CN101825625A - 同时检测人体尿液中尿乳酸、肌酸和β-羟丁酸的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种能同时检测人体尿液中尿乳酸、肌酸和β-羟丁酸的试剂盒，包括尿液纯化装置和干化学反应装置，所述尿液纯化装置内装有由重量比为0.2～1∶0.1～2的中性氧化铝和活性炭组成的选择性吸附剂，所述活性炭经过10％～20％的NaOH浸泡，所述选择性吸附剂在密闭烘箱内经70～250℃烘烤4～72小时处理；所述干化学反应装置为含有乳酸检测孔、肌酸检测孔和β-羟丁酸检测孔的反应盒。本发明可同时测定尿液中尿乳酸、肌酸和β-羟丁酸浓度，简单，迅速，不需任何仪器和专业训练人员即可得到定性或半定量的结果。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断用试剂盒领域，特别涉及一种可同时检测人体尿液中尿乳酸、肌酸和β-羟丁酸的试剂盒，该试剂盒通过干化学法定性和半定量测定人体尿液中乳酸、肌酸和β-羟丁酸的浓度，用以减肥效果及运动强度的评价。
背景技术
肥胖，在世界范围内已越来越多的引起医学界的关注。研究显示，肥胖可诱发糖尿病，高胆固醇以及肾功能衰竭等诸多疾病。在我国，改革开放以来，随着人民生活水平的提高和营养状态的改善，肥胖和超重者日益增多，肥胖已经成为我国社会一个不容忽视的健康问题。
由于肥胖人群的增多，减肥、瘦身在我国也随之成为一种时尚。在减肥的过程中，人们往往只追求体重的减轻和身材的苗条，而忽视了由于减肥引起的身体代谢的变化以及对人体产生的影响。更有甚者，通过服用大量减肥药或超出身体承受能力的高强度运动来达到减肥的目的，更是会造成体内代谢紊乱甚至引起相关疾病，不但不能达到减肥的目的，反而对身体健康造成极大损害。
在减肥过程中，人们一般只是通过称量体重来评价减肥的效果，但是一个有意义的减肥效果不能仅仅通过简单的称量体重来判断，因为人体内体液的平衡和其它一些因素对人体的体重有着很大的影响。一个有意义的，健康的减肥过程，应该是体内脂肪，糖类被代谢为更小分子物质的过程，同时应该综合考虑减肥对人体代谢的影响。
目前国内尚无针对减肥效果评价的相关发明或商品试剂盒，国外有类似用途的试纸条(专利号US 2004/0043376 A1)，但只检测人尿液中β-羟丁酸一种指标，不能全面反映减肥对人体代谢的影响，且只能定性检测，不能半定量检测。
美国GDS Technology公司的Keto
是一种可以用来测定血液样本中β-羟丁酸浓度的干化学试纸条，对于测定尿液中的β-羟丁酸浓度，存在以下缺陷：1.反应时pH值必须控制在8.5以上，尿液的酸碱度往往不能达到这一pH值，常造成假阳性的结果2.所用的β-羟丁酸脱氢酶容易被氯离子抑制，而尿液中大量存在氯离子，常造成假阴性的结果。3.没有纯化尿液的装置，结果易受尿液中其它物质的干扰。因此，该产品不适于测定尿液中β-羟丁酸浓度。
国内有单独检测乳酸和β-羟丁酸的液体试剂盒，但需要相关仪器才能得出结果，费用高，操作也较为繁琐，检测需要时间长。国内外也有单独检测乳酸的干化学试纸条，但也需要与相应的干化学检测仪联用，不能目测，费用也较高。国内外尚无测定肌酸的发明专利或商品化试剂盒。
测定尿乳酸、肌酸和β-羟丁酸浓度之前，需除去尿中干扰物，国外同类产品采用下列方法来除去尿中干扰物：a.通过尿液的稀释(1；20～1∶5)来降低干扰物影响，但被测物也同时被稀释，测定结果准确度降低，不适合低浓度乳酸，肌酸和β-羟丁酸的测定。B.采用离子交换柱如Ambertile IR-45(OH-owex 50W×8(H+)混合而成阴阳离子交换柱，虽然提高了测定结果的准确度，但在除干扰物的同时同样稀释了样本，且操作过程复杂费时。
商品试剂盒Galactosur(瑞典)和GB 1430512(专利号，日本)液中干扰物时采取稀释和离子交换结合的方法：将尿液1∶5或1∶2稀释；采用表面涂有离子交换剂的层析纸；这种处理在一定程度上可以减少干扰物对反应的影响，然而对于受试验者摄入大量水果，或摄入VitC药物，或其它原因造成尿中电解质浓度过高时，不能完全除去尿中干扰物，使酶促反应无法进行。
发明内容
本发明的目的是提供一种能同时检测人体尿液中尿乳酸、肌酸和β-羟丁酸的试剂盒。
乳酸是糖原酵解的终产物，而糖原酵解是人类肌肉活动能量的主要来源之一，它是在体内供氧不能满足有氧氧化的情况下发生的；因此，体内乳酸浓度的含量可以反应人体运动的负荷程度，国际上也常把乳酸含量作为衡量运动员运动强度的指标之一。在运动减肥的过程中可以作为运动强度的指标以及反映糖类的代谢状况；肌酸是一种主要存在于骨骼肌中的天然有机化合物，是磷酸肌酸的前体物质。在骨骼肌能量的代谢中，磷酸肌酸是能量的来源，当ATP水平下降时，磷酸肌酸可以促进三磷酸腺嘌呤核苷酸(ATP)合成；因此肌酸是一种重要的能量供应和储存物质，它可以反应减肥过程中肌肉营养状态和代谢状况；β-羟丁酸是酮体的主要成分，在肝脏内合成，占酮体的70％以上，可以代表酮体的含量；而酮体是脂肪分解的终产物，是衡量脂肪代谢的标志物，可以通过监测减肥过程中β-羟丁酸的含量来反映脂肪代谢的状况。本发明通过提供一种能够同时快速定性和半定量测定人体尿液中乳酸、肌酸和β-羟丁酸浓度的试剂盒，从而可以综合全面的对人的减肥效果进行评价。
本发明试剂盒包括尿液纯化装置和干化学反应装置，此外还可包括用作对照的比色卡。
