JP4847668B2 - 糖化アルブミンの検出方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、血清中の特定の糖化タンパク質の検出方法に関する発明である。
背景技術
糖尿病の治療は、可能な限り的確に、かつ、早期に発見して行うことが好ましい。かかる糖尿病のマーカーとして、血清中の糖化アルブミンが、短期的血糖管理指標として着目されており、この糖化アルブミンの適切な検出方法が現在模索されている。
現在、血清中の糖化アルブミンは、いわゆるＨＰＬＣ法によって行われている（臨床検査ｖｏｌ．４０：１２７５−１２８０，１９９６）が、この方法では、大量の検体を処理することが困難であり、ランニングコストも嵩むという問題点がある。
本発明者らは、この課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、酵素法により血清中の糖化タンパク質を検出することが可能な糖タンパク質測定試薬を用いることが有効であることに想到した。そして、さらに、この検出の方式における精度を向上させるために、糖タンパク質測定試薬で得た糖化タンパク質の定量値を、同一の血清検体において定量したアルブミンの定量値で除して補正すると、この補正値が、血清中の糖化アルブミンの定量値（上記のＨＰＬＣ法での定量値）と、非常に良好な相関を示すことが明らかにした。
しかしながら、この相関性が良好な糖化アルブミンの定量方法を用いても、現状では、得られる回帰式をプロットした場合に、Ｙ軸負方向（Ｘ軸正方向）への切片が現れてしまい、取扱いが複雑・不便になり、臨床現場等における円滑な取扱いを妨げる原因ともなりかねない。
そこで、本発明が解決すべき課題は、酵素法を用いた補正定量法を用いて、回帰式をプロットしても、上記のような切片が現れることなく、かつ、ＨＰＬＣ法によって行われる糖化アルブミンの定量値と、１：１対応の相関が認められるようにする手段を提供することにある。
発明の開示
本発明者は、この課題の解決に向けて、まず、上記の切片が現れる原因についての検討を行った。
その結果、本発明者は、上記の切片が現れるのは、酵素法による定量の際に用いる、糖化アルブミンの標準物質として、人工タイプのものを用いていることに原因があることを突き止めた。
すなわち、現状において、酵素法において用いる糖化アルブミンは、アルブミンをコードする遺伝子を組み込んだ大腸菌等から得られる、組換え型アルブミンまたはヒト由来のアルブミン画分を、グルコース存在下で、３７℃付近で保温することにより、強制的にアルブミンを糖化して得られる糖化アルブミンである。この人工糖化アルブミンは、アルブミンに４か所存在する糖鎖結合部位全てにグルコースを結合させることを目指している。しかしながら、かかる従来の糖化アルブミンを標準物質として酵素法を行うと、ＨＰＬＣ法で行った結果に必ずしもよい相関を示すとは限らない傾向が認められる。この理由として、本来、少なくとも健常人の血清に存在する糖化アルブミンの糖の結合数は、４未満であり、多くは、１〜２程度であり、従来から用いられているＨＰＬＣ法による糖化アルブミンの定量法においては、アルブミンにおける糖の結合数にかかわらず、１分子の糖化アルブミンを等しく認識することが可能であるが、酵素法による定量の場合には、この糖の結合数によって測定値に変動が認められてしまうことが考えられる。また、上述の強制的な糖化を行った場合の糖化を、完璧に行うためには（すなわち、アルブミン１分子当りの糖結合数の平均を、ほぼ４とする）、グルコース存在下での保温を長期間（最低、１週間程度）行う必要があるが、この保存期間中にアルブミン自体が変性してしまう傾向が認められるために、このような長期間の保存を行うこと自体が困難である。その結果、アルブミン１分子当りの糖結合数にばらつきが多くなった結果、測定値の変動を生じてしまっていることが考えられる。
このように、可能な限り、通常の血清に存在する糖化アルブミンに近似したもので、かつ、アルブミン１分子当りの糖結合数のばらつきが少ない糖化アルブミンを糖化アルブミンの標準物質として用いらなければ、必然的にＨＰＬＣ法により得られる結果とのズレが生じてしまうこととなるのである。
かかる人工糖化アルブミンを酵素法において用いることによって生ずる不利益を解消する手段として、本発明者は、ヒト（健常人）の血清に存在する糖化アルブミンを分離・採取して、これを糖化アルブミンの標準物質として用いることに想到した。
すなわち、本発明は、糖タンパク質測定試薬で、血清中の糖化タンパク質を定量し、その定量値を、同血清中の総アルブミンの定量値で除して補正し、かかる補正値を同血清中の糖化アルブミンの定量値とする、糖タンパク質測定試薬を用いて糖化アルブミンを検出する方法において、標準物質として使用する糖化アルブミンが、健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得られる糖化アルブミンである、糖化アルブミンの検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
健常人（本発明においては、糖尿病または糖尿病境界域ではない人のことを意味する。具体的には、健常人は、空腹時血漿血糖値が１１０ｍｇ／ｄｌ未満で、かつ、７５ｇグルコース負荷試験の２時間後の血漿血糖値が１４０ｍｇ／ｄｌ未満の者として定義される）の血液に由来する糖化アルブミン（以下、自然糖化アルブミンともいう）とは、通常、健常人の血清において存在する糖化アルブミンのことを意味するものであり、具体的には、糖化部位が４か所存在するアルブミンにおける、アルブミン１分子当りの平均糖化数が、４未満、通常は１〜２である糖化アルブミンのことを意味する。
このように、本検出方法において標準物質として用いられ得る自然糖化アルブミンの、１分子当りの糖結合数の平均は、一般的には１〜２であり、後述する実施例において示されるように、好適には、概ね１．３〜２．１（小数点第２位以下は四捨五入）であるので、本発明では、かかる糖結合数の平均が１．３〜２．１（小数点第２位以下は四捨五入）である糖化アルブミンを、標準物質として用いた検出方法も、本検出方法として提供する。
