CN2613760Y - 乙型肝炎五项指标集成检测反应板和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及乙型肝炎五项指标集成检测反应板和试剂盒。所述的反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括1－200个样本孔，2－5个阴性对照孔，1－3个阳性质控孔，其中每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着HBsAg、HBeAg二种抗原和抗－HBs、抗－Hbe、抗－HBc三种抗体的蛋白质微点阵。本实用新型的反应板和试剂盒可简便快速地同时检测多人份的乙型肝炎五项指标。
Description
技术领域
本实用新型属于体外临床诊断检测技术领域，确切地说，属于一种适于乙型肝炎五项指标(HBsAg\抗-HBs\HBeAg\抗-HBe\抗-HBc)集成检测的反应板和试剂盒。
背景技术
HBsAg、抗-HBs、HbeAg、抗-Hbe、抗-HBc检测是乙型肝炎诊断的五项最为常用的指标，目前多使用的固相酶免分析法(ELISA)进行单指标检测。
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，也可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
ELISA法的类型包括：双抗体夹心法、双抗原夹心法、间接法、竞争法等。
双抗体夹心法其原理及操作步骤为：
1)将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2)加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
3)加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量
双抗原夹心法其原理及操作步骤为：
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
竞争法其原理及操作步骤为：
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBcELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。
在乙肝五项中，HBsAg、HbeAg二项常用双抗体夹心法，抗-HBs常用双抗原夹心法，抗-Hbe、抗-HBc常用竞争法。目前现有的检测方法最大的缺点是每个反应孔一次只能检测一个指标，检测效率低。
因此，本领域迫切需要开发能够同时检测乙型肝炎五项指标(HBsAg\抗-HBs\HBeAg\抗-HBe\抗-HBc)的检测反应板和试剂盒。
发明内容
本实用新型的目的就是提供一种能够同时检测乙型肝炎五项指标(HBsAg\抗-HBs\HBeAg\抗-HBe\抗-HBc)的检测反应板和试剂盒。该反应板和试剂盒可简便快速地同时检测多人份的乙型肝炎五项指标。
在本实用新型的第一方面，提供了一种乙肝五项集成检测反应板，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括1-200个样本孔，2-5个阴性对照孔，1-3个阳性质控孔，其中，其特征在于：每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着HBsAg、HBeAg二种抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三种抗体的蛋白质微点阵。
在一优选例中，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。
在另一优选例中，所述样本孔的数量为5-50个。
在另一优选例中，所述的HBsAg、HBeAg二种抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三种抗体在固相载体上各有3个点样点。
在本实用新型的第二方面，提供了一种乙肝五项集成检测试剂盒，它包括本实用新型上述的乙肝五项集成检测反应板。
在另一优选例中，还包括：酶结合物、反应液和检测液、阴性对照、阳性质控品。
在另一优选例中，所述的反应液由HRP标记的抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc混合组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，使用前混合。
在另一优选例中，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。
附图说明
图1是本实用新型一种固相载体上乙肝抗原和抗体的点样示意图。
图2是在本实用新型的反应孔中进行的各抗原一抗体反应的示意图。
具体实施方式
乙型肝炎五项指标集成检测的关键和难点是，HBsAg与抗-HBs、HbeAg与抗-HBe的难以同时检测。本实用新型经过深入而广泛的研究，对检测反应板作了改进，在本实用新型中检测抗原用双抗体夹心法，而检测对应抗体用竞争法，从而解决了抗原及其抗体同时检测的的问题。
具体而言，为提高乙肝五项(HBsAg、HbeAg、抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc)的检测效率，本实用新型利用固相酶免分析原理，应用微点阵检测技术和化学发光检测技术设计了一种乙肝五项集成检测反应板，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括1-200个样本孔，2-5个阴性对照孔，1-3个阳性质控孔，其中，其特征在于：每一反应孔的底部平面上有固相载体，且在固相载体上包被着HBsAg、HBeAg二种抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三种抗体的蛋白质微点阵。
各反应孔的数量没有特别限制，通常样本孔为1-200个，较佳地5-50个。阴性对照孔为2-5个，较佳地2-4个。阴性质控孔为1-3个，较佳地为2-3个。
在本实用新型中，反应孔的形状和大小没有特别限制，可以是圆形、方形、六角形、椭圆形、或其他如何形状。大小通常为直径0.1-5cm，深度为0.1-2cm。
在本实用新型中，反应板基板的材料可以选用本领域常用的各种材料，较佳的基材材料包括玻璃、塑料、陶瓷等。
在本实用新型中，包被乙肝抗原或抗体的固相载体可以选用本领域常用的各种固相载体，包括(但并不限于)：玻璃片、塑料片、硝酸纤维(NC)膜、PDVF膜等，较佳的固相载体包括NC、PDVF膜。
用于本实用新型的HBsAg、HBeAg二种抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三种抗体都可用常规方法制备或购得。此外，可采用本领域常规的各种包被方法将抗原或抗体包被在固相载体。
在固相载体上，HBsAg、HBeAg二种抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三种抗体各有2-5个点样点，较佳地3个点样点。此外，较佳地在固相载体上还包括一个定位点(见图1)。各点样点之间的距离通常为0.1-100mm。
