CN115792205A - 诊断midd的方法和试剂盒 - Google Patents
诊断midd的方法和试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115792205A CN115792205A CN202211084715.0A CN202211084715A CN115792205A CN 115792205 A CN115792205 A CN 115792205A CN 202211084715 A CN202211084715 A CN 202211084715A CN 115792205 A CN115792205 A CN 115792205A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactate
- lactic acid
- detecting
- reagent
- binding protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 208000014413 Maternally-inherited diabetes and deafness Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 148
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 74
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims abstract description 74
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 152
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 147
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 59
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 59
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 46
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 46
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 35
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 31
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 30
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 23
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 11
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 claims description 10
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 9
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 238000004448 titration Methods 0.000 claims description 8
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 7
- 108010073450 Lactate 2-monooxygenase Proteins 0.000 claims description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 7
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 20
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 17
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 14
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 13
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 13
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 13
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 2
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001104043 Syringa Species 0.000 description 2
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000009535 clinical urine test Methods 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 2
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 2
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N (2s)-2,6-diaminohexanoic acid;(2s)-2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O NWZSZGALRFJKBT-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000004104 gestational diabetes Diseases 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N hydrazine Substances NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 hydrazine compound Chemical class 0.000 description 1
- IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N hydrazine monohydrate Substances O.NN IKDUDTNKRLTJSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 150000004060 quinone imines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/493—Physical analysis of biological material of liquid biological material urine
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及诊断MIDD的方法和试剂盒。具体提供诊断MIDD方法，包括：(1)检测尿液中乳酸，(2)与对照水平比较。本发明的方法简单快速，结果准确，能够即时检测出MIDD患者。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及诊断MIDD的方法和试剂盒。
背景技术
糖尿病是人体葡萄糖代谢机制异常引起的慢性疾病，以高血糖为典型特征。根据国际糖尿病联盟的数据，截至2019年，在20岁到79岁的人群中，共有约4.63亿糖尿病患者。糖尿病目前无法治愈，患者不仅需要定期监测血糖，甚至有的需要终生注射胰岛素或服用降血糖药物。根据糖尿病的病因进行分类，可分为T1DM、T2DM、妊娠期糖尿病以及特殊糖尿病等，其中T2DM是我国糖尿病人的主要群体，占总患病人数的53％。
糖尿病是由于人体葡萄糖代谢调节机制异常引起的疾病，而乳酸是人体糖酵解的终产物。目前已有大量文献报道糖尿病人存在乳酸代谢异常的情况，但二者联系尚不明确。
发明内容
基于现有技术不足，本发明第一方面提供检检测尿液样品中乳酸的试剂及其在诊断MIDD中的用途。
本发明第一方面提供用于检测源自尿液的样品中乳酸的试剂和任选的乳酸标准品在制备用于诊断MIDD(线粒体m.3243A>G突变型糖尿病)或用于在糖尿病患者中鉴定MIDD的试剂盒中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述检测乳酸的试剂包括使用选自如下的一种或多种方法检测乳酸所需的试剂：色谱法、滴定法、比色法、酶学分析法、光学探针法。
在一个或多个实施方案中，所述用于检测乳酸的试剂包括处理尿液的试剂，例如3NPH_HCl、EDC和/或缓冲液。所述处理使样品中的乳酸适于后续检测。，
在一个或多个实施方案中，所述用于检测乳酸的试剂包括转化、富集、分离或识别乳酸的试剂。优选地，所述用于检测乳酸的试剂包括选自以下的一种或多种：抗体、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸结合蛋白或它们的功能变体。