所述尿液纯化装置内装有由重量比为0.2～1∶0.1～2的中性氧化铝和活性炭组成的选择性吸附剂，所述活性炭经过10％～20％NaOH浸泡处理，优选采用10％的NaOH处理，所述选择性吸附剂在密闭烘箱内经70～250℃下烘烤4～72小时活化处理。通过选择性吸附剂可以完全除去尿中的干扰物质胆红素和维生素C。上述尿液纯化装置可以采用现有的常规装置形式，或采用类似图1所示的注入式尿液纯化装置。该纯化装置包括填料腔(填装选择性吸附剂)，所述填料腔的顶部具有加液口，在所述加液口处具有密封帽，在所述填料腔中填装有选择性吸附剂，所述填料腔的底部具有出液口，所述出液口呈锥形状凸起，并在凸起端具有堵头帽，在所述填料腔的底部具有卡膜环，在所述卡膜环下面具有滤膜。
所述干化学反应装置为含有三个干化学反应盲孔的反应盒，这三个反应盲孔分别为用来检测人体尿液乳酸浓度的乳酸测定孔、用来检测人体尿液肌酸浓度的肌酸测定孔和用来检测人体尿液β-羟丁酸浓度的β-羟丁酸测定孔；
所述乳酸测定孔内从孔底部起依次放有显色剂垫、过氧化物酶垫和乳酸氧化酶垫；
所述肌酸测定孔内从孔底部起依次放有显色剂垫、过氧化物酶垫、肌氨酸氧化酶垫和肌酸酶垫；
所述β-羟丁酸测定孔内从孔底部起依次放有氯化硝基四氮唑兰(NBT)垫、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)垫、黄递酶垫和β-羟丁酸脱氢酶垫。
所述乳酸氧化酶垫是将垫载体在含有100～300U/ml乳酸氧化酶ph＝7.0～7.2的PIPES缓冲液中浸泡后干燥处理获得。
所述过氧化物酶垫是将垫载体在含有500～1000U/ml过氧化物酶pH＝7.0～7.2的PIPES缓冲液中浸泡后干燥处理获得。
所述显色剂垫是将垫载体在含有1～5.2g/L 4-氨基氨替吡琳和0.2～2g/L 3，5-二氯二羟基苯璜酸的生理盐水中浸泡后干燥处理获得。
所述肌酸酶垫是将垫载体在含有3000～5000U/ml肌酸酶和5-10g/100ml第一酶稳定剂pH＝7.5～8.3的Tris-HCl缓冲液中浸泡后干燥处理获得；所述第一酶稳定剂为海藻糖、葡聚糖或乙二胺四乙酸二钠盐。
所述肌氨酸氧化酶垫是将垫载体在含750～1000U/ml肌氨酸氧化酶和5-15g/100ml第二酶稳定剂pH＝7.5～8.3的Tris-HCl缓冲液中浸泡后干燥处理获得；所述第二酶稳定剂为海藻糖、葡聚糖、乙二胺四乙酸二钠盐或黄素二核苷酸。
所述β-羟丁酸脱氢酶垫是将垫载体在含100～400U/ml β-羟丁酸脱氢酶和3-10g/100ml第三酶稳定剂pH＝8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液中浸泡后干燥处理获得；所述第三酶稳定剂为牛血清白蛋白或乙二胺四乙酸二钠盐。
所述黄递酶垫是将载体在含250～680U/ml黄递酶和4-12g/100ml第四酶稳定剂的pH＝8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液中浸泡后干燥处理获得；所述第四酶稳定剂为牛血清白蛋白、氯化钠或氯化钾。
所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸垫是将载体在含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、2-吗啉乙磺酸缓冲液和第五稳定剂的pH＝4.0～6.0辅酶I溶液中浸泡，之后进行干燥处理获得；在所述辅酶I溶液中，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为0.125～0.32g/L；所述2-吗啉乙磺酸缓冲液浓度为50mmol/L；所述第五稳定剂在溶液中质量百分浓度为1.2-6.2g/100ml；所述第五稳定剂为海藻糖或乙二胺四乙酸钠盐。
所述氯化硝基四氮唑兰垫是将载体在含1.2-2.1g/100ml氯化硝基四氮唑兰和体积百分比86.5％二甲亚砜的第二显色剂溶液中浸泡后干燥处理获得。
上述涉及到的各种垫载体可以是滤纸，玻璃纤维或层析纸；各种垫载体的直径宜与相应的测定孔直径相同。
所述标准比色卡包含三组颜色，每组有三个不同色阶的卡片，三组颜色分别代表不同浓度的乳酸、肌酸和β-羟丁酸值的色标；
代表不同浓度的乳酸浓度值的色标包括0.1mmol/L的色标，0.3mmol/L的色标和1.0mmol/L的色标；(按照印刷行业国家标准色谱，颜色分别标号为M50Y10，M100Y25，M100C40Y90)
代表不同浓度的肌酸浓度值的色标包括0.1mmol/L、0.6mmol/L和1.2mmol/L的色标；(按照印刷行业国家标准色谱，颜色分别标号为M20Y5，M60Y20，M90Y40)
代表不同浓度的β-羟丁酸浓度值的色标包括0.1mmol/L、0.5mmol/L和1.0mmol/L的色标。(按照印刷行业国家标准色谱，颜色分别标号为C20M20，M90C100Y30，C100M60)
测定时，可将标准比色板上颜色与反应结果比较，用以对被测物进行定性和半定量判读和测定。
使用本发明的试剂盒进行尿乳酸、肌酸和β-羟丁酸测定的步骤 为：
1.将图1中尿样纯化装置的密封帽打开，取1.5ml尿液注入尿样纯化装置的管体中，盖上密封帽，摇晃20次后，取下堵头帽，用注射器将尿液由下堵头推出。