すなわち、本検出方法は、糖タンパク質測定試薬で、血清中の糖化タンパク質を定量し、その定量値を、同血清中の総アルブミンの定量値で除して補正し、かかる補正値を同血清中の糖化アルブミンの定量値とする、糖タンパク質測定試薬を用いて糖化アルブミンを検出する方法において、標準物質として使用する糖化アルブミンの１分子当りの糖結合数の平均が１．３〜２．１である、糖化アルブミンの検出方法、としても提供される。
自然糖化アルブミンを製造するには、直接、ヒトの血清から、非糖化アルブミンと糖化アルブミンとを分別する手段（例えば、アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体）を用いて、自然糖化アルブミンを分別採取することが、効率的、かつ、現実的である。しかしながら、自然糖化アルブミンの製造方法は、これに限定されるべきものではなく、例えば、非糖化アルブミン分子の糖化部位の一部分を保護基等で、糖化を起こさない状態とし、これに対して、現在行われている、強制糖化を行った後に、保護基等を除去すること等を行うことによっても、自然糖化アルブミンを得ることができる。
なお、上記の酵素を用いた糖タンパク質測定試薬は、例えば、プロテアーゼと糖化アミノ酸に基質特異性が認められる、ケトアミノオキシターゼまたはフルクトサミンオキシダーゼを組み合わせた試薬が挙げられ、この態様の測定試薬は、いわゆる「Ｇｌｙ−Ｐｒｏ試薬」として、オートワコーフルクトサミン試薬（和光純薬社製）および「Ｇｌｙ−ＰｒｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ」から発売されている。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態を説明する。
Ａ．自然糖化アルブミンの製造
上述したように、自然糖化アルブミンは、健常人の血清または血漿から分離・採取することにより製造することが、現状では効率的である。
自然糖化アルブミンを製造する前提として、まず、健常人のヒトアルブミンを調製することが好適である。ヒトアルブミン（糖化アルブミンを含んでいる）は、通常公知の方法により、ヒト血清または血漿から分離して得ることが可能である。例えば、陰イオン交換カラムにより、ヒト血清または血漿中の蛋白をアルブミンとその他の蛋白成分に分離することにより得ることができる。
次いで、かかる健常人のヒトアルブミンから、糖化アルブミンを、非糖化アルブミンと糖化アルブミンを選択することができる手段を施し、分離して採取することが好ましい。このアルブミンの選択手段としては、例えば、糖化アルブミンまたは非糖化アルブミンのいずれかを特異的に吸着可能な分子種をリガンドとした担体を用いた糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分別を挙げることができる。かかる担体としては、例えば、アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体等を挙げることができる。
アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体においては、担体にリガンドとして結合しているアミノフェニルボロン酸の水酸基と、糖化アルブミンにおいて結合しているグルコースのｃｉｓ−ｄｉｏｌ基と結合することにより、糖化アルブミンが選択的に捕捉される。この担体に捕捉された糖化アルブミンを、溶出することにより、所望する自然糖化アルブミンを製造することができる。糖化アルブミンの溶出手段としては、アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体であれば、例えば、Ｄ−ソルビトール等のような、ｃｉｓ−ｄｉｏｌ基を有する他の物質を、担体に捕捉された糖化アルブミンに対して置換すること等が挙げられるが、選択する分別担体の具体的な種類に応じて選択されるべきものであり、これに限定されるものではない。
なお、上記の糖化アルブミンの製造過程を、非糖化アルブミンの選択的な製造手段とすることも可能であり、この非糖化アルブミンも、標準物質として非常に有用である（なお、非糖化アルブミンの製造原料となる血液の供給者は、非健常人であってもよいが、健常人であることが好適である）。通常、上記の糖化アルブミンの製造過程を、非糖化アルブミンの選択的な製造手段として用いた場合の非糖化アルブミンには、通常、自然糖化アルブミンが、全アルブミン量に対して１０〜１５質量％程度含有される。また、本検出方法を行うに際しては、上記の非糖化アルブミンの代わりに、健常人の血清そのものを用いることもできる。
上記の糖化アルブミンを含む画分からの、自然糖化アルブミンの精製・採取は、蛋白質を精製・採取する際に汎用されている、公知の方法を駆使して行うことができる。すなわち、通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、ゲル濾過、液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、透析法等を適宜用いることにより、糖化アルブミンを含む画分から、所望の自然糖化アルブミンを精製・採取することができる。
このようにして製造される自然糖化アルブミンは、上述したように、４か所存在するアルブミンの糖化部位のうち、平均で、アルブミン１分子当り４か所未満、通常は、１〜２か所、さらに具体的には、１．３〜２．１か所（小数点第２位以下は四捨五入）が糖化されている糖化アルブミンである。
上述したように、自然糖化アルブミンを、酵素法による糖化アルブミン定量における標準物質として用いることにより、酵素法においても、糖化部位が全てが糖化した人工の糖化アルブミンに認められるような過反応が認められないため、酵素法を用いた補正定量法による糖化アルブミン定量の簡便性を維持しつつ、精度の高いデータを得ることができる。
すなわち、ＨＰＬＣ法による糖化アルブミンの定量結果と、ほぼ１：１で相関し、かつ、回帰式をプロットしても、プロット図において切片が現れることを回避することが可能である。
Ｂ．本検出方法および検出用キット