在一个或多个实施方案中，所述用于检测乳酸的试剂包括选自以下的一种或多种：甲酸、乙腈、异丙醇。
在一个或多个实施方案中，所述乳酸结合蛋白的功能变体包括乳酸光学探针。
在一个或多个实施方案中，所述乳酸光学探针选自：Laconic、Green Lindoblum、GEM-IL、eLACCO1.1、LiLac。
在一个或多个实施方案中，所述乳酸光学探针包含融合的乳酸结合蛋白和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于乳酸结合蛋白的序列内、N端或C端。
在一个或多个实施方案中，所述乳酸光学探针如CN202011516287.5中任一实施方案所述。
在一个或多个实施方案中，与对照水平相比，MIDD患者的样品中乳酸水平显著提高。所述对照水平源自非MIDD患者或健康对象的相应样品中的乳酸水平。在一个或多个实施方案中，所述对照水平为大于或等于117±23μM的数值。
本发明第二方面还提供一种检测尿液中乳酸的试剂盒，包含检测乳酸的试剂和尿液处理试剂。
在一个或多个实施方案中，所述检测乳酸的试剂如本文第一方面所述。
在一个或多个实施方案中，所述尿液处理试剂包括但不限于：3NPH_HCl、 EDC、缓冲液。
在一个或多个实施方案中，所述缓冲液是基于磷酸盐的缓冲液或Tris，例如HEPES、PBS等。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含乳酸标准品。
在一个或多个实施方案中，所述检测乳酸的试剂包括转化、富集、分离或识别乳酸的试剂。优选地，所述试剂包括选自以下的一种或多种：抗体、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸结合蛋白或它们的功能变体、甲酸、乙腈、异丙醇。
本发明还提供一种检测尿液中乳酸的试剂盒，包含本文第一方面任一实施方案中所述的乳酸光学探针和缓冲液。
在一个或多个实施方案中，所述缓冲液是基于磷酸盐的缓冲液或Tris，例如HEPES、PBS等。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括：检测线粒体m.3243A>G 突变的试剂、检测对象血糖的试剂、和/或检测对象尿糖的试剂。
本发明还提供诊断MIDD或在糖尿病患者中鉴定MIDD的方法，包括： (1)检测尿液中乳酸，(2)与对照水平比较，其中，MIDD患者尿液中的乳酸水平高于对照水平。
在一个或多个实施方案中，所述检测乳酸的步骤是通过选自如下的一种或多种方法检测乳酸：色谱法、滴定法、比色法、酶学分析法、光学探针法。
在一个或多个实施方案中，光学探针法包括：将尿液与乳酸光学探针混合，检测荧光强度，根据所述荧光强度确定乳酸含量。
在一个或多个实施方案中，与对照水平相比，MIDD患者尿液中的乳酸水平显著提高。所述对照水平源自非MIDD患者或健康对象的相应样品中的乳酸水平。优选地，所述对照水平为大于或等于117±23μM的数值。
在一个或多个实施方案中，所述乳酸光学探针包含融合的乳酸结合蛋白和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于乳酸结合蛋白的序列内、N端或C端。优选地，所述乳酸光学探针如PCT/CN2020/137900中任一实施方案所述。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本文中健康人、LADA、T2DM以及MIDD临床特征；
图2为基于探针的临床样本即时检测方法的流程图；
图3为探针FiLa-H的血清测试结果；图3(A)为血清乳酸水平，图3(B)为UHPLC-MS和探针FiLa-H检测结果对比图；
图4为探针FiLa的血清测试结果；图4(A)为血清乳酸水平，图4(B) 为UHPLC-MS和探针FiLa检测结果对比图；
图5为探针FiLa-H的尿液测试结果；图5(A)为尿液乳酸水平，图5(B) 为UHPLC-MS和探针FiLa-H检测结果对比图；
图6为三种患病样本与健康样本的乳酸水平对比图；
图7为三种患病样本乳酸水平对比图。
具体实施方式
在给出数值或范围时，本文所用术语“约”指该数值或范围在给定数值或范围的20％以内、10％以内和5％以内。
本文所用术语“包含”、“包括”和其等同形式包括“含有”以及“由……组成”的含义，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。
由于患者的发病年龄和临床表现缺乏显著的区分度，MIDD(线粒体 m.3243A>G突变引起的一类特殊糖尿病分型)患者经常被误诊为T1DM或 T2DM。通过检测成人隐匿性自身免疫性糖尿病LADA(隐匿性自身免疫性糖尿病患者，T1DM的一类分型)、T2DM(II型糖尿病患者)以及MIDD(线粒体m.3243A>G突变引起的一类特殊糖尿病分型)病人的血清样本和尿液样本，分析乳酸水平变化。本发明发现，尿乳酸升高与MIDD患者密切相关，因此，乳酸可作为该疾病的潜在筛查标志物，重新识别糖尿病的这些临床表现(尿乳酸和血糖异常升高)以促使对MIDD的快速筛查。
因此，本发明提供诊断MIDD或在糖尿病患者中鉴定MIDD的方法，包括：(1)检测尿液中乳酸，(2)与对照水平比较，其中，MIDD患者尿液中的乳酸水平高于对照水平。特别地，与对照水平相比，MIDD患者尿液中的乳酸水平显著提高。
本文中，对照水平是可作为诊断依据的参照尿乳酸水平。这样的水平可以通过基于MIDD对象的样品与健康对象或非MIDD对象的样品之间的比较来获得。此外，对照水平也可以是健康对象或非MIDD对象的水平。对照水平可以源自一个对象或至少两个对象的群。本领域技术人员可以根据期望的灵敏度和特异性来选择参考水平。在示例性实施方案中，对照水平为大于或等于 117±23μM的尿乳酸水平。
在示例性实施方案中，使用色谱和探针法检测乳酸。但本领域技术人员可以理解，本领域的其他检测乳酸的方法也可用于本发明，例如滴定法、比色法、酶学分析法、光学探针法。其他检测乳酸的方法在本领域技术人员的知识范围内。本领域知晓这些方法检测乳酸的步骤和试剂。上述方法的示例性描述可参考：色谱法(例如HPLC)、滴定法(BiomedicalChromatography 2012,26(11): 1408-1415；Food Chemistry 2012,135(3):1078-1082)、比色法、基于过氧化氢的检测方法、酶循环法(Cell Stem Cell 2019,25(6):754-767；Annals of Epidemiology 2013,23(12):791-796；Analyst 1972,97(151):142-145)、酶联电化学分析方法(Biochemistry Biophysics Reports 2016,5:35-54.)、核磁共振技术NMR(Nature Chemical Biology 2016,12(11):937-943)、液相质谱LC-MS(The Journal ofClinical Investigation 2021,131(2):e136055；Nature 2017,551(7678):115-118)
乳酸检测
比色法：
利用乳酸脱氢酶(LDH)将乳酸生成丙酮酸，氧化型辅酶(例如NAD+) 接受H+而被还原成还原型辅酶(例如NADH)。在340nm波长处测定NADH 的吸光度，从而计算出样本中的乳酸含量。在反应体系中，LDH催化的反应是可逆反应，所以在缓冲液中需要加入肼类化合物与丙酮酸生成稳定复合物，使反应顺方向进行。比色法所需的试剂包括但不限于：乳酸脱氢酶、NAD+、缓冲液(例如Tris)、水合肼等。
基于过氧化氢的检测方法：
利用乳酸氧化酶将乳酸生成丙酮酸并产生过氧化氢，然后通过检测过氧化氢的水平来定量检测乳酸。例如基于安培检测法和光度测定法的乳酸分析仪，或在过氧化物酶的作用下将过氧化氢转变为其他可检测物(例如醌亚胺、3-氨基邻苯二甲酸酯等)。所需的试剂包括但不限于：乳酸氧化酶、过氧化物酶、缓冲液等。
色谱法：
多种色谱法均可以检测乳酸，例如HPLC、LC-MS、UHPLC-MS等。示例性地，UHPLC-MS检测乳酸步骤包括：将样品或标准溶液依次与3NPH_HCl 溶液和EDC溶液混合。将混合物冷冻，然后离心取上清液进行定量分析。将上清液注入UHPLC系统，用水进行分离，采用甲酸和乙腈/异丙醇梯度洗脱。乳酸定量配对的离子为224/137。
光学探针法：
本发明涉及基于遗传编码光学探针的临床样本乳酸即时检测方法。所述方法包括：将任选稀释的尿液与乳酸光学探针接触，通过检测乳酸光学探针的荧光变化定量乳酸。
本文中，乳酸光学探针指利用光学性质的变化定量检测乳酸水平的多肽探针。这样的探针通常包含能识别乳酸的蛋白(即乳酸结合蛋白)以及能响应该蛋白与乳酸的结合而发生光学性质变化的蛋白(即光学活性多肽，例如荧光蛋白)。通常，乳酸光学探针包含一个或多个乳酸结合蛋白和一个或多个光学活性多肽，其中一个或多个光学活性多肽位于一个或多个乳酸结合蛋白的序列内、 N端或C端。本领域已知多种可用于检测乳酸的光学探针，参见例如： PCT/CN2020/137900、Laconic(PLos one 2013,8(2),e57712)、GreenLindoblum(Scienfic Reports 2020,10,19562)、GEM-IL(Cell Reports Methods 2021,1(7), 100092)、eLACCO1.1(Nature Communications 2021,12,7058)、LiLac(NatureCommunications 2022,13,2919)。本领域技术人员可以理解，除了实施例中使用的光学探针之外，其他乳酸光学探针亦可用于本发明进行乳酸水平检测。
