CN101900734B - 一种糖尿病酮症及其他酮体偏高症状诊断试纸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种糖尿病酮症及其他酮体偏高症状诊断试纸，包括如下试剂：(1)第一相浸液：稳定剂和保护剂、牛血清白蛋白、草酸、NAD+、NADP+、黄递酶；、3-羟基丁酸脱氢酶及缓冲液；(2)第二相浸液：NBT、PMS及有机溶剂；其制备包括：将滤纸在第一相浸液中浸泡后，吸取过多的浸液，于20-50℃下迅速温热干燥，再在第二相浸液中浸泡，于20-50℃下再次干燥，得到测定试纸的原纸；然后粘贴在塑料片基上，切割成块，制得测定试剂条。本发明的诊断试纸可以组装成多种检测装置，且具有操作方便，检测快速，灵敏度好，准确性高等优点，可以半定量检测牛奶、尿液、血液中的3-羟基丁酸的含量，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于糖尿病酮症及其他酮体偏高症状的临床检测领域，特别涉及一种糖尿病酮症及其他酮体偏高症状诊断试纸。
背景技术
3-羟基丁酸(3-Hydroxybutyric acid)是脂肪代谢的终产物之一，约占酮体的78％，而乙酰乙酸和丙酮占22％，分子式：C4H8O3，结构式如下所示：
正常情况下，酮体的浓度基本恒定，而在糖尿病酮症及其他酮体偏高症状发生早期，3-羟基丁酸就可有明显升高，此时乙酰乙酸尚无明显变化。在酮症恢复期，3-羟基丁酸迅速下降时，乙酰乙酸在一定时间内仍然保持升高或下降缓慢，这时用硝普盐法会引起临床对病情的高估。因此，3-羟基丁酸的测定在糖尿病酮症及其他酮体偏高症状的诊断、治疗监测中比乙酰乙酸测定更灵敏，更可靠，同样在糖尿病控制的预防中也非常有价值，正常人血3-羟基丁酸＜0.27mmol/L。
同时，3-羟基丁酸在奶牛酮病诊断预防中也是一个重要指标奶牛酮病是泌乳奶牛常见的营养代谢病，主要类型有：
(1)原发性酮病(生产性或自发性酮病)(primary ketosis，productive ketosis orspontaneous ketosis)-干物质摄入减少而能量需求增加所致的能量负平衡；
(2)继发性酮病(secondary ketosis)-采食量减少；
(3)食物性酮病(alimentary ketosis)-青贮丁酸含量高；
(4)饥饿性酮病(starvation ketosis)-体况不佳，饲料质量不良；
(5)特殊营养缺乏性酮病(ketosis due to specific nutritional deficiency)-钴缺乏、磷缺乏。
酮病表现为高血酮持续能量负平衡，严重的会导致高血脂而发生脂肪肝，产奶量、乳汁质量下降，繁殖性能降低，以及内分泌紊乱等，从而导致奶牛淘汰率增加，给奶牛场造成严重的经济损失。据研究，美国奶牛的酮病发生率达到17％，印度达15％，而加拿大，在泌乳期的前9周，奶牛亚临床酮病的发病率高达59％。我国奶牛酮病的发病率占泌乳牛的10％～30％，且发病率有逐年上升的趋势。定期对奶牛奶酮，尿酮，血酮水平进行监测，更好地控制和预防酮病，减少奶牛场的经济损失。
牛奶中3-羟基丁酸、丙酮的变化临界值常用于诊断奶牛酮病的手段。血酮在100mg/L～200mg/L为亚临床酮病，60mg/L～100mg/L为可疑酮病；血浆中BHBA正常值为小于1.0mmol/L，当其在1mmol/L～2.5mmol/L为亚临床型酮病。奶牛血清中的BHBA在0.9mmol/L以下为正常，0.9mmol/L～1.7mmol/L为轻微酮血症，大于1.7mmol/L为严重酮血症。尿酮正常为3mg/L～30mg/L，在30mg/L以上为异常，在100mg/L以上为亚临床症状。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种糖尿病酮症及其他酮体偏高症状诊断试纸，该试纸可以组装成多种检测装置，且具有操作方便，检测快速，灵敏度好，准确性高等优点，具有良好的应用前景。
本发明的一种糖尿病酮症及其他酮体偏高症状诊断试纸，包括如下试剂：
(1)第一相浸液 总体积v＝100ml
稳定剂和/或保护剂1-10g；
牛血清白蛋白20-2000mg； 草酸200-2000mg；
NAD+(辅酶I)0.1-2.0g； NADP+(辅酶II)0.01-1.0g；
黄递酶200-20000iu； 3-羟基丁酸脱氢酶2000-100000iu；
补加缓冲液至总体积为100ml；
(2)第二相浸液 总体积v＝100m
氯化硝基四氮唑蓝NBT 0.1-0.5g；
吩嗪二甲酯硫酸盐PMS 0.02-0.2g；
