CN107991252A - 一种用于α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的稳定剂及其制备方法 - Google Patents

一种用于α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的稳定剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于α‑羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的稳定剂及其制备方法，属于体外诊断领域。所述稳定剂包括下列质量百分比的组分：0.1～0.5％乙二胺四乙酸二钠、1～3％蔗糖、1～2％Triton X‑100、3～5％CCD、1～2％甘油，0.1～0.2％液体生物防腐剂Proclin300，余量水。本发明的稳定剂用于α‑羟丁酸脱氢酶测定试剂盒中，确保了试剂盒检测结果的准确性，并且使α‑羟丁酸脱氢酶试剂盒更为稳定，可有效延长试剂盒的保存时间。此外，该稳定剂成本低廉，配制简单，值得进一步广泛推广。

Description

一种用于α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的稳定剂及其制备方法
技术领域
本发明属于体外诊断领域，具体涉及一种用于α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的稳定剂及其制备方法。
背景技术
α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)是心肌酶谱中的一种酶，在哺乳动物体内普遍存在，主要分布在心肌红细胞、白细胞及肾脏等组织或器官中。α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)不是一个独立的特异酶，而是含有H亚基的乳酸脱氢酶同工酶LDH1和LDH2的总称。测定α-羟丁酸脱氢酶，其实际反映的是乳酸脱氢酶同工酶LDH1和LDH2的活性，对诊断心肌疾病和肝病有重要意义。α-HBDH活性升高常见于急性心肌梗塞、骨骼肌损伤、急性肝炎、白血病及恶性肿瘤等。
目前用于α-羟丁酸脱氢酶的检测方法主要有酶学比色法、连续监测法等。目前关于稳定的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的报道有限，仅有专利CN201610273293.X、CN201410404609.5和CN201610129718.X对该试剂盒进行报道。目前市面上的试剂盒存在稳定性不好，准确度不高的问题。因此，研究一种配制简单、成本低廉、针对α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒有稳定效果的稳定剂，制备得到稳定的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒，具有相当的市场价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的稳定剂及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种测定α-羟丁酸脱氢酶的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的稳定剂，所述稳定剂包括下列质量百分比的组分：0.1～0.5％乙二胺四乙酸二钠、1～3％蔗糖、1～2％Triton X-100、3～5％CCD、1～2％甘油，0.1～0.2％液体生物防腐剂Proclin300，余量水。
优选的，所述稳定剂包括下列质量百分比的组分：0.2～0.4％乙二胺四乙酸二钠、1～2％蔗糖、1～1.5％Triton X-100、3～4％CCD、1～1.5％甘油，0.2％液体生物防腐剂Proclin300，余量水。
优选的，所述稳定剂包括下列质量百分比的组分：0.2％乙二胺四乙酸二钠、1％蔗糖、1％Triton X-100、3％CCD、1％甘油，0.2％液体生物防腐剂Proclin300，余量水。
优选的，所述α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括：Trisbase 12.00g/L、盐酸81.00g/L、α-酮丁酸0.85g/L和余量水；第二试剂包括：Trisbase 3.60g/L、盐酸0.650g/L、β-NADH 1.00g/L和余量水。
优选的，稳定剂在α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的试剂中的使用量为1％v/v-3％v/v。