2.将推出的液体分别滴加两滴于三个反应孔中；
3.在室温下静置25分钟，观察反应孔内反应垫颜色；
4.将反应孔内反应垫颜色与标准比色卡上颜色进行对比，可以定性和半定量的得到被测物浓度。
本发明试剂盒具有如下优点：
1.可同时测定尿液中尿乳酸、肌酸和β-羟丁酸浓度，简单，迅速，不需任何仪器和专业训练人员即可得到定性或半定量的结果。
2.通过尿液纯化装置对尿液进行处理，有效去除了尿液中维生素C，胆红素等干扰物质，操作简便，保证了结果的稳定。
3.通过对不同反应试剂的独立分层印渍，提高了产品的稳定性和准确性。
4.本发明首次将尿中乳酸，肌酸和β-羟丁酸作为三个相关指标进行减肥效果的评价，更全面，科学地反映了人在减肥过程中的身体代谢状况。
5.本发明也可用于单独测定人尿液中乳酸，肌酸和β-羟丁酸，用于相关疾病的辅助筛查和诊断。
附图说明
图1为尿液纯化装置的结构示意图，图中1密封帽，2填料腔，3选择性吸附剂，4卡膜环，5滤膜，6出液口，7堵头帽，8进液口；
图2为干化学反应装置的结构示意图，A1为乳酸测定孔，A2为肌酸测定孔；A3为β-羟丁酸测定孔。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。
具体实施方案中试剂盒包括注入式尿液纯化装置、干化学反应装置和标准比色卡。
所述注入式尿液纯化装置(如图1)为一内装用来特异吸附尿液中干扰物质的选择性特异吸附剂的滴定式容器，所述选择性特异吸附剂为在70～250℃下烘烤4～72小时进行活化处理的吸附剂，该选择性特异吸附剂由0.2～1重量份中性氧化铝和0.1～2重量份纯化活性炭组成，所述纯化活性炭经10％(质量体积比)NaOH溶液处理；所述选择性特异吸附剂可以完全除去尿中的干扰物质如胆红素和维生素C；
所述干化学反应装置(如图2所示)为含有三个干化学反应盲孔的盒式反应装置，所述三个干化学反应盲孔从上至下分别为用来检测人体尿液乳酸浓度的乳酸测定孔A1、用来检测人体尿液肌酸浓度的肌酸测定孔A2和用来检测人体尿液β-羟丁酸浓度的β-羟丁酸测足孔A3；
所述乳酸测定孔A1内从孔底部起依次放有显色剂垫、过氧化物酶垫和乳酸氧化酶垫；
所述肌酸测定孔A2内从孔底部起依次放有显色剂垫、过氧化物酶垫、肌氨酸氧化酶垫和肌酸酶垫；
所述β-羟丁酸测定孔A3内从孔底部起依次放有氯化硝基四氮唑兰(NBT)垫、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)垫、黄递酶垫和β-羟丁酸脱氢酶垫；
所述各种垫载体为滤纸，玻璃纤维或层析纸；所述各种垫载体的直径与相应的测定孔直径相同；
所述乳酸氧化酶垫为将垫载体在由乳酸氧化酶和哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液组成的pH＝7.0～7.2第一酶液中经浸泡，之后进行干燥处理的乳酸氧化酶垫；在所述第一酶液中，所述乳酸氧化物酶浓度为100～300U/ml，所述PIPES缓冲液浓度为100mmol/L；
所述过氧化物酶垫为将垫载体在由过氧化物酶和哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液组成的pH＝7.0～7.2第二酶液中经浸泡，之后进行干燥处理的过氧化物酶垫；在所述第二酶液中，所述过氧化物酶浓度为500～1000U/ml，所述哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液的浓度为100mmol/L；
所述肌酸酶垫为将载体在由肌酸酶，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris-HCl)和第一酶稳定剂组成的pH＝7.5～8.3的第三酶液中经浸泡，之后进行干燥处理的肌酸酶垫；在所述第三酶液中，所述肌酸酶浓度为3000～5000U/ml，所述Tris-HCl缓冲液浓度为50mmol/L；所述第一酶稳定剂的浓度为5-10g/100ml；所述酶稳定剂为海藻糖，葡聚糖或乙二胺四乙酸二钠盐；
所述肌氨酸氧化酶垫为将载体在由肌氨酸氧化酶、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris-HCl)和第二酶稳定剂组成的pH＝7.5～8.3的第四酶液中经浸泡，之后进行干燥处理的肌氨酸氧化酶垫；在所述第四酶液中，所述肌氨酸氧化酶浓度为750～1000U/ml，所述Tris-HCl缓冲液浓度为50mmol/L；所述酶稳定剂浓度为5-15g/100ml；所述第二酶稳定剂为海藻糖、葡聚糖、乙二胺四乙酸二钠盐或黄素二核苷酸；
所述显色剂垫为将垫载体在由4-氨基氨替吡琳(4AAP)、3，5-二氯二羟基苯璜酸(DCHBS)和生理盐水组成的第一显色剂液中浸泡，之后进行干燥处理的显色剂垫；在第一显色剂液中，所述4-氨基氨替吡琳浓度为1～5.2g/L；所述3，5-二氯二羟基苯璜酸浓度为0.2～2g/L；
所述β-羟丁酸脱氢酶垫为将垫载体在由β-羟丁酸脱氢酶、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris-HCl)和第三酶稳定剂组成的pH＝8.0～9.0第五酶液中浸泡，之后进行干燥处理的脱氢酶垫；在所述第五酶液中，所述β-羟丁酸脱氢酶浓度为100～400U/ml，所述Tris-HCl缓冲液浓度为50mmol/L；所述第三酶稳定剂浓度为3-10g/100ml；所述β-羟丁酸脱氢酶垫的直径与β-羟丁酸脱氢酶测定孔直径相同；所述第三酶稳定剂为牛血清白蛋白或乙二胺四乙酸二钠盐；
