JP2013190390A - ホモシステイン測定用前処理試薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 還元剤および抗酸化剤を含む緩衝液からなる、試料中に含まれる酸化型ホモシステインを遊離型ホモシステインに変換するための試薬により、前記課題を解決する。
【選択図】 図1
Description
(1)試料(例えば血液)中に含まれるタンパク質またはアミノ酸と結合状態にある酸化型ホモシステインを還元剤で処理することで、遊離型ホモシステインに変換し、
(2)遊離型ホモシステインを、アデノシンの共存下、ホモシステインをアデノシル化する酵素で処理することで、S−アデノシルホモシステインに変換し、
(3)S−アデノシルホモシステインを認識する抗体(抗S−アデノシルホモシステイン抗体)を用いて、いわゆる競合法によりS−アデノシルホモシステインを測定する、
方法が知られている(非特許文献3)。
(1)試料(例えば血液)中に含まれるタンパク質またはアミノ酸と結合状態にある酸化型ホモシステインを還元剤で処理することで、遊離型ホモシステインに変換し、
(2)遊離型ホモシステインを、アデノシンの共存下、ホモシステインをアデノシル化する酵素で処理することで、S−アデノシルホモシステインに変換する、
前処理が必要となる。本発明の試薬は少なくとも前記(1)の前処理を行なうための試薬であるが、本発明の試薬を前記(1)および(2)の前処理を同時に行なえる試薬とすると、試薬構成を簡素化できる点で好ましい。前記(1)および(2)の前処理を同時に行なえる試薬とするには、還元剤および抗酸化剤の他に、基質であるアデノシンおよびホモシステインをアデノシル化するための酵素をさらに含んでいればよい。ホモシステインをアデノシル化するための酵素としてはS−アデノシルホモシステイン加水分解酵素が例示できる。またホモシステインをアデノシル化するための酵素として、コラーゲンペプチドなど前記酵素を含むタンパク質を用いてもよい。アデノシンの量は逆反応が生じない範囲で適宜決定すればよいが、通常は0.04mol/Lから0.2mol/Lの範囲である。
(1)下記に示す8種類の溶液(溶液Aから溶液H)を調製し、それぞれガラス製バイアルに分注した。
4mmol/Lのトリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を含む20
mmol/Lのクエン酸緩衝液(pH6.0)+0.08mmol/Lのアデノシ
ン
溶液B:溶液Aに0.5mmol/Lのガラクトースを添加した溶液
溶液C:溶液Aに0.5mmol/Lのグルコースを添加した溶液
溶液D:溶液Aに0.5mmol/Lのキシロースを添加した溶液
溶液E:溶液Aに0.5mmol/Lのマルトースを添加した溶液
溶液F:溶液Aに0.5mmol/Lのシステインを添加した溶液
溶液G:溶液Aに0.5mmol/Lのシステイン酸を添加した溶液
溶液H:溶液Aに0.5mmol/Lのグルタチオンを添加した溶液
(2)各溶液に対し、35℃で13日間放置する、促進劣化試験を実施した。
(3)促進劣化試験後の還元剤溶液中に残存するTCEP量は、5,5’−Dithiobis(2−nitrobenzoic acid)(DTNB)溶液に前記還元剤溶液を添加し、前記還元剤溶液中に残存するTCEPによってDTNBが還元されて生成される5−Mercapto−2−nitrobenzoic acidの、412nmでの吸光度を測定することで定量した。あらかじめ濃度既知のTCEP溶液(3種類)を添加したDTNB溶液の吸光度測定結果から検量線を作成し、それに基づきTCEPの残存量を算出した。
(1)下記に示す6種類の溶液(溶液A、溶液B、溶液IからL)を調製し、それぞれガラス製バイアルに分注した。
溶液B:実施例1(1)で調製した溶液B
溶液I:
4mmol/LのTCEPを含む20mmol/LのMES(2−(N−モルホリ
ノ)エタンスルホン酸)緩衝液(pH6.0)+0.8mmol/Lのアデノシン
溶液J:溶液Iに0.5mmol/Lのガラクトースを添加した溶液
溶液K:
4mmol/LのTCEPを含む20mmol/Lのビス−トリス緩衝液(pH
6.5)+0.08mmol/Lのアデノシン
溶液L:溶液Kに0.5mmol/Lのガラクトースを添加した溶液
(2)各溶液に対し、35℃で13日間放置する、促進劣化試験を実施した。
(3)実施例1(3)と同様な方法で残存TCEP量を算出した。
血液試料中に含まれる酸化型ホモシステインを遊離型ホモシステインに変換した上でS−アデノシルホモシステインに変換し、得られたS−アデノシルホモシステインを市販の全自動エンザイムイムノアッセイ装置(商品名:AIA−2000、東ソー製)を用いた1ステップ競合法により測定することで、血液試料中に含まれるホモシステイン量を測定した。詳細を以下に示す。
(1)以下に示す前処理試薬および免疫測定試薬を調製した。
(前処理試薬)
酵素試薬(8kU/LのS−アデノシルホモシステイン加水分解酵素、50
mg/mLのブタ皮由来コラーゲンペプチドおよび50mg/mLのトレハロースを
含む20mmol/Lのクエン酸緩衝液(pH6.0)の凍結乾燥品)を実施例1
(1)で調製した溶液Aまたは溶液Bで溶解し、得られた試薬
(免疫測定試薬)
S−アデノシル−L−ホモシステインとBSAとの結合物を固定化した直径約2mm
の球状の固相、およびマウス由来抗S−アデノシル−L−ホモシステイン抗体と標識
物質であるアルカリ性ホスファターゼ(ALP)との結合物を含む試薬をプラスチッ
ク製のカップに分注し、凍結乾燥した試薬
(2)血液試料を(1)で作製した前処理試薬に添加し、37℃で10分間撹拌することで前処理を行なった。
(3)前処理後の溶液を(1)で作製した免疫測定試薬に添加し、37℃にて10分間撹拌した。
(4)AIA−2000のB/F(Bound/Free)分離機構によりB/F分離操作を実施し、固相成分としてカップ中に残った成分に含まれる標識物質(ALP)の量を測定することで血液試料中に含まれるホモシステイン量を測定した。なおALPの測定は、その基質である4−メチルウンベリフリルリン酸(4MUP)を加え、ALPによって4MUPが分解されて生成する4−メチルウンベリフェロン(4MU)の増加速度(nmol/L/秒)を4MUからの蛍光強度を測定して算出した。
(5)別途、血液試料中に含まれるホモシステイン量を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法を用いて測定し、(4)で測定したホモシステイン量と比較した。
Claims (6)
- 還元剤および抗酸化剤を含む緩衝液からなる、試料中に含まれる酸化型ホモシステインを遊離型ホモシステインに変換するための試薬。
- 還元剤、抗酸化剤、アデノシンおよびホモシステインをアデノシル化する酵素を含む緩衝液からなる、試料中に含まれる酸化型ホモシステインを遊離型ホモシステインに変換し、さらに前記遊離型ホモシステインをS−アデノシルホモシステインに変換するための試薬。
- 抗酸化剤が還元糖である、請求項1または2に記載の試薬。
- 還元糖がガラクトースである、請求項3に記載の試薬。
- 緩衝液がクエン酸緩衝液である、請求項1から4のいずれかに記載の試薬。
- 請求項1から5のいずれかに記載の試薬とS−アデノシルホモシステインを認識する抗体とを含む、試料中に含まれるホモシステインを測定するための試薬。
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