JPH0223887A - 生物学的流体の酸素含量の測定法およびそれを乾式化学処理により測定するための装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は生物学的流体の酸素含量の測定法に関する。よ
り詳細には本発明は流体、たとえば血液の酸素含量の測
定法を提供し、本発明方法を乾式化学的処理により実施
するための装置を包含する。

（従来の技術） 酸素が細胞のミトコンドリアによる酸化的リン酸化の過
程を促進させるのに不可欠であり、この酸化的リン酸化
によりエネルギーがアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とし
て蓄積されることは、生物科学および関連科学の分野で
周知である。血液中の酸素濃度は肺から受容される供給
量および組織の要求によって異なる。血流中の大部分の
酸素は赤血球のヘモグロビンにより運ばれる。これらの
パラメーターのうち１または２以上に影響を与えるもの
はいずれも血中酸素濃度を変化させる可能性がある。た
とえば肺栓塞の場合のように肺を通る血流が妨げられる
と１分圧によって測定した血中酸素含量はこれに応じて
低下する可能性がある。

従って血中酸素濃度（ならびにｐＨおよび二酸化炭素）
の測定は身体の代謝／呼吸状態を示す重要な臨床像を与
えることができる。

現在の技術では、血中ガスは最も一般的には特定の膜電
極を用いる実験室用ポーラログラフイー装置により測定
される。この方法は適正に使用された場合はきわめて正
確であるが、熟練した技術者による分析のために検体を
水中に入れて速やかに実験室へ運ぶ必要があり、慎重な
反復検量を必要とし、かつ計測に高い費用を要するとい
う欠点がある。

（発明が解決しようとする課題） 緊急事態においては動脈血酸素に関する試験を要求され
る場合が多いので、当技術分野においては患者の病床で
の採用に適用でき、最小限度の処置で少なくとも重宝量
的な値が得られ、実験室におけるより精密な検査はのち
の機会にゆだねる、簡単かつ迅速な、経費のかからない
方法が強く求められている。

従って本発明の目的は、血液その他の生物学的流体中の
酸素濃度を患者の病床で測定するための迅速で、しかも
経費のかからない方法を提供することである。

本発明の他の目的は、血中酸素濃度を測定するためのこ
の種の方法が溶液状でも乾燥状態でも実施できることで
ある。乾燥状態での方法はあらかじめ秤量したごく少量
の試薬を使用できるため経済的かつ便利であるので、特
に好ましい。

さらに本発明の他の目的は、視覚的手段で酸素濃度を測
定することができ、かつ既存の計測法に容易に適用でき
、これによってさらに経済性および使用上の便宜性をも
たらす方法を提供することである。

本発明の他の目的および利点は当業者に自明であろう。

（課題を解決するための手段） 上記および関連の目的は、下記の反応系において酸素を
水素受容体として利用し、その結果過酸化水素を生成す
ることが現在知られているＦ１５５株の酵素（これらは
オキシドレダクターゼとして知られているより大きな酵
素群の一部である）のうち少なくとも１種を用いる本発
明によって達成される。

Ｍｔ＋０２−−−−−、、−−−一″Ａ　＋Ｈ２Ｏ２適
切な酵素の例にはグルコースオキシダーゼ。

セルロプラスミン、オキサレートオキシダーゼおよびＬ
−アミノ酸オキシダーゼが含まれる。

明らかに先行技術においては知られていないが。

まずオキシダーゼおよび反応体の量を定めることにより
、特定の試料中の０２濃度の測定に上記の反応系を適用
することができる。さらにこの反応系の利点は、キノン
−イミン色原体を用いる周知のペルオキシダーゼ媒介ト
リンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ　）反応によって生成過酸化
物を測定しうろことである。生じた可視色濃度は存在す
る過酸化水素の量に比例する。オキシダーゼ反応におい
てはこの値は上記反応条件下で存在する酸素の量の直接
的尺度であろう。溶存酸素の濃度はその分圧に比例する
ことが知られて℃・る。