另一方面，本实用新型还提供了一种乙肝五项集成检测试剂盒，该试剂盒可实现多指标并行化、高通量检测。它包括本实用新型的反应孔板、洗涤液、反应液、检测液(A、B)、阴性对照、阳性质控品等。其中反应液由HRP标记的抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc混合组成，检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，发光物为鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物等，使用前混合。
在本实用新型中，HBsAg、HbeAg的检测用双抗体夹心法，抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc的检测用竞争法，检测原理如图2所示。
本实用新型巧妙地综合利用了固相酶联免疫原理、蛋白质微点阵检测技术和化学发光检测技术，实现了乙型肝炎五种指标的同时检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
检测反应板的制备
取96孔板，设置90个样本孔，3个阴性对照孔，3个阳性质控孔。在每个反应孔的底部放置一固相载体(NC膜或PDVF膜)，且在固相载体上包被着HBsAg、HBeAg二种抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三种抗体的蛋白质微点阵(图1)。
实施例2
试剂盒制备
制备含一乙型肝炎五项指标集成检测，它含有
实施例1的反应孔板一块(16-36人份)，洗涤浓缩液1瓶，反应液1瓶，检测液A一瓶，检测液B一瓶，阳性对照一瓶，阴性对照一瓶。
洗涤浓缩液、反应液、检测液A、检测液B、阳性对照和阴性对照与常规的单指标检测乙型肝炎中所用的试剂相同。
实施例3
乙型肝炎五项指标集成检测
按以下方法对各测试血清样品进行检测：
1、加待检测血清或阴性对照、阳性质控于相应反应孔内，100ul/孔。
2、37℃保温振荡反应30分钟。
3、用洗液洗涤4-6次，每次浸泡2分钟。
4、每孔加反应液100ul/孔。
5、用洗液洗涤4-6次，每次浸泡2分钟。
6、加检测液20ul/孔，振动，使检测液均匀分布于孔的底部。
7、用CCD检测，视发光信号强度曝光30-60秒。
结果判定
HBsAg、HbeAg
样本信号值/阴性对照值≥1.6
抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc
(阴性对照信号值-样本信号值)/阴性对照信号值≥0.34
与此同时，用常规方法对测试的血清样品进行常规检测。结果表明，用本实用新型的试剂盒得出的测试结果与常规方法相同。
在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种乙肝五项集成检测反应板，其特征在于，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括1-200个样本孔，2-5个阴性对照孔，1-3个阳性质控孔，其中，其特征在于：每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着HBsAg、HBeAg二种抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三种抗体的蛋白质微点阵。
2.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。
3.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述样本孔的数量为5-50个。
4.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的HBsAg、HBeAg二种抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三种抗体在固相载体上各有3个点样点。
4.一种乙肝五项集成检测试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1所述的乙肝五项集成检测反应板。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括：酶结合物、反应液和检测液、阴性对照、阳性质控品。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的反应液由HRP标记的抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc混合组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，使用前混合。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN103792230A (zh) * | 2014-01-13 | 2014-05-14 | 东北农业大学 | 一种奶牛酮病诊断试剂盒及其检测方法 |
| CN108982838A (zh) * | 2018-08-21 | 2018-12-11 | 江苏三联生物工程有限公司 | 一种用于传染病检测的蛋白芯片及其制备方法 |
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2003
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: QUFU YULON BIOLOGY TECHNOLOGY LTD. Free format text: FORMER OWNER: MU HAIDONG Effective date: 20060721 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20060721 Address after: 273100 Administrative Committee of Qufu Economic Development Zone, Shandong Patentee after: Qufu Yulong Biological Technology Co., Ltd. Address before: 200233 building 50, building 1089, 4 North Qinzhou Road, Shanghai Patentee before: Mu Haidong |
|
| C57 | Notification of unclear or unknown address | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Zhang Dandan Document name: Notification of Termination of Patent Right |
|
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CX01 | Expiry of patent term |
Expiration termination date: 20130331 Granted publication date: 20040428 |
|
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Zhang Dandan Document name: Notification of Expiration of Patent Right Duration |