本发明所用的示例性乳酸光学探针是PCT/CN2020/137900中记载的光学探针，该申请通过引用全文纳入本文。所述乳酸光学探针包含乳酸结合蛋白或其功能变体和光学活性多肽或其功能变体，其中光学活性多肽或其功能变体位于乳酸结合蛋白或其功能变体的序列内、N端或C端。
在一个或多个实施方案中，所述乳酸结合蛋白具有SEQ ID NO:1所示的序列或其功能片段，或与其有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列相同性并保留乳酸结合功能的变体。在优选的实施方案中，乳酸结合蛋白如SEQ ID NO:1的第80-258位氨基酸所示或如该SEQ ID NO:1所示，或与其有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列相同性的变体。
在一个实施方案中，光学活性多肽是荧光蛋白或其保留荧光响应能力的功能片段或变体。在一个实施方案中，荧光蛋白选自黄色荧光蛋、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、苹果红荧光蛋白(如PCT/CN2020/137900的SEQ ID NO:2-5 所示的cpYFP、cpGFP、cpBFP和cpmApple)。
在一个实施方案中，乳酸光学探针还包含侧接所述光学活性多肽的一个或多个接头。本发明所述接头可以是任何长度的任何氨基酸序列。在一个实施方案中，光学活性多肽侧翼包含不超过5个氨基酸的接头，例如0、1、2、3、4 个氨基酸的接头。在一个实施方案中，光学活性多肽侧翼的接头包含氨基酸Y。在一个实施方案中，接头Y位于光学活性多肽的N端和/或C端。在一个实施方案中，乳酸光学探针如下所示：乳酸结合蛋白的第一部分B1-Y-光学活性多肽A-乳酸结合蛋白的第二部分B2。在一个实施方案中，乳酸光学探针不包含接头。
在一个实施方案中，光学活性多肽位于乳酸结合蛋白的选自以下的一个或多个位点：93/94，93/95，93/96，93/97，94/95，94/96，94/97，95/96，95/97， 96/97，119/120，119/121，120/121，137/138，137/139，137/140，137/141，138/139， 138/140，138/141，139/140，139/141，140/141，158/159，158/160，158/161， 159/160，159/161，160/161，185/186，185/187，185/188，185/189，185/190， 185/191，186/187，186/188，186/189，186/190，186/191，187/188，187/189， 187/190，187/191，188/189，188/190，188/191，189/190，189/191，190/191， 208/209，208/210，209/210，230/231，230/232和/或231/232，编号对应于乳酸结合蛋白的全长。优选地，光学活性多肽位于乳酸结合蛋白的选自以下的一个或多个位点：185/186，185/187，185/188，185/189，185/190，185/191，186/187， 186/188，186/189，186/190，186/191，187/188，187/189，187/190，187/191， 188/189，188/190，188/191，189/190，189/191或190/191。在一个或多个实施方案中，本发明B1-A-B2式乳酸光学探针可为当cpYFP位于乳酸结合蛋白或其功能片段的185/186，185/187，185/188，185/189，185/190，185/191，186/187， 186/188，186/189，186/190，186/191，187/188，187/189，187/190，187/191，188/189，188/190，188/191，189/190，189/191或190/191处的探针。在示例性实施方案中，B1-A-B2式乳酸光学探针可为当cpYFP位于乳酸结合蛋白或其功能片段的185/186，185/187，185/188，185/189，185/190，186/187，186/188， 186/189，186/190，187/189，189/191和190/191处的探针。在一个或多个实施方案中，所述乳酸结合蛋白的功能片段如SEQ IDNO:1第80-258位所示。
乳酸光学探针中的乳酸结合蛋白可具有一个或多个突变。包含突变的乳酸结合蛋白的乳酸光学探针对乳酸的响应高于或低于未突变的对应物，均可用于检测乳酸。优选地，乳酸光学探针对乳酸的响应(参见PCT/CN2020/137900) 超过对照荧光蛋白的1.2倍或低于对照荧光蛋白的0.8均可用于检测乳酸。在一个实施方案中，所述突变位于乳酸结合蛋白或其功能片段的第185、第189 和/或第190位。示例性地，在一个或多个实施方案中，所述突变包含：P189R 和P190D、P189R和P190A、P189R和P190I、P189R和P190Q、P189R和P190N、 P189D和P190D、P189D和P190E、P189D和P190V、P189D和P190L、P189D 和P190F、P189D和P190I、P189D和P190Q、P189D和P190N、P189D和P190G、 P189D和P190Y、P189D和P190W、P189E和P190R、P189E和P190A、P189E 和P190V、P189E和P190Q、P189A和P190L、P189A和P190F、P189A和P190M、 P189A、P189A和P190N、P189A和P190G、P189A和P190H、P189A和P190T、 P189V和P190D、P189V和P190E、P189V和P190A、P189V、P189V和P190N、 P189V和P190H、P189V和P190Y、P189L和P190V、P189L和P190F、P189L 和P190M、P189L和P190G、P189L和P190H、P189F和P190D、P189F和P190L、 P189F和P190F、P189F和P190I、P189F和P190N、P189F和P190H、P189F 和P190Y、P189F和P190K、P189F和P190T、P189F和P190W、P189I和P190R、 P189I和P190D、P189I和P190A、P189I和P190V、P189I和P190M、P189I 和P190Q、P189I和P190G、P189I和P190Y、P189I和P190S、P189I和P190T、 P189M和P190R、P189M和P190D、P189M和P190E、P189M和P190F、P189M 和P190G、P189M和P190S、P189M和P190W、P189C和P190D、P189C和P190E、P189C和P190F、P189C和P190I、P189C和P190M、P189C和P190C、 P189C、P189C和P190H、P189C和P190Y、P189C和P190S、P189C和P190W、 P190L、P190F、P190I、P190Q、P190N、P190K、P190T、P189Q和P190E、 P189Q和P190A、P189Q和P190V、P189Q和P190M、P189Q和P190C、P189Q和P190Q、P189Q和P190H、P189Q和P190S、P189N和P190R、P189N和 P190D、P189N和P190L、P189N和P190F、P189N和P190C、P189N、P189N 和P190N、P189N和P190G、P189N和P190H、P189N和P190Y、P189N和 P190T、P189G和P190V、P189G和P190F、P189G和P190M、P189G和P190C、 P189G和P190G、P189G和P190H、P189G和P190K、P189G和P190W、P189H 和P190R、P189H和P190D、P189H和P190E、P189H和P190L、P189H和P190S、 P189Y和P190R、P189Y和P190L、P189Y和P190N、P189Y和P190H、P189Y 和P190S、P189Y和P190T、P189K和P190D、P189K和P190E、P189K和P190V、 P189K和P190L、P189K和P190F、P189K和P190I、P189K和P190M、P189K、 P189K和P190Q、P189K和P190N、P189K和P190Y、P189K和P190K、P189K 和P190T、P189S和P190E、P189S和P190A、P189S和P190L、P189S和P190F、 P189S和P190M、P189S和P190C、P189S、P189S和P190Q、189S和P190Y、 P189S和P190K、P189S和P190S、P189T和P190R、P189T和P190D、P189T 和P190M、P189T和P190C、P189T、P189T和P190Q、P189T和P190N、P189T和P190H、P189T和P190Y、P189T和P190K、P189T和P190W、P189W和 P190A、P189W和P190V、P189W和P190F、P189W、P189W和P190Q、P189W 和P190H、P189W和P190S、P189W和P190T、P189W和P190W。