本検出方法は、血清中（常法により、血液検体から調製することが可能である）の糖化タンパク質を、糖タンパク質測定試薬で定量することを前提としている。かかる測定は、「Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｃ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ｏｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｓｔｓ，４ｔｈｅｄ．，ＡＡＣＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９９５」に記載されている方法を採ることができる。
この測定の大まかな原理は、以下のごとくである。
▲１▼血清中の糖化タンパク質をプロナーゼ、プロテイナーゼＫ等のプロテアーゼにより消化し、フルクトシルアミノ酸して、
▲２▼このフルクトシルアミノ酸を基質として、酸素の存在下でケトアミノオキシダーゼまたはフルクトサミンオキシダーゼを作用させて過酸化水素を発生させ、
▲３▼この過酸化水素を定量〔例えば、４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン等の存在下で、ペルオキシダーゼを作用させて発色させ、これを５５０ｎｍにおける吸光度測定により定量する方法等〕する。
本検出方法では、このような酵素法による測定において、標準物質として、上述した自然糖化アルブミンを用いることを特徴とする。
また、本検出方法では、上記の糖化タンパク質を定量する血清において、別途、総アルブミンを定量することが必要である。
かかる総アルブミンの定量方法は、特に限定されず、免疫比濁法、ラテックス法、色素法等を例示することができる。
このようにして得られる総アルブミンの定量値で、上記の糖化タンパク質の定量値を除して補正することにより、血清中の糖化アルブミン値を的確に定量・検出することができる。
本検出方法の最も好ましい態様は、▲１▼自然アルブミンを標準物質として用いた血清中の糖化タンパク質の定量過程、▲２▼同血清中の総アルブミンの定量過程、および、▲３▼ ▲１▼で得られた値を▲２▼で得られた値で除する補正過程の、３つの過程を、自動化して行うことである。
かかる自動化過程は、既存の血清検査用の自動化定量装置を、本検出方法に応じて調整することで、当業者であれば、容易に行うことができる。
本発明により、低コストで、従来のＨＰＬＣ法による結果と同等の結果を得ることが可能である。
なお、本検出方法において用いる検体を、尿検体とすることも、具体的な検査の目的によっては可能である。
また、本発明は、標準物質として、自然糖化アルブミン（健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得られる糖化アルブミン、または、糖化アルブミンの１分子当りの糖結合数の平均が１．３〜２．１の糖化アルブミン）を、キットの構成要素として含む、本検出方法を行うための、検出用キット（以下、本検出用キットともいう）をも提供する発明である。本検出用キットには、検出の標準物質として用いる、上述した内容の自然糖化アルブミンの他に、非糖化アルブミン、酵素法による糖化タンパク質を定量するための、定量試薬等を必要に応じてキットの構成要素として含有させることができる。
実施例
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明する。
参考例
２０名の血液提供者〔健常人６名（検体番号１〜６）、境界域糖尿病患者４名（検体番号７〜１０）、糖尿病患者（検体番号１１〜２０）〕を募って、ＨＰＬＣにより、各検体の全アルブミンに対する糖化タンパク質の質量比率を計測し、その値から、公知の手法〔安川恵子他：グリコアルブミン，臨床検査４０（１２），１２７５〜１２８０頁（１９９６年）〕に従い、全アルブミンに対する糖化タンパク質のモル比率〔Ａ〕を算出した。また、同じ検体に対して、「Ｇｌｙ−Ｐｒｏ試薬」（Ｇｌｙ−ＰｒｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ：ゼンザイム社製）を用いて、血清中の糖化タンパク質の全アルブミンに対するモル比率〔Ｂ〕を測定した。そして、前者〔Ａ〕で、後者〔Ｂ〕で除した、〔Ｂ〕／〔Ａ〕を算出することにより、各検体の糖化アルブミンの１分子当りの平均糖結合数を求めた。この結果を第１表に示す。
この結果により、健常人である、検体１〜６の提供者に由来する糖化アルブミンの１分子当りの平均糖結合数は、それぞれ、１．３〜２．１（小数点第２位以下は四捨五入）であり（６検体の平均値は、２．０１である）、これに対して、境界糖尿病や糖尿病の患者からの検体における糖化アルブミンの１分子当りの平均糖結合数は、数値が大きくなり、かつ、ばらつきが大きいことがわかる。
このように、健常人に血液に由来する糖化アルブミンは、１分子当りの糖結合数が、ばらつきが少なく、ほぼ２であり、酵素法で糖化アルブミンを定量する場合の標準物質として適していることが明らかとなった。
製造例
陰イオン交換カラムにより、ヒト（健常人：上記参考例の検体１〜３の提供者）の血清（各人１５０ｍＬ）から分離された粗ヒトアルブミンを、透析してグルコースを除去して、さらに、これを濃縮した後、生理食塩水で希釈し、蛋白濃度を７ｇ／ｄｌの割合に調整した。次いで、このヒトアルブミン溶液を、アミノフェニルボロン酸アガロースゲル（シグマ社製）と混合した。具体的には、ゲル５ｍＬに対し、ヒトアルブミン溶液５ｍＬ（体積比１：１）を混合した。なお、ゲルは、再生液１（２０ｍＭ 水酸化ナトリウム）および再生液２（０．３％ 酢酸）で処理した後に、平衡化してから使用した。
上記の混合ゲルを、１６時間冷蔵（４℃）しつつ静置した後、ゲルの上に溜まった血清成分をカラムの開口部からピペットで抜取り、除去した。
▲１▼糖化アルブミンの低値試料の調製