由于α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的原理是α-酮丁酸在α-羟丁酸脱氢酶的作用下和β-NADH反应，分解生成α-羟基丁酸和NAD+，在340nm处NADH吸光度的下降速率与HBDH活性成正比。但是由于试剂盒中包含的NADH本身性质不稳定，极易被氧化不利于保存，导致α-羟丁酸脱氢酶试剂盒缺乏稳定性，保存时间短，直接影响到临床使用。
所以本发明中将乙二胺四乙酸二钠、蔗糖、Triton X-100、CCD、％甘油和液体生物防腐剂Proclin300进行复配得到稳定剂。其中，乙二胺四乙酸二钠和CCD可以稳定NADH的空间结构，Triton X-100和甘油可以形成保护膜，使其隔绝空气，避免被氧化。此外，随着保存时间的延长，稳定剂中的CCD、糖类等有机物易受到空气、水中微生物的腐蚀，因此加入一定的防腐剂。
一种α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒用稳定剂的制备方法，按照上述任一项所述称取各组分，在溶解容器中依次加入乙二胺四乙酸二钠、甘油、CCD和蔗糖，加适量水搅拌使其完全溶解；再加入Triton X-100充分乳化；乳化完全后加入液体生物防腐剂Proclin300和足量的水，搅拌使其完全溶解后，过滤，分装，制备得到稳定剂。
一种α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒，所述试剂盒中包括上述任一项所述的稳定剂。
一种测定α-羟丁酸脱氢酶的方法，将上述任一项所述的稳定剂加入到α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的试剂中，进行α-羟丁酸脱氢酶的测定。
本发明的有益效果是：
本发明的稳定剂用于α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒中，确保了试剂盒检测结果的准确性，并且使α-羟丁酸脱氢酶试剂盒更为稳定，可有效延长试剂盒的保存时间。此外，该稳定剂成本低廉，配制简单，值得进一步广泛推广。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明以下实施例中涉及的仪器有：日立全自动生化仪1台(日立7020)，也可以采用其它品牌的相关仪器。
实施例1
一种用于α-羟丁酸脱氢酶试剂盒的稳定剂，包括下列组分：2.00g/L乙二胺四乙酸二钠、10.00g/L蔗糖、10.00g/L Triton X-100、30.00g/LCCD、10.00g/L甘油和2.00g/L液体生物防腐剂Proclin300，余量为水。
按照上述任一项所述称取各组分，在溶解容器中依次加入乙二胺四乙酸二钠、甘油、CCD和蔗糖，加适量水搅拌使其完全溶解；再加入Triton X-100充分乳化；乳化完全后加入液体生物防腐剂Proclin300和足量的水，搅拌使其完全溶解后，过滤，分装，制备得到一种用于α-羟丁酸脱氢酶试剂盒的稳定剂。
将实施例1应用于α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒，并从长期稳定性有效期和使用量两方面进行评价。
(一)稳定性、准确性、精密度
1、试验用稳定剂：配制实施例1所述稳定剂。
2、试验用α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒，由试剂1和试剂2组成。
试剂1：Trisbase 12.00g/L、盐酸81.00g/L、α-酮丁酸0.85g/L；
试剂2：Trisbase 3.60g/L、盐酸0.65g/L、β-NADH 1.00g/L。
3、试验方法及结果：
按实施例1配制稳定剂，按2％(v/v)的量加入α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒中(试剂1和试剂2均按此量添加)，与不添加复合稳定剂的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒分别测定样本中α-羟丁酸脱氢酶(HBDH)含量。
以英国朗道血清质控水平2(质控2)和血清质控水平3(质控3)为样本，标准品为英国朗道常规校准品，采用日立7020型全自动生化分析仪进行检测，设一个空白测试、两个样本测试(空白测试以生理盐水代替样本)。样本与试剂1和试剂2的比例为：250μL和50μL，设定的主波长为340nm、副波长为405nm，样本与试剂1混匀后，37℃孵育5min，读取各管吸光度A1，加入试剂2混匀后反应5min，读取吸光度A2，每管的吸光度变化Δ，A＝A2-A1，扣除试剂空白后计算出样本、标准品的吸光度变化值Δ，然后计算出样本中α-羟丁酸脱氢酶的含量。质控2中HBDH靶值为239U/L，质控3中HBDH的靶值为450U/L，允许偏差范围在±10％。