所述黄递酶垫为将载体在由黄递酶、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris-HCl)和第四酶稳定剂组成的pH＝8.0～9.0第六酶液中浸泡，之后进行干燥处理的黄递酶垫；在所述第六酶液中，所述黄递酶浓度为250～680U/ml，所述Tris-HCl缓冲液浓度为50mmol/L；所述第四酶稳定剂浓度为4-12g/100ml；所述第四酶稳定剂为牛血清白蛋白，氯化钠或氯化钾；
所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸垫为将载体在由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液和第五稳定剂组成的pH＝4.0～6.0辅酶I溶液中浸泡，之后进行干燥处理的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸垫；在所述辅酶I溶液中，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为0.125～0.32g/L；所述2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液浓度为50mmol/L；所述稳定剂在溶液中质量百分浓度为1.2-6.2g/100ml；所述第五稳定剂为海藻糖或乙二胺四乙酸钠盐；
所述氯化硝基四氮唑兰(NBT)垫为将载体在由氯化硝基四氮唑兰和二甲亚砜组成的第二显色剂溶液中浸泡，之后进行干燥处理的氯化硝基四氮唑兰垫；在第二显色剂溶液中，所述二甲亚砜的体积百分比浓度为86.5％；所述氯化硝基四氮唑兰在溶液中的终浓度为1.2-2.1g/100ml；
所述标准比色板包含：
表示浓度0.1mmol/L乳酸色标，浓度0.3mmol/L乳酸色标和浓度1.0mmol/L乳酸色标的标准乳酸比色板；
表示浓度0.1mmol/L肌酸色标，浓度0.6mmol/L肌酸色标和浓度1.2mmol/L肌酸色标的标准肌酸比色板；和
表示浓度0.1mmol/L β-羟丁酸色标，浓度0.5mmol/L β-羟丁酸色标和浓度1.0mmol/L β-羟丁酸色标的标准β-羟丁酸比色板；
测定时，可将标准比色板上颜色与反应结果比较，用以对被测物进行定性和半定量判读和测定。
实施例1 尿液纯化装置
如图1所示，该尿液纯化装置为一种滴定式容器，包括填料腔2，所述填料腔2的顶部具有加液口8，在所述加液口8处具有密封帽1，在所述填料腔2中填装有选择性吸附剂3，所述填料腔2的底部具有出液口6，所述出液口6呈锥形状凸起，并在凸起端具有堵头帽7，在所述填料腔2的底部具有卡膜环4，在所述卡膜环4下面具有滤膜5。
实施例2 检测试剂盒
尿液纯化装置
尿液纯化装置的结构同实施例1。在本例中选择性特异吸附剂为由0.5g中性氧化铝，0.3g的纯化活性炭组成的吸附剂，其中纯化活性炭经10％NaOH处理，该选择性吸附剂在70℃烘烤72小时进行活化。经过活化的吸附剂可以完全吸附除去尿中的干扰物质如胆红素，维生素C等干扰物质。
干化学反应装置的制备
制备乳酸氧化酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由100U/ml乳酸氧化酶和pH＝7.0，100mmol/L哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。制备过氧化物酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由500U/ml过氧化物酶，pH＝7.0，100mmol/L哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备显色剂垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由1g/L的4-氨基安替吡琳，0.2g/L的3，5-二氯二羟基苯璜酸和生理盐水组成的显色剂液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备肌酸酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由3000U/ml的肌酸酶，50mmol/L，pH＝7.5的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，5g/100ml海藻糖，10g/100ml葡聚糖和50mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备肌氨酸氧化酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由800U/ml的肌氨酸氧化酶，50mmol/L，pH＝7.5的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，6g/100ml海藻糖，12g/100ml葡聚糖和5g/100ml乙二胺四乙酸二钠盐，6g/100ml黄素二核苷酸组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备β-羟丁酸脱氢酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由100U/ml