CN103792230A - 一种奶牛酮病诊断试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种奶牛酮病诊断试剂盒及其检测方法。试剂盒包括试剂1、试剂2、试剂3、检测器和标准比色板，试剂1为心肌黄酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-羟丁酸脱氢酶的混合物，试剂2为二甲基亚砜、磷酸氢二钠、氯化镁、叠氮钠和亚硝酸钠的混合溶液，试剂3为噻唑蓝溶液。检测时，首先进行乳汁中酮体的分离，然后在检测器的加样孔中加入配制好的试剂1、试剂2及试剂3的混合液和被检样品，反应3min后与标准比色板对照即可判读检测结果。该试剂盒操作简便，特异性和灵敏度高，重复性好，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种奶牛酮病诊断试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于兽医临床诊断学领域，涉及一种奶牛酮病诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

酮病是围产期奶牛的重要的营养代谢性疾病，具有发病率高、群发性的特点。妊娠母牛分娩后，采食量下降，同时泌乳量迅速增加，奶牛处于能量负平衡状态，引起奶牛酮病的发生。奶牛酮病的主要特点是乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮含量升高和血葡萄糖含量降低。近年来，由于高产奶牛品种的引进和繁育、高能饲料的开发、使用，集约化饲养管理的普及等方面的因素，使得奶牛酮病的发病率日益升高。酮病奶牛的产奶量显著降低，且容易继发脂肪肝、子宫内膜炎、生产瘫痪、乳腺炎和胎衣不下等疾病，提高了奶牛的淘汰率，导致的诊疗及产奶量降低等经济损失比较巨大。据报道，中国奶牛酮病的发病率占泌乳牛的20-30％，严重制约我国奶牛养殖业的健康发展。

根据是否出现临床症状，常将酮病分为临床酮病和亚临床酮病。在大多数临床病例中，酮病的临床综合症与病牛血液酮体水平存在较高的相关性奶牛酮病的主要代谢障碍是低血糖和高酮(乳酮、尿酮和血酮)体，并共同引发酮病的临床症状。临床酮病是指病牛出现了明显的损害健康的症状，使管理人员认为有必要进行下一步的诊断调查，对经实验室或牛旁检测酮体升高的病例进行治疗。临床症状包括产奶量显著降低、采食减少、粪便干燥和体重降低。另一方面，亚临床酮病指奶牛体内酮体含量超过阈值，但无明显临床症状。由于亚临床酮病不出现明显的临床症状，监控项目开展时必须对看似健康的牛进行检测，以检出亚临床酮病奶牛。血液、尿液和乳汁中酮体含量升高，但不表现临床症状的称为亚临床酮病，相比较于临床酮病，亚临床酮病给奶牛带来更大的经济损失。大量的研究结果表明，亚临床酮病在高产奶牛产后2-8周广泛存在，发病率在8-36％之间。

奶牛亚临床酮病的诊断主要依靠检测血液中的酮体含量来实现，在规模化奶牛养殖场，采集牛的血液工作量大，耗时费力，且需要的仪器设备要求高，检测成本也较高，针对我国实际国情，目前仍难以大范围普及使用。此外，采集血液本身对奶牛是一种应激反应，存在一定的损伤，而对于奶牛酮病，需要常态化的定期监控，常态化的采集血液会导致奶牛各方面的应激反应。而相较于采集血液，采集牛乳则非常方便、经济，在每日榨乳时使用试管即可收集，且不会对奶牛产生应激和损伤。酮体包括乙酰乙酸、丙酮和β-羟丁酸，在乳汁中β-羟丁酸的含量最高且性质稳定，因此，检测乳汁β-羟丁酸的含量实现奶牛亚临床酮病的诊断最为可行。

发明内容

本发明的目的在于建立一种使用牛乳检测奶牛酮病的试剂盒，以便更快速准确检测奶牛酮病。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种奶牛酮病诊断试剂盒，包括检测器、3种试剂和标准比色板检测试剂，检测器上开有多个加样孔，检测器的一端设置有凹槽，检测器的另外一端为手持端，试剂1为心肌黄酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-羟丁酸脱氢酶的混合物，按质量比为2∶2∶1混合；试剂2为二甲基亚砜、磷酸氢二钠、氯化镁、叠氮钠和亚硝酸钠的混合溶液，二甲基亚砜质量浓度为0.1％，叠氮钠的质量浓度为0.01％、亚硝酸钠的质量浓度为0.01％，磷酸氢二钠的质量浓度为1％，氯化镁的质量浓度为1％；试剂3为噻唑蓝溶液，质量浓度为0.2％。

