内、型间的交叉反应性，比如 EV71和CA16的基因组的相似性达到了80％，而本单克隆抗体16E1 不与EV71、CA6、CA10等肠道病毒属其他型别病毒存在交叉反应，能很好避免交叉反应性对试剂盒建立的制约，具有优秀的应用意义。
【附图说明】
图1为实施例1的CA16兔多抗血清纯化后SDS-PAGE电泳图，
其中第1泳道：预染蛋白marker；第2泳道：纯化多抗。
图2为实施例6的灵敏度和线性范围结果。
图3为实施例6的准确性结果。
图4为实施例7的适用性研究结果。
【具体实施方式】
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
以下实施例涉及以下材料或设备，这些材料或设备也是本领域技术人员根据现有技术的指导可以直接获得：
以下实施例涉及以下材料或设备：
CA16病毒的来源为：
(1)CA16V-24株由北京科兴生物制品有限公司提供，本领域技术人员可以相同途径获得，毒株标本来源为浙江省杭州市。
(2)CA16/00190/B1b(GenBank No.MF177223)病毒由厦门大学于2011年分离获得，标本来源于台湾一份HFMD阳性的临床样本。
RPMI-1640培养液的组成为：培养基干粉(GIBCO-31800-105)、 L-谷氨酰胺(SIGMA-ALBRICH-G8540)和碳酸氢钠 (SIGMA-ALBRICH-S5761)。
FBS：GIBCO-10099-141
20％FBS RPMI-1640培养液是在RPMI-1640培养液基础上添加按总体积计20％FBS。
HT培养液是在RPMI-1640培养液的基础上添加了次黄嘌呤 (SIGMA-ALBRICH-H9377)和胸腺嘧啶脱氧核苷 (SIGMA-ALBRICH-T9250)。
HAT培养液是HT培养液的基础上添加了氨基喋呤 (SIGMA-ALBRICH-A5159)。
RPMI-1640完全培养液是在RPMI-1640培养液中加入按总体积计10％FBS。
HT完全培养液是在HT培养液中加入按总体积计10％FBS。
HAT完全培养液是在HAT培养液中加入按总体积计10％FBS。
在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为质量百分比，“：”均为重量比。
实施例1：抗CA16单克隆抗体的制备
(1)小鼠免疫
CA16病毒的免疫：对6-8周龄BALB/c雌鼠，使用CA16病毒免疫原进行免疫，每隔2周加强免疫一次，每次免疫前采集200μL 眼框静脉血或20μL尾静脉血以备滴度测定。当小鼠血清滴度达到平台期后，停止免疫，休息两个月后进行融合。
(2)融合杂交瘤的制备和筛选
1、小鼠巨噬细胞的制备：将一只6周龄左右的BALB/c小鼠处死，自来水冲洗后，浸泡于75体积％乙醇溶液中5min；取出小鼠并充分暴露腹部，用无菌镊子提起腹膜，将腹膜中央处剪一小口，用1 mL吸管通过小口向腹腔内注入适量HT培养液，用吸管小心在腹腔内搅动，最后吸出培养液于离心管中。将腹腔细胞液溶解于HAT培养液或HT培养液中，使终浓度为2×105/mL；将细胞加入96孔细胞培养板，置培养箱培养，也可直接与融合细胞混合后添加到96孔细胞培养板中。
2、小鼠胸腺细胞的制备：将一只13天龄左右的BALB/c小鼠引颈处死，自来水冲洗，浸泡于75％乙醇溶液中5min。将小鼠放入超净工作台，暴露胸腔，取出乳白色的胸腺。将胸腺研磨后通过200目细胞筛，得到胸腺饲养细胞液。
