CN108588044A

CN108588044A - 一种peg修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法

Info

Publication number: CN108588044A
Application number: CN201810306747.8A
Authority: CN
Inventors: 罗维晓; 魏海明; 王美丽; 胡晓飞
Original assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Current assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Priority date: 2018-04-08
Filing date: 2018-04-08
Publication date: 2018-09-28

Abstract

本发明涉及一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，属于临床体外检测技术领域，其基本步骤为首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和AEO‑9两种物质作为激活剂，然后加入载体PEG20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修饰酶。配方组成成分：PIEPES、对氨基苯磺酸、AEO‑9、PEG20000、保护剂、乳化剂、离子物质、胆固醇氧化酶、胆固醇脂酶、MIT，本方法操作简单、成本低，与PEG修饰酶法检测高密度脂蛋白胆固醇具有良好的兼容性。

Description

一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，属于临床体外检测技术领域。

背景技术

PEG修饰酶法检测血清高密度脂蛋白胆固醇，由1995年Sugiuchi首先提出，属于均相法检测血高密度脂蛋白胆固醇的一种重要的方法，其方法的反应原理为试剂1中硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖与标本中的LDL、VLDL及CM形成水溶性复合物。试剂 2 中PEG修饰酶系对 HDL发生反应，从而达到检测目的。本法原理着重点在于:①硫酸α-环糊精对富含apoB的LDL组分产生一种屏蔽作用；②PEG修饰酶中的PEG分子产生空间位阻,不利于大分子底物与酶接触,而又不影响小分子的HDL与酶发生酶促反应；③试剂2中的表面活性剂在不影响硫酸α-环糊精-LDL复合物的基础上能使HDL快速充分溶解。上述三点充分保证HDL 测定的特异性和准确性。本法试剂非常优良，与CDC指定的比较方法具有非常好的相关性，本法能够实现对HDL充分、快速反应 ,对LDL的非特异性反应极少，抗干扰能力较强，结果较准确。

但因技术难度较大 ,国内尚无产品问世，技术问题主要存在于修饰酶的合成与表面活性剂的筛选，其中最难以控制的就是PEG修饰酶的制备，Sugiuchi建立的方法为首先将PEG6000使用N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺（DCCI）进行活化，将胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，加入到0.1mol/L的HEPES PH=8.5的缓冲液，溶解完全后，将活化的PEG6000加入到酶溶液中，令PEG6000与酶通过共价键结合在一起，至少需要30分钟的时间，然后将PEG6000使用滤网将其过滤掉，然后使用HPLC方法进行检测结合后的酶的活性，作者通过大量的实验发现，本方法存在以下几个问题：①在PEG6000与酶结合的过程中，即使是PEG6000非常过量，但是也有少量的酶类没有被结合，这就在使用的时候为修饰酶的特异性增加了难度；②所激活PEG6000的两种物质，如果清理不当，会对后面HDL-C的检测造成影响，③如果没有结合酶的PEG过滤不够彻底，则会造成结果HDL-C的检测不准确，④修饰酶的过程过于繁杂，需要很高的技术和实验水平，修饰酶的获取成本高。

因此基于以上的条件制约，影响了PEG-修饰酶法这种非常优良的检测方法的普及和推广，因此根据这些问题，发明了一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法。

发明内容

本发明涉及一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

1）基本原理：以PEG20000为载体，在激活剂以及离子物质存在的情况下，使胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶与PEG20000之间形成离子键，以获取具有对脂蛋白具有选择性的PEG修饰酶；

2)基本步骤：

首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和AEO-9两种物质作为激活剂，然后加入载体PEG20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修饰酶；