本发明还具有如下技术特点：

1、所述的标准比色板为1个白色区间和3个紫色区间，其中3个紫色区间随酮浓度增加，从左至右颜色逐渐加深；4个颜色区间分别对应的结果为正常，弱阳，中阳和强阳。

2、本试剂盒采用奶牛乳汁检测。

3、一种以非诊断为目的检测奶牛酮病的检测方法：

步骤一、乳汁酮体分离的方法为：将新鲜采集的奶牛乳汁收集于离心管中，按体积比3∶1∶1∶1，加入质量浓度为50％高氯酸、质量浓度为37％盐酸、质量浓度为98％硫酸和质量浓度为65％硝酸，16500r／min离心15-20min，收集上清液待测；

步骤二、取200mg试剂1，加入到20mL试剂2中混合均匀，将试剂1和试剂2的混合液加入到检测器的加样孔中，每孔加入50μL，再加入20μL试剂3，充分混匀，最后加入50μL乳汁上清液样品；所述的试剂1为心肌黄酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-羟丁酸脱氢酶的混合物，按质量比为2∶2∶1混合；试剂2为二甲基亚砜、磷酸氢二钠、氯化镁、叠氮钠和亚硝酸钠的混合溶液；二甲基亚砜质量浓度为0.1％，叠氮钠和亚硝酸钠的质量浓度为0.01％，磷酸氢二钠，氯化镁的质量浓度为1％；试剂3为噻唑蓝溶液，质量浓度为0.2％；

步骤三、加样3min后观察颜色反应，与标准比色板所提供的标准色阶相对照，判读检测结果；所述的标准比色板从左至右为1个白色区间和3个紫色区间，其中3个紫色区从左至右颜色逐渐加深，体现从左至右酮浓度逐渐增加。

4、其中，步骤二或采取如下方法：

取200mg试剂1，加入到20mL体积比为5∶2的试剂2和试剂3的混合液中，充分混匀，将混合液加入到检测器的加样孔中，每孔加入50μL，然后再加入50μL乳汁上清液样品。

本发明涉及的试剂盒具有使用方便、经济实用、敏感性和特异性高、稳定性好的特点，适用于规模化奶牛养殖场的奶牛酮病的快速诊断。

附图说明

图1为试剂盒检测器的纵观图；

图2为试剂盒检测器的横观图；

图3为试剂盒的标准比色板。

具体实施方式

实施例1

溶液的配制及样品的检测

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述：

(1)本试剂盒检测的原理

(2)溶液的组成及配制

试剂1为心肌黄酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-羟丁酸脱氢酶的混合物，按质量比为2∶2∶1混合。配制时分别称取200mg心肌黄酶、200mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和100mgβ-羟丁酸脱氢酶，混合均匀盛放于棕色塑料内，-20℃密封保存备用。

试剂2为二甲基亚砜、磷酸氢二钠、氯化镁、叠氮钠和亚硝酸钠的混合溶液；二甲基亚砜质量浓度为0.1％，叠氮钠的质量浓度为0.01％、亚硝酸钠的质量浓度为0.01％，磷酸氢二钠的质量浓度为1％，氯化镁的质量浓度为1％，溶剂为灭菌蒸馏水，保存于试剂瓶内备用。

试剂3为噻唑蓝溶液，质量浓度为0.2％，溶剂为灭菌蒸馏水。

(3)样品的检测

步骤一，乳汁酮体分离的方法为：取新鲜采集的奶牛乳汁收集于3mL离心管中，加入0.2mL混合液，其混合为质量浓度为50％高氯酸、质量浓度为37％盐酸、质量浓度为98％硫酸和质量浓度为65％硝酸，16500r／min离心15-20min，收集上清液待测。

步骤二，取200mg试剂1，加入到20mL试剂2中混合均匀，将试剂1和试剂2的混合液加入到检测器的加样孔中，每孔加入50μL，再加入20μL试剂3，充分混匀，加入50μL乳汁上清液样品。

步骤三，加样3min后观察颜色反应，与标准比色板所提供的标准色阶相对照，判读检测结果。

实施例2

溶液的配制及样品的检测

(1)溶液的组成及配制

试剂1为心肌黄酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-羟丁酸脱氢酶的混合物，按质量比为2∶2∶1混合。配制时分别称取200mg心肌黄酶、200mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和100mgβ-羟丁酸脱氢酶，混合均匀盛放于棕色塑料内，-20℃密封保存备用。

试剂2为二甲基亚砜、磷酸氢二钠、氯化镁、叠氮钠和亚硝酸钠的混合溶液；二甲基亚砜质量浓度为0.1％，叠氮钠的质量浓度为0.01％、亚硝酸钠的质量浓度为0.01％，磷酸氢二钠的质量浓度为1％，氯化镁的质量浓度为1％，溶剂为灭菌蒸馏水，保存于试剂瓶内备用。

试剂3为噻唑蓝溶液，质量浓度为0.2％，溶剂为灭菌蒸馏水。

(2)样品的检测：

步骤一，乳汁酮体分离的方法为：取新鲜采集的奶牛乳汁收集于3mL离心管中，加入0.2mL混合液，其混合为质量浓度为50％高氯酸、质量浓度为37％盐酸、质量浓度为98％硫酸和质量浓度为65％硝酸，16500r／min离心15-20min，收集上清液待测。