次に、混合ゲルに、平衡化液〔０．０２Ｍ ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．６），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１Ｍ ＭｇＣｌ２〕５ｍＬを流すことで、未吸着成分を溶出させた。かかる未吸着成分を、試料の５００倍容量の冷却した生理食塩水中で、スターラーで攪拌しながら透析し、この透析液を、限外濾過膜（セントリコン１０：アミコン社製）を用いて、３０００ｒｐｍで６時間の限外濾過を行い、約１／４まで濃縮を行った（１／２濃縮毎にセントリコン１０を、新しいものと交換した）。
このようにして得た試料の濃縮物を、糖化アルブミンの低値試料（非糖化アルブミン）とした。
この糖化アルブミンの低値試料の自然糖化アルブミン量は、全アルブミン量に対して約１０質量％であった。
▲２▼糖化アルブミンの高値試料の調製
上記の工程▲１▼により、未吸着成分を溶出させた混合ゲルに、再度、上記の平衡化液を４５ｍＬ流し、混合ゲルを洗浄した。次に、この混合ゲルに、溶出液〔０．０２Ｍ ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．６），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ ソルビトール〕２０ｍＬを流し、７〜１０ｍＬの分画を回収した。かかる分画を、５００倍容量の冷却した生理食塩水中で、スターラーで攪拌しながら透析し、この透析液を、限外濾過膜（セントリコン１０：アミコン社製）を用いて、３０００ｒｐｍで６時間の限外濾過を行い、約１／４まで濃縮を行った（１／２濃縮毎にセントリコン１０を、新しいものと交換した）。
このようにして得た試料の濃縮物を、糖化アルブミンの高値試料（糖化アルブミン）とした。
なお、この糖化アルブミンの高値試料のアルブミン１分子当りの平均糖結合数は、２．０２であった。
▲３▼糖化アルブミンの人工高値試料の調製
ヒト血清（検体１〜３提供者の血清）から分離された、粗ヒトアルブミン２ｇを、５質量％グルコースと０．０５質量％アジ化ナトリウムを含有する水溶液１００ｍｌ中に溶解し、３７℃で４８時間の保温を行った。その後、この溶液を、透析膜を用いて、５℃の蒸留水中で一晩の透析を行った。透析を終了後、透析物を限外濾過膜（セントリコン１０：アミコン社製）を用いて、３０００ｒｐｍで６時間の限外濾過を行い、約１／４まで濃縮を行った（１／２濃縮毎にセントリコン１０を、新しいものと交換した）。このようにして得た試料を、糖化アルブミンの人工的高値試料とした。
試験例１
４８人の血液検体提供者からの血液検体から、それぞれ血清を得て、「Ｇｌｙ−Ｐｒｏ試薬」（Ｇｌｙ−ＰｒｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ：ゼンザイム社製）により、上記の製造例において製造した糖化アルブミンの低値試料と同人工的高値試料を標準液として使用して、血清中の糖化タンパク質（１）を定量した。
そして、同時に、ＨＰＬＣ法〔「臨床検査ｖｏｌ．４０：１２７５−１２８０，１９９引に記載された２カラム法〕によって、血清中の糖化アルブミン（２）を定量した。
次に、（１）の値を、常法によって定量した、各々の血清検体における総アルブミン値（ｇ／Ｌ）で除した値を算出した（３）。
そして、上記の（１）の代わりに（３）の値（％）の値と、（２）との相関を検討した図面が、第１図である。
第１図において、横軸正方向における切片の存在が認められた。この切片は、すでに、ＨＰＬＣ法で臨床的に認められている正常範囲を逸脱するもので、これをこのまま臨床現場で用いると、少なからず取扱いに混乱を惹き起こす可能性を否定することができない。
試験例２
試験例１と同様の試験系において、上記の製造例において製造した糖化アルブミンの低値試料と同高値試料を標準液として使用して、血清中の糖化タンパク質（１）’を定量した。
そして、上記と同様の血清中の糖化アルブミン（２）のＨＰＬＣ法による定量値と、（１）’を総アルブミン値で除した値（３）’との相関を検討した図面が、第２図である。
この第２図においては、第１図のような切片が認められず、相関係数は、０．９７０で良好であり、かつ、傾きも１．０４５と、ＨＰＬＣ法による測定値（２）との間において、殆ど変動は認められなかった。
これらの結果により、本検出方法により、糖尿病に関する良好な指標となり得る糖化アルブミンを、精度良く、かつ、簡便に検出・定量することができることが明らかになった。
つまり、本検出方法が、糖尿病の検出において、非常に有効な手段であることがわかる。
産業上の利用可能性
本発明により、糖尿病に関する良好な指標となり得る糖化アルブミンを、精度良く、かつ、簡便に検出・定量することができることが明らかになり、非常に有効な糖尿病の検出手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、血清中の糖化アルブミン値と人工の糖化アルブミンを標準物質として用いた補正酵素法により得られる補正値との相関を検討した図面であり、第２図は、血清中の糖化アルブミン値と自然糖化アルブミンを標準物質として用いた補正酵素法により得られる補正値との相関を検討した図面である。
本発明は、血清中の特定の糖化タンパク質の検出方法に関する発明である。
背景技術
糖尿病の治療は、可能な限り的確に、かつ、早期に発見して行うことが好ましい。かかる糖尿病のマーカーとして、血清中の糖化アルブミンが、短期的血糖管理指標として着目されており、この糖化アルブミンの適切な検出方法が現在模索されている。
現在、血清中の糖化アルブミンは、いわゆるＨＰＬＣ法によって行われている（臨床検査ｖｏｌ．４０：１２７５−１２８０，１９９６）が、この方法では、大量の検体を処理することが困難であり、ランニングコストも嵩むという問題点がある。
本発明者らは、この課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、酵素法により血清中の糖化タンパク質を検出することが可能な糖タンパク質測定試薬を用いることが有効であることに想到した。そして、さらに、この検出の方式における精度を向上させるために、糖タンパク質測定試薬で得た糖化タンパク質の定量値を、同一の血清検体において定量したアルブミンの定量値で除して補正すると、この補正値が、血清中の糖化アルブミンの定量値（上記のＨＰＬＣ法での定量値）と、非常に良好な相関を示すことが明らかにした。
