CN108982838A - 一种用于传染病检测的蛋白芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于六项传染病标志物检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：（1）黑玻片预处理；（2）抗体溶液或抗原溶液点样；（3）封闭工艺；制得所述蛋白芯片。本发明蛋白芯片用于检测传染病，可以对乙肝，丙肝，梅毒和艾滋病的重要标志物浓度进行快速测定。本发明人开发了同时包含有TP‑Ab、HIV‑Ab、HCV‑Ab、HBs‑Ag、HBe‑Ag和HBc‑Ag六个指标的蛋白芯片诊断试剂盒，具有快速，高效，低成本等优点。

Description

一种用于传染病检测的蛋白芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测传染病的蛋白芯片及其制备方法。

背景技术

传染病对患者而言，轻者引起不适，严重影响肝、肾、脑、心、肺、血液等器官等功能障碍，甚至危及生命；对家庭和社会而言，可以传染给接触密切者，部分传染病传播极快，可以威胁全社会；同时造成社会资源的浪费和环境的污染。为了避免生命的危害，减少资源的浪费和环境的污染，并且随着科技不断发展，血液中的传染病监测被逐步应用于临床，给传染病的早期诊断、诊断提供了方法。

六个传染传染病指标：TP、HCV、HIV、HBs-Ag、HBe-Ag、HBc-Ag。

TP(梅毒)由梅毒螺旋体引起，患病后病程漫长，早期侵犯生殖器和皮肤，晚期侵犯全身各器官，并生多种多样的症状和体征，病变几乎能累及全身各个脏器，由于其病程长，危害性大。

HCV(丙型病毒性肝炎)是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等传播，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌。

HIV(人类免疫缺陷病毒)是一种危害性极大的传染病，由感染艾滋病病毒(HIV病毒)引起。HIV是一种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免疫系统中最重要的CD4T淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能，因此，人体易于感染各种疾病，并可发生恶性肿瘤，病死率较高。

HBs-Ag(乙型肝炎表面抗原)是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。

HBe-Ag(乙型肝炎病毒e抗原)是乙肝病毒内核的一种主要结构蛋白，它的检出可作为DNA多聚酶和环状DNA分子存在的标志，表示肝细胞有进行性损害和高度传染性。在临床实践中，HBe-Ag的检测对指导乙型肝炎的诊断和治疗也具有十分重要的临床意义。

HBc-Ag(乙型肝炎核心抗原)在HBV感染中占有重要地位，他能反映血清中:Dane颗粒的存在及肝内HBV的复制，并可与其他的HBV血清学标志物起互相配合和互相补充的作用。

目前这六个指标已经被医院广泛应用检测。但是目前采取的主流方法是免疫单指标的测定方法(例如ELISA和化学发光法等)。虽然能够测定这六个指标，但是存在检测速度慢，检测成本高等缺点。而且六个指标分别检测存在着操作不便，出错概率大等现实问题。自身是否感染传染病是大众急切想知道的问题，为了加快检测的速度，不少医院不得不同时采多管血样，分别用于检测TP、HCV、HIV、HBs-Ag、HBe-Ag、HBc-Ag，造成了较大的浪费和病人负担。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种用于传染病检测的蛋白芯片及其制备方法。本发明蛋白芯片用于检测传染病六个指标，应用本公司独创的蛋白芯片技术实现联合检测可以有效地提高检测效率，降低检测成本；本发明人开发了同时包含有TP、HCV、HIV、HBs-Ag、HBe-Ag、HBc-Ag六个指标的蛋白芯片诊断试剂盒，具有快速，高效，低成本等优点。

本发明的技术方案如下：

一种用于传染病检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：

(1)黑玻片预处理；

(2)抗体溶液点样；

(3)封闭工艺，制得所述蛋白芯片。

步骤(1)中所述黑玻片预处理的方法为：

①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16～24h，之后采用纯化水清洗2～8次；

②将黑玻片置于质量浓度为0.05～1％的硅烷溶液中浸泡20～60min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100～180℃条件下烘烤0.2～0.6h。

步骤(2)中所述抗体溶液包括HBs单克隆抗体溶液、HBe单克隆抗体溶液、HBc单克隆抗体溶液；抗原溶液包括TP抗原溶液、HIV抗原溶液、HCV抗原溶液。

步骤(2)中所述点样的方法为机器自动化点样。

步骤(3)中所述封闭过程为：将点样好的黑玻片没入封闭液中1～24h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。