在一些具体实施方案中，所述突变还包含M185F、M185Y、M185L、M185I、M185Q、M185G、M185H、M185A、M185P、M185N、M185C、M185W、M185S、M185V、 M185D、M185T、M185R、M185E或M185K；优选地，所述突变还包含M185F、 M185Y、M185L、M185I、M185Q、M185G、M185H、M185A、M185N、M185C、 M185W、M185S、M185V、M185D、M185T、M185R或M185K。在一些具体实施方案中，所述突变包含P189R和P190A，P189D和P190D，P189D和P190E， P189D和P190Q，P189D和P190Y，P189A和P190N，P189A和P190G，P189V 和P190H，P189F和P190I，P189F和P190N，P189F和P190K，P189I和P190D， P189I和P190A，P189I和P190V，P189I和P190M，P189M和P190R，P189M 和P190E，P189M和P190F，P189M和P190G，P189M和P190S，P189C和 P190E，P190Q，P189Q和P190M，P189Q和P190C，P189N和P190N，P189G 和P190F，P189H和P190L，P189H和P190S，P189Y和P190L，P189K和P190V，P189K和P190T，P189S和P190A，P189S和P190M，P189S和P190Q，P189S 和P190K，P189S和P190S，P189T和P190D，P189W和P190A，P189W和P190T，P189C和P190D，P189C和P190Y，P189N和P190Y，P189R和P190I， P189M和P190D，P189H和P190R，P189N，P189F和P190D，P189F和P190H， P189N和P190F，P189C和P190F，P189H和P190D，或P189S。在一些具体实施方案中，所述突变还包含M185F、M185Y、M185L、M185I、M185Q、 M185G、M185H、M185A、M185P、M185N、M185C、M185W、M185S、M185V、 M185D、M185T、M185R、M185E或M185K；优选地，所述突变还包含M185F、 M185Y、M185L、M185I、M185Q、M185G、M185H、M185A、M185N、M185C、 M185W、M185S、M185V、M185D、M185T、M185R或M185K。
在一些实施方案中，所述突变包含P189S，P189C和P190D，P189C和 P190Y，P189N和P190Y，P189R和P190I，P189M和P190D，P189H和P190R， P189N，P189F和P190D，P189F和P190H，P189N和P190F，P189C和P190F，或P189H和P190D。在一个或多个实施方案中，所述突变还包含M185F、M185Y、 M185L、M185I、M185Q、M185G、M185H、M185A、M185P、M185N、M185C、M185W、M185S、M185V、M185D、M185T、M185R、M185E或M185K；优选地，所述突变还包含M185F、M185Y、M185L、M185I、M185Q、M185G、 M185H、M185A、M185N、M185C、M185W、M185S、M185V、M185D、M185T、 M185R或M185K。
在一些实施方案中，所述突变包含：(1)P189C和P190D、P189M和P190D、 P189F和P190D，或P189H和P190D，和任选的(2)M185F、M185Y、M185L、 M185I、M185Q、M185G、M185H、M185A、M185P、M185N、M185C、M185W、 M185S、M185V、M185D、M185T、M185R、M185E或M185K。
在一些实施方案中，所述突变包含：(1)P189C和P190D、P189M和P190D、或P189H和P190D，和任选的(2)M185F、M185Y、M185L、M185I、M185Q、 M185G、M185H、M185A、M185P、M185N、M185C、M185W、M185S、M185V、 M185D、M185T、M185R、M185E或M185K；或者，所述突变包含：(1) P189F和P190D，和任选的(2)M185F、M185Y、M185L、M185I、M185Q、 M185G、M185H、M185A、M185N、M185C、M185W、M185S、M185V、M185D、M185T、M185R或M185K。
在示例性实施方案中，乳酸光学探针可为乳酸结合蛋白功能片段的 185/189位点插入有cpYFP并且具有选自以下的一个或多个突变的探针：P189R 和P190D、P189R和P190A、P189R和P190I、P189R和P190Q、P189R和P190N、 P189D和P190D、P189D和P190E、P189D和P190V、P189D和P190L、P189D 和P190F、P189D和P190I、P189D和P190Q、P189D和P190N、P189D和P190G、 P189D和P190Y、P189D和P190W、P189E和P190R、P189E和P190A、P189E 和P190V、P189E和P190Q、P189A和P190L、P189A和P190F、P189A和P190M、 P189A、P189A和P190N、P189A和P190G、P189A和P190H、P189A和P190T、 P189V和P190D、P189V和P190E、P189V和P190A、P189V、P189V和P190N、 P189V和P190H、P189V和P190Y、P189L和P190V、P189L和P190F、P189L和P190M、P189L和P190G、P189L和P190H、P189F和P190D、P189F和P190L、 P189F和P190F、P189F和P190I、P189F和P190N、P189F和P190H、P189F 和P190Y、P189F和P190K、P189F和P190T、P189F和P190W、P189I和P190R、 P189I和P190D、P189I和P190A、P189I和P190V、P189I和P190M、P189I 和P190Q、P189I和P190G、P189I和P190Y、P189I和P190S、P189I和P190T、P189M和P190R、P189M和P190D、P189M和P190E、P189M和P190F、P189M 和P190G、P189M和P190S、P189M和P190W、P189C和P190D、P189C和 P190E、P189C和P190F、P189C和P190I、P189C和P190M、P189C和P190C、 P189C、P189C和P190H、P189C和P190Y、P189C和P190S、P189C和P190W、 P190L、P190F、P190I、P190Q、P190N、P190K、P190T、P189Q和P190E、 P189Q和P190A、P189Q和P190V、P189Q和P190M、P189Q和P190C、P189Q 和P190Q、P189Q和P190H、P189Q和P190S、P189N和P190R、P189N和 P190D、P189N和P190L、P189N和P190F、P189N和P190C、P189N、P189N 和P190N、P189N和P190G、P189N和P190H、P189N和P190Y、P189N和 P190T、P189G和P190V、P189G和P190F、P189G和P190M、P189G和P190C、 P189G和P190G、P189G和P190H、P189G和P190K、P189G和P190W、P189H 和P190R、P189H和P190D、P189H和P190E、P189H和P190L、P189H和P190S、 P189Y和P190R、P189Y和P190L、P189Y和P190N、P189Y和P190H、P189Y和P190S、P189Y和P190T、P189K和P190D、P189K和P190E、P189K和P190V、 P189K和P190L、P189K和P190F、P189K和P190I、P189K和P190M、P189K、 P189K和P190Q、P189K和P190N、P189K和P190Y、P189K和P190K、P189K 和P190T、P189S和P190E、P189S和P190A、P189S和P190L、P189S和P190F、 P189S和P190M、P189S和P190C、P189S、P189S和P190Q、189S和P190Y、 P189S和P190K、P189S和P190S、P189T和P190R、P189T和P190D、P189T 和P190M、P189T和P190C、P189T、P189T和P190Q、P189T和P190N、P189T 和P190H、P189T和P190Y、P189T和P190K、P189T和P190W、P189W和 P190A、P189W和P190V、P189W和P190F、P189W、P189W和P190Q、P189W 和P190H、P189W和P190S、P189W和P190T、P189W和P190W。在进一步的实施方案中，所述突变还包含M185F、M185Y、M185L、M185I、M185Q、 M185G、M185H、M185A、M185P、M185N、M185C、M185W、M185S、M185V、 M185D、M185T、M185R、M185E或M185K；优选地，所述突变还包含M185F、 M185Y、M185L、M185I、M185Q、M185G、M185H、M185A、M185N、M185C、 M185W、M185S、M185V、M185D、M185T、M185R或M185K。