3、小鼠骨髓瘤细胞的制备：取小鼠骨髓瘤细胞株 Sp2/0-Ag14(Sp2/0)，这种细胞株易培养、融合率高，是目前最理想的融合细胞，用20％FBS RPMI-1640培养液培养骨髓瘤细胞。当细胞数在104-106/mL时，细胞呈对数生长，此时细胞浑圆透亮、大小均一、边缘清晰、排列整齐、呈半致密分布。一般在细胞处于对数生长中期时(约1×105-5×105/mL)，可按1:5–1:10的比例进行稀释传代。选处于生长旺盛、形态良好的对数生长期细胞供融合用，融合骨髓瘤细胞的活细胞数应达95％以上。融合前将骨髓瘤细胞从培养瓶移入离心管，用RPMI-1640培养液洗3次(1000rpm，5min)，然后用 RPMI-1640培养液重悬细胞，计数。一般从融合前5天开始复苏小鼠骨髓瘤细胞，每次融合约需6瓶35cm2 Sp2/0细胞。
4、免疫脾细胞的制备：取待融合的BALB/C小鼠，致死后收集血液制成抗血清，可作为抗体检测的阳性对照。自来水冲洗小鼠并浸泡于75％乙醇溶液中5min；取出脾脏，用剪刀将其剪成小块放于200 目细胞筛网上，再用研磨棒(注射器内芯)挤压研磨。用吹管滴加RPMI-1640培养液。补加适量的RPMI-1640培养液，静置3-5min，取上2/3部分悬液移入50mL塑料离心管中。上述过程反复2–3次。用RPMI-1640培养液洗细胞3次(1000rpm离心10min)，然后用 RPMI-1640培养液重悬细胞并计数。
5、使用PEG促融剂融合制备杂交瘤：融合前先将1mL的 PEG-1500、10mL的RPMI-1640培养液和200mL完全培养基平衡至 37℃。将制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于50mL离心管内(1×108脾细胞和1×107骨髓瘤细胞，约10:1)，1500rpm离心8min，轻轻弹击管底，使细胞疏松成糊状。吸取0.8mL PEG加入离心管内，在 60s内加完，边加边轻轻搅拌。随即加入10mL预温至37℃的 RPM-1640完全培养液，温和搅拌。最后补加RPMI-1640培养液至 40mL，1000rpm离心5min。弃上清，取少量HT培养液将细胞吹散，之后将准备好的HT培养液加入。将细胞加入96孔细胞培养板，每孔100μL，放入CO2培养箱中培养。12h后，配置HAT完全培养基，每个孔中滴加100μL。5天后，用HT完全培养基给孔中的细胞上清进行50-100％的换液。9-14天后，吸取上清进行检测。
6、杂交瘤的筛选：依据现有技术使用间接ELISA筛选，包被纯化的CA16病毒抗原100ng/孔，加入细胞上清50μL检测，并挑选出阳性克隆孔。
7、杂交瘤细胞的克隆化：在筛选出的含阳性上清的培养孔中通常是二个以上的杂交瘤集落。其中有的集落可能不分泌抗体或分泌非实验所要的抗体。因此，须利用克隆培养方法把它们分开，选出所需的杂交瘤细胞。最常用的克隆培养方法是有限稀释法。先把细胞按一定浓度进行梯度稀释，然后接种到96孔细胞培养板中，尽可能使孔内只有一个细胞生长。将杂交瘤单克隆阳性细胞株重复克隆2–3次，直到100％阳性后认为得到稳定克隆株。
(3)单抗腹水的诱导
1、取BALB/c小鼠2-3只，腹腔注入0.5mL液体石蜡油。
2、1周后，处理对数生长期的杂交瘤细胞，1000rpm离心5min，弃上清液。用无血清培养液悬浮杂交瘤细胞，并将细胞数调至(1-2) ×106/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。
3、7-10天，小鼠腹部明显膨大后，引颈处死小鼠。将小鼠用自来水冲洗，浸泡于75％乙醇中5min。使小鼠腹部朝上，用注射针头将小鼠四肢固定于解剖台板。用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，然后从两边向小鼠背部方向剪开，用大镊子撕开皮肤，充分暴露腹部。用无菌眼科镊子提起腹膜，在腹膜中央处剪一小口，然后用1mL吸管通过小口吸出腹腔内全部腹水。将所有腹水混合放入离心管中， 3000rpm离心20min，之后收集上清。
(4)单抗腹水的纯化:将腹水用辛酸-饱和硫酸铵沉淀和ProteinA 亲和层析纯化(购自美国GE公司)，获得纯化的单克隆抗体。.