根据以上测定方法，以同批次同瓶装的质控2、质控3作为检测样本，分别用添加2％(v/v)稳定剂的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒和不添加稳定剂的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒进行检测，每7天检测一次，检测周期64天，计算得到测定质控结果的相对偏差(CV)、标准偏差(SD)、相对标准偏差(CV)和有效期天数，其中相对偏差、相对标准偏差这两项可反映测定结果的稳定性。
检测结果见表1。
表1检测结果
由表1结果可知，未加入稳定剂的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒与加入2％稳定剂的试剂盒相比，其检测结果相对偏差、相对标准偏差分别明显偏高。说明没有加入稳定剂的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒很不稳定，有效期天数只能维持15天左右。加入2％稳定剂的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒在整个测试周期中，准确度均在允许偏差范围内，精密度CV小于4％，说明该测定试剂盒在64天内能保持良好的稳定性、准确性、精密度。由此可见，添加了2％稳定剂的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒在测试稳定性、准确度、精密度方面表现更为优异，稳定剂对其有明显的稳定效果，可有效延长α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的保存期限。
(二)使用量比对试验
1、试验用稳定剂：配制实施例1所述稳定剂。
2、试验用α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒，由试剂1和试剂2组成。
试剂1：Trisbase 12.00g/L、盐酸81.00g/L、α-酮丁酸0.85g/L；
试剂2：Trisbase 3.60g/L、盐酸0.65g/L、β-NADH 1.00g/L。
3、试验方法及结果：
将稳定剂按照1％(v/v)、2％(v/v)、3％(v/v)的比例分别加入α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒中(试剂1和试剂2均按同样量添加)，进行样本中α-羟丁酸脱氢酶的测定。按本发明稳定性试验的测定方法测定，计算得到测定质控结果的相对偏差(CV)、标准偏差(SD)、相对标准偏差(CV)和有效期天数，其中，相对偏差、相对标准偏差这两项可反映测定结果的稳定性。结果见表2。
表2检测结果
表2结果显示：稳定剂的三种不同加入量对α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的稳定作用均有所增强，从而不同程度地延长试剂盒的保存期限和提高试剂盒的测试稳定性、准确度、精密度。加入1％稳定剂的试剂盒作用最弱，有效期天数约22天；加入3％稳定剂的试剂盒相对偏差、相对标准偏差较加入2％稳定剂的试剂盒低，说明3％稳定剂的加入量不是最优选；加入2％稳定剂的试剂盒的相对偏差、相对标准偏差最小，说明加入2％稳定剂的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒测试稳定性、准确性、精密度最好，在试剂盒开瓶后64天左右还能保持良好的测试性能。因此，2％可定为稳定剂在α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒中的最佳使用量。
从以上数据和分析结果可以得到，α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒加入本发明所述稳定剂后，能延长试剂盒的保存时间，有效提高测试稳定性、准确性、精密度，且最适加入体积比大约为2％。该α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的稳定剂成本低廉，配制简单，值得进一步推广使用。
实施例2
一种用于α-羟丁酸脱氢酶试剂盒的稳定剂，包括下列组分：2.50g/L乙二胺四乙酸二钠、15.00g/L蔗糖、12.00g/L Triton X-100、40.00g/LCCD、12.00g/L甘油和2.00g/L液体生物防腐剂Proclin300，余量为水。
按照上述任一项所述称取各组分，在溶解容器中依次加入乙二胺四乙酸二钠、甘油、CCD和蔗糖，加适量水搅拌使其完全溶解；再加入Triton X-100充分乳化；乳化完全后加入液体生物防腐剂Proclin300和足量的水，搅拌使其完全溶解后，过滤，分装，制备得到一种用于α-羟丁酸脱氢酶试剂盒的稳定剂。
实施例3