在示例性实施方案中，乳酸光学探针可为乳酸结合蛋白功能片段的 185/189位点插入有cpYFP并且具有选自以下的一个或多个突变的探针：P189S， P189C和P190D，P189C和P190Y，P189N和P190Y，P189R和P190I，P189M 和P190D，P189H和P190R，P189N，P189F和P190D，P189F和P190H，P189N 和P190F，P189C和P190F，或P189H和P190D。在示例性实施方案中，所述乳酸结合蛋白功能片段是SEQ ID NO:1的第80-258位，所述突变是P189N， P189S，P189C和P190F，P189N和P190F，P189N和P190Y，P189H和P190R， P189R和P190I，P189F和P190H，P189C和P190Y，P189C和P190D，P189M 和P190D，P189H和P190D，或P189F和P190D。在进一步的实施方案中，所述突变还包含M185F、M185Y、M185L、M185I、M185Q、M185G、M185H、M185A、M185P、M185N、M185C、M185W、M185S、M185V、M185D、M185T、 M185R、M185E或M185K；优选地，所述突变还包含M185F、M185Y、M185L、 M185I、M185Q、M185G、M185H、M185A、M185N、M185C、M185W、M185S、 M185V、M185D、M185T、M185R或M185K。
在一些具体实施方案中，乳酸光学探针可为乳酸结合蛋白功能片段的 185/189位点插入有cpYFP并且具有突变的探针，所述乳酸结合蛋白功能片段是SEQ ID NO:1的第80-258位，所述突变包含：(1)P189C和P190D、P189M 和P190D、P189F和P190D，或P189H和P190D，和任选的(2)M185F、M185Y、 M185L、M185I、M185Q、M185G、M185H、M185A、M185P、M185N、M185C、 M185W、M185S、M185V、M185D、M185T、M185R、M185E或M185K。优选地，所述突变包含：(1)P189C和P190D、P189M和P190D、或P189H和 P190D，和任选的(2)M185F、M185Y、M185L、M185I、M185Q、M185G、 M185H、M185A、M185P、M185N、M185C、M185W、M185S、M185V、M185D、M185T、M185R、M185E或M185K；或者，所述突变包含：(1)P189F和 P190D，和任选的(2)M185F、M185Y、M185L、M185I、M185Q、M185G、 M185H、M185A、M185N、M185C、M185W、M185S、M185V、M185D、M185T、 M185R或M185K。优选地，乳酸光学探针是乳酸结合蛋白功能片段的185/189位点插入有cpYFP并且具有P189F和P190D突变的探针，或者是乳酸结合蛋白功能片段的185/189位点插入有cpYFP并且具有M185L、P189H和P190D 突变的探针。
在具体实施方案中，乳酸光学探针包括具有PCT/CN2020/137900中SEQ ID NO:6-30、34-40所示序列的乳酸光学探针。在示例性实施方案中，乳酸光学探针包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或3(PCT/CN2020/137900中SEQ ID NO:30或35)其变体或由其组成。在一个实施方案中，乳酸光学探针包含与氨基酸序列SEQ ID NO:2或3有至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％序列相同性的序列。
乳酸光学探针可以与其它功能多肽融合，例如，功能多肽位于所述乳酸光学探针的N端和/或C端。在一些实施方案中，功能多肽包括用于纯化的标签或者用于免疫印迹的标签。光学探针和其它功能多肽之间可具有接头。
本文所用术语“功能变体”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与原始多肽或蛋白(例如乳酸结合蛋白或荧光蛋白)相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的多肽或蛋白(例如乳酸结合蛋白或荧光蛋白)的功能变体、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii) 成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白 (如分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些功能变体、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
所述类似物与原始多肽或蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变体。诱导变体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术得到。
在一些实施方案中，检测乳酸的过程中包括建立乳酸标准曲线的步骤。乳酸标准曲线的确定是本领域常规手段，是一种通过对不同的已知浓度的乳酸标品进行相应检测，并将浓度与检测结果或源自检测结果的计算结果对应起来的曲线。
对于基于光学探针的乳酸分析，在将光学探针与样品中的乳酸接触后，根据荧光蛋白的不同选择合适的激发和发射波长检测荧光强度，并根据乳酸标准曲线进行定量分析。
在示例性实施方案中，对于单激发波长的荧光蛋白而言(例如cpBFP 和cpmApple)，数据处理过程包括：
F＝FSample-FBLK
F代表单通道的实际荧光强度，FSample代表表达探针的样本荧光强度， FBLK代表未表达探针的样本荧光强度。利用标准品的荧光强度建立标准曲线，然后根据标准曲线进行样品乳酸的定量分析。在示例性实施方案中，对于 cpBFP，激发波长是360nm BP 10nm、发射波长是450nm BP 10nm；对于 cpmApple，激发波长是540nm BP 25nm、发射波长是590nm BP20nm。
对于多激发波长荧光蛋白而言(例如cpYFP和cpGFP)，数据处理过程包括：
F＝FSample-FBLK
R＝F激发波长1/F激发波长2
F代表单通道的实际荧光强度，FSample代表表达探针的样本荧光强度， FBLK代表未表达探针的样本荧光强度。F激发波长1代表探针在第一激发波长(对于cpYFP是485nm BP 20nm)处激发后于发射波长处(对于cpYFP或 cpGFP是528nm)发射的荧光强度，F激发波长2代表探针在第二激发波长(对于cpYFP是420nm BP 20nm)处激发后于发射波长处(对于cpYFP或cpGFP是528nm)发射的荧光强度。第一和第二激发波长可根据探针所携带的荧光蛋白的光谱性质决定的。
R(Ratio)代表探针的荧光比值。滤光片的带宽BP(band pass)表示中值两侧总范围，例如485BP 20nm即475-495nm。
[Lac]＝Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)
[Lac]代表乳酸水平；Kd代表探针的解离常数；Rmin和Rmax分别代表不加或加入饱和浓度乳酸后的探针蛋白荧光比值；R代表样品的荧光比值。
通常，乳酸检测前，样品可经过预处理去除可能影响检测的物质。这样的预处理方法可以根据具体的检测方法而调整。本领域技术人员知晓此类预处理的过程和所需试剂。例如，使用UHPLC-MS分析的方法如Xie et al.,2021所述，样品预处理包括：将样品(例如血液、尿液)依次与3NPH_HCl溶液和 EDC溶液混合，然后在-20℃下冷冻并取上清液进行分析。又如，在使用光学探针检测样品乳酸时，样品(例如血液、尿液)先使用缓冲液(例如HEPES)稀释，然后与光学探针混合，测定荧光强度。
此外，本发明还提供检测尿液中乳酸的试剂盒，该试剂盒包含检测乳酸的试剂和任选的尿液处理试剂。
如本文所用，术语乳酸“检测物质”、“检测试剂”和“检测乳酸的试剂”可互换使用，均是指针对乳酸，且可用于直接或间接检测出乳酸存在和/或含量的物质。为了方便检测，本发明的检测试剂还可带有可检测标记，所述可检测标记包括但不限于：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗体)等。
在一些实施方案中中，所述检测乳酸的试剂包括转化、富集、分离或识别乳酸的试剂。如上所述，本领域技术人员可以理解，包括色谱和探针法在内的检测乳酸的方法均可用于本发明，例如滴定法、比色法、酶学分析法、光学探针法。本领域知晓这些方法检测乳酸的步骤和试剂。因此，示例性地，本文中的检测乳酸的试剂是如下所述的方法中所用的试剂：色谱法(例如HPLC)、滴定法(Biomedical Chromatography 2012,26(11):1408-1415；FoodChemistry 2012,135(3):1078-1082)、比色法、基于过氧化氢的检测方法、酶循环法(CellStem Cell 2019,25(6):754-767；Annals of Epidemiology 2013,23(12):791-796；Analyst 1972,97(151):142-145)、酶联电化学分析方法 (Biochemistry BiophysicsReports 2016,5:35-54.)、核磁共振技术NMR(Nature Chemical Biology 2016,12(11):937-943)、液相质谱LC-MS(The Journal of Clinical Investigation 2021,131(2):e136055；Nature 2017,551(7678):115-118)。上述方法中所涉及的试剂包括但不限于：抗体、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸结合蛋白或它们的功能变体。示例性的实施方案中，所述检测乳酸的试剂还可以是选自以下的一种或多种：3NPH_HCl，EDC，甲酸、乙腈、异丙醇。