实施例2 16E1单抗的相关性质
将CA16全病毒灭活抗原包被至酶标板上(浓度为1μg每孔)，然后加入16E1(使用浓度为1μg每孔)，加入HRP标记羊抗鼠IgG，显色后检测450/630nm的OD值。实验结果显示16E1能与四家企业的CA16原液发生较强的反应，优于现有的其他单抗在相同实验下的效果。结果见表1(OD值大于1.6以上认为达到了反应的平台期，表明单抗的反应性较好)。
此外，还检测了16E1单抗对CA16原型株G10和流行株190、731 的中和能力。检测方法如下：将单抗的使用浓度稀释至10mg/ml并稀释100倍，进行2倍梯度稀释(1：100～1：12800)，分别将CA16毒株(100CCID50/50μl)与上述稀释后的单抗1：1混合孵育2h后加入 RD细胞中，35℃培养7d后观察CPE，并计算单抗的中和效价。结果见表2，本单抗能中和CA16流行株190和731。
表1 ELISA方法检测16E1单抗与不同疫苗原液反应OD值
表2 16E1单抗中和CV-A16毒株的能力
Figure BDA0002253413170000082
实施例3：CA16 HRP标记兔多克隆抗体的制备
将Vero细胞复苏后于36.5±0.5℃培养。细胞浓度达到0.1～10×106 /ml时，取CA16病毒(CA16V-24)按MOI 0.05～0.1感染Vero细胞，置 35.5±0.5℃培养2～4天，收获细胞上清，即为CA16收获液。CA16收获液澄清后用超滤膜浓缩5倍以上。然后进行分子筛层析和离子交换层析，检测波长为280nm，分别收集洗脱液和流穿液，即得纯化液，甲醛灭活后即得CA16疫苗原液。CA16纯化液经HPLC检测纯度在90％以上。检测抗原含量为13220U/ml，总蛋白质含量为6μg/ml。将此批原液作为免疫原。
免疫动物为新西兰大白兔2只，在背部皮下多点免疫，按照0， 2，3，4，5周免疫流程免疫5针。第1针剂量为6ml/只(免疫原与完全弗氏佐剂1：1混合)，第2-5针为2ml/只(免疫原与不完全弗氏佐剂1：1混合)。第5针后1周采血，3000rpm离心15min，分离血清，分别获得编号为24-1和24-2的血清数量分别为50ml。
按照CA16中和抗体滴度测定方法检测CA16兔多抗血清针对 CA16病毒种子的中和抗体滴度，结果见表3。
表3 兔抗CA16多抗血清中和抗体滴度
Figure BDA0002253413170000091
由表3可见，2份CA16兔多抗血清中和抗体滴度分别为1:6144 和1:384，24-1的中和抗体滴度远高于24-2的中和抗体滴度，故对 24-1批CA16兔多抗血清进行间接法抗体效价检测，检测结果见表4。
表4 CA16兔多抗血清间接酶联免疫法效价吸光度(450/630nm)结果
Figure BDA0002253413170000092
由表4结果可见，24-1批CA16兔多抗血清对于CA16间接法效价为106。
综合两份CA16兔多抗血清对CA16病毒的间接法效价和中和抗体滴度，选择编号为24-1的CA16兔多抗血清建立后续检测方法。
采用葡萄球菌蛋白A(SPA)方法对24-1号兔多抗进行纯化，并对纯化后的抗体进行SDS-PAGE鉴定，IgG的重链和轻链所占含量应不低于80％。电泳结果显示(见图1)，第1泳道：预染蛋白marker；第2泳道：纯化多抗。纯化后兔抗CA16多抗在约48KD与24KD左右有两条主蛋白条带，分别为IgG的重链与轻链。经凝胶成像仪扫描分析纯化抗体的纯度为：96.5％，纯度≥80％。将纯化得到24-1号多抗采用过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶，标记后加等体积甘油分装，-20℃保存。
实施例4：抗原检测体系的确定
比较了三种常用的ELISA检测体系，分别为：
体系1：兔多抗+抗原+16E1(鼠源)+羊抗兔HRP
体系2：16E1(鼠源)+抗原+兔多抗+羊抗兔HRP
体系3：16E1(鼠源)+抗原+兔多抗HRP。
分别采取棋盘法摸索合适的使用浓度，抗原为按照实施例1生产的CA16疫苗原液。
在满足本底要求的情况下，体系1的灵敏度只能达到125ng/ml，不能满足检测需求；体系2的灵敏度最高，能达到1ng/ml；体系3 的灵敏度能达到12.5ng/ml。由于体系3的检测步骤较少，能缩短检测时间，故选择体系3建立检测方法。
实施例5：配置CA16病毒抗原ELISA检测试剂盒
(1)样本稀释液
小牛血清 100ml
0.01M PBS 900ml
Proclin 300 0.5ml
(2)浓缩洗液(20×)
Figure BDA0002253413170000101
Figure BDA0002253413170000111
(3)水解酪蛋白
酪蛋白 100g