しかしながら、この相関性が良好な糖化アルブミンの定量方法を用いても、現状では、得られる回帰式をプロットした場合に、Ｙ軸負方向（Ｘ軸正方向）への切片が現れてしまい、取扱いが複雑・不便になり、臨床現場等における円滑な取扱いを妨げる原因ともなりかねない。
そこで、本発明が解決すべき課題は、酵素法を用いた補正定量法を用いて、回帰式をプロットしても、上記のような切片が現れることなく、かつ、ＨＰＬＣ法によって行われる糖化アルブミンの定量値と、１：１対応の相関が認められるようにする手段を提供することにある。
発明の開示
本発明者は、この課題の解決に向けて、まず、上記の切片が現れる原因についての検討を行った。
その結果、本発明者は、上記の切片が現れるのは、酵素法による定量の際に用いる、糖化アルブミンの標準物質として、人工タイプのものを用いていることに原因があることを突き止めた。
すなわち、現状において、酵素法において用いる糖化アルブミンは、アルブミンをコードする遺伝子を組み込んだ大腸菌等から得られる、組換え型アルブミンまたはヒト由来のアルブミン画分を、グルコース存在下で、３７℃付近で保温することにより、強制的にアルブミンを糖化して得られる糖化アルブミンである。この人工糖化アルブミンは、アルブミンに４か所存在する糖鎖結合部位全てにグルコースを結合させることを目指している。しかしながら、かかる従来の糖化アルブミンを標準物質として酵素法を行うと、ＨＰＬＣ法で行った結果に必ずしもよい相関を示すとは限らない傾向が認められる。この理由として、本来、少なくとも健常人の血清に存在する糖化アルブミンの糖の結合数は、４未満であり、多くは、１〜２程度であり、従来から用いられているＨＰＬＣ法による糖化アルブミンの定量法においては、アルブミンにおける糖の結合数にかかわらず、１分子の糖化アルブミンを等しく認識することが可能であるが、酵素法による定量の場合には、この糖の結合数によって測定値に変動が認められてしまうことが考えられる。また、上述の強制的な糖化を行った場合の糖化を、完璧に行うためには（すなわち、アルブミン１分子当りの糖結合数の平均を、ほぼ４とする）、グルコース存在下での保温を長期間（最低、１週間程度）行う必要があるが、この保存期間中にアルブミン自体が変性してしまう傾向が認められるために、このような長期間の保存を行うこと自体が困難である。その結果、アルブミン１分子当りの糖結合数にばらつきが多くなった結果、測定値の変動を生じてしまっていることが考えられる。
このように、可能な限り、通常の血清に存在する糖化アルブミンに近似したもので、かつ、アルブミン１分子当りの糖結合数のばらつきが少ない糖化アルブミンを糖化アルブミンの標準物質として用いらなければ、必然的にＨＰＬＣ法により得られる結果とのズレが生じてしまうこととなるのである。
かかる人工糖化アルブミンを酵素法において用いることによって生ずる不利益を解消する手段として、本発明者は、ヒト（健常人）の血清に存在する糖化アルブミンを分離・採取して、これを糖化アルブミンの標準物質として用いることに想到した。
すなわち、本発明は、糖タンパク質測定試薬で、血清中の糖化タンパク質を定量し、その定量値を、同血清中の総アルブミンの定量値で除して補正し、かかる補正値を同血清中の糖化アルブミンの定量値とする、糖タンパク質測定試薬を用いて糖化アルブミンを検出する方法において、標準物質として使用する糖化アルブミンが、健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得られる糖化アルブミンである、糖化アルブミンの検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
健常人（本発明においては、糖尿病または糖尿病境界域ではない人のことを意味する。具体的には、健常人は、空腹時血漿血糖値が１１０ｍｇ／ｄｌ未満で、かつ、７５ｇグルコース負荷試験の２時間後の血漿血糖値が１４０ｍｇ／ｄｌ未満の者として定義される）の血液に由来する糖化アルブミン（以下、自然糖化アルブミンともいう）とは、通常、健常人の血清において存在する糖化アルブミンのことを意味するものであり、具体的には、糖化部位が４か所存在するアルブミンにおける、アルブミン１分子当りの平均糖化数が、４未満、通常は１〜２である糖化アルブミンのことを意味する。
このように、本検出方法において標準物質として用いられ得る自然糖化アルブミンの、１分子当りの糖結合数の平均は、一般的には１〜２であり、後述する実施例において示されるように、好適には、概ね１．３〜２．１（小数点第２位以下は四捨五入）であるので、本発明では、かかる糖結合数の平均が１．３〜２．１（小数点第２位以下は四捨五入）である糖化アルブミンを、標準物質として用いた検出方法も、本検出方法として提供する。
すなわち、本検出方法は、糖タンパク質測定試薬で、血清中の糖化タンパク質を定量し、その定量値を、同血清中の総アルブミンの定量値で除して補正し、かかる補正値を同血清中の糖化アルブミンの定量値とする、糖タンパク質測定試薬を用いて糖化アルブミンを検出する方法において、標準物質として使用する糖化アルブミンの１分子当りの糖結合数の平均が１．３〜２．１である、糖化アルブミンの検出方法、としても提供される。
自然糖化アルブミンを製造するには、直接、ヒトの血清から、非糖化アルブミンと糖化アルブミンとを分別する手段（例えば、アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体）を用いて、自然糖化アルブミンを分別採取することが、効率的、かつ、現実的である。しかしながら、自然糖化アルブミンの製造方法は、これに限定されるべきものではなく、例えば、非糖化アルブミン分子の糖化部位の一部分を保護基等で、糖化を起こさない状態とし、これに対して、現在行われている、強制糖化を行った後に、保護基等を除去すること等を行うことによっても、自然糖化アルブミンを得ることができる。