所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液；所述封闭蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或多种。

一种所述蛋白芯片的应用，将所述蛋白芯片制成试剂盒。

所述试剂盒还包括标记有HRP酶或碱磷酶的第二抗体溶液、对标记物敏感的化学发光底物。

本发明有益的技术效果在于：

本发明蛋白芯片用于检测六个重要的传染病指标，应用蛋白芯片技术实现联合检测可以有效地提高检测效率，降低检测成本；同时包含有HBs、HBe、HBc、TP、HIV、HCV六个指标的蛋白芯片诊断试剂盒，具有快速，高效，低成本等优点。配合本公司的自动化蛋白芯片阅读仪，可以实现自动化检测。由于有效地将六个指标集成在一张芯片中进行检测，只需要一份病人血样就可以实现六个指标的同时快速检测。本产品和技术作为一种新颖的检测方法，目前世界上还没有同类产品面市。

本发明采用经典的免疫学双抗体夹心法与免疫学双抗原夹心法。在玻璃为载体的芯片基质上固定捕获抗体或抗原，这些抗体或抗原可以捕获被测样本中特异性的抗原或抗体，被捕获的抗原或抗体与标记有HRP酶的第二抗体相结合，形成夹心式结合产物。加入对标记物(HRP酶或碱磷酶)敏感的化学发光底物进行化学发光，其光信号通过CCD摄像头采集，通过光信号的强弱可以判断被测样本中特定标志物抗原的浓度。

本试剂盒使用了传染病芯片技术平台，而国内其他厂家的单项检测方法使用的是普通化学发光手段。与之相比，本产品的优势在于：①由于抗原或抗体与本产品抗体或抗原结合的特异性高、亲和力强，并且受到其他杂质影响较低，因此，对生物样品的要求非常低，可简化样品的前处理过程；②能够快速高通量、平行化定量分析大量的蛋白质样品；③操作简单，结果正确率高；④病人只需采一份血样，且迅速可以给出监测结果。⑤所需试剂和样品少，价格低廉。

附图说明

图1为本发明抗体点样示意图；

图中，列1：阳性质控列；列2：空白；列3：TP测定列；列4：HCV测定列；列5：HIV测定列；列6：空白；列7：HBs测定列；列8：HBe测定列；列9：HBc测定列；列10：空白；列11：阴性对照列。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

一种用于传染病指标检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：

(1)黑玻片预处理；

①将黑玻片置于含有2％NaOH的玻片预处理液中浸泡16h，之后采用纯化水清洗2～8次；

②将黑玻片置于质量浓度为0.05％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡60min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于180℃条件下烘烤0.2h。

(2)抗体溶液、抗原溶液点样；

参考图1，采用机器自动化点样HBs单克隆抗体溶液、HBe单克隆抗体溶液和HBc单克隆抗体溶液，抗体溶液浓度为0.1mg/mL，每点点样20nL；TP抗原溶液、HCV抗原溶液和HIV抗原溶液，抗原溶液浓度为0.01mg/ml，每点点样20nL，各抗体点样分布如图1所示。

(3)封闭工艺；

将点样好的黑玻片没入封闭液(内含1％牛血清白蛋白的PBS缓冲液)中10h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。

(4)试剂盒

将所述蛋白芯片与标记有HRP酶的第二抗体溶液(浓度为1ug/ml，其中介质为外购的赛默飞公司的酶标二抗稀释液，pH＝6.0)、检测液A(含1％鲁米诺和2％Tris)和检测液B(含1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。

实施例2

一种用于传染病指标检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：

(1)黑玻片预处理；

①将黑玻片置于含有2％NaOH的玻片预处理液中浸泡24h，之后采用纯化水清洗2～8次；

②将黑玻片置于质量浓度为0.5％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡30min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于140℃条件下烘烤0.5h。

(2)抗体溶液、抗原溶液点样；

参考图1，采用机器自动化点样HBs单克隆抗体溶液、HBe单克隆抗体溶液和HBc单克隆抗体溶液，抗体溶液浓度为0.1mg/mL，每点点样20nL；TP抗原溶液、HCV抗原溶液和HIV抗原溶液，抗原溶液浓度为0.01mg/ml，每点点样20nL，各抗体点样分布如图1所示。

