CN101118237A - 一种奶牛亚临床酮病诊断试纸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种奶牛亚临床酮病诊断试纸，属于兽医临床检验学领域。包括支持垫和固定于其上的测试垫，其特征在于该试纸的测试垫包括如下试剂：D－(－)－3－羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，50mg～100mg；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，300mg～500mg；黄递酶，35U/mg～45U/mg，500～1000mg；NBT，100mg～200mg；Tris Base，分子量121.14，1.21g；草酸，分子量126，126mg；海藻糖，分子量383，4～6g；蒸馏水100ml。本发明使用方便、经济实用、敏感性和特异性高、稳定性好的奶牛亚临床酮病诊断试纸，试纸用于对奶牛乳汁中D－(－)－3－羟丁酸和D－(－)－3－羟丁酸盐的检测。
Description
技术领域
本发明属于兽医临床检验学领域，所检测物质为奶牛乳汁中的D-(-)-3-羟基丁酸及其盐，适用于集约化奶牛养殖场奶牛亚临床酮病的监测。
背景技术
酮体是脂肪酸代谢过程中的产物，酮体的生产量的大小反映了脂肪氧化代谢的强度。正常情况下，血液中酮体浓度相对恒定，这是因为肝中产生的酮体可在肝外组织迅速利用，尤其是肾脏和心肌具有较强的使乙酰乙酸氧化的酶系，其次是大脑。肌肉组织也是利用酮体的重要组织。对于不能利用脂肪酸的脑组织来说，利用酮体作为能源具有重要意义。但在某些生理或病理情况下，如因饥饿将糖原耗尽后，食物中糖供给不足时，或因患病而缺乏氧化糖的能力时，脂肪动员加速，肝脏中酮体生成增加，超过了肝外组织氧化的能力。又因糖代谢减少，丙酮酸缺乏，可与乙酰辅酶A缩合成柠檬酸的草酰乙酸减少，更减少酮体的去路使酮体积聚于血内成为酮血症。血内酮体过多，由尿排出，又形成酮尿。酮体为酸性物质，若超过血液的缓冲能力时，就可引起酮症酸中毒。
奶牛养殖业已成为我国畜牧业的支柱产业。酮病是奶牛主要的群发性高发性疾病之一，我国奶牛酮病发病率为15-30％，且呈逐年上升趋势。大量研究表明，奶牛酮病与围产期奶牛的许多疾病有关，如胎衣不下、子宫内膜炎、皱胃变位、生产瘫痪等。按是否出现临床症状可将酮病分为临床酮病和亚临床酮病。临床酮病具有典型的临床症状，如食欲骤减、呼出气体有酮味、产奶量下降或出现神经症状等，不难做出诊断。亚临床酮病无明显的临床症状，发病率10-20倍于临床酮病，且容易引发临床酮病，给奶牛养殖业造成的经济损失尤为巨大。
奶牛亚临床酮病的诊断主要依靠检测体内酮体含量，其中乙酰乙酸占20％；D-(-)-3-羟丁酸占78％；丙酮占2％。酮体的三种成分中乙酰乙酸含量较低，易挥发，且奶牛酮病后期乙酰乙酸的含量反而降低，与酮病的发生和发展并不是正相关；丙酮含量最低，性状不是很稳定；D-(-)-3-羟丁酸占含量最高且与疾病的发生发展成正相关；故丙酮和乙酰乙酸都不适合于作为奶牛亚临床酮病的早期诊断指标，以D-(-)-3-羟丁酸作为奶牛亚临床酮病的早期诊断指标最为合理。只有实施有效的早期诊断，从而进行合理的防治，方能减少由此病所导致的巨大损失。
目前，奶牛酮体的定量检测方法有水杨醛比色法、改良式水杨醛比色法、高效液相色谱法、D-(-)-3-羟丁酸酶法分析试剂盒、气相色谱法，存在的主要缺点为需要昂贵的仪器和标准化的实验室、操作繁琐、检测成本高、花费时间长；定性检测方法有酮粉法，存在的主要缺点为操作过程复杂、敏感性和特异性较低。因此，这些方法均不适合集约化奶牛养殖场用于对奶牛的亚临床酮病的监测。
发明内容
本发明提供一种奶牛亚临床酮病诊断试纸，以解决对奶牛的亚临床酮病的检测过程存在的操作繁琐、检测成本高、花费时间长、敏感性和特异性较低的问题。
本发明采取的技术方案是：包括支持垫和固定于其上的测试垫，其特征在于该试纸的测试垫包括如下试剂：
脱氢酶：D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，50mg～100mg；
辅酶：
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，300mg～500mg；
黄递酶，35U/mg～45U/mg，500～1000mg；
显色剂：NBT，100mg～200mg；
Tris Base，分子量121.14，1.21g；
草酸，分子量126，126mg；
海藻糖，分子量383，4～6g；
蒸馏水100ml。
本发明的技术方案中测试垫还包括氯化钠，300mg～600mg。
本发明试纸的制备方法是：
按该配方配制100mL反应液，用1M的盐酸调pH值至8.5，取薄型中速定量滤纸，完全浸入该溶液中，2分钟后取出，于37℃恒温干燥箱内悬挂干燥45分钟。
本发明试纸的制备方法还包括：将滤纸裁剪成3×3cm的纸片，粘贴于3×6cm聚乙烯塑料薄板上，装入棕色瓶内，加入干燥剂，密闭保存。
本发明的反应原理：
依据上述反应原理，制作干燥试纸条。D-(-)-3-羟丁酸或其盐在D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶的催化下与NAD反应生成乙酰乙酸和NADH，最适PH为8.5，生成的NADH在黄递酶的催化下与NBT作用生成蓝黑色的不溶于水的甲月替(formazan)，依据生成的显色物质的颜色强度制作标准比色卡，半定量的测定D-(-)-3-羟丁酸或其盐的含量。