なお、上記の酵素を用いた糖タンパク質測定試薬は、例えば、プロテアーゼと糖化アミノ酸に基質特異性が認められる、ケトアミノオキシターゼまたはフルクトサミンオキシダーゼを組み合わせた試薬が挙げられ、この態様の測定試薬は、いわゆる「Ｇｌｙ−Ｐｒｏ試薬」として、オートワコーフルクトサミン試薬（和光純薬社製）および「Ｇｌｙ−ＰｒｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ」から発売されている。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態を説明する。
Ａ．自然糖化アルブミンの製造
上述したように、自然糖化アルブミンは、健常人の血清または血漿から分離・採取することにより製造することが、現状では効率的である。
自然糖化アルブミンを製造する前提として、まず、健常人のヒトアルブミンを調製することが好適である。ヒトアルブミン（糖化アルブミンを含んでいる）は、通常公知の方法により、ヒト血清または血漿から分離して得ることが可能である。例えば、陰イオン交換カラムにより、ヒト血清または血漿中の蛋白をアルブミンとその他の蛋白成分に分離することにより得ることができる。
次いで、かかる健常人のヒトアルブミンから、糖化アルブミンを、非糖化アルブミンと糖化アルブミンを選択することができる手段を施し、分離して採取することが好ましい。このアルブミンの選択手段としては、例えば、糖化アルブミンまたは非糖化アルブミンのいずれかを特異的に吸着可能な分子種をリガンドとした担体を用いた糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分別を挙げることができる。かかる担体としては、例えば、アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体等を挙げることができる。
アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体においては、担体にリガンドとして結合しているアミノフェニルボロン酸の水酸基と、糖化アルブミンにおいて結合しているグルコースのｃｉｓ−ｄｉｏｌ基と結合することにより、糖化アルブミンが選択的に捕捉される。この担体に捕捉された糖化アルブミンを、溶出することにより、所望する自然糖化アルブミンを製造することができる。糖化アルブミンの溶出手段としては、アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定した担体であれば、例えば、Ｄ−ソルビトール等のような、ｃｉｓ−ｄｉｏｌ基を有する他の物質を、担体に捕捉された糖化アルブミンに対して置換すること等が挙げられるが、選択する分別担体の具体的な種類に応じて選択されるべきものであり、これに限定されるものではない。
なお、上記の糖化アルブミンの製造過程を、非糖化アルブミンの選択的な製造手段とすることも可能であり、この非糖化アルブミンも、標準物質として非常に有用である（なお、非糖化アルブミンの製造原料となる血液の供給者は、非健常人であってもよいが、健常人であることが好適である）。通常、上記の糖化アルブミンの製造過程を、非糖化アルブミンの選択的な製造手段として用いた場合の非糖化アルブミンには、通常、自然糖化アルブミンが、全アルブミン量に対して１０〜１５質量％程度含有される。また、本検出方法を行うに際しては、上記の非糖化アルブミンの代わりに、健常人の血清そのものを用いることもできる。
上記の糖化アルブミンを含む画分からの、自然糖化アルブミンの精製・採取は、蛋白質を精製・採取する際に汎用されている、公知の方法を駆使して行うことができる。すなわち、通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、ゲル濾過、液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、透析法等を適宜用いることにより、糖化アルブミンを含む画分から、所望の自然糖化アルブミンを精製・採取することができる。
このようにして製造される自然糖化アルブミンは、上述したように、４か所存在するアルブミンの糖化部位のうち、平均で、アルブミン１分子当り４か所未満、通常は、１〜２か所、さらに具体的には、１．３〜２．１か所（小数点第２位以下は四捨五入）が糖化されている糖化アルブミンである。
上述したように、自然糖化アルブミンを、酵素法による糖化アルブミン定量における標準物質として用いることにより、酵素法においても、糖化部位が全てが糖化した人工の糖化アルブミンに認められるような過反応が認められないため、酵素法を用いた補正定量法による糖化アルブミン定量の簡便性を維持しつつ、精度の高いデータを得ることができる。
すなわち、ＨＰＬＣ法による糖化アルブミンの定量結果と、ほぼ１：１で相関し、かつ、回帰式をプロットしても、プロット図において切片が現れることを回避することが可能である。
Ｂ．本検出方法および検出用キット
本検出方法は、血清中（常法により、血液検体から調製することが可能である）の糖化タンパク質を、糖タンパク質測定試薬で定量することを前提としている。かかる測定は、「Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｃ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ｏｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｓｔｓ，４ｔｈｅｄ．，ＡＡＣＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９９５」に記載されている方法を採ることができる。
この測定の大まかな原理は、以下のごとくである。
▲１▼血清中の糖化タンパク質をプロナーゼ、プロテイナーゼＫ等のプロテアーゼにより消化し、フルクトシルアミノ酸して、
▲２▼このフルクトシルアミノ酸を基質として、酸素の存在下でケトアミノオキシダーゼまたはフルクトサミンオキシダーゼを作用させて過酸化水素を発生させ、
▲３▼この過酸化水素を定量〔例えば、４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン等の存在下で、ペルオキシダーゼを作用させて発色させ、これを５５０ｎｍにおける吸光度測定により定量する方法等〕する。