β-羟丁酸脱氢酶，pH＝8.0，50mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，3g/100ml牛血清白蛋白，5g/100ml乙二胺四乙酸二钠盐组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备黄递酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由250U/mlβ-羟丁酸脱氢酶，pH＝8.0，50mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，4g/100ml氯化钠，4g/100ml氯化钾，6g/100ml牛血清白蛋白组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由0.125g/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，50mmol/L，pH＝4.0的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液和1.2g/100ml海藻糖，2g/100ml乙二胺四乙酸二钠组成的辅酶I液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
氯化硝基四氮唑兰(NBT)垫制备：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由1.2g/100ml的氯化硝基四氮唑兰和体积百分比86.5％的二甲亚砜组成第二显色剂液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
将显色剂垫，过氧化物酶垫和乳酸氧化酶垫从下至上放入图2所示的干化学反应装置的乳酸测定孔(盲孔A1)内。将显色剂垫，过氧化物酶垫，肌氨酸氧化酶垫和肌酸酶垫从下至上放入图2所示的干化学反应装置的肌酸测定孔(盲孔A2)内。将氯化硝基四氮唑兰(NBT)垫，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸垫，黄递酶垫和β-羟丁酸脱氢酶垫从下至上放入图2所示的干化学反应装置的β-羟丁酸测定孔(盲孔A3)内。
在被测尿样中分别加入相应量的干扰物维生素C和胆红素，使其终浓度分别达到下表所示浓度，用上述尿液纯化装置纯化后进行检测，显色程度用“+”表示，“+”数目与显色深度呈正比。
表1 尿液纯化装置纯化效果
实施例3
尿液纯化装置
本例中尿液纯化装置同实施例1。本实施例的选择性特异吸附剂为由0.4g中性氧化铝，0.2g的纯化活性炭组成的吸附剂：其中纯化活性炭经10％NaOH处理，该选择性吸附剂在150℃烘烤36小时进行活化，经过活化的吸附剂可以完全吸附除去尿中的干扰物质如胆红素，维生素C等干扰物质。
干化学反应装置的制备
制备乳酸氧化酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由200U/ml乳酸氧化酶和pH＝7.2，100mmol/L哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备过氧化物酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由800U/ml过氧化物酶，pH＝7.2，100mmol/L哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备显色剂垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由2.2g/L的4-氨基安替吡琳，1.1g/L的3，5-二氯二羟基苯璜酸和生理盐水组成的显色剂液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备肌酸酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由4000U/ml的肌酸酶，50mmol/L，pH＝8.0的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，6g/100ml海藻糖，6g/100ml葡聚糖和50mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备肌氨酸氧化酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由900U/ml的肌氨酸氧化酶，50mmol/L，pH＝8.0的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，10g/100ml海藻糖，10g/100ml葡聚糖和10g/100ml乙二胺四乙酸二钠盐和6g/100ml黄素二核苷酸组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备β-羟丁酸脱氢酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由200U/ml