在使用尿液处理试剂后，样品中的乳酸可能更适于后续检测。这样的预处理方法可以根据具体的检测方法而调整。本领域技术人员知晓此类预处理的过程和所需试剂。例如，使用UHPLC-MS分析的方法如Xie et al.,2021所述，样品预处理包括：将样品(例如血液、尿液)依次与3NPH_HCl溶液和EDC 溶液混合，然后在-20℃下冷冻并取上清液进行分析。又如，在使用光学探针检测样品乳酸时，样品(例如血液、尿液)先使用缓冲液(例如HEPES)稀释，然后与光学探针混合，测定荧光强度。在一个或多个实施方案中，所述尿液处理试剂包括但不限于：3NPH_HCl、EDC、缓冲液。
所述试剂盒还可包括缓冲液。缓冲液的作用在于给乳酸检测所涉及的反应提供稳定的缓冲环境。本领域技术人员可以根据经验选择合适的缓冲液，例如基于磷酸盐的缓冲液(HEPES、PBS)或Tris等。
所述试剂盒还可包括诊断MIDD可能涉及的其他辅助检测所需的试剂，例如检测线粒体m.3243A>G突变的试剂(例如PCR引物)、检测对象血糖的试剂(例如葡萄糖氧化酶)、检测对象尿糖的试剂(例如葡萄糖氧化酶)。这些均在本领域技术人员内的知识范围内。
本发明还提供上述检测乳酸的试剂在制备用于检测MIDD或在糖尿病患者中鉴定MIDD的试剂盒中的用途。
在本文中，浓度、含量、百分数和其它数值均可用范围的形式表示。也应理解，使用这种范围形式只是为了方便和简洁，应该被弹性地解读为包括范围上下限所明确提及的数值，还应包括该范围内包括的所有单个数值或子范围。
本发明具有以下有益效果：
基于探针的体液样品测定不需要耗时的样品制备(即预处理或纯化)，因此非常快速和方便。通常，对于一个样品从样品移液到测量的整个过程需要约 1分钟，对于自动微孔板测定中的96个样品，通常需要约3分钟。这些优势使其成为代谢诊断和筛查的有前途的技术。
以下将以具体实施例的方式对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域的常规方法和试剂。
实施例
检测方法：
1.蛋白诱导表达及纯化
将探针质粒转化到BL21(DE3)或JM109(DE3)表达型菌株中，然后挑取单克隆到试管中一级培养，次日将一级培养的菌以1:100接种到锥形瓶中，待 OD600为0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，置于18℃培养，诱导目的蛋白的表达。
(1)收集菌体：蛋白表达24-48h后使用离心机4000rpm离心10min收取表达蛋白的菌体，用buffer A重悬。
(2)超声破碎：超声破碎仪程序设置为超声1s停3s，一个工作循环时间为300s，使用Φ15的探头，功率为55％。
(3)离心：当菌体超声至澄清时，使用离心机9600rpm，4℃离心30min，保留上清，弃掉沉淀。
(4)柱子预处理：自装的镍离子亲和层析柱先用5个柱体积(CV)的去离子水冲洗，然后用5个柱体积(CV)的buffer A平衡亲和层析柱。
(5)蛋白上柱：将破碎离心后的上清加到预处理好的镍柱中。
(6)洗杂：加入50mM咪唑的洗杂缓冲液将杂蛋白去除。
(7)洗脱：加入300mM咪唑的洗脱缓冲液将目的蛋白从镍柱中洗脱下来。
(8)镍柱处理：用5个柱体积(CV)的buffer B(500mM咪唑的缓冲液)处理使用完毕后的镍柱，然后加入5个柱体积(CV)的去离子水，最后将柱子填料浸在20％乙醇溶液中。
Buffer A：20mM磷酸盐、0.5M NaCl、10mM咪唑。
Buffer B：20mM磷酸盐、0.5M NaCl、500mM咪唑。
蛋白经过镍柱纯化之后是溶解在洗脱溶液中，而对蛋白进行性质检测或者贮存蛋白时需要更换溶液，因此需要对纯化的蛋白质进行脱盐处理，首先，需要预处理脱盐柱，同样使用5个柱体积(CV)的去离子水冲洗，之后用5个柱体积(CV)的脱盐缓冲液处理；其次，将待脱盐的蛋白质加入脱盐柱，收集蛋白；最后，用10个柱体积(CV)的去离子水处理脱盐柱。
2.临床样本采集
糖尿病及健康组血清样本由上海交通大学附属第六人民医院和上海市东方医院提供，样品采集和后续实验经过该机构评审委员会批准，并得到所有参与者的知情同意。
3.血清和尿液检测方法
对于基于荧光蛋白探针的乳酸分析，血清样品在HEPES缓冲液中稀释50 或100倍，尿液样品稀释20倍。使用96孔黑色孔板进行测定，设置不同浓度梯度乳酸标准。加入50μL稀释样品和50μL 0.8μM探针蛋白溶液。或者使用 Echo 650声波移液系统结合BioTekMultifloFX自动分液仪将0.5μL血清样品或2.5μL尿液样品直接与100μL的探针蛋白(0.4μM)混合。通过Synergy neo2 多功能酶标仪的485BP 20nm或420BP 10nm激发和528BP 20nm发射带宽的滤光器立即测定荧光强度，根据乳酸标准曲线进行定量分析。
荧光检测数据处理(以FiLa探针为例)
F＝FSample-FBLK
R(Ratio)＝F485/F420
F代表单通道的实际荧光强度，FSample代表表达探针的样本荧光强度， FBLK代表未表达探针的样本荧光强度。F485代表荧光蛋白样品在485nm处激发528nm处发射的荧光强度，F420代表荧光蛋白样品的在420nm处激发528nm处发射的荧光强度。RatioFiLa代表探针的荧光强度比值。
滤光片的带宽BP(band pass)表示中值两侧总范围，485BP 20nm即 475-495nm。
[Lac]＝Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)
[Lac]代表乳酸水平；Kd代表FiLa探针的解离常数；Rmin和Rmax分别代表不加或加入饱和浓度乳酸后的探针蛋白荧光比值；R代表尿液或血清的荧光比值。
4.血清和尿液中乳酸的UHPLC-MS分析
血清和尿液中的乳酸通过UHPLC(Agilent,1290)和三重四极杆(Agilent, 6460C)质谱仪测定(Analytical Chemistry 93,5709-5717)。将5μL等分试样的血清或尿液样品或标准溶液依次与25μL的160mM 3NPH_HCl溶液和25μL 的120mM EDC溶液混合。将混合物在-20℃下冷冻20分钟，然后离心取上清液进行定量分析。
将每5μL样品注入Agilent 1290UHPLC系统，用水进行分离，采用0.1％甲酸和乙腈/异丙醇(7:3,v/v)梯度洗脱。使用ESI负模式对多反应监测进行质量分析。乳酸定量配对的离子为224/137。
实施例1
检测合作医院提供的成人隐匿性自身免疫性糖尿病LADA(T1DM的一类分型)、T2DM以及MIDD(线粒体m.3243A>G突变引起的一类特殊糖尿病分型)病人的血清样本，每种疾病类型为15名患者，为了排除年龄、性别以及身高体重等指标带来的代谢差异，本实施例根据糖尿病人的年龄、性别、BMI等指标，为患者样本匹配了健康人的对照样本，其临床特征如下表1-4、图1 所示。
表1
表2
表3
表4
首先建立基于探针的临床样本即时检测方法，测量时间不到1分钟，对于 96孔板仅需0.5μL血清或2.5μL的尿液即可，检测流程如图2所示。
实施例2
在随机血清测试中，使用探针FiLa-H(SEQ ID NO:2)检测，T2DM组血清乳酸水平最高(3.33±0.25mM)，其次是m.3243A>G突变组(2.80±0.23mM)、 LADA组(2.67±0.25mM)和对照组(2.10±0.20mM)。为了验证探针法检测乳酸的准确性，本实施例采用了超高效液相色谱/质谱联用UHPLC-MS和探针检测结果进行对比。相比于HPLC-MS技术，UHPLC-MS具有更高的解析度、灵敏度和检测效率。本实施例运用相关性分析以及Bland-Altmann分析法对两种方法测得的结果进行评价，结果显示，两种方法相关性分析获得的皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)r值高达0.961。而Bland-Altmann分析结果显示，绝大部分分析结果都落在了95％一致性界限内，说明这两种方法测得的结果具有很高的一致性，可信度高，如图3所示。
使用FiLa探针(SEQ ID NO:3)以及PCT/CN2020/137900的实施例中的其他探针进行相同的检测也呈现出相同的结果，并且展现出很好的相关性和一致性，如图4所示。
实施例3
在随机尿液测试中，使用探针FiLa-H检测，m.3243A>G突变组的乳酸水平为344±73μM，显著高于其他三组，而LADA、T2DM和对照组之间没有显著差异(127±25μM vs 111±21μM vs 117±23μM，p>0.5)，如图5(A)所示。
使用UHPLC-MS方法进行测定，并运用相关性分析以及Bland-Altmann 分析法对两种方法测得的结果进行评价，表明使用探针检测的结果与 UHPLC-MS测定结果一致(如图5(B)所示)。
实施例4
使用探针FiLa-H检测对象样品的血清乳酸浓度和尿液乳酸浓度，结果如表1-4所示。