一种用于α-羟丁酸脱氢酶试剂盒的稳定剂，包括下列组分：3.00g/L乙二胺四乙酸二钠、20.00g/L蔗糖、10.00g/L Triton X-100、35.00g/LCCD、10.00g/L甘油和2.00g/L液体生物防腐剂Proclin300，余量为水。
按照上述任一项所述称取各组分，在溶解容器中依次加入乙二胺四乙酸二钠、甘油、CCD和蔗糖，加适量水搅拌使其完全溶解；再加入Triton X-100充分乳化；乳化完全后加入液体生物防腐剂Proclin300和足量的水，搅拌使其完全溶解后，过滤，分装，制备得到一种用于α-羟丁酸脱氢酶试剂盒的稳定剂。
实施例4
一种用于α-羟丁酸脱氢酶试剂盒的稳定剂，包括下列组分：3.50g/L乙二胺四乙酸二钠、20.00g/L蔗糖、15.00g/L Triton X-100、35.00g/LCCD、12.00g/L甘油和2.00g/L液体生物防腐剂Proclin300，余量为水。
按照上述任一项所述称取各组分，在溶解容器中依次加入乙二胺四乙酸二钠、甘油、CCD和蔗糖，加适量水搅拌使其完全溶解；再加入Triton X-100充分乳化；乳化完全后加入液体生物防腐剂Proclin300和足量的水，搅拌使其完全溶解后，过滤，分装，制备得到一种用于α-羟丁酸脱氢酶试剂盒的稳定剂。
实施例5
一种用于α-羟丁酸脱氢酶试剂盒的稳定剂，包括下列组分：3.00g/L乙二胺四乙酸二钠、18.00g/L蔗糖、12.00g/L Triton X-100、35.00g/LCCD、10.00g/L甘油和2.00g/L液体生物防腐剂Proclin300，余量为水。
按照上述任一项所述称取各组分，在溶解容器中依次加入乙二胺四乙酸二钠、甘油、CCD和蔗糖，加适量水搅拌使其完全溶解；再加入Triton X-100充分乳化；乳化完全后加入液体生物防腐剂Proclin300和足量的水，搅拌使其完全溶解后，过滤，分装，制备得到一种用于α-羟丁酸脱氢酶试剂盒的稳定剂。
实施例6
一种用于α-羟丁酸脱氢酶试剂盒的稳定剂，包括下列组分：4.00g/L乙二胺四乙酸二钠、20.00g/L蔗糖、15.00g/L Triton X-100、40.00g/LCCD、15.00g/L甘油和2.00g/L液体生物防腐剂Proclin300，余量为水。
按照上述任一项所述称取各组分，在溶解容器中依次加入乙二胺四乙酸二钠、甘油、CCD和蔗糖，加适量水搅拌使其完全溶解；再加入Triton X-100充分乳化；乳化完全后加入液体生物防腐剂Proclin300和足量的水，搅拌使其完全溶解后，过滤，分装，制备得到一种用于α-羟丁酸脱氢酶试剂盒的稳定剂。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的稳定剂，其特征在于，所述稳定剂包括下列质量百分比的组分：0.1～0.5％乙二胺四乙酸二钠、1～3％蔗糖、1～2％Triton X-100、3～5％CCD、1～2％甘油，0.1～0.2％液体生物防腐剂Proclin300，余量水。
2.根据权利要求1所述的稳定剂，其特征在于：所述稳定剂包括下列质量百分比的组分：0.2～0.4％乙二胺四乙酸二钠、1～2％蔗糖、1～1.5％Triton X-100、3～4％CCD、1～1.5％甘油，0.2％液体生物防腐剂Proclin300，余量水。
3.根据权利要求1所述的稳定剂，其特征在于：所述α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括：Trisbase 12.00g/L、盐酸81.00g/L、α-酮丁酸0.85g/L和余量水；第二试剂包括：Trisbase 3.60g/L、盐酸0.650g/L、β-NADH 1.00g/L和余量水。
4.根据权利要求1～3任一项所述的稳定剂，其特征在于：稳定剂在α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的试剂中的使用量为1％v/v-3％v/v。
5.一种α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒用稳定剂的制备方法，其特征在于：按照权利要求1-4任一项所述称取各组分，在溶解容器中依次加入乙二胺四乙酸二钠、甘油、CCD和蔗糖，加适量水搅拌使其完全溶解；再加入Triton X-100充分乳化；乳化完全后加入液体生物防腐剂Proclin300和足量的水，搅拌使其完全溶解后，过滤，分装，制备得到稳定剂。
6.一种α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括权利要求1-4任一项所述的稳定剂。
7.一种测定α-羟丁酸脱氢酶的方法，其特征在于：将权利要求1-4任一项所述的稳定剂加入到α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒的试剂中，进行α-羟丁酸脱氢酶的测定。
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