补加有机溶剂至总体积为100ml；
所述的稳定剂和/或保护剂是天然或人工聚合高分子胶体；选自明胶、阿拉伯胶、牛血清白蛋白、聚乙二醇、聚丙烯酸-丙烯酸酯中的一种或几种混合物；
所述的缓冲液为pH＝5.8-8.8的40-80mmol/L Tris-丙二酸缓冲液或磷酸盐缓冲液；
所述的有机溶剂为乙醇或甲醇；
本发明的一种糖尿病酮症及其他酮体偏高症状诊断试纸的制备方法，包括：
(1)将滤纸在上述第一相浸液中浸泡3-8分钟后，吸取过多的浸液，于20-50℃下迅速温热干燥，再在第二相浸液中浸泡3-8分钟后，于20-50℃下再次干燥，得到测定试纸的原纸；
(2)将上述测定试纸的原纸粘贴在塑料片基上，切割成块，制得测定试剂条。
所述的试剂条的规格为0.3×0.3～0.8×0.8cm2。
本发明的反应原理如下：
NAD(P)H+PMS→NAD(P)++PMS·H2
PMS·H2+NBT→PMS+formazan
其中，NAD+：辅酶I；
NADH：还原辅酶I；
NADP：辅酶II；
NADPH：还原辅酶II；
Diaphorase：黄递酶；
NBT：硝基四氮唑蓝，氯化硝基四氮唑蓝一类显色剂；
PMS：吩嗪二甲酯硫酸盐；
formazan：甲臜(为蓝紫色化合物)；
生成的formazan的显色程度与待测体液的3-羟基丁酸浓度正相关，可以印制成标准色卡附加在包装材料(密封袋或说明书)上，显色的程度与标准色可比较从而半定量测定3-羟基丁酸浓度。
有益效果
本发明的诊断试纸可以组装成多种检测装置，且具有操作方便，检测快速，灵敏度好，准确性高等优点，可以半定量检测常规液体(如，牛奶、尿液)、血液(如，血清/全血)中的3-羟基丁酸的含量，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为试剂块与PVC片所组成的检测装置；
图2为由试剂块、滤血膜、两片PVC片所组成的检测装置；
其中，一片PVC作为显色面，另一片PVC作为加样面。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
第一相酶溶液液总体积为100mL的配制过程如下：
1)溶入阿拉伯胶5g；
2)溶入牛血清白蛋白500mg；
3)溶入草酸300mg；
4)溶入NAD+0.5g，NADP+0.2g；
5)溶入黄递酶，10000iu；
6)溶入3-羟基丁酸脱氢酶100000iu；
7)加入pH8.0的50mmol/L Tris-丙二酸缓冲液至100ml；
第一相溶液浸渍：
溶液制备好后，加入浸渍机，将一卷whatman 3MM滤纸安装好，烘干温度设定30℃，走纸速度设定3.0mm/秒，开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干；
第二相溶液制备：
溶入氯化硝基四氮唑蓝250mg；(即浓度为0.25g/100ml)
吩嗪二甲酯硫酸盐100mg；(即浓度为0.10g/100ml)
以无水乙醇100ml为溶剂。
第二相溶液浸渍：
将第二相溶液加入浸渍机，将浸好第一相的滤纸安装好，烘干温度设定45℃，走纸速度设定3.0mm/秒，开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干，至此原纸制作完成。
试纸制作：取一段原纸，单面贴好双面胶，用5mm滚刀切成5mm细条，将细条贴在8cm*25cm宽的pvc薄片上，在用滚刀切成5mm宽的试剂条，放到黑色密闭瓶中，放好干燥剂备用。
牛奶3-羟基丁酸浓度的测定：
3-羟基丁酸钠sigma：H6501
新鲜牛奶(光明)，称取12.60mg3-羟基丁酸钠，加入100ml鲜牛奶中溶解，分别用鲜牛奶稀释成0umol/L，50umol/L，100umol/L，200umol/L，500umol/L，1000umol/L六种浓度。取六根实施例1制备的试剂条同时浸入上述六种溶液中，约十秒钟取出，用吸水纸吸去多余水分，然后两分钟看颜色，结果从阴性的黄色到1000umol/L的深紫色各梯度区分明显。
实施例2
第一相酶溶液液总体积为100mL的配制过程如下：
8)溶入阿拉伯胶5g；
9)溶入牛血清白蛋白500mg；
10)溶入草酸300mg；
11)溶入NAD+0.5g，NADP+0.2g；
12)溶入黄递酶，10000iu；
13)溶入3-羟基丁酸脱氢酶100000iu；
14)加入pH8.0的50mmol/L Tris-丙二酸缓冲液至100ml；
第一相溶液浸渍：
溶液制备好后，加入浸渍机，将一卷whatman 3MM滤纸安装好，烘干温度设定30℃，走纸速度设定3.0mm/秒，开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干；