Proclin 300 1ml
加纯化水至 1000ml
(4)酶稀释液
Figure BDA0002253413170000112
(5)终止液
浓硫酸 112ml
纯化水 888ml
(6)显色液A
(7)显色液B
Figure BDA0002253413170000114
(8)HRP标记的兔抗CA16多抗
分装实施例1中制备的HRP标记的CA16兔多抗5μL。
(9)酶标板的包被；将前述制备的纯化的抗CA16的单克隆抗体16E1作为包被抗体，以最佳包被浓度3.7μg/ml(用0.05M pH9.6 的碳酸盐缓冲液稀释)，每孔100μl加于96孔聚苯乙烯酶标板(coastar) 孔内，并于4℃下放置14-20h，弃去包被液，用洗液(0.01M PBS，0.05％Tween20)，拍干；加入封闭液(10％兰州民海小牛血清，0.01M PBS)200μl/孔，于37℃孵箱封闭1h，弃去封闭液，拍干，室温条件下自然干燥4h，真空封装，得到抗CA16单克隆抗体包被板。
除上述的HRP标记CA16多抗需在-20℃保存外，其余试剂盒内物品均为2-8℃保存。
实施例6：检测试剂盒的说明书
本检测方法操作的SOP如下：
1.用样本稀释液将2000U/ml的CA16国家抗原标准品稀释至 200、100、50、25、12.5U/ml，将待检测样品稀释至适当系列浓度(2 倍稀释)；
2.每孔加入100μl系列浓度的抗原标准品、阴性对照(样本稀释液)、系列浓度的待测样本，均做双复孔，37℃孵育1h；
3.用1：20倍稀释后的洗液洗板5次，拍干；
4.将酶标多抗进行1：4000倍稀释，每孔加100μl，37℃孵育1h；
5.按步骤3方法进行洗板；
6.每孔加入显色液A、显色液B各50μl，37℃孵育10min；
7.加入终止液(2M H2SO4)，50μl/孔，在酶标仪上读取450/630nm 的OD值。
按照以下方法计算抗原含量：
(1)将CA16国家抗原参考品系列浓度的抗原含量对双复孔OD 值均值采用Excel进行散点作图，添加趋势线，选择“显示公式”和“显示R2值”，要求R2值≥0.98试验结果方才有效；
(2)按照Statistical Analysis软件双平行线法规定的格式建立Excel文件，用Statistical Analysis软件的Parallel Line Assay，再 Response下面选择Log(y)，然后选择要统计的Excel文件，结果显示为Parallel和Lineality两项均符合要求(即右上角不出现“﹡﹡”)时，方可统计结果。样本的CA16抗原含量＝CA16国家抗原标准品的浓度×Relative Potency。
上述操作程序和/或抗原含量的计算方法可作为本发明试剂盒的说明书而成为试剂盒的一部分。
实施例7：验证上述试剂盒的线性范围、线性、特异性、灵敏度、准确性、精密度和重复性
(1)特异性试验：
将EV71病毒、甲肝病毒(HAV)、脊髓灰质炎病毒(IPV)抗原稀释至1000ng/ml和100ng/ml，CA16国家抗原标准品稀释至200ng/ml和 50ng/ml，连同原倍浓度MEM培养基、DMEM培养基、10％小牛血清(FBS)，按照实施例5的方法进行试验，结果见表5。
表5 特异性试验结果
Figure BDA0002253413170000131
以上结果表明本检测体系只特异性检测CA16，而不与其他肠道病毒等反应。
(2)灵敏度和线性范围测试
将CA16国家抗原标准品稀释至200U/ml，然后以2倍梯度稀释至100、50、25、12.5U/ml，按照实施例5的方法进行实验，最终得到的线性结果如图2所示。
本发明的试剂盒灵敏度为12.5U/ml，线性范围为12.5-200U/ml，实验结果表明本发明的试剂盒具有良好的灵敏度和线性范围。
(3)准确性：
将国家标准品2ug/ml稀释至浓度为150U/ml，50U/ml，20U/ml 作为高中低浓度的待测样本，单人按照实施例5重复实验6次，计算高中低三个浓度的回收率，结果如图3所示。
其中，回收率的计算方法是实测值/理论值×100％。
图3结果表明，高中低三个浓度的回收率在80-110％之间，处于可接受范围。
(4)中间精密度：
不同的操作员在不同时间，选择150U/ml，50U/ml，20U/ml的国家抗原标准品作为待测样本，按照实施例5板间各重复试验3次，计算双人CV值，结果见表6.
表6 中间精密度结果
Figure BDA0002253413170000141
其中，CV％的计算方法是标准差/平均值×100％。
以上结果表明，双人重复试验中变异系数<15％，具有较好的中间精密度。
(5)重复性：
选择150U/ml，50U/ml，20U/ml的国家抗原标准品作为待测样本，按照实施例5单人重复实验6次，计算CV值，结果见表7.