多くのオキシダーゼがこの目的に用いられるであろうが
、市販されており、かつその反応体が通常は血液中でき
わめて低い濃度であり、そのため無関係な生理的過程が
この試験系の基本的な酸素測定の目的を変更させること
がないものを選ぶことが望ましい。さらに反応生成物の
うち１種または２種以上が一次反応速度（ｔｈｅ　ｐｒ
ｉｍａｒｙｒｅａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　）に比例した
可視色彩を生じる共役反応（ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ　　）によって定量できるものであるべきであ
る。

本発明の詳細な説明するものとして、サルコシンオキシ
ダーゼ（ＥＣ１，５，３，１）を用いる代表的分析系の
例につきさらに詳述する。ただし以下の例は説明のため
に提示されるにすぎず１本発明の範囲に対する限定を意
図したものではない。

同様な有用性をもつ多数の類似のオキシダーゼを使用す
ることができる。

（ｉ）ＣＨ３−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ＋Ｈ２０＋０２
　　　。

サルコシンオキシダーゼ Ｈ２Ｏ２＋ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ＋Ｈ（？ＨＯこの
オキシダーゼおよび他のオキシダーゼの化学は以前から
知られていたが、それらの酸素依存性を定量的分析方法
に利用する試みはなされていなかったと思われ、この特
性を生物学系における酸素濃度の測定に利用する試みは
もちろんなされていなかった。種々の供給源から得たオ
キシダーゼの反応を室内空気中で行うことは、生化学者
その他の当業者が一般的に実施していた。従って先行技
術は飽和量の酸素を有効に利用する方向に向けることに
よって、本発明方法から遠ざかる教示をなすものであり
、もちろん上記の原理を生物学的流体、たとえば全血、
血漿、血清、髄液、尿。

唾液、涙、胃腸液などに含まれる酸素の定量に応用する
ことは記載または示唆されていなかった。

前述のように反応（ｉ）の副生物である過酸化物は下記
の反応系に従ってペルオキシダーゼおよび指示薬（Ｉｎ
）を用いて定量できる。

＋２１　　Ｈ２Ｏ。＋１・−一！シらａ几う７二ｉ−呈
色あるいは反応（ｉ）の生成物であるホルムアルデヒド
（ＨＣＨＯ）をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤ）の存在下でホルムアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ１，２，１，４６）により分析する方法を選ぶ
こともできる。ＮＡＤ還元生成物（ＮＡＤＨ）の量が、
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ　）またはジアフ
ォラーゼ（ｄ、（ａｐｈｏｒａｓｅ　）（ＥＣ１，６，
４，３）の存在下でニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴ
Ｂ）またはヨードニトロテトラゾリウムパイオン、）　
（ＺＮＴ）の還元を伴う共役反応系により測定される。

生成した有色ホルマザン（ｃｏｌｏｒｅｄ　ｆｏｒｍａ
ｚａｎ　　）の量は視覚的に、または比色定量的に蒋測
定され、最初の被験試料中に存在していた酸素の量に比
例する。

本発明による分析法を示す他の例として、以下の試薬系
を記述する。もちろん本発明の範囲は下記の系にのみ限
定されないと解すべきである。

（実施例） 下記の試薬溶液を調製した。

１）サルコシンオキシダーゼ（アルトロバクター（Ａｒ
ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の菌種由来；グルコン酸カリ
ウムおよびＥＤＴＡ）−２５単位／水１ｍｌ。

２）ペルオキシダーゼ（セイヨウワサビ由来；ＥＣ１，
１１，１，７）−３２０単位／水１ｍｌ。

３）４−アミノアンチピリン−６ｍｇ／　（０，２Ｍ　
トリス緩衝液（ｐＨ７，４）４酎十Ｎ、Ｎ−ジメチルア
ニリン１滴）。

４）サルコシン（遊離塩基）−５ｍｇ／水２ｉ。

溶液≠１．≠２および−１１−３のアリコート（ａｌｉ
ｑｕｏｔ：試料の一部）５０μｅを無酸素環境下で脱酸
素処理したのち、被験血清２５μｅ１次いで５０μｅの
溶液≠４と混合した。室温で１分間インキュベートした
のち、０．１規定ＨＣ（ｉ’）ｍｔを添加し、５６５１
ｍで光学密度を読み取った。結果は平行して行った既知
濃度の被験試料と相関関係を示した。

本発明の一部として、上記の反応による試験系を乾式化
学処理により行うための装置が提供される。図面はこの
種の装置の好ましい形態を示す。

図面について詳細に考案する。ＰＩＩＩＢに試薬≠１．
≠２および≠３の混合物を含浸させ、風乾する。早期反
応を防止するために、サルコシン溶液≠４を水中ではな
く非水性溶剤中に調製することが好ましく１次いでこれ
を用いて同じ２紙に含浸させ、風乾する。あるいはサル
コシンの水溶液を用いることもできるが、含浸紙は無酸
素環境下表の透明な硬い支持層に吸着させる。２紙また
はパッド＋〒−→Ｂは適切ないかなる吸収性（ｂｉｂｕ
ｌｏｕｓ　）材料であってもよ（、たとえば紙。

セルロース誘導体、糸ガラス、綿、羊毛、または他の合
成材料からなるストリップ（５ｔｒｉｐ）またはスワブ
（ｓｗａｂ　）である点を留意すべきである。

パッドの寸法および吸収性が被験検体の容量を決定し、
これによりピペット操作の工程が避けられる。ベンゼン
中のエチルセルロース溶液なパッドＢの上面に施し、風
乾する。これにより血漿および気体は通過させるが血球
は通過させない半透過性バリヤーが与えられる。この種
のバリヤーは米国特許筒３．２９８．７８９号明細書に
示されており、その関連部分をここに参考として引用す
る。処理された２紙を次いで酸素を含有しない気体、た
とえば窒素、水素またはヘリウムを含む透明な不透過性
プラスチック裏またはガラス製キューブ（Ａ）に入れる
。

容器への上部にはルアーロック（Ｉｕｅｒ−１ｏｃｋ　
）式レセプタクル（Ｃ）がある。被験血液試料を含む注
射器をＣに施す。ねじ込むと注射器の先端の突起が薄い
プラスチ、クフイルム製のバリヤーＤを貫き、または押
しのける。これによって被験試料は室内空気と接触せず
にパッドＢ上へ通過する。

（ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ　ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　）
の利用により。

または標準カラーチャートと視覚的に比較することによ
り定量する。このユニ、トは試験終了後には廃棄するも
のとする。

あるいは反応チャンバーが細い円筒形カラムの形であり
、処理済みパッドなカラム頂部に載せ、反応パッドから
出る発色を保持し、呈示するための不活性吸収材をカラ
ム本体内に配置することもできる。

最後に１本発明のペーパー相法（ｐａｐｅｒ　ｐｈａｓ
ｅｍｅｔｈｏｄ　）’Ｏ好ましい形態においては吸収性
材料をベンゼンまたはこれに類する有機溶剤中のエチル
セルロースまたは酢酸セルロースに浸ｉすることにより
、被験試料から赤血球および大型高分子を除去する。続
いて吸収性材料を上記溶液から取出し１次いで試験操作
を行う前に吸収性材料を風乾する。

（発明の効果） 本発明において解明された方法を酸素含量の測定が重要
であるいかなる状況、たとえば食品加工または金属処理
にも適用できることは明らかである。さらに、隣接する
反応パッドについて、ｐＨおよびＣＯ２に関して既知の
比色系を用いてこれらの被分析体を同時に測定すること
ができ、これによって完全な動脈血ガス測定が可能とな
る。

本発明の数種の具体例のみを提示および説明したが、当
業者には本発明の精神および範囲から逸脱することなく
多種の変更をなしうろことは明らかであろう。

【図面の簡単な説明】 図面は本発明の装置の一形態を示し、記号はそれぞれ下
記のものを表わす。 Ａ：キューブ（カラム）　　　Ｂ：吸収性材料Ｃ：ルア
ーロック式レセプタクルＤ＝バリヤー手続補正書（方式
） ％式％ 生物学的流体の酸素含量の測定法およびそれを乾式化学
処理により測定するための装置 ６、補正をする者 事件との関係 住所

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）検査される生物学的流体の被験試料に、酵素
   反応 I に用いる反応混合物中のあらかじめ定められた
   量の還元型反応体（ＡＨ＿２）、オキシダーゼ酵素（Ｅ
   ）および緩衝剤を供給し、 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （ｂ）反応 I における反応生成物の生成速度を測定し
   、その際該反応生成物の生成速度は上記生物学的流体の
   被験試料中の酸素濃度に正比例し；そして （ｃ）反応 I の上記反応生成物の生成速度を少なくと
   も１種の既知酸素濃度の標準品中における同一生成物の
   生成に対する反応速度と比較し、これにより上記生物学
   的流体の酸素濃度を判定する工程からなる、生物学的流
   体の酸素含量の測定法。 ２、測定される反応生成物がホルムアルデヒドである、
   請求項１に記載の方法。 ３、測定される反応生成物がＨ＿２Ｏ＿２である、請求
   項１に記載の方法。 ４、用いられる緩衝液がトリス緩衝液である、請求項１
   に記載の方法。 ５、酵素がサルコシンオキシダーゼであり、反応体がサ
   ルコシンである、請求項１に記載の方法。 ６、工程（ｂ）および（ｃ）は、次の共役反応II、▲数
   式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｉｎは指示薬であるキノン−イミン色原体を表
   わす）において生じる色の光学密度の比較により行われ
   る、請求項１に記載の方法。 ７、生じた色が透過型分光測光法により測定される、請
   求項６に記載の方法。 ８、生じた色が標準化カラーチャートとの視覚的な比較
   により測定される、請求項６に記載の方法。 ９　工程（ｂ）および（ｃ）は、次の共役反応IIIおよ
   びIV▲数式、化学式、表等があります▼（III） ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） （式中、 ＮＡＤはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであり
   ； ＮＡＤＨは還元ＮＡＤであり； ＩＮＴはヨードニトロテトラゾリウムバイオレットであ
   り；そして ＰＭＳはフェナジンメトスルフェートである）において
   生じる色の光学密度の比較により行われる、請求項１に
   記載の方法。 １０、生じた色が透過型分光測光法により測定される、
   請求項９に記載の方法。 １１、生じた色が標準化カラーチャートとの視覚的な比
   較により測定される、請求項９に記載の方法。 １２、検査される生物学的流体が全血、血漿または血清
   である、請求項１に記載の方法。 １３、（ａ）あらかじめ定められた量のオキシダーゼお
   よび緩衝剤を水溶液状で供給し； （ｂ）該水溶液の定量比色分析のための指示薬系を添加
   し； （ｃ）吸収性材料を該水溶液に浸漬し； （ｄ）吸収性材料を水溶液から取出し； （ｅ）水溶液から取出したのちの吸収性材料を風乾し； （ｆ）該吸収性材料を還元型反応体の無水有機溶液に浸
   漬し； （ｇ）吸収性材料を還元型反応体の無水有機溶液から取
   出し； （ｈ）工程（ｇ）後の吸収性材料を風乾し；（ｉ）該吸
   収性材料に検査される生物学的流体を施して酵素反応（
   I ）を開始させ、 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （ｊ）反応（ I ）の生成物少なくとも１種の生成速度
   を定量比色分析により生じた色の量により測定し；そし
   て （ｋ）生じた色の量を少なくとも１種の既知の酸素濃度
   の標準品と比較し、これにより、生じた色の量は検査さ
   れる生物学的流体の酸素濃度に正比例する 工程からなる、乾式化学処理による生物学的流体の酸素
   濃度の測定法。 １４、吸収性材料が紙からなるストリップまたはスワプ
   である、請求項１３に記載の方法。 １５、吸収性材料がセルロース誘導体または合成材料か
   らなる、請求項１３に記載の方法。 １６、吸収性材料が糸ガラスである、請求項１３に記載
   の方法。 １７、吸収性材料が綿からなる、請求項１３に記載の方
   法。 １８、吸収性材料が羊毛からなる、請求項１３に記載の
   方法。 １９、検査される生物学的流体が全血、血漿または血清
   である、請求項１３に記載の方法。 ２０、さらに、工程（ｉ）に先立って 生物学的流体が血液である場合は、ベンゼン中のエチル
   セルロースおよび酢酸セルロースよりなる群から選ばれ
   る溶液に吸収性材料を浸漬することにより生物学的流体
   から赤血球および大型高分子を除去し； 吸収性材料を該溶液から取出し；そして 吸収性材料を風乾する 工程を含む、請求項１３に記載の方法。 ２１、生じた色が反射率分光測光法により定量される、
   請求項１３に記載の方法。 ２２、生じた色が標準化カラーチャートとの視覚的な比
   較により定量される、請求項１３に記載の方法。 ２３、無酸素環境を内包するキューブまたはカラム；キ
   ューブまたはカラム内に収容された吸収性材料であって
   、吸収性材料にあらかじめ定められた量のオキシダーゼ
   、緩衝剤、還元型反応体、および比色分析用指示薬が含
   浸されており、吸収性材料がセルロースまたはセルロー
   ス誘導体の被膜を有するもの； キューブまたはカラムの上部に配置されたルアーロック
   式レセプタクルであって、ルアーロック式レセプタクル
   が検査される生物学的流体の試料を入れた注射器を受容
   しうるもの； 注射器により穿刺または排除されうるバリヤーであって
   、バリヤーがキューブまたはカラムの上部のルアーロッ
   ク式レセプタクルとキューブまたはカラムとの間に配置
   されたもの からなり、吸収性材料に検査される生物学的流体を施し
   て酵素反応（ I ）を開始させたのち ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 反応（ I ）の生成物のうち少なくとも１種の生成速度
   を定量比色分析において生じた色の濃度により測定し、
   生じた色の量を少なくとも１種の既知酸素濃度の標準品
   と比較し、これにより、生じた色の量は検査される生物
   学的流体の酸素濃度に正比例する ものである、乾式化学処理により生物学的流体の酸素濃
   度を測定するための装置。 ２４、キューブまたはカラムが透明な不浸透性プラスチ
   ックまたはガラスで作成された、請求項２３に記載の装
   置。 ２５、キューブまたはカラムが窒素、水素、ヘリウムお
   よびそれらの組合わせよりなる群から選ばれる気体を含
   む、請求項２３に記載の装置。 ２６、吸収性材料がサルコシンオキシダーゼ、ペルオキ
   シダーゼ、テトラメチルベンジジンおよび０．２Ｍトリ
   ス緩衝液（ｐＨ７．４）からなる反応混合物を含浸させ
   、次いで乾燥させ、次いで非水性溶剤中のサルコシンを
   含浸させ、次いで再び乾燥させたものである、請求項２
   ３に記載の装置。 ２７、吸収性材料がサルコシンオキシダーゼ、ホルムア
   ルデヒドデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチド、ヨードニトロテトラゾリウムバイオレッ
   ト、フェナジンメトスルフェートおよび０．２Ｍトリス
   緩衝液（ｐＨ７．４）からなる反応混合物を含浸され、
   次いで乾燥され、次いで非水性溶剤中のサルコシンを含
   浸され、次いで再び乾燥されたものである、請求項２３
   に記載の装置。 ２８、吸収性材料が濾紙である、請求項２３に記載の装
   置。 ２９、バリヤーが薄いプラスチックフィルムで作成され
   た、請求項２３に記載の装置。 ３０、生物学的流体が全血、血漿または血清である、請
   求項２３に記載の装置。