(3)封闭工艺；

将点样好的黑玻片没入封闭液(内含2％卵清蛋白的PBS缓冲液)中24h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。

(4)试剂盒

将所述蛋白芯片与标记有HRP酶的第二抗体溶液(浓度为1ug/ml，其中介质为外购的赛默飞公司的酶标二抗稀释液，pH＝6.0)、检测液A(含1％鲁米诺和2％Tris)和检测液B(含1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。

实施例3

一种用于传染病指标检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：

(1)黑玻片预处理；

①将黑玻片置于含有2％NaOH的玻片预处理液中浸泡20h，之后采用纯化水清洗2～8次；

②将黑玻片置于质量浓度为1％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡20min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100℃条件下烘烤0.6h。

(2)抗体溶液点样；

参考图1，采用机器自动化点样HBs单克隆抗体溶液、HBe单克隆抗体溶液和HBc单克隆抗体溶液，抗体溶液浓度为0.1mg/mL，每点点样20nL；TP抗原溶液、HCV抗原溶液和HIV抗原溶液，抗原溶液浓度为0.01mg/ml，每点点样20nL，各抗体点样分布如图1所示。

(3)封闭工艺；

将点样好的黑玻片没入封闭液(内含3％牛血清白蛋白的Tris缓冲液)中8h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。

(4)试剂盒

将所述蛋白芯片与标记有HRP酶的第二抗体溶液(浓度为1ug/ml，其中介质为外购的赛默飞公司的酶标二抗稀释液，pH＝6.0)、检测液A(含1％鲁米诺和2％Tris)和检测液B(含1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。

测试例：

使用本公司生产的SLXP-001型生物芯片阅读仪对临床血清进行检测，SLXP-001型生物芯片阅读仪的工作过程如下：

仪器自动吸取200ul的待测血清样本至反应杯中，仪器将本发明实施例制得的蛋白芯片自动地放入待测血清中，30℃孵育40分钟，随后仪器夹爪将芯片取出，经仪器自动冲洗后投入到标记有HRP酶的第二抗体溶液(200ul，仪器自动提前吸好)，再次孵育40分钟后，仪器夹爪将芯片再次取出，经仪器自动冲洗后投入到发光底物溶液中(由100ul的检测液A和100ul的检测液B混合而成，由仪器自动吸取和混合)，最后对蛋白芯片进行拍照成像，软件自动分析图片，给出分析结果。检测结果如表1、表2所示，参比试剂为雅培公司的系列单指标试剂盒。

表1

表2

由上表可见，本发明所提供的试剂盒，同时检测TP、HCV、HIV、HBs-Ag、HBe-Ag、HBc-Ag六个指标，可以获得与单指标试剂盒相似的结果，未见阴阳性判断不一致的样本。本实验采用的与参比试剂是世界知名的进口品牌试剂盒。使用本试剂盒可以实现高效率，简操作，低成本，用时短等多个优点，非常有助于及时，准确地发现病人是否患有哪种传染病，及时的进行相应的对症治疗。

Claims (8)

1.一种用于传染病检测的蛋白芯片，其特征在于所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：

（1）黑玻片预处理；

（2）抗体溶液或抗原溶液点样；

（3）封闭工艺，制得所述蛋白芯片。

2.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于步骤（1）中所述黑玻片预处理的方法为：

①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16~24h，之后采用纯化水清洗2~8次；

②将黑玻片置于质量浓度为0.05~1%的硅烷溶液中浸泡20~60min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100~180℃条件下烘烤0.2~0.6h。

3.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于步骤（2）中所述抗体溶液包括HBs单克隆抗体溶液、HBe单克隆抗体溶液、HBc单克隆抗体溶液；抗原溶液包括TP抗原溶液、HIV抗原溶液、HCV抗原溶液。

4.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于步骤（2）中所述点样的方法为机器自动化点样。

5.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于步骤（3）中所述封闭过程为：将点样好的黑玻片没入封闭液中1~24h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。

6.根据权利要求5所述的蛋白芯片，其特征在于所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液；所述封闭蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或多种。

7.一种权利要求1~6任一项所述蛋白芯片的应用，其特征在于将所述蛋白芯片制成试剂盒。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述试剂盒还包括标记有HRP酶或碱磷酶第二抗体溶液、对标记物敏感的化学发光底物。