ROC分析表明，MIDD与健康对照相比，尿乳酸具有合理的区分能力，曲线下面积(AUC)为0.867；而LADA与健康对照相比尿乳酸没有显著区分能力(0.502，失败分数)，T2DM与健康对照相比也没有显著区分能力(0.511，失败分数)(图6)。因此，尿液中乳酸水平高是MIDD(m.3243A>G)患者的显著临床参数，这是以前未报道过的结果。
此外，由于患者的发病年龄和临床表现缺乏显著的区分度，MIDD患者经常被误诊为T1DM或T2DM。如图7所示，MIDD患者的尿乳酸水平相对T1DM 或T2DM的尿乳酸水平也具备显著差异：MIDD与LADA(尿乳酸，0.804；血清乳酸，0.520)和T2DM(尿乳酸，0.853；血清乳酸，0.684)。因此，尿乳酸特征评分有助于区分MIDD与LADA以及T2DM。
这些结果表明，尿乳酸升高与MIDD患者密切相关，可作为该疾病的潜在筛查标志物。重新识别糖尿病的这些临床表现(尿乳酸和血糖异常升高)以促使对MIDD的快速筛查。
Claims (10)
1.用于检测源自尿液的样品中乳酸的试剂、或用于检测源自尿液的样品中乳酸的试剂和乳酸标准品，在制备用于诊断MIDD或用于在糖尿病患者中鉴定MIDD的试剂盒中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用于检测乳酸的试剂包括使用选自如下的一种或多种方法检测乳酸所需的试剂：色谱法、滴定法、比色法、酶学分析法、光学探针法。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述用于检测乳酸的试剂包括转化、富集、分离或识别乳酸的试剂，
优选地，所述用于检测乳酸的试剂包括选自以下的一种或多种：抗体、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸结合蛋白或它们的功能变体、甲酸、乙腈、异丙醇。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述乳酸结合蛋白的功能变体包括乳酸光学探针，
优选地，
所述乳酸光学探针包含乳酸结合蛋白和光学活性多肽，
更优选地，所述光学探针具有选自以下的一个或多个特征：
所述乳酸结合蛋白具有SEQ ID NO:1所示的序列或其功能片段，
所述乳酸结合蛋白在下述位点处具有突变：(1)P189和/或P190，和任选的(2)M185，
所述光学活性多肽位于所述乳酸结合蛋白的选自以下的一个或多个位点：93/94，93/95，93/96，93/97，94/95，94/96，94/97，95/96，95/97，96/97，119/120，119/121，120/121，137/138，137/139，137/140，137/141，138/139，138/140，138/141，139/140，139/141，140/141，158/159，158/160，158/161，159/160，159/161，160/161，185/186，185/187，185/188，185/189，185/190，185/191，186/187，186/188，186/189，186/190，186/191，187/188，187/189，187/190，187/191，188/189，188/190，188/191，189/190，189/191，190/191，208/209，208/210，209/210，230/231，230/232和/或231/232。
5.一种检测尿液中乳酸的试剂盒，所述试剂盒包含检测乳酸的试剂和尿液处理试剂，
优选地，所述检测乳酸的试剂包括使用选自如下的一种或多种方法检测乳酸所需的试剂：色谱法、滴定法、比色法、酶学分析法、光学探针法，
更优选地，所述检测乳酸的试剂包括转化、富集、分离或识别乳酸的试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测乳酸的试剂包括选自以下的一种或多种：抗体、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸结合蛋白或它们的功能变体、3NPH_HCl，EDC，甲酸、乙腈、异丙醇，
所述尿液处理试剂包括：3NPH_HCl、EDC、缓冲液；优选地，所述缓冲液是基于磷酸盐的缓冲液或Tris。
7.一种检测尿液中乳酸的试剂盒，包含乳酸光学探针和缓冲液，所述光学探针包含乳酸结合蛋白和光学活性多肽，
优选地，所述光学活性多肽位于乳酸结合蛋白的序列内、N端或C端，
优选地，所述缓冲液是基于磷酸盐的缓冲液或Tris，例如HEPES、PBS等。
8.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述光学探针具有选自以下的一个或多个特征：
所述乳酸结合蛋白具有SEQ ID NO:1所示的序列或其功能片段，
所述乳酸结合蛋白在下述位点处具有突变：(1)P189和/或P190，和任选的(2)M185，
所述光学活性多肽位于所述乳酸结合蛋白的选自以下的一个或多个位点：93/94，93/95，93/96，93/97，94/95，94/96，94/97，95/96，95/97，96/97，119/120，119/121，120/121，137/138，137/139，137/140，137/141，138/139，138/140，138/141，139/140，139/141，140/141，158/159，158/160，158/161，159/160，159/161，160/161，185/186，185/187，185/188，185/189，185/190，185/191，186/187，186/188，186/189，186/190，186/191，187/188，187/189，187/190，187/191，188/189，188/190，188/191，189/190，189/191，190/191，208/209，208/210，209/210，230/231，230/232和/或231/232。
9.如权利要求5-9中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：检测线粒体m.3243A>G突变的试剂、检测对象血糖的试剂、和/或检测对象尿糖的试剂。
10.诊断MIDD或在糖尿病患者中鉴定MIDD的方法，包括：(1)检测尿液中乳酸，(2)与对照水平比较，其中，MIDD患者尿液中的乳酸水平高于对照水平。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211084715.0A CN115792205A (zh) | 2022-09-06 | 2022-09-06 | 诊断midd的方法和试剂盒 |
| PCT/CN2023/116730 WO2024051646A1 (zh) | 2022-09-06 | 2023-09-04 | 诊断midd的方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211084715.0A CN115792205A (zh) | 2022-09-06 | 2022-09-06 | 诊断midd的方法和试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115792205A true CN115792205A (zh) | 2023-03-14 |
Family
ID=85431711
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211084715.0A Pending CN115792205A (zh) | 2022-09-06 | 2022-09-06 | 诊断midd的方法和试剂盒 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115792205A (zh) |
| WO (1) | WO2024051646A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024051646A1 (zh) * | 2022-09-06 | 2024-03-14 | 华东理工大学 | 诊断midd的方法和试剂盒 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101825625A (zh) * | 2009-03-06 | 2010-09-08 | 北京中生金域诊断技术有限公司 | 同时检测人体尿液中尿乳酸、肌酸和β-羟丁酸的试剂盒 |
| CN112924608A (zh) * | 2019-12-06 | 2021-06-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于糖尿病早期诊断的多肽标志物及检测试剂盒和方法 |
| CN113004420A (zh) * | 2019-12-19 | 2021-06-22 | 华东理工大学 | 乳酸光学探针及其制备方法和应用 |
| US20210382071A1 (en) * | 2018-10-10 | 2021-12-09 | Helsingin Yliopisto | Biomarkers for mitochondrial diseases and related methods |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002315044A1 (en) * | 2001-06-08 | 2002-12-23 | Mitokor | Organellar proteomics including determination of targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome using mass spectrometry |