表7 重复性结果
CV的计算方法同上。
以上结果表明，CV值在控制在10％以内，具有良好的重复性。
(6)耐用性：
单人检测，高中低浓度选择150U/ml，50U/ml，20U/ml，分别对孵育时间和孵育温度做出改变，结果见表8、表9。
表8 孵育时间的影响
Figure BDA0002253413170000161
表9 孵育温度的影响
Figure BDA0002253413170000162
以上结果表明在浓度范围20-150U/ml、孵育温度37-39℃范围内，回收率均在80％-120％之间，表明本发明的试剂盒的耐用性满足要求。
实施例7：评价该试剂盒的适用性。
将试剂盒分发给国内7家CA16疫苗生产企业，分别按照SOP 检测本企业的CA16疫苗原液。7家企业所用毒株包括B1a、B1b和 B2b三个亚型。按照实施例5判断原则评价各家原液的适用性。各家双平行线法检测结果如图4。结果表明本试剂盒能够用于国内7家企业CA16原液抗原含量的定量检测。
综上所述，本发明的16E1单克隆抗体具备良好的特异性，不与肠道病毒的其他型别发生交叉反应，对不同来源的CA16病毒具有良好的广谱性，具有优秀的应用意义。

Claims (3)

1.柯萨奇病毒A组16型单克隆抗体16E1，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株16E1产生，该杂交瘤细胞株于2019年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.C2019167，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株16E1的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)小鼠免疫
对6-8周龄BALB/c雌鼠使用CA16病毒免疫原进行免疫，每隔2周加强免疫一次，每次免疫前检测小鼠血清滴度，当小鼠血清滴度达到平台期后停止免疫，准备融合；
(2)融合杂交瘤的制备和筛选
(2.1)小鼠巨噬细胞的制备
将BALB/c小鼠处死，取腹腔细胞液溶解于HAT培养液或HT培养液中，直至细胞在培养液中的终浓度为2×105个/mL；将细胞加入96孔细胞培养板，置培养箱培养，得到小鼠巨噬细胞；
(2.2)小鼠胸腺细胞的制备
将BALB/c小鼠处死，取出胸腺，将胸腺研磨后通过200目细胞筛，得到胸腺饲养细胞液；
(2.3)小鼠骨髓瘤细胞的制备
取小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0-Ag14(Sp2/0)，用20％FBS RPMI-1640培养液培养，选处于对数生长期细胞，融合前将骨髓瘤细胞从培养瓶移入离心管，用RPMI-1640培养液洗3次，用RPMI-1640培养液重悬细胞，计数；
(2.4)免疫脾细胞的制备
取待融合的BALB/C小鼠，处死后收集血液制成抗血清作为抗体检测的阳性对照；取小鼠脾脏，过200目细胞筛网后用研磨棒挤压研磨，滴加RPMI-1640培养液静置3-5min，取上2/3部分悬液移入50 mL塑料离心管中；本步骤反复2–3次，然后用RPMI-1640培养液洗细胞3次，再用RPMI-1640培养液重悬细胞并计数，得到免疫脾细胞；
(2.5)使用PEG促融剂融合制备杂交瘤
将1mL的PEG-1500、10mL的RPMI-1640无血清培养基和200mL完全培养基平衡至37℃；将步骤(2.3)制备的骨髓瘤细胞与步骤(2.4)制备的脾细胞混合于50mL离心管内，其中脾细胞与骨髓瘤细胞的个数比为10:1，1500rpm离心8min，轻轻弹击管底，使细胞疏松成糊状；吸取0.8mL PEG加入离心管内，加入10mL 37℃的RPM-1640完全培养液，温和搅拌，最后补加RPMI-1640培养液至40mL，1000rpm离心5min；弃上清，取HT培养液将细胞吹散，之后加入HT培养液；将所得细胞加入96孔细胞培养板，每孔100μL，放入CO2培养箱中培养12h后，在每个孔中滴加100μL HAT完全培养基；CO2培养箱中培养5天后，用HT完全培养基给孔中的细胞上清换液，换液体积比为50-100％；9-14天后，吸取上清进行检测；
(2.6)杂交瘤的筛选
使用间接ELISA法进行筛选，包被纯化的CA16病毒抗原100ng/孔，加入细胞上清50μL检测，挑选出阳性克隆孔；
(2.7)杂交瘤细胞的克隆化
利用克隆培养方法选出杂交瘤细胞，重复克隆2–3次，直到100％阳性后，得到杂交瘤细胞16E1。
3.权利要求1所述的单克隆抗体16E1在柯萨奇病毒A16型病毒抗原检测中的应用。
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