3)配方组成成分：

PIEPES 100mmol/L PH=7.0

对氨基苯磺酸 5mmol/L

AEO-9 1.2g/L

PEG20000（sigma） 5G/L

保护剂 2ml/L-3ml/L

乳化剂 1ml/L-3 ml /L

离子物质 3g/L-5g/L

胆固醇氧化酶 3KU/l

胆固醇脂酶 1KU/l

防腐剂 0.5g/L-1g/L。

所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，试剂中所述保护剂为磷脂血清；

所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，试剂所述乳化剂为曲拉通-100；

所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，试剂所述离子物质为氯化钠；

所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，试剂所述防腐剂为MIT。

本发明的创新之处如下：

1）本发明建立其一种操作简单的获取PEG修饰胆固醇氧化酶和PEG修饰胆固醇脂酶的制备方法，由原来的共价结合，改为离子结合；

2）在试剂中选取了分子量较大的PEG20000作为载体，即使是有未被活化的PEG20000加入到试剂中也不会造成影响试剂的反应；

3）在试剂中加入对氨基苯磺酸和AEO-9能够较好激活PEG20000，且不会对酶活性以及高密度脂蛋白胆固醇的检测造成影响；

4）乳化剂曲拉通100和氯化钠则能增加酶与激活后的PEG20000的结合；

5）磷脂血清则能够提高产品PEG-修饰酶的稳定性，而MIT防腐剂的选择则能够较好的抑制细菌的生长。

附图说明

图1 为实施例3试剂检测方法；

图2 为实施例1与和实施例2分别与对照组PEG修饰酶检测结果比较；

图3 为实施例1与对照组PEG修饰酶相关性；

图4 为实施例2与对照组PEG修饰酶相关性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明：

实施列1

一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法。

1)基本步骤：

首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和AEO-9两种物质作为激活剂，然后加入载体PEG20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修饰酶。

2)配方组成成分：

PIEPES 100mmol/L PH=7.0

对氨基苯磺酸 5mmol/L

AEO-9 1.2g/L

PEG20000（sigma） 5G/L

磷脂血清 2ml/L

曲拉通-100 1ml/L

氯化钠 3g/L

胆固醇氧化酶 3KU/l

胆固醇脂酶 1KU/l

MIT 0.5g/L。

实施例2

本实施例描述的是一种原料增加后的新型的PEG修饰胆固醇氧化酶和PEG修饰胆固醇脂酶的制备：

制备步骤：

1）首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和AEO-9两种物质作为激活剂，然后加入载体PEG20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修饰酶。

2)配方组成成分：

PIEPES 100mmol/L PH=7.0

对氨基苯磺酸 5mmol/L

AEO-9 1.2g/L

PEG20000（sigma） 5G/L

磷脂血清 3ml/L

曲拉通-100 3 ml /L

氯化钠 5g/L

胆固醇氧化酶 3KU/l

胆固醇脂酶 1KU/l

MIT 1g/L。

实施例3

本实施例描述的是将实施例1、2方法获取的PEG修饰酶与Sugiuchi方法获取的PEG修饰酶进行临床应用检测结果比较。

1）配置PEG修饰酶方法的高密度脂蛋白检测试剂配置方案：

本方案为双试剂:

试剂R1:MOPS缓冲液30mmol/L,PH7.0；a-环状葡聚糖硫酸盐0.5mmol/L；硫酸葡聚糖0.5g/L；氯化镁 2mmol/L；EMSE 0.3g/L。

试剂R2: MOPS缓冲液30mmol/L,PH7.0；PEG修饰胆固醇脂酶1KU/L；PEG修饰胆固醇氧化酶5KU/L；过氧化物酶30KU/L；4-AA 0.5g/L。

2)检测比较：

将实施例1和实施2作为实验组，以Sugiuchi方法描述制备的PEG修饰酶作为对照组，按照PEG修饰酶法高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的配置方法，作为原材料加入使用，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用终点法进行测定。将试剂R1和R2按照3:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，具体操作方法见图1。

将实施例1、2方法获取的PEG修饰酶和对照组PEG修饰酶，分别配置成高密度脂蛋白胆固醇检测试剂，进行40个临床样本的检测比对，其对比检测的结果见图2。结果发现相对偏差在10%以内，实施例1与和实施例2分别与对照组的相关系数分别为：R1=0.9980和R2=0.9977，结果如图3、图4，这说明具有非常好的相关性。

Claims

1.一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法如下：

1）基本原理：以PEG20000为载体，在激活剂以及离子物质的存在的情况下，使胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶与PEG20000之间形成离子键，以获取具有对脂蛋白具有选择性的PEG修饰酶；

2)基本步骤：

3)配方组成成分：

PIEPES 100mmol/L PH=7.0

对氨基苯磺酸 5mmol/L

AEO-9 1.2g/L

PEG20000（sigma） 5G/L

保护剂 2ml/L-3ml/L

乳化剂 1ml/L-3 ml /L

离子物质 3g/L-5g/L

胆固醇氧化酶 3KU/l

胆固醇脂酶 1KU/l

MIT 0.5g/L-1g/L。

2.根据权利要求1所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，其特征在于试剂中所选择的酶结合载体为PEG20000。

3.根据权利要求1所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，其特征在于试剂R1所述PEG激活剂为对氨基苯磺酸和AEO-9。

4.根据权利要求1所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，其特征在于所述乳化剂为曲拉通-100。

5.根据权利要求1所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，其特征在于所述离子物质为氯化钠。

6.根据权利要求1所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，其特征在于所述保护剂为磷脂血清。