本検出方法では、このような酵素法による測定において、標準物質として、上述した自然糖化アルブミンを用いることを特徴とする。
また、本検出方法では、上記の糖化タンパク質を定量する血清において、別途、総アルブミンを定量することが必要である。
かかる総アルブミンの定量方法は、特に限定されず、免疫比濁法、ラテックス法、色素法等を例示することができる。
このようにして得られる総アルブミンの定量値で、上記の糖化タンパク質の定量値を除して補正することにより、血清中の糖化アルブミン値を的確に定量・検出することができる。
本検出方法の最も好ましい態様は、▲１▼自然アルブミンを標準物質として用いた血清中の糖化タンパク質の定量過程、▲２▼同血清中の総アルブミンの定量過程、および、▲３▼ ▲１▼で得られた値を▲２▼で得られた値で除する補正過程の、３つの過程を、自動化して行うことである。
かかる自動化過程は、既存の血清検査用の自動化定量装置を、本検出方法に応じて調整することで、当業者であれば、容易に行うことができる。
本発明により、低コストで、従来のＨＰＬＣ法による結果と同等の結果を得ることが可能である。
なお、本検出方法において用いる検体を、尿検体とすることも、具体的な検査の目的によっては可能である。
また、本発明は、標準物質として、自然糖化アルブミン（健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得られる糖化アルブミン、または、糖化アルブミンの１分子当りの糖結合数の平均が１．３〜２．１の糖化アルブミン）を、キットの構成要素として含む、本検出方法を行うための、検出用キット（以下、本検出用キットともいう）をも提供する発明である。本検出用キットには、検出の標準物質として用いる、上述した内容の自然糖化アルブミンの他に、非糖化アルブミン、酵素法による糖化タンパク質を定量するための、定量試薬等を必要に応じてキットの構成要素として含有させることができる。
実施例
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明する。
参考例
２０名の血液提供者〔健常人６名（検体番号１〜６）、境界域糖尿病患者４名（検体番号７〜１０）、糖尿病患者（検体番号１１〜２０）〕を募って、ＨＰＬＣにより、各検体の全アルブミンに対する糖化タンパク質の質量比率を計測し、その値から、公知の手法〔安川恵子他：グリコアルブミン，臨床検査４０（１２），１２７５〜１２８０頁（１９９６年）〕に従い、全アルブミンに対する糖化タンパク質のモル比率〔Ａ〕を算出した。また、同じ検体に対して、「Ｇｌｙ−Ｐｒｏ試薬」（Ｇｌｙ−ＰｒｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ：ゼンザイム社製）を用いて、血清中の糖化タンパク質の全アルブミンに対するモル比率〔Ｂ〕を測定した。そして、前者〔Ａ〕で、後者〔Ｂ〕で除した、〔Ｂ〕／〔Ａ〕を算出することにより、各検体の糖化アルブミンの１分子当りの平均糖結合数を求めた。この結果を第１表に示す。
このように、健常人に血液に由来する糖化アルブミンは、１分子当りの糖結合数が、ばらつきが少なく、ほぼ２であり、酵素法で糖化アルブミンを定量する場合の標準物質として適していることが明らかとなった。
製造例
陰イオン交換カラムにより、ヒト（健常人：上記参考例の検体１〜３の提供者）の血清（各人１５０ｍＬ）から分離された粗ヒトアルブミンを、透析してグルコースを除去して、さらに、これを濃縮した後、生理食塩水で希釈し、蛋白濃度を７ｇ／ｄｌの割合に調整した。次いで、このヒトアルブミン溶液を、アミノフェニルボロン酸アガロースゲル（シグマ社製）と混合した。具体的には、ゲル５ｍＬに対し、ヒトアルブミン溶液５ｍＬ（体積比１：１）を混合した。なお、ゲルは、再生液１（２０ｍＭ 水酸化ナトリウム）および再生液２（０．３％ 酢酸）で処理した後に、平衡化してから使用した。
上記の混合ゲルを、１６時間冷蔵（４℃）しつつ静置した後、ゲルの上に溜まった血清成分をカラムの開口部からピペットで抜取り、除去した。
▲１▼糖化アルブミンの低値試料の調製
次に、混合ゲルに、平衡化液〔０．０２Ｍ ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．６），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１Ｍ ＭｇＣｌ２〕５ｍＬを流すことで、未吸着成分を溶出させた。かかる未吸着成分を、試料の５００倍容量の冷却した生理食塩水中で、スターラーで攪拌しながら透析し、この透析液を、限外濾過膜（セントリコン１０：アミコン社製）を用いて、３０００ｒｐｍで６時間の限外濾過を行い、約１／４まで濃縮を行った（１／２濃縮毎にセントリコン１０を、新しいものと交換した）。
このようにして得た試料の濃縮物を、糖化アルブミンの低値試料（非糖化アルブミン）とした。
この糖化アルブミンの低値試料の自然糖化アルブミン量は、全アルブミン量に対して約１０質量％であった。
▲２▼糖化アルブミンの高値試料の調製
上記の工程▲１▼により、未吸着成分を溶出させた混合ゲルに、再度、上記の平衡化液を４５ｍＬ流し、混合ゲルを洗浄した。次に、この混合ゲルに、溶出液〔０．０２Ｍ ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．６），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ ソルビトール〕２０ｍＬを流し、７〜１０ｍＬの分画を回収した。かかる分画を、５００倍容量の冷却した生理食塩水中で、スターラーで攪拌しながら透析し、この透析液を、限外濾過膜（セントリコン１０：アミコン社製）を用いて、３０００ｒｐｍで６時間の限外濾過を行い、約１／４まで濃縮を行った（１／２濃縮毎にセントリコン１０を、新しいものと交換した）。
このようにして得た試料の濃縮物を、糖化アルブミンの高値試料（糖化アルブミン）とした。
なお、この糖化アルブミンの高値試料のアルブミン１分子当りの平均糖結合数は、２．０２であった。
▲３▼糖化アルブミンの人工高値試料の調製