NBT是一种染色强度较高的染料，目前已大量的应用于免疫组织化学、细胞活性测定等，对光不敏感，故将其作为制作干燥试纸条的显色剂。D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶是专一性催化D-(-)-3-羟丁酸的酶。黄递酶起传递氢离子的作用，比较其它同类的酶，该酶性质稳定，对光敏感性较低，符合试纸条制作要求。D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶和黄递酶目前均可以大量表达纯化，容易买到。海藻糖是由特殊双糖分子构成的非还原性糖，特性非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，有效的保护酶蛋白的分子结构不被破坏，从而维持酶蛋白的活性，可有效保证试纸的检测和保存稳定性，否则难以商品化推广应用。奶牛乳汁中的乳酸脱氢酶可竞争性地与试纸所含NAD发生反应，加入草酸可去除这一干扰因素，提高检测结果的准确性。
配制的不同浓度的D-(-)-3-羟丁酸标准溶液，滴加数滴于制作好的试纸条上，依据反应后试纸条产生不同的颜色，制作试纸条标准比色卡。在实际使用时，将与被检乳样反应后的试纸条与标准比色卡对照，从而得出检测结果。所用的试纸可用普通的滤纸，也可用其它适合的吸湿膜等。试纸条的支垫部分可用聚乙烯薄板，也可用其它适合的硬质材料，但所用材料要无吸湿性。
本发明使用方便、经济实用、敏感性和特异性高、稳定性好的奶牛亚临床酮病诊断试纸，试纸用于对奶牛乳汁中D-(-)-3-羟丁酸和D-(-)-3-羟丁酸盐的检测。
附图说明
附图是本发明的结构示意图。
具体实施方式
试剂：
D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，
厂家：Asahi kasei pharma corporation，日本；
显色剂为NBT，分子式C40H30N10O6·2Cl，分子量为817.60～817.65，别名硝基四氮唑蓝、硝基蓝四氮唑、四唑氮蓝、氮蓝四唑、硝基蓝四唑、四唑硝基蓝、硝基氯化四氮唑蓝、氯化硝基四氮唑蓝；
厂家：sigma；
Tris Base，分子量121.14，厂家：sigma；
黄递酶，35U/mg～45U/mg，厂家：Asahi kasei pharma corporation，日本；
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，厂家：sigma；
草酸，分子量126，126mg，北京化工厂；
海藻糖，分子量383～383.3，4～6g，厂家：北京舒伯伟化工仪器有限责任公司；
蒸馏水100ml。
实施例1试纸的制作
包括支持垫2和固定于其上的测试垫1，该试纸的测试垫包括如下试剂：
D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，50mg；
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，300mg；
显色剂为NBT，100mg；
黄递酶，35U/mg，500mg；
Tris Base，分子量121.14，1.21g；
草酸，分子量126，126mg；
海藻糖，分子量383.3，4g；
蒸馏水100ml。
按该配方配制100mL反应液，用1M的盐酸调pH值至8.5，取薄型中速定量滤纸，完全浸入该溶液中，2分钟后取出，于37℃恒温干燥箱内悬挂干燥45分钟，然后将滤纸裁剪成3×3cM的纸片，粘贴于3×6cM聚乙烯塑料薄板上，装入棕色瓶内，加入干燥剂，密闭保存。
实施例2试纸的制作
D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，75mg；
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，400mg；
显色剂为NBT，150mg；
黄递酶，38U/mg，750mg；
Tris Base，分子量121.14，1.21g；
草酸，分子量126，126mg；
海藻糖，分子量383.3，5g；
蒸馏水100ml。
制作方法同实施例1。
实施例3试纸的制作
D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，100mg；
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，500mg；
显色剂为NBT，200mg；
黄递酶，45U/mg，1000mg；
Tris Base，分子量121.14，1.21g；
草酸，分子量126，126mg；
海藻糖，分子量383.3，6g；
蒸馏水100ml。
制作方法同实施例1。
实施例4试纸的制作
D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，55mg；
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，350mg；
显色剂为NBT，110mg；
黄递酶，38U/mg，550mg；
Tris Base，分子量121.14，1.21g；
氯化钠，300mg；
草酸，分子量126，126mg；
海藻糖，分子量383.3，5g；
蒸馏水100ml。
按该配方配制100mL反应液，用1M的盐酸调pH值至8.5，取薄型中速定量滤纸，完全浸入该溶液中，2分钟后取出，于37℃恒温干燥箱内悬挂干燥45分钟，然后将滤纸裁剪成3×3cM的纸片，粘贴于3×6cM聚乙烯塑料薄板上，装入棕色瓶内，加入干燥剂，密闭保存。