步骤二，取200mg试剂1，加入到20mL体积比为5∶2的试剂2和试剂3的混合液中，充分混匀，将混合液加入到检测器的加样孔中，每孔加入50μL，最后加入50μL乳汁上清液样品。

步骤三，加样3min后观察颜色反应，与标准比色板所提供的标准色阶相对照，判读检测结果。

实施例3

临床应用性研究

选取3个黑龙江省规模化饲养的奶牛养殖场，随机取500头产后2个月内的泌乳奶牛的乳样和血样，按照本发明所提及的乳样处理方法处理乳样，采用本发明的试剂盒检测，同时按照表1配制酮粉(已有的一种奶牛酮病检测方法)并检测乳汁酮体含量，比较2种检测方法。使用酶催化动力学方法试剂盒(UK，Randox)测定血样中β-羟丁酸含量，检测仪器为美国贝克曼全自动生化分析仪，以血样中β-羟丁酸含量>1200μmol／L为阳性判读标准。测试结果表明该试剂盒检测的敏感性可达到90％，特异性92％。检测结果优于酮粉法，结果如表2所示。

表1酮粉的配制

表2试剂盒检测的敏感性和特异性

注：敏感性：真正的阳性样品被检出为阳性的百分率；特异性：真正的阴性结果被检出为阴性的百分率。

本发明涉及的检测奶牛乳汁β-羟丁酸的奶牛酮病诊断试剂盒具有使用方便、经济实用、敏感性和特异性高、稳定性好的特点，适用于规模化奶牛养殖场的奶牛酮病的快速诊断。

Claims (5)

1.一种奶牛酮病诊断试剂盒，包括检测器、3种试剂和标准比色板，其特征在于：检测器上开有多个加样孔，检测器的一端设置有凹槽，检测器的另外一端为手持端，试剂1为心肌黄酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-羟丁酸脱氢酶的混合液，按质量比为2∶2∶1混合；试剂2为二甲基亚砜、磷酸氢二钠、氯化镁、叠氮钠和亚硝酸钠的混合溶液，二甲基亚砜质量浓度为0.1％，叠氮钠的质量浓度为0.01％、亚硝酸钠的质量浓度为0.01％，磷酸氢二钠的质量浓度为1％，氯化镁的质量浓度为1％；试剂3为噻唑蓝溶液，质量浓度为0.2％。

2.根据权利要求1所述的一种奶牛酮病诊断试剂盒，其特征在于：所述的标准比色板为1个白色区间和3个紫色区间，其中3个紫色区间随酮浓度增加，从左至右颜色逐渐加深；4个颜色区间分别对应的结果为正常，弱阳，中阳和强阳。

3.根据权利要求1或2所述的一种奶牛酮病诊断试剂盒，其特征在于：采用奶牛乳汁检测。

4.一种以非诊断为目的检测奶牛酮病的检测方法，其特征在于：

步骤一、乳汁酮体分离的方法为：将新鲜采集的奶牛乳汁收集于离心管中，按体积比3∶1∶1∶1，加入质量浓度为50％高氯酸、质量浓度为37％盐酸、质量浓度为98％硫酸和质量浓度为65％硝酸，16500r／min离心15-20min，收集上清液待测；

步骤二、取200mg试剂1，加入到20mL试剂2中混合均匀，将试剂1和试剂2的混合液加入到检测器的加样孔中，每孔加入50μL，再加入20μL试剂3，充分混匀，最后加入50μL乳汁上清液样品；所述的试剂1为心肌黄酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和β-羟丁酸脱氢酶的混合物，按质量比为2∶2∶1混合；试剂2为二甲基亚砜、磷酸氢二钠、氯化镁、叠氮钠和亚硝酸钠的混合溶液，二甲基亚砜质量浓度为0.1％，叠氮钠的质量浓度为0.01％、亚硝酸钠的质量浓度为0.01％，磷酸氢二钠的质量浓度为1％，氯化镁的质量浓度为1％；试剂3为噻唑蓝溶液，质量浓度为0.2％；

步骤三、加样3分钟后观察颜色反应，与标准比色板所提供的标准色阶相对照，判读检测结果；所述的标准比色板从左至右为1个白色区间和3个紫色区间，其中3个紫色区从左至右颜色逐渐加深，体现从左至右酮浓度逐渐增加。

5.根据权利要求4所述的一种以非诊断为目的检测奶牛酮病的检测方法，其特征在于，步骤二或采取如下方法：

取200mg试剂1，加入到20mL体积比为5∶2的试剂2和试剂3的混合液中，充分混匀，将混合液加入到检测器的加样孔中，每孔加入50μL，然后再加入50μL乳汁上清液样品。

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