ヒト血清（検体１〜３提供者の血清）から分離された、粗ヒトアルブミン２ｇを、５質量％グルコースと０．０５質量％アジ化ナトリウムを含有する水溶液１００ｍｌ中に溶解し、３７℃で４８時間の保温を行った。その後、この溶液を、透析膜を用いて、５℃の蒸留水中で一晩の透析を行った。透析を終了後、透析物を限外濾過膜（セントリコン１０：アミコン社製）を用いて、３０００ｒｐｍで６時間の限外濾過を行い、約１／４まで濃縮を行った（１／２濃縮毎にセントリコン１０を、新しいものと交換した）。このようにして得た試料を、糖化アルブミンの人工的高値試料とした。
試験例１
４８人の血液検体提供者からの血液検体から、それぞれ血清を得て、「Ｇｌｙ−Ｐｒｏ試薬」（Ｇｌｙ−ＰｒｏＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ：ゼンザイム社製）により、上記の製造例において製造した糖化アルブミンの低値試料と同人工的高値試料を標準液として使用して、血清中の糖化タンパク質（１）を定量した。
そして、同時に、ＨＰＬＣ法〔「臨床検査ｖｏｌ．４０：１２７５−１２８０，１９９引に記載された２カラム法〕によって、血清中の糖化アルブミン（２）を定量した。
次に、（１）の値を、常法によって定量した、各々の血清検体における総アルブミン値（ｇ／Ｌ）で除した値を算出した（３）。
そして、上記の（１）の代わりに（３）の値（％）の値と、（２）との相関を検討した図面が、第１図である。
第１図において、横軸正方向における切片の存在が認められた。この切片は、すでに、ＨＰＬＣ法で臨床的に認められている正常範囲を逸脱するもので、これをこのまま臨床現場で用いると、少なからず取扱いに混乱を惹き起こす可能性を否定することができない。
試験例２
試験例１と同様の試験系において、上記の製造例において製造した糖化アルブミンの低値試料と同高値試料を標準液として使用して、血清中の糖化タンパク質（１）’を定量した。
そして、上記と同様の血清中の糖化アルブミン（２）のＨＰＬＣ法による定量値と、（１）’を総アルブミン値で除した値（３）’との相関を検討した図面が、第２図である。
この第２図においては、第１図のような切片が認められず、相関係数は、０．９７０で良好であり、かつ、傾きも１．０４５と、ＨＰＬＣ法による測定値（２）との間において、殆ど変動は認められなかった。
これらの結果により、本検出方法により、糖尿病に関する良好な指標となり得る糖化アルブミンを、精度良く、かつ、簡便に検出・定量することができることが明らかになった。
つまり、本検出方法が、糖尿病の検出において、非常に有効な手段であることがわかる。
産業上の利用可能性
本発明により、糖尿病に関する良好な指標となり得る糖化アルブミンを、精度良く、かつ、簡便に検出・定量することができることが明らかになり、非常に有効な糖尿病の検出手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、血清中の糖化アルブミン値と人工の糖化アルブミンを標準物質として用いた補正酵素法により得られる補正値との相関を検討した図面であり、第２図は、血清中の糖化アルブミン値と自然糖化アルブミンを標準物質として用いた補正酵素法により得られる補正値との相関を検討した図面である。
Claims (6)
- 酵素を用いた糖タンパク質測定試薬で、血清中の糖化タンパク質を定量し、その定量値を、同血清中の総アルブミンの定量値で除して補正し、かかる補正値を同血清中の糖化アルブミンの定量値とする、糖タンパク質測定試薬を用いて糖化アルブミンを検出する方法において、ＨＰＬＣ法による糖タンパク質の測定値との等価性を担保するための高値試料である標準物質として使用する糖化アルブミンが、健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得られる糖化アルブミンであって、かつ、当該糖化アルブミンの１分子当りの糖結合数の平均が１．３〜２．１である、糖化アルブミンの検出方法。
- ＨＰＬＣ法による糖タンパク質の測定値との等価性を担保するための低値試料である標準物質として使用する非糖化アルブミンが、健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得られる非糖化アルブミンである、請求項１に記載の糖化アルブミンの検出方法。
- 糖タンパク質測定試薬で、血清中の糖化タンパク質を定量し、その定量値を、同血清中の総アルブミンの定量値で除して補正し、かかる補正値を同血清中の糖化アルブミンの定量値とする、糖タンパク質測定試薬を用いて糖化アルブミンを検出する方法において、健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得られ、かつ、当該糖化アルブミンの１分子当りの糖結合数の平均が１．３〜２．１である糖化アルブミンを、ＨＰＬＣ法による糖タンパク質の測定値との等価性を担保するための高値試料である標準物質として用いて、血清中の糖化アルブミンを検出する、健常人由来の糖化アルブミンの使用方法。
- 健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得られる非糖化アルブミンを、ＨＰＬＣ法による糖タンパク質の測定値との等価性を担保するための低値試料である標準物質として用いる、請求項３に記載の糖化アルブミンの使用方法。
- ＨＰＬＣ法による糖タンパク質の測定値との等価性を担保するための高値試料である標準物質として、健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得られる糖化アルブミンであって、かつ、当該糖化アルブミンの１分子当りの糖結合数の平均が１．３〜２．１である糖化アルブミンをキットの構成要素として含む、請求項１記載の糖化アルブミンの検出方法を行うための、検出用キット。
- ＨＰＬＣ法による糖タンパク質の測定値との等価性を担保するための低値試料である標準物質として、健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得られる非糖化アルブミンをキットの構成要素として含む、請求項５に記載の検出用キット。
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