β-羟丁酸脱氢酶，pH＝8.5，50mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，3g/100ml牛血清白蛋白，3g/100ml乙二胺四乙酸二钠盐组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备黄递酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由300U/ml黄递酶，pH＝8.5，50mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，8g/100ml氯化钠，8g/100ml氯化钾，5g/100ml牛血清白蛋白组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由0.15g/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，和50mmol/L，pH＝5.5的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，和3g/100ml乙二胺四乙酸二钠盐，4g/100ml海藻糖组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
氯化硝基四氮唑兰(NBT)垫制备：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由1.8g/ml的氯化硝基四氮唑兰和体积百分比86.5％的二甲亚砜组成第二显色剂液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
将显色剂垫，过氧化物酶垫和乳酸氧化酶垫从下至上放入图2所示的干化学反应装置的乳酸测定孔(盲孔A1)内。将显色剂垫，过氧化物酶垫，肌氨酸氧化酶垫和肌酸酶垫从下至上放入图2所示的干化学反应装置的肌酸测定孔(盲孔A2)内。将氯化硝基四氮唑兰(NBT)垫，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸垫，黄递酶垫和β-羟丁酸脱氢酶垫从下至上放入图2所示的干化学反应装置的β-羟丁酸测定孔(盲孔A3)内。
在被测尿样中分别加入相应量的干扰物维生素C和胆红素，使其终浓度分别达到下表所示浓度，用上述尿液纯化装置纯化后进行检测，显色程度用“+”表示，“+”数目与显色深度呈正比。
表2 尿液纯化装置纯化效果
实施例4
尿液纯化装置
本例中尿液纯化装置同实施例1。本实施例的选择性特异吸附剂为由0.8g中性氧化铝，0.5g的纯化活性炭组成的吸附剂：其中纯化活性炭经20％NaOH处理，该选择性吸附剂在250℃烘烤4小时进行活化，经过活化的吸附剂可以完全吸附除去尿中的干扰物质如胆红素，维生素C等干扰物质。)
干化学反应装置的制备
制备乳酸氧化酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由300U/ml乳酸氧化酶和pH＝7.2，100mmol/L哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备过氧化物酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由1000U/ml过氧化物酶，pH＝7.2，100mmol/L哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备显色垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由4.8g/L的4-氨基安替吡琳，2.4g/L的3，5-二氯二羟基苯璜酸和生理盐水组成的显色剂液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备肌酸酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由5000U/ml的肌酸酶，50mmol/L，pH＝8.3的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，5g/100ml海藻糖，5g/100ml葡聚糖和5g/100ml乙二胺四乙酸二钠盐组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备肌氨酸氧化酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由1000U/ml的肌氨酸氧化酶，50mmol/L，pH＝8.3的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，5g/100ml海藻糖，5g/100ml葡聚糖和50mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备β-羟丁酸脱氢酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由400U/ml