第二相溶液制备：
溶入氯化硝基四氮唑蓝250mg；
吩嗪二甲酯硫酸盐100mg；
以无水乙醇100ml为溶剂。
第二相溶液浸渍：
将第二相溶液加入浸渍机，将浸好第一相的滤纸安装好，烘干温度设定45℃，走纸速度设定3.0mm/秒，开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干，至此原纸制作完成。
试纸制作：取一段原纸，单面贴好双面胶，用5mm滚刀切成5mm细条，将细条贴在8cm*25cm宽的pvc薄片上，在用滚刀切成5mm宽的试剂条，放到黑色密闭瓶中，放好干燥剂备用。(图1)
全血3-羟基丁酸浓度的测定：
取一段原纸用8mm滚刀切成8mm细条，然后再用剪刀剪成方块备用，在8cm*25cm宽的pvc薄片单侧贴好双面胶，然后用8mm滚刀切成8mm宽的细条，在距一端10mm处打直径5mm的孔，将试剂块贴在打孔的位置上，试剂块上面覆盖一块10mm*5mm的滤血膜，备用。(图2)
取10份用雅培c8000生化仪测定3-羟基丁酸的血样用上述试条测定，结果阴阳性，及阳性标本的浓度，基本和生化仪的结果相符。
实施例3
第一相酶溶液液总体积为100mL的配制过程如下：
1)溶入阿拉伯胶5g；
2)溶入牛血清白蛋白500mg；
3)溶入草酸300mg；
4)溶入NAD+0.5g，NADP+0.5g；
5)溶入黄递酶，10000iu；
6)溶入3-羟基丁酸脱氢酶100000iu；
7)加入pH8.7的80mmol/L Tris-丙二酸缓冲液至100ml；
第一相溶液浸渍：
溶液制备好后，加入浸渍机，将一卷whatman 3MM滤纸安装好，烘干温度设定30℃，走纸速度设定3.0mm/秒，开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干；
第二相溶液制备：
溶入氯化硝基四氮唑蓝250mg；
吩嗪二甲酯硫酸盐100mg；
以无水乙醇100ml为溶剂。
第二相溶液浸渍：
将第二相溶液加入浸渍机，将浸好第一相的滤纸安装好，烘干温度设定45℃，走纸速度设定3.0mm/，开始浸渍走纸，溶液浸完后滤纸在烘干箱停留1小时，以便完全烘干，至此原纸制作完成。
试纸制作：取一段原纸，单面贴好双面胶，用5mm滚刀切成5mm细条，将细条贴在8cm*25cm宽的pvc薄片上，在用滚刀切成5mm宽的试剂条，放到黑色密闭瓶中，放好干燥剂备用。(图1)
尿液3-羟基丁酸浓度的测定：
3-羟基丁酸钠sigma：H6501
阴性尿液3-羟基丁酸，称取12.60mg3-羟基丁酸钠，加入100m阴性尿液中溶解，分别用阴性尿液稀释成0umol/L，100umol/L，200umol/L，500umol/L，1000umol/L五种浓度。取5根实施例2制备的试剂条同时浸入上述5种溶液中，约十秒钟取出，用吸水纸吸去多余水分，然后两分钟看颜色，结果从0的黄色到1000umol/L的深紫色各梯度区分明显。
Claims (2)
1.一种糖尿病酮症及其他酮体偏高症状诊断试纸，其特征在于：所述的诊断试纸的制备方法，包括：
（1）将滤纸在第一相浸液中浸泡3-8分钟后，吸取过多的浸液，于20-50℃下迅速温热干燥，再在第二相浸液中浸泡3-8分钟后，于20-50℃下再次干燥，得到测定试纸的原纸；
（2）将上述测定试纸的原纸粘贴在塑料片基上，切割成块，制得测定试剂条；
所述的第一相浸液 v=100ml
稳定剂1-10g；
牛血清白蛋白20-2000mg； 草酸200-2000mg；
NAD+（辅酶I）0.1-2.0g； NADP+（辅酶II）0.01-1.0g；
黄递酶200-20000 IU； 3-羟基丁酸脱氢酶2000-100000 IU；
补加缓冲液至总体积为100ml；
所述的第二相浸液 v=100 ml
氯化硝基四氮唑蓝NBT 0.1-0.5g；
吩嗪二甲酯硫酸盐PMS 0.02-0.2g；
补加有机溶剂至总体积为100ml；
所述的稳定剂是天然或人工聚合高分子胶体；选自明胶、阿拉伯胶、牛血清白蛋白、聚乙二醇、聚丙烯酸-丙烯酸酯中的一种或几种混合物；
所述的缓冲液为pH=5.8-8.8的40-80mmol/L Tris-丙二酸缓冲液或磷酸盐缓冲液；
所述的有机溶剂为乙醇或甲醇。
2.根据权利要求1所述的一种糖尿病酮症及其他酮体偏高症状诊断试纸，其特征在于：所述的试剂条的规格为0.3×0.3~0.8×0.8 cm2。
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