实施例5试纸的制作
D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，80mg；
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，400mg；
显色剂为NBT，150mg；
黄递酶，40U/mg，800mg；
Tris Base，分子量121.14，1.21g；
氯化钠，450mg；
草酸，分子量126，126mg；
海藻糖，分子量383.3，5g；
蒸馏水100ml。
制作方法同实施例4。
实施例6试纸的制作
D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，90mg；
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，450mg；
显色剂为NBT，180mg；
黄递酶，42U/mg，900mg；
Tris Base，分子量121.14，1.21g；
氯化钠，600mg；
草酸，分子量126，126mg；
海藻糖，分子量383.3，5g；
蒸馏水100ml。
制作方法同实施例4。
实施例7标准比色卡的制作
配制浓度为50μmol/L、100μmmol/L、200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L的D-(-)-3-羟丁酸标准溶液，与D-(-)-3-羟丁酸诊断试纸反应后用数码相机拍照，制成标准比色卡。
上述浓度由紫色到蓝紫色，再到蓝黑色，颜色逐渐加深。根据相关研究报导，奶牛乳汁中的D-(-)-3-羟丁酸含量大于200μmol/L时，可初步认定其患有亚临床酮病，而奶牛乳汁中的D-(-)-3-羟丁酸含量为50μmol/L、100μmmol/L对应的结果为正常奶牛，含量为100μmmol/L～200μmol/L为疑似病牛，500μmol/L以上的为严重病牛。
实施例8试纸条评价
1、灵敏度测试
配制0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L、600μmol/L、700μmol/L、800μmol/L、900μmol/L、1000μmol/L的D-(-)-3-羟丁酸溶液，用试纸检测其浓度，分析测试结果，浓度为50μmol/L、100μmmol/L、200μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L的D-(-)-3-羟丁酸溶液的测试结果与标准比色卡所示的颜色相同，浓度为150μmol/L的溶液的测试结果显示其位于100μmmol/L、200μmol/L溶液之间，浓度为300μmol/L、400μmol/L的溶液的测试结果显示其位于200μmol/L、500μmol/L的溶液之间，浓度为600μmol/L、700μmol/L、800μmol/L、900μmol/L的溶液的测试结果显示其位于500μmol/L、1000μmol/L的溶液之间、且颜色随着浓度的升高而逐渐加深。该测试结果显示，该试纸的灵敏度能够满足要求，检测出奶牛是否得了亚临床酮病。符合设计要求。
2、特异性测试
取D-(-)-3-羟丁酸、乙酰乙酸、3-羟基戊酸、丙酮、3-氧代戊酸和己酸测定，分别配制成不同浓度的溶液，使用试纸测试，检测结果所制作的试纸与乙酰乙酸、3-羟基戊酸、丙酮、3-氧代戊酸和己酸均不发生反应，特异性较高。
3、稳定性测试
将试纸分别置于4℃、常温、37℃条件下密封保存，每隔15天取出，观察外观性状，并测试标准D-(-)-3-羟丁酸溶液，测试结果表明试纸的有效期可达到15个月，完全符合国家相关产品认证标准。
4、临床应用性研究
根据我们的试验需要，选择饲养管理较差的牛群，随机取200头泌乳奶牛的乳样，先使用酶催化动力学方法测定D-(-)-3-羟丁酸含量，再用试纸条检测其乳中D-(-)-3-羟丁酸含量，测试结果表明该试纸检测的敏感性可达到88％，完全可以推广应用到实际生产应用中，具有经济价值和现实意义。
Claims (4)
1.一种奶牛亚临床酮病诊断试纸，包括支持垫和固定于其上的测试垫，其特征在于该试纸的测试垫包括如下试剂：
脱氢酶：D-(-)-3-羟丁酸脱氢酶，2270U/mg，50mg～100mg；
辅酶：
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，300mg～500mg；
黄递酶，35U/mg～45U/mg，500～1000mg；
显色剂：NBT，100mg～200mg；
Tris Base，分子量121.14，1.21g；
草酸，分子量126，126mg；
海藻糖，分子量383，4～6g；
蒸馏水100ml。
2.根据权利要求1所述的奶牛亚临床酮病诊断试纸，其特征在于：测试垫还包括：氯化钠，300mg～600mg。
3.一种如权利要求1或2所述的奶牛亚临床酮病诊断试纸的制作方法，其特征在于：按该配方配制100mL反应液，用1M的盐酸调pH值至8.5，取薄型中速定量滤纸，完全浸入该溶液中，2分钟后取出，于37℃恒温干燥箱内悬挂干燥45分钟。
4.如权利要求3所述的奶牛亚临床酮病诊断试纸的制作方法，其特征在于还包括：将滤纸裁剪成3×3cm的纸片，粘贴于3×6cm聚乙烯塑料薄板上，装入棕色瓶内，加入干燥剂，密闭保存。
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