β-羟丁酸脱氢酶，pH＝9.0，50mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，6g/100ml牛血清白蛋白，50mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备黄递酶垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由680U/ml黄递酶，pH＝9.0，50mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，12g/100ml氯化钠，10g/100ml氯化钾，8g/100ml牛血清白蛋白组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸垫：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由0.32g/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，和50mmol/L，pH＝6.0的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液和6.2g/100ml乙二胺四乙酸二钠盐，5g/100ml海藻糖组成的酶液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
氯化硝基四氮唑兰(NBT)垫制备：
采用Whatman的3MM级色谱层析纸做载体，切成直径3.98mm的圆片，并将所述层析纸载体在由2.1g/100ml的氯化硝基四氮唑兰和体积百分比86.5％的二甲亚砜组成第二显色剂液中浸泡2小时，20℃条件下干燥4小时。
将显色剂垫，过氧化物酶垫和乳酸氧化酶垫从下至上放入图2所示的干化学反应装置的乳酸测定孔(盲孔A1)内。将显色剂垫，过氧化物酶垫，肌氨酸氧化酶垫和肌酸酶垫从下至上放入图2所示的干化学反应装置的肌酸测定孔(盲孔A2)内。将氯化硝基四氮唑兰(NBT)垫，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸垫，黄递酶垫和β-羟丁酸脱氢酶垫从下至上放入图2所示的干化学反应装置的β-羟丁酸测定孔(盲孔A3)内。
在被测尿样中分别加入相应量的干扰物维生素C和胆红素，使其终浓度分别达到下表所示浓度，用上述尿液纯化装置纯化后进行检测，显色程度用“+”表示，“+”数目与显色深度呈正比。
表3 尿液纯化装置纯化效果
实施例5
使用本发明的试剂盒进行尿乳酸，肌酸和β-羟丁酸测定的步骤为：
将图1中尿样纯化装置的密封帽打开，取1.5ml尿液注入尿样纯化装置的管体中，盖上密封帽，摇晃20次后，取下堵头帽，用注射器将尿液由下堵头(出液口)推出。
将推出的液体分别滴加两滴于三个反应孔中；
在室温下静置25分钟，观察反应孔内反应垫颜色；
将反应孔内反应垫颜色与标准比色板上颜色进行对比，可以定性和半定量的得到被测物浓度。
取3份未剧烈运动、无糖尿病、肌肉疾病和脂类代谢障碍者的尿液，混匀，加入乳酸溶液使终浓度分别达到1，2，3，5，10mmol/L，加入肌酸溶液使终浓度分别达到1，3，6，10，12mmol/L，加入β-羟丁酸溶液使终浓度分别达到1，2，3，5，10，共制的A，B，C，D，E五种样品：
样品A：乳酸1mmol/L；肌酸1mmol/L；β-羟丁酸1mmol/L
样品B：乳酸2mmol/L；肌酸3mmol/L；β-羟丁酸2mmol/L
样品C：乳酸3mmol/L；肌酸6mmol/L；β-羟丁酸3mmol/L
样品D：乳酸5mmol/L；肌酸10mmol/L；β-羟丁酸5mmol/L
样品E：乳酸10mmol/L；肌酸12mmol/L；β-羟丁酸10mmol/L
将上述样品用蒸馏水稀释10倍后，按照上述步骤进行检测，与标准比色板上色阶进行比较，
确定色阶范围，同时用“+”表示显色程度，“+”数目与显色深度呈正比。
表4 样品检测结果
| 样品 | 乳酸 | 肌酸 | β-羟丁酸 |
| A | 0.1(+) | 0.1(+) | 0.1～0.5(+) |
| B | 0.1～0.3(++) | 0.1～0.6(++) | 0.1～0.5(++) |
| C | 0.3～1.0(+++) | 0.6～1.2(+++) | 0.5(++) |
| D | 0.3～1.0(+++) | 0.6～1.2(+++) | 0.5～1.0(+++) |
| E | 1.0(++++) | ＞1.2(++++) | 1.0(++++) |
由表4可以看出，通过本发明试剂盒对乳酸、肌酸和β-羟丁酸进行检测，能够基本反映出尿液中这些成分的含量。因此，可以通过本发明试剂盒对尿液中的乳酸、肌酸和β-羟丁酸进行定性和半定量的检测。
实施例6
挑选20例肥胖者，采用运动的方式进行减肥，每天快步行走3h左右，理论上热能消耗可增加26.4×103J，同时控制饮食，共进行30天。用本产品检测上述被测人群减肥之前与之后尿样，显色结果与标准比色卡比较，记录色阶范围，用“+”“-”表示显色程度。进行对比，评价减肥效果。表5显示的这20例肥胖者减肥前后的乳酸、肌酸和β-羟丁酸的变化。
表5减肥前后各指标的检测
由表5可以看出，通过本发明试剂盒对减肥人群减肥前后尿乳酸、肌酸和β-羟丁酸进行检测，可以反映出减肥人群在减肥前后三项指标的差异，从而对减肥效果进行有效评价。
Claims (9)
1.一种同时检测人体尿液中尿乳酸、肌酸和β-羟丁酸的试剂盒，包括尿液纯化装置和干化学反应装置
所述尿液纯化装置内装有由重量比为0.2～1∶0.1～2的中性氧化铝和活性炭组成的选择性吸附剂，所述活性炭经过10％～20％NaOH浸泡处理，所述选择性吸附剂在密闭烘箱内70～250℃下烘烤4～72小时活化处理；
所述干化学反应装置为含有乳酸检测孔、肌酸检测孔和β-羟丁酸检测孔的反应盒；
所述乳酸检测孔内从孔底部起依次放有显色剂垫、过氧化物酶垫和乳酸氧化酶垫；
所述肌酸检测孔内从孔底部起依次放有显色剂垫、过氧化物酶垫、肌氨酸氧化酶垫和肌酸酶垫；
所述β-羟丁酸检测孔内从孔底部起依次放有氯化硝基四氮唑兰垫、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸垫、黄递酶垫和β-羟丁酸脱氢酶垫。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有比色卡。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述乳酸氧化酶垫是将垫载体在含有100～300U/ml乳酸氧化酶pH＝7.0～7.2的PIPES缓冲液中浸泡后干燥处理获得。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述过氧化物酶垫是将垫载体在含有500～1000U/ml过氧化物酶pH＝7.0～7.2的PIPES缓冲液中浸泡后干燥处理获得。
5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述显色剂垫是将垫载体在含有1～5.2g/L 4-氨基氨替吡琳和0.2～2g/L 3，5-二氯二羟基苯璜酸的生理盐水中浸泡后干燥处理获得。
6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述肌酸酶垫是将垫载体在含有3000～5000U/ml肌酸酶和5-10g/100ml第一酶稳定剂pH＝7.5～8.3的Tris-HCl缓冲液中浸泡后干燥处理获得；所述第一酶稳定剂为海藻糖、葡聚糖或乙二胺四乙酸二钠盐；
所述肌氨酸氧化酶垫是将垫载体在含750～1000U/ml肌氨酸氧化酶和5-15g/100ml第二酶稳定剂pH＝7.5～8.3的Tris-HCl缓冲液中浸泡后干燥处理获得；所述第二酶稳定剂为海藻糖、葡聚糖、乙二胺四乙酸二钠盐或黄素二核苷酸。
7.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，
所述β-羟丁酸脱氢酶垫是将垫载体在含100～400U/ml β-羟丁酸脱氢酶和3-10g/100ml第三酶稳定剂pH＝8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液中浸泡后干燥处理获得；所述第三酶稳定剂为牛血清白蛋白或乙二胺四乙酸二钠盐；
所述黄递酶垫是将载体在含250～680U/ml黄递酶和4-12g/100ml第四酶稳定剂的pH＝8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液中浸泡后干燥处理获得；所述第四酶稳定剂为牛血清白蛋白、氯化钠或氯化钾；
所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸垫是将载体在含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、2-吗啉乙磺酸缓冲液和第五稳定剂的pH＝4.0～6.0辅酶I溶液中浸泡，之后进行干燥处理获得；在所述辅酶I溶液中，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为0.125～0.32g/L；所述2-吗啉乙磺酸缓冲液浓度为50mmol/L；所述第五稳定剂在溶液中质量百分浓度为1.2-6.2g/100ml；所述第五稳定剂为海藻糖或乙二胺四乙酸钠盐；
所述氯化硝基四氮唑兰垫是将载体在含1.2-2.1g/100ml氯化硝基四氮唑兰和体积百分比86.5％二甲亚砜的第二显色剂溶液中浸泡后干燥处理获得。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述尿液纯化装置为滴定式纯化装置。
9.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述尿液纯化装置包括填料腔，所述填料腔的顶部具有加液口，在所述加液口处具有密封帽，在所述填料腔中填装有选择性吸附剂，所述填料腔的底部具有出液口，所述出液口呈锥形状凸起，并在凸起端具有堵头帽，在所述填料腔的底部具有卡膜环，在所述卡膜环下面具有滤膜。
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