| CN101324555A (zh) * | 2007-06-13 | 2008-12-17 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | D-乳酸诊断/测定试剂盒及d-乳酸的浓度测定方法 |
| CN109917040A (zh) * | 2019-04-02 | 2019-06-21 | 清华大学 | 一种基于液质联用定量多种肠道菌群有机酸的方法 |
| CN115792205A (zh) * | 2022-09-06 | 2023-03-14 | 华东理工大学 | 诊断midd的方法和试剂盒 |
-
2022
- 2022-09-06 CN CN202211084715.0A patent/CN115792205A/zh active Pending
-
2023
- 2023-09-04 WO PCT/CN2023/116730 patent/WO2024051646A1/zh unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101825625A (zh) * | 2009-03-06 | 2010-09-08 | 北京中生金域诊断技术有限公司 | 同时检测人体尿液中尿乳酸、肌酸和β-羟丁酸的试剂盒 |
| US20210382071A1 (en) * | 2018-10-10 | 2021-12-09 | Helsingin Yliopisto | Biomarkers for mitochondrial diseases and related methods |
| CN112924608A (zh) * | 2019-12-06 | 2021-06-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种用于糖尿病早期诊断的多肽标志物及检测试剂盒和方法 |
| CN113004420A (zh) * | 2019-12-19 | 2021-06-22 | 华东理工大学 | 乳酸光学探针及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 丛龙杰等: "粪便内中短链脂肪酸柱前衍生化UHPLC-QTOF-MS/MS分析方法研究", 《药学学报》, vol. 55, no. 1, pages 131 - 138 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024051646A1 (zh) * | 2022-09-06 | 2024-03-14 | 华东理工大学 | 诊断midd的方法和试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024051646A1 (zh) | 2024-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chiou et al. | Urinary 8-hydroxydeoxyguanosine and its analogs as DNA marker of oxidative stress: development of an ELISA and measurement in both bladder and prostate cancers | |
| EP3020825B1 (en) | Method for measuring glycated hemoglobin | |
| Javors et al. | Current status of carbohydrate deficient transferrin, total serum sialic acid, sialic acid index of apolipoprotein J and serum β‐hexosaminidase as markers for alcohol consumption | |
| Panteghini | Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage | |
| US20140227728A1 (en) | Novel fructosyl peptidyl oxidase | |
| EP2319937B1 (en) | Blood component measurement method utilizing hemolyzed whole blood, and kit for the method | |
| EP1898215B1 (en) | Method of assaying endocrine substance in specimen | |
| WO2024051646A1 (zh) | 诊断midd的方法和试剂盒 | |
| CN111334557B (zh) | 一种稳定、抗干扰能力强的血清唾液酸测定试剂盒及其制备方法和应用 | |
| Burbelo et al. | High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome | |
| US20030017523A1 (en) | Method of measuring lipid components and method of examining of renal failure | |
| JP4602577B2 (ja) | 前糖尿病状態のスクリーニング方法及びスクリーニング用試薬 | |
| US20130004972A1 (en) | Method for the detection of prediabetes | |
| Yamato et al. | High-performance liquid chromatography determination of ketone bodies in human plasma by precolumn derivatization with p-nitrobenzene diazonium fluoroborate | |
| US20040048387A1 (en) | Method of detecting saccharified albumin | |
| Zhang et al. | Expression, purification and identification of isotope-labeled recombinant cystatin C protein in Escheichia coli intended for absolute quantification using isotope dilution mass spectrometry | |
| KR102650195B1 (ko) | 유리 메티오닌ｒ설폭사이드를 정량적으로 측정할 수 있는 형광단백질 센서 및 이의 용도 | |
| JP2014171442A (ja) | Ｌ−フェニルアラニン及びｌ−チロシンの定量方法 | |
| Yoshida et al. | Determination of flavin contents in neutrophils by a sensitive chemiluminescence assay: evidence for no translocation of flavoproteins from the cytosol to the membrane upon cell stimulation | |
| CN105734113B (zh) | 一种酶法检测d-3-羟丁酸的试剂盒及其制备方法 | |
| Sakiyama et al. | A rapid pretreatment method for the determination of pentosidine in human plasma by high performance liquid chromatography | |
| Abdelhamid et al. | Possibility of Xanthine Oxidase and Malondialdehyde as a marker for Myocardial Infarction | |
| Zhou et al. | Monitoring catalytic reaction of bilirubin oxidase and determination of bilirubin and bilirubin oxidase activity by capillary electrophoresis | |
| US20060292663A1 (en) | Method of measuring lactate dehydrogenase activity in serum, and device for measuring lactate dehydrogenase activity in serum | |
| US20080254496A1 (en) | Methods for Detection of Fungal Disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |