CN105699640B - 一种检测肠道屏障功能的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测肠道屏障功能的试剂盒，包括：反应装置、一种或多种显色液和一种或多种稀释液；所述反应装置包括血浆分离器和反应基板，反应基板包含空白对照孔、二胺氧化酶反应孔、D‑乳酸反应孔和细菌内毒素反应孔；所述的血浆分离器每个孔内设有血浆分离膜；所述的空白对照孔内放有空白垫。

Description

一种检测肠道屏障功能的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种检测肠道屏障功能的试剂盒，更具体地说，涉及一种检测血液中D-乳酸、二胺氧化酶和细菌内毒素的试剂盒。

背景技术

肠道屏障功能障碍主要表现为肠黏膜屏障受损、肠微生态紊乱和肠道动力障碍。肠屏障功能障碍是各种原因引起的肠黏膜损伤、萎缩，肠通透性增加，肠菌群失调，从而导致细菌和(或)内毒素易位，并可诱发和(或)加重全身炎症反应和多器官功能障碍。肠屏障功能障碍对危重疾病的发生、发展、转归有重要影响。肠屏障功能障碍在危重病患者中较常见，但目前尚缺乏较为客观的临床诊断标准与统一的治疗方案。

肠粘膜屏障是指肠道能防止肠腔内的有害物质如细菌和毒素穿过肠粘膜进入体内其他组织器官和血液循环的结构和功能的总和。它包括：肠粘膜上皮、肠粘液、肠道菌群、分泌性免疫球蛋白、肠道相关淋巴组织(Gut-associated lymphoid tissue，GALT)、胆盐、激素和胃酸等。肠道粘膜时常受到各种刺激性物质和损伤性因素的攻击和侵蚀，但在正常情况下肠粘膜仍能有效地发挥分泌、吸收等生理功能，并保持其结构的完整性。但是，在严重烧伤、创伤、手术等应激状态下，上述肠粘膜屏障作用受到破坏，可出现肠粘膜水肿，肠绒毛高度降低，肠系膜血管收缩，血流减少，细胞凋亡加速，严重者甚至造成细菌和毒素移位发展成为肠源性败血症，并可导致多脏器功能衰竭(MOF)而危及生命。

通常可以通过检测肠道通透性、肠粘膜的损伤情况以及细菌是否易位等来检测肠道屏障功能是否发生障碍。在临床上，通常可用各种核素标记肠道不吸收的大分子物质(如DTPA或EDTA等)，通过检测尿中核素标记物的排泄量来确定肠道通透性是否增高；以非代谢性的低聚糖为探针的肠道通透性检测方法在临床最为常用，其中又以乳果糖/甘露醇双糖分子探针为代表和最常用，尿中两者比值增高表明肠道通透性增高，粘膜机构屏障功能受损。但是此种方法操作繁琐，同时需要病人服用相应的不易吸收的物质，而且需要相应的检测仪器，在临床上较难推广。细菌易位常用的诊断方法有细菌培养，通常是在无菌条件下取肠系膜淋巴结等进行细菌培养,培养到细菌即为阳性，但是此种方法有相当大的创伤性，难以在临床上开展。

目前，在临床上急需一种简便、快捷的方法来迅速对住院病人的肠道屏障功能是否发生障碍做出较为全面准确的判断。

发明内容

本发明的目的是提供一种肠道屏障功能的检测试剂盒。本试剂盒中的三项指标中D-乳酸代表肠道通透性的变化，二胺氧化酶代表肠黏膜的损伤程度，细菌内毒素代表肠道是否发生细菌易位。本试剂盒将三项指标综合在一起测定，分别从三个方面综合而且全面的反映了肠道的屏障功能。

为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测肠道屏障功能的试剂盒，其包括：

1)反应装置

所述反应装置包括血浆分离器和反应基板，反应基板包含空白对照孔、二胺氧化酶反应孔、D-乳酸反应孔和细菌内毒素反应孔；

2)一种或多种显色液；

3)一种或多种稀释液。

前述试剂盒，所述的血浆分离器每个孔内设有血浆分离膜。

前述试剂盒，所述的空白对照孔内放有空白垫。

前述试剂盒，所述的二胺氧化酶反应孔从孔底部起依次放有底物垫和显色垫。

其中，所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；所述的底物溶液以100-1000mmol/L pH6.0-8.0的缓冲液为溶剂，包括0.0001-0.01g/mL的二胺氧化酶底物、10-10000U/mL的过氧化物酶、0.005％-50％的稳定剂和0.005％-50％的表面活性剂；

其中，所述底物为腐胺、组胺、尸胺或者氨基丁烯，优选所述底物为腐胺和尸胺；

其中，所述100-1000mmol/L pH6.0-8.0的缓冲液为磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或PIPES缓冲液的一种或几种，优选所述缓冲液为600-800mmol/L pH6.5-7.0的磷酸钠和磷酸钾缓冲液；

其中，所述稳定剂为D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-环糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、明胶、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的一种或几种，优选所述稳定剂为D-海藻糖；

其中，所述表面活性剂为吐温80、吐温20、Triton X-100、NP40或山梨醇中的一种或多种，优选所述表面活性剂为吐温80。

其中，所述显色液以水为溶剂，包括0.00001-10mg/mL的显色剂和0.01-100g/L稳定剂；优选所述显色液包括1-5mg/mL的显色剂和10-20g/L稳定剂；

所述显色剂为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、邻联茴香胺、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物(MBTH)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲基氨基)-二苯胺钠盐(DA-64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲基氨基)吩噻嗪钠盐(DA-67)或10-乙酰基-3,7-二羟基吩恶嗪(Ampliflu Red)中的一种或多种，优选所述显色剂为TOOS、DA-67和Ampliflu Red；

所述稳定剂为D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-环糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、明胶、肌醇、木糖、阿拉伯糖醇、马来酸、酒石酸或者柠檬酸中的一种或多种，优选所述稳定剂为蔗糖和D-海藻糖。

前述试剂盒，所述的D-乳酸反应孔从孔底部起依次放有酶垫和显色剂垫。

所述酶垫由酶液滴加在载体上制备而成；所述的酶液以水为溶剂，包括10-1000U/mL的D-乳酸脱氢酶，5-500mmol/L pH6.0-9.0的缓冲液，0.005％-50％的稳定剂；

其中，所述5-500mmol/L pH6.0-9.0的缓冲液为磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或PIPES缓冲液中的一种或多种，优选所述的缓冲液为200-300mmol/LpH8.0-9.0的Tris-HCl和PIPES缓冲液；

其中，所述酶稳定剂为D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-环糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、明胶、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的一种或多种；优选所述的酶稳定剂为牛血清白蛋白和肌醇。

其中，所述显色剂垫由显色液滴加在载体上制备而成；所述的显色液以水为溶剂，包括0.01-10mmol/L的氧化型辅酶、0.01-100mmol/L的电子传递体、0.1-100mg/mL的显色剂和0.005％-50％的稳定剂；

其中，所述氧化型辅酶为NAD、NADP、thio-NAD或thio-NADP中的一种或多种；优选所述氧化型辅酶为NAD；所述电子传递体为黄递酶或者N-甲基吩嗪硫酸盐(PMS)；所述显色剂为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、碘硝基四唑紫(INT)、3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(XTT)或氯化硝基四氮唑蓝(NBT)的一种或几种；优选所述显色剂为MTT；所述稳定剂为D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-环糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、明胶、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的一种或几种；优选所述稳定剂为牛血清白蛋白和肌醇。

前述试剂盒，所述细菌内毒素反应孔放有底物垫；所述底物垫由底物溶液滴加在载体上制备而成；所述的底物溶液以水为溶剂，包括0.02-20mg/mL的底物、0.01-10mol/LpH6.0-9.0的缓冲液、0.1-10％的激活剂和0.005％-50％的稳定剂；

其中，所述底物为甘氨酰-L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、精氨酰-精氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、甘氨酰-精氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、精氨酰-精氨酸-β-萘胺、甘氨酰-L-脯氨酸-β-萘胺、亮氨酰-甘氨酸-4-甲氧基-β-萘胺的一种或多种；优选所述底物为精氨酰-精氨酸-4-甲氧基-β-萘胺；所述缓冲液为磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或PIPES缓冲液中的一种或多种；所述激活剂为K⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Li⁺、Na⁺、Co²⁺、Triton X-100、吐温20或吐温80中的一种或多种，优选所述激活剂为Triton X-100；所述稳定剂为D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-环糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、明胶、肌醇、木糖或阿拉伯糖醇中的一种或多种，优选为D-海藻糖和牛血清白蛋白。

前述试剂盒，所述载体为滤纸、玻璃纤维或者层析纸。

前述试剂盒，所述显色液以水为溶剂，包括0.00001-10mg/mL的显色剂和0.01-100mmol/L稳定剂；

其中，所述显色剂为固蓝B、固红B、固蓝BB和固蓝RR、固紫B、对二甲基肉桂醛中的一种或多种，优选所述显色剂为固蓝B和固紫B；

其中，所述稳定剂为D-海藻糖、蔗糖、葡聚糖、β-环糊精、牛血清白蛋白、甘露醇、聚乙二醇、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、K⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Li⁺、Na⁺、Co²⁺、明胶、肌醇、木糖、阿拉伯糖醇、马来酸、酒石酸或者柠檬酸中的一种或多种，优选所述稳定剂为Zn2+。

前述的试剂盒，所述稀释液以水为溶剂，包括0.00001-10mg/mL的激活剂和pH6.0-9.0、0.01-100mmol/L缓冲液；

其中，所述激活剂为乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、K⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Li⁺、Na⁺、Co²⁺、Triton X-100、吐温20或吐温80中的一种或多种，优选为Mn²⁺；所述缓冲液为磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或PIPES缓冲液；优选为PIPES缓冲液。

前述的试剂盒，所述显色剂垫、酶垫和底物垫的载体均为滤纸、玻璃纤维或者层析纸。

本发明将酶液、显色液和各种底物液滴加在载体上制备成相应地反应垫，本领域技术人员知道，考虑到试剂盒保存的需要，所制备的反应垫必须具备相当高的稳定性，发明人在大量实验研究的基础上，确定了上述酶液、显色液和各种底物液的组成及其配方，使得试剂盒具有理想的稳定性，能够在实际应用中推广。

本发明中，D-乳酸指标用来衡量肠道通透性的变化，如果D-乳酸浓度≥5μg/mL，则表示肠道的通透性增加；二胺氧化酶指标用来衡量肠粘膜是否受损，如果二胺氧化酶浓度≥10U/L，则表示肠粘膜已经受损，随着酶活性的逐渐升高，肠粘膜的损伤程度越来越严重；细菌内毒素指标用来衡量细菌是否发生易位，如果细菌内毒素浓度≥5U/L，则表示有可能已经发生了细菌易位，随着酶活性的增加，细菌易位的程度逐渐加深。基于这些研究结果，本发明建立了一种简便、快速的肠道屏障功能的测定试剂盒，包括D-乳酸浓度的检测、二胺氧化酶和细菌内毒素活性的检测。

采用上述技术方案，本发明的优点在于：

1.肠道屏障功能检测试剂盒通过对血液中D-乳酸浓度的测定以及对二胺氧化酶和细菌内毒素活性的测定，从肠道通透性的变化、肠黏膜的损伤程度和肠道是否发生细菌易位三个方面综合而且全面的反映了肠道的屏障功能，从而直接检测出被检测者肠道屏障功能是否发生障碍，指导合理的临床用药，该方法操作简便快速，准确性高，适用于临床常规检测特别是临床病人床旁检测使用。

2.具有自动分离血浆的功能。本试剂盒不需要真空采血管，只采用末梢血做样本，不用仪器设备，操作简便，可在医院急诊室、基层医疗与保健单位及病人家庭使用，尤其适合于医院的床旁快速检测。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1肠道屏障功能检测试剂盒的制备

本实施例提供肠道屏障功能检测试剂盒的制备，制备方法如下：

1)反应基板的制备：

反应基板优选但并不限于由ABS工程塑料制成，其上设有空白对照孔、二胺氧化酶反应孔、D-乳酸反应孔和细菌内毒素反应孔，在每个反应孔中填入下述相应的反应垫；空白对照孔和反应孔的尺寸可为优选

2)血浆分离器的制备：

血浆分离器中血浆分离膜的结构为现有技术习用的即可，本发明对此不作特别限定，将全血滴加在血浆分离膜上，实现血清和红细胞的分离。

3)二胺氧化酶反应孔中底物垫的制备：

底物溶液：底物0.1g；

过氧化物酶100单位；

稳定剂0.005％；

表面活性剂0.01％；

100mmol/L pH7.0的Tris-HCl缓冲液10mL；

将底物溶液1μL滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后，密封保存在2-8℃。

显色液：

显色剂10mg；

稳定剂2mg；

蒸馏水10mL；

将显色溶液1μL滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后，密封保存在2-8℃。

4)D-乳酸反应孔中酶垫和显色剂垫的制备：

酶垫的制备：

酶液：

D-乳酸脱氢酶10000单位；

稳定剂1％；

100mmol/L pH8.0的磷酸缓冲液10mL；

将1μL酶液滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后，密封保存在2-8℃。

显色剂垫的制备：

显色液：

显色剂1000mg；

氧化型辅酶10mmol/L；

电子传递体0.01mmol/L；

稳定剂5％；

蒸馏水10mL；

将1μL显色液滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后，密封保存在2-8℃。

5)细菌内毒素反应孔中底物垫的制备：

底物溶液：底物200mg；

激活剂0.01mmol/L；

稳定剂1％；

10mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液10mL；

将底物溶液1μL滴加在层析纸上，避光条件下，25℃流动空气干燥4小时后，密封保存在2-8℃。

6)将2)～5)制备的反应垫填入相应的反应孔中，用冲压机压实，然后装上带有血浆分离膜的血浆分离器，装入铝箔袋中，即得反应装置。

7)显色液的制备：

显色剂10g；

稳定剂0.01mmol/L；

蒸馏水1000mL；

充分混匀后，分装在深色瓶中保存或进行冻干保存。

8)稀释液的制备

稳定剂2％；

2mmol/L pH7.5Tris-HCl缓冲液1000mL；

充分混匀后，分装在深色瓶中保存或进行冻干保存。

实施例2肠道屏障功能检测试剂盒的使用方法

本实施例提供肠道屏障功能检测试剂盒的使用方法，具体为：

用采血针从指尖采取微量全血后，直接加到装置的血浆分离器内，全血经血浆分离膜分离后，血清到达装置的各反应孔，在二胺氧化酶和D乳酸反应孔内加入一滴(约10μL)稀释液，在细菌内毒素反应孔内加入一滴(约10μL)显色液。将反应装置放在干化学检测仪器上面反应15min。通过干化学分析仪进行定量判读，可以定量得到被测物浓度。

实施例3肠道屏障功能检测试剂盒的应用

本试剂盒是提供一种肠道屏障功能的检测试剂盒，对临床上病人的血液样本进行检测，检查病人的肠道屏障功能是否发生障碍，以辅助病人进行肠道屏障功能的重建。

试剂盒的具体使用方法如下：

1)在使用时，首先将试剂盒从2℃～8℃取出，平衡到室温开始使用。

2)撕掉铝箔包装，取出反应装置。

3)用采血管从指尖采取全血，直接加到装置的每个反应孔的血液进样孔内；如果样品为血清或血浆，则需将血浆分离装置撕掉，在每个反应孔加入4μL样品即可。

4)静置片刻待血全部渗入后揭去血浆分离器。

5)在二胺氧化酶和乳酸孔中加入10μL稀释液，在细菌内毒素孔加入10μL显色液。

6)将反应装置放在JY-DLT肠道屏障检测仪的反应孔内反应15min，待仪器发出报警声后，将反应装置从反应孔内取出，放入检测孔，即可打印或上传检测结果。

如果检测结果符合二胺氧化酶≤10U/L，D-乳酸≤15mg/L，细菌内毒素≤20U/L，则认为此人肠道屏障功能良好，其余情况则认为肠道屏障功能发生障碍。

Claims (8)

1.一种检测肠道屏障功能的试剂盒，其特征在于，其包括：

1)反应装置

所述反应装置包括血浆分离器和反应基板，所述反应基板包含空白对照孔、二胺氧化酶反应孔、D-乳酸反应孔和细菌内毒素反应孔；

2)一种或多种显色液；

3)一种或多种稀释液；

所述的血浆分离器每个孔内设有血浆分离膜；所述的空白对照孔内放有空白垫；

其中，所述的二胺氧化酶反应孔从孔底部起依次放有第一底物垫和显色垫：所述第一底物垫由第一底物溶液滴加在载体上制备而成；所述的第一底物溶液以600-800mmol/LpH6.5-7.0的磷酸钠和磷酸钾缓冲液为溶剂，包括0.0001-0.01g/mL的第一底物、10-10000U/mL的过氧化物酶、0.005％-50％的D-海藻糖和0.005％-50％的吐温20，所述第一底物为二胺氧化酶底物；所述显色垫由第一显色液滴加在载体上制备而成；所述第一显色液以水为溶剂，包括1-5mg/mL的第一显色剂和10-20g/L D-海藻糖；所述第一显色剂为TOOS、DA-67和Ampliflu Red；

其中，所述的D-乳酸反应孔从孔底部起依次放有酶垫和显色剂垫：所述酶垫由酶液滴加在载体上制备而成；所述的酶液以水为溶剂，包括10-1000U/mL的D-乳酸脱氢酶，200-300mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl或PIPES缓冲液，0.005％-50％的牛血清白蛋白和肌醇；所述显色剂垫由第二显色液滴加在载体上制备而成；所述的第二显色液以水为溶剂，包括：

0.01-10mmol/L的NAD；

0.01-100mmol/L的黄递酶或者N-甲基吩嗪硫酸盐；

0.1-100mg/mL的第二显色剂，所述第二显色剂为NBT或MTT；

0.005％-50％的牛血清白蛋白和肌醇；

其中，所述细菌内毒素反应孔放有第二底物垫。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述稀释液以水为溶剂，包括0.00001-10mg/mL的第一激活剂和pH6.0-9.0、0.01-100mmol/L缓冲液，所述第一激活剂为乙二胺四乙酸二钠、K⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Li⁺、Na⁺、Co²⁺、Triton X-100、吐温20或吐温80中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其中，所述第一激活剂为Mn²⁺。

4.根据权利要求1-3任一项所述试剂盒，所述第二底物垫由第二底物溶液滴加在载体上制备而成；所述的第二底物溶液以水为溶剂，包括0.02-20mg/mL的第二底物、0.01-10mol/L pH6.0-9.0的缓冲液、0.1-10％的第二激活剂和0.005％-50％的稳定剂，所述第二底物为甘氨酰-L-脯氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、精氨酰-精氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、甘氨酰-精氨酸-4-甲氧基-β-萘胺、精氨酰-精氨酸-β-萘胺、甘氨酰-L-脯氨酸-β-萘胺、亮氨酰-甘氨酸-4-甲氧基-β-萘胺中的一种或多种，所述第二激活剂为K⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Li⁺、Na⁺、Co²⁺、Triton X-100、吐温20或吐温80中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其中，所述第二底物为精氨酰-精氨酸-4-甲氧基-β-萘胺。

6.根据权利要求4所述试剂盒，其中，所述第二激活剂为Triton X-100。

7.根据权利要求1-3、5-6任一项所述试剂盒，其特征在于，所述显色垫、显色剂垫、酶垫、第一底物垫和第二底物垫的载体均为滤纸、玻璃纤维或者层析纸。

8.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述显色垫、显色剂垫、酶垫、第一底物垫和第二底物垫的载体均为滤纸、